JP2024500118A - トウモロコシ湿潤製粉における改善された繊維洗浄 - Google Patents

トウモロコシ湿潤製粉における改善された繊維洗浄 Download PDF

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Abstract

湿潤製粉プロセスにおいてトウモロコシ穀粒からの全デンプン収量及び／又はグルテン収量を増加させる方法であって、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒の画分をタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はチオレドキシンと混合することを含む方法が提供される。【選択図】なし

Description

本発明は、好ましくは、繊維洗浄中、トウモロコシ穀粒を酵素組成物と接触させることにより、湿潤製粉プロセスにおける前記トウモロコシ穀粒からのデンプン及び／又はグルテン収量を改善／増加させる方法に関する。
トウモロコシの従来の湿潤製粉は、デンプン及びいくつかの副産物（例えば、胚、グルテン（タンパク質）及び繊維）の回収及び精製のために設計されたプロセスである。繊維は、最も価値のない副産物であるため、産業界では、繊維の割合を減らしながら、デンプン及びグルテンなどのより価値の高い製品の収量を増加させることにかなりの努力を注いでいる。高品質デンプンは、乾燥デンプン、改質デンプン、デキストリン、甘味料及びアルコールなどの製品に更に加工された後、様々な商業目的に使用され得るために価値がある。グルテンは、通常、コーングルテンミール（およそ６０％のタンパク質）又はコーングルテンフィード（およそ２０％のタンパク質）として動物の飼料のために使用される。
湿潤製粉プロセスは、使用される特定の製粉装置に大きく依存して変化し得るが、通常、プロセスは、以下を含む：穀物洗浄、浸漬、粉砕、胚芽分離、第２の粉砕、繊維分離、グルテン分離及びデンプン分離。トウモロコシ穀粒が洗浄された後、それらは、典型的には、時間及び温度が制御された条件下で水又は希釈ＳＯ２溶液に浸漬することによって軟化される。次に、穀粒を粉砕して果皮を粉砕し、胚芽を穀粒の残りの部分から分離する。主に繊維、デンプン及びグルテンからなる残留スラリーは、繊維洗浄プロセスで微粉砕及びスクリーニングされ、繊維がデンプン及びグルテンから分離された後、グルテンとデンプンとが分離され、デンプンは、洗浄／濾過プロセスで精製され得る。
湿潤製粉プロセスの浸漬工程のための酵素の使用など、湿潤製粉プロセスのいくつかの工程における酵素の使用が示唆されている。市販の酵素製品Ｓｔｅｅｐｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓから入手可能）は、湿潤製粉プロセスの第１の工程、即ちトウモロコシ穀粒を水に浸す浸漬工程に適することが示されている。
より最近では、トウモロコシ湿潤製粉における全加工時間を有意に短縮し、処理剤としての二酸化硫黄に対する必要性を排除するためにプロテアーゼを使用する、修正された湿潤製粉プロセスである「酵素的製粉」が開発されている。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ，８１，ｐ．６２６－６３２（２００４）。
米国特許第６，５６６，１２５号明細書は、トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬トウモロコシ穀粒を生成し、浸漬トウモロコシ穀粒を粉砕して粉砕トウモロコシスラリーを生成し、粉砕トウモロコシスラリーを酵素（例えば、プロテアーゼ）と共にインキュベートすることを伴う、トウモロコシからデンプンを得る方法を開示している。
米国特許第５，０６６，２１８号明細書は、穀粒を洗浄し、穀粒を水に浸漬して軟化させ、次に穀粒をセルラーゼ酵素と共に製粉することを含む、穀粒、特にトウモロコシを製粉する方法を開示している。
国際公開第２００２／０００７３１号パンフレットは、穀粒を水に１～１２時間浸漬し、浸漬穀粒を湿潤製粉して、穀粒を酸性プロテアーゼなどの１つ以上の酵素で処理することを含む、作物穀粒を処理するプロセスを開示している。
国際公開第２００２／０００９１１号パンフレットは、製粉デンプンを酸性プロテアーゼに曝すことを含む、デンプングルテンを分離するプロセスを開示している。
国際公開第２００２／００２６４４号パンフレットは、デンプンスラリーを、有効量の酸性プロテアーゼを含む水溶液で洗浄することを含む、製粉プロセスのデンプンとグルテンとの分離工程から得られたデンプンスラリーを洗浄するプロセスを開示している。
国際公開第２０１４／０８２５６６号パンフレット及び国際公開第２０１４／０８２５６４号パンフレットは、湿潤製粉で使用するためのセルロース分解性組成物を開示している。
国際公開第２０１６／０９５８５６号パンフレットは、キシラナーゼ及びアラビノフラノシダーゼを含む組成物並びにトウモロコシ湿潤製粉プロセスにおける繊維洗浄でのこれらの組成物の使用を開示している。
国際公開第２０１９／０２３２２２号パンフレットは、繊維洗浄工程においてセルラーゼと組み合わせてＧＨ５キシラナーゼ及びＧＨ３０キシラナーゼを適用する湿潤製粉プロセスを開示している。
国際公開第２０１７／０８８８２０号パンフレットは、繊維洗浄工程において、アルファ－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ（ＧＨ６２）を単独で又はキシラナーゼ（ＧＨ１０）と組み合わせて添加することにより、繊維からのトウモロコシ湿潤製粉におけるデンプン放出を改善するプロセスを開示している。
国際公開第２０１８／０５３２２０号パンフレットは、酵素インキュベーションのための専用の空間／タンクを用いることにより、繊維洗浄工程で酵素を適用するために最適化されている、湿潤製粉プロセスの一部としての繊維洗浄システムを開示している。
当技術分野では、トウモロコシの湿式製粉において、トウモロコシ穀粒の浸漬（ｓｔｅｅｐｉｎｇ）／浸漬（ｓｏａｋｉｎｇ）中、トウモロコシ穀粒の粉砕中及びデンプンとグルテンとの分離中に酵素を使用する効果が研究されているが、トウモロコシ湿潤製粉に関連するエネルギー消費量及びコストを低下させ、デンプン及びグルテンの収量増大を与え得る改善された技術が依然として必要とされている。
第１の態様では、本発明は、湿潤製粉プロセスにおいてトウモロコシ穀粒からのデンプン収量及び／又はグルテン収量を増加させる方法であって、粉砕トウモロコシ穀粒又は粉砕穀粒の画分、特に繊維豊富画分を、有効量の、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒するポリペプチド、例えばチオレドキシンペプチド又はタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）と接触させることを含む方法に関する。
更なる態様では、本発明は、タンパク質ジスルフィド活性を有する単離ポリペプチド又は酸化、還元若しくは異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒することができるチオレドキシンペプチドに関する。
本発明は、タンパク質ジスルフィド活性を有するポリペプチド）をコードするポリヌクレオチド又は酸化、還元若しくは異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒することができるチオレドキシンペプチド、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ベクター及び宿主細胞並びに本発明のポリペプチドを生成する方法にも関する。
更に、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物に関する。
本発明は、本発明のポリペプチドを生成する方法にも関する。
定義
酵素の定義：
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）：タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（本明細書ではＰＤＩとも称される）（ＥＣ５．３．４．１）という用語は、酸化、還元又は異性化によってフォールディングされる際に、タンパク質内の残基間のジスルフィド結合の形成及び切断を触媒する酵素を意味する。ＰＤＩは、レドックスタンパク質のチオレドキシンスーパーファミリーのメンバーであり、典型的には少なくとも３つのドメインを含み、２つの触媒ドメインは、少なくとも１つの非触媒ドメインによって分離されている、ＣＸＸＣ、好ましくはＣＧＨＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位をそれぞれ含む（Ｐｅｒｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３：８０，Ｈａｔａｈｅｔ ａｎｄ Ｒｕｄｄｏｃｋ，２００７，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ ２７４：５２２３－５２３４）。一実施形態では、活性部位モチーフは、ＣＧＨＣ、ＣＴＨＣ、ＣＰＨＣ及びＣＳＭＣから選択される。触媒ドメインは、典型的には、タンパク質ドメインファミリーＰｆ０００８５（チオレドキシン、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）に、タンパク質ドメインファミリーの大規模な集合体であるＰｆａｍデータベースによって分類されるとおりに属する（Ｍｉｓｔｒｙ，ｅｔ ａｌ．，２０２０，“Ｐｆａｍ：Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ ｉｎ ２０２１”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋａａ９１３；ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）非触媒ドメインは、ＰｆａｍドメインＰｆ１３８４８に属し得る（チオレドキシン＿６ドメイン、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／ＰＦ１３８４８）。好ましい実施形態では、本発明のプロセスに適したＰＤＩは、ポリペプチドモチーフＣＧＨＣ、ＣＴＨＣ、ＣＰＨＣ又はＣＳＭＣ、好ましくはＣＧＨＣからなる活性部位を含む少なくとも１つのＰｆ０００８５ドメインを含む。別の好ましい実施形態では、ＰＤＩは、連続した順序Ｐｆ０００８５、Ｐｆ１３８４８、Ｐｆ０００８５で配置されたドメインを有する３ドメイン構造を含む。３つのドメインは、ペプチドリンカーによって分離され得る。ＰＤＩ活性とは、実施例第５７～５９ページ（ジチオスレイトールによるインスリン還元アッセイ）のアッセイの項に記載され、且つ実施例７で適用されたインスリン還元アッセイ（基質としてインスリンを用い、且つＤＴＴの存在下における）でポリペプチドが活性を有することを意味する。
チオレドキシンペプチド（Ｔｒｘ）：チオレドキシンという用語は、システインチオール－ジスルフィド交換によるタンパク質ジスルフィド結合の還元を触媒するタンパク質を意味する。チオレドキシンは、他のタンパク質の還元を促進することによって抗酸化剤として作用する（Ｃｏｌｌｅｔ ａｎｄ Ｍｅｓｓｅｎｓ，２０１０，Ａｎｔｉｏｘｉｄ．Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ．１３，１２０５－１２１６）。チオレドキシンは、典型的には、サイズがおよそ１２ｋＤの小型酸化還元酵素であり、ジチオール－ジスルフィド活性部位、例えばＣＧＰＣを含有する。チオレドキシンは、遍在的であり、植物及び細菌から哺乳動物までの多くの生物に見られる。リボヌクレアーゼ、絨毛性ゴナドトロピン、凝固因子、糖質コルチコイドレセプタ及びインスリンを含む、チオレドキシンに対する複数のインビトロ基質が同定されている。インスリンの還元は、従来、活性試験として使用される。チオレドキシンは、ＣＸＸＣモチーフ中の２つの隣接システインの存在により、それらのアミノ酸配列のレベルで特徴付けられる。これらの２つのシステインは、チオレドキシンが他のタンパク質を還元する能力にとって重要である。チオレドキシンタンパク質は、他のタンパク質、例えばグルタレドキシン、ＰＤＩ及びジスルフィドオキシダーゼなどの構成成分としても見出される、チオレドキシンフォールドと称される特徴的な三次構造も有する。したがって、本発明によれば、チオレドキシンペプチドは、レドックスタンパク質のチオレドキシンスーパーファミリーのメンバーであり、典型的にはＣＸＸＣモチーフ、好ましくはＣＧＰＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位を含む触媒ドメインを含む。チオレドキシン様ペプチドは、タンパク質ドメインファミリーＰｆ０００８５（チオレドキシン、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）に、Ｐｆａｍデータベースよって分類されるとおりに属する（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）。チオレドキシンペプチド活性とは、実施例に記載のインスリン還元アッセイにおいて、Ｐｆ０００８５ドメインを含むペプチドが活性を有することを意味する。本発明にかかるチオレドキシンペプチドは、実施例、例えば実施例７に開示されるインスリン還元アッセイ（基質としてインスリンを用い、且つＤＴＴの存在下における）で活性を有するべきである。
アラビノフラノシダーゼ／アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド：用語「アラビノフラノシダーゼ」とは、アルファ－Ｌ－アラビノシド中の末端非還元アルファ－Ｌ－アラビノフラノシド残基の加水分解を触媒するアルファＬ－アラビノフラノシドアラビノフラノヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．５５）を意味する。酵素は、アルファ－Ｌ－アラビノフラノシド、（１，３）並びに／又は（１，２）及び／若しくは（１，５）結合を含有するアルファ－Ｌ－アラビナン、アラビノキシラン及びアラビノガラクタンに作用する。アルファ－Ｌアラビノフラノシダーゼは、アラビノシダーゼ、アルファ－アラビノシダーゼ、アルファ－Ｌ－アラビノシダーゼ、アルファ－アラビノフラノシダーゼ、多糖アルファ－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ、アルファ－Ｌ－アラビノフラノシドヒドロラーゼ、Ｌ－アラビノシダーゼ又はアルファ－Ｌ－アラビナナーゼとしても知られている。アラビノフラノシダーゼ活性は、２００μｌの総容積中において、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）の１ｍｌ当たり５ｍｇの中粘度小麦アラビノキシラン（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｌｔｄ．，Ｂｒａｙ，Ｃｏ．Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を４０℃で３０分間使用し、それに続くＡＭＩＮＥＸ（登録商標）ＨＰＸ－８７Ｈカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるアラビノース分析によって決定され得る。アラビノフラノシダーゼは、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，１９９１，Ａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９－３１６及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ ａｎｄ Ｂａｉｒｏｃｈ，１９９６，Ｕｐｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：６９５－６９６に従い、例えばＧＨ４３、ＧＨ６２、ＧＨ５１ファミリーに見出すことができる。
ベータ－グルコシダーゼ／ベータ－グルコシダーゼ活性を有するポリペプチド：用語「ベータ－グルコシダーゼ」とは、ベータ－Ｄ－グルコースの放出を伴う末端非還元ベータ－Ｄ－グルコース残基の加水分解を触媒するベータ－Ｄ－グルコシドグルコヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）を意味する。Ｖｅｎｔｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：５５－６６の手順に従い、基質としてｐ－ニトロフェニル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシドを用いて、ベータ－グルコシダーゼ活性を決定し得る。１単位のベータ－グルコシダーゼは、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む５０ｍＭのクエン酸ナトリウム中の基質としての１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－ベータ－Ｄ－グルコピラノシドからの、２５℃、ｐＨ４．８で１分当たりに生成されるｐ－ニトロフェノレートアニオン１．０μモルと定義される。
ベータ－キシロシダーゼ／ベータ－キシロシダーゼ活性を有するポリペプチド：用語「ベータ－キシロシダーゼ」とは、短いベータ（１→４）－キシロオリゴ糖をエキソ加水分解して非還元末端からＤ－キシロース残基を連続的に除去することを触媒するベータ－Ｄ－キシロシドキシロヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．３７）を意味する。ｐＨ５、４０℃において、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１００ｍＭのクエン酸ナトリウム中の基質としての１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－ベータ－Ｄ－キシロシドを使用して、ベータ－キシロシダーゼ活性を決定し得る。１単位のベータ－キシロシダーゼは、０．０１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を含む１００ｍＭのクエン酸ナトリウム中の１ｍＭのｐ－ニトロフェニル－ベータ－Ｄ－キシロシドからの、４０℃、ｐＨ５で１分当たりに生成されるｐ－ニトロフェノレートアニオン１．０μモルと定義される。
セロビオヒドロラーゼ／セロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド：用語「セロビオヒドロラーゼ」とは、セルロース、セロオリゴ糖又は任意のベータ－１，４結合グルコース含有ポリマー中の１，４－ベータ－Ｄ－グルコシド連結を加水分解して、この鎖の還元末端（セロビオヒドロラーゼＩ）又は非還元末端（セロビオヒドロラーゼＩＩ）からセロビオースを放出することを触媒する１，４－ベータ－Ｄ－グルカンセロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１及びＥ．Ｃ．３．２．１．１７６）を意味する（Ｔｅｅｒｉ，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：１６０－１６７；Ｔｅｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２６：１７３－１７８）。Ｌｅｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７２，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２７３－２７９；ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９８２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １４９：１５２－１５６；ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ ａｎｄ Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ，１９８５，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８７：２８３－２８８；及びＴｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０：５７５－５８１により説明されている手順に従い、セロビオヒドロラーゼ活性を決定し得る。
セルロース分解性酵素又はセルラーゼ／セルラーゼ活性又はセルロース分解活性を有するポリペプチド：用語「セルロース分解性酵素」又は「セルラーゼ」とは、繊維などのセルロースを含む任意の物質を含むセルロース系材料を加水分解する１つ以上（例えば、いくつか）の酵素を意味する。セルロース分解性酵素として、エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ３．２．１．９１及びＥ．Ｃ３．２．１．１５０）、ベータ－グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）又はそれらの組合せが挙げられる。セルロース分解性酵素活性を測定するための２つの基本的な手法は、（１）総セルロース分解性酵素活性を測定すること、及び（２）個々のセルロース分解性酵素活性（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びベータ－グルコシダーゼ）を測定すること（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２４：４５２－４８１に説明のとおり）を含む。全体的なセルロース分解性酵素活性は、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１フィルタ、結晶セルロース、細菌性セルロース、藻類のセルロース、綿、前処理されたリグノセルロースなどを含む不溶性基質を使用して測定され得る。最も一般的な全体的なセルロース分解活性アッセイは、基質としてＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１フィルタを使用するフィルタアッセイである。このアッセイは、国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）によって確立された（Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７－６８）。
セルロース分解性酵素活性は、以下の条件下：好適な温度（例えば、４０℃～８０℃、例えば４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃又は８０℃など）及び好適なｐＨ（例えば、４～９、例えば４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５又は９．０など）での、３～７日にわたる、前処理されたトウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）（又は他の前処理されたセルロース性材料）中のセルロースの１～５０ｍｇのセルロース分解性酵素タンパク質／ｇにおいて、セルロース分解性酵素タンパク質の添加なしの対照加水分解と比較して、セルロース分解性酵素によるセルロース材料の加水分解中の糖の産生／放出の増加を測定することによって決定され得る。典型的な条件は、１ｍｌの反応物、洗浄又は未洗浄ＰＣＳ、５％不溶性固体（乾燥重量）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５、１ｍＭのＭｎＳＯ４、５０℃、５５℃又は６０℃で７２時間、ＡＭＩＮＥＸ（登録商標）ＨＰＸ－８７Ｈカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）による糖分析である。
エンドグルカナーゼ：用語「エンドグルカナーゼ」とは、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロースなど）、リケニン、穀物のベータ－Ｄ－グルカン又はキシログルカン等の混合ベータ－１，３グルカン中のベータ－１，４結合及びセルロース系構成成分を含む他の植物材料中の１，４－ベータ－Ｄ－グリコシド連結のエンド加水分解を触媒するエンド－１，４－（１，３；１，４）－ベータ－Ｄ－グルカン４－グルカノヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）を意味する。エンドグルカナーゼ活性を、還元糖アッセイにより決定される基質粘度の低下又は還元末端の増加を測定することにより決定し得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ２４：４５２－４８１）。本発明の目的のために、ｐＨ５、４０℃において、Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７－２６８の手順に従って基質としてカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を使用して、エンドグルカナーゼ活性を決定する。
ファミリー６１グリコシドヒドロラーゼ：「ファミリー６１グリコシドヒドロラーゼ」、又は「ファミリーＧＨ６１」、又は「ＧＨ６１」という用語は、Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，１９９１，Ａ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８０：３０９－３１６及びＨｅｎｒｉｓｓａｔ ａｎｄ Ｂａｉｒｏｃｈ，１９９６，Ｕｐｄａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６：６９５－６９６に従い、グリコシドヒドロラーゼファミリー６１に分類されるポリペプチドを意味する。このファミリーにおける酵素は、１ファミリーメンバーの非常に弱いエンド－１，４－ベータ－Ｄ－グルカナーゼ活性の測定に基づくグリコシドヒドロラーゼファミリーとして元来分類されていた。これらの酵素の作用の構造及び様式は、非規範的であり、それらは、真正グリコシダーゼと見なすことができない。しかしながら、セルラーゼ又はセルラーゼの混合物と併せて使用される場合、リグノセルロースの分解を増強するそれらの能力に基づくＣＡＺｙ分類に保たれる。ＧＨ６１ポリペプチドは、最近では、溶解多糖モノオキシゲナーゼと分類されており（Ｑｕｉｎｌａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ２０８：１５０７９－１５０８４；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．，２０１１，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：１３９９－１４０６；Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０：１０５１－１０６１）、「副次的活性９」又は「ＡＡ９」ポリペプチドと呼ばれている。
加水分解酵素又はヒドロラーゼ／ヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド：「加水分解酵素」とは、水を使用して基質を分解する任意の触媒タンパク質を指す。加水分解酵素には、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端アルファ－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ）；ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端ベータ－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ）、セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、ベータ－グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、ベータ－キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）が挙げられる。
キシラナーゼ／キシラナーゼ活性を有するポリペプチド：用語「キシラナーゼ」とは、キシラン中の１，４－ベータ－Ｄ－キシロシド連結のエンド加水分解を触媒する１，４－ベータ－Ｄ－キシラン－キシロヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）を意味する。キシラナーゼ活性を、３７℃において、０．０１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ－１００及び２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６中の基質としての０．２％のＡＺＣＬ－アラビノキシランにより決定し得る。１単位のキシラナーゼは、２００ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６中の基質としての０．２％のＡＺＣＬ－アラビノキシランから、３７℃、ｐＨ６で１分当たりに生成された１．０μモルのアズリンとして定義される。キシラナーゼは、例えば、ＧＨ５、ＧＨ８、ＧＨ３０、ＧＨ１０及びＧＨ１１ファミリーに見出すことができる。
ＧＨ５ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー５のメンバーに分類される。
ＧＨ８ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー８のメンバーに分類される。
ＧＨ３０ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー３０のメンバーに分類される。
ＧＨ１０ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺｙｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）のデータベースにおいて、グリコシドヒドロラーゼファミリー１０のメンバーに分類される。（Ｌｏｍｂａｒｄ，Ｖ．；Ｇｏｌａｃｏｎｄａ Ｒａｍｕｌｕ，Ｈ．；Ｄｒｕｌａ，Ｅ．；Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．；Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．（２１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１３）．”Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）ｉｎ ２０１３”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４２（Ｄ１）：Ｄ４９０－Ｄ４９５；Ｃａｎｔａｒｅｌ ＢＬ，Ｃｏｕｔｉｎｈｏ ＰＭ，Ｒａｎｃｕｒｅｌ Ｃ，Ｂｅｒｎａｒｄ Ｔ，Ｌｏｍｂａｒｄ Ｖ，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ Ｂ（Ｊａｎｕａｒｙ ２００９）．“Ｔｈｅ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺｙｍｅｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）：ａｎ ｅｘｐｅｒｔ ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｆｏｒ Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ”．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２３３－８）。
ＧＨ１１ポリペプチドは、酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー１１のメンバーに分類される。
ＧＨ６２ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー６２のメンバーに分類される。
ＧＨ４３ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ｅｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー４３のメンバーに分類される。
ＧＨ５１ポリペプチド：酵素活性を有するポリペプチドを指し、このポリペプチドは、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ ＥｎＺＹｍｅｓ（ＣＡＺｙｍｅｓ）のデータベースにおいてグリコシドヒドロラーゼファミリー５１のメンバーに分類される。
他の定義：
これに関連して、用語は、当業者にとって通常のように使用される。これらの用語のいくつかを以下で説明する。
接触時間：１つ以上の酵素が基質と反応するために、この１つ以上の酵素は、この基質と接触しなければならない。「接触時間」とは、１つ以上の酵素の有効量が基質塊の少なくとも一部と接触する期間を指す。酵素は、接触時間中に全ての基質塊と接触しなくてもよいが、１つ以上の酵素を基質塊と混合することで接触時間中に基質塊の一部が酵素触媒加水分解されるようにする。
トウモロコシ穀粒：様々なトウモロコシ穀粒が既知であり、例えばデントコーン、フリントコーン、ポッドコーン、縞模様トウモロコシ、スイートコーン、ワキシーコーン及び同類のものが挙げられる。
いくつかのトウモロコシ穀粒は、穀粒中の胚芽を保護する「果皮」と称される外被を有する。果皮は、水及び水蒸気に抵抗し、昆虫及び微生物にとって望ましくない。「果皮」によって被覆されていない穀粒の唯一の領域は、「尖帽部」であり、これは、穀粒の穂軸への付着点である。
トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒の画分：この用語は、湿潤製粉のプロセスを経たトウモロコシ穀粒を説明するために使用される。トウモロコシ穀粒が分解され加工される際にこの用語が使用される場合、トウモロコシ穀粒の全ての分画された部分が包含されると見なされる。この用語は、例えば、浸漬穀粒、粉砕穀粒、トウモロコシ穀粒塊、第１の画分、第２の画分、トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分等を含む。
トウモロコシ穀粒塊：好ましくは、繊維、グルテン及びデンプンを含む塊に言及するために使用され、好ましくは作物の穀粒に蒸気を当てて粉砕し、胚から、繊維、グルテン及びデンプンを含む塊を分離することにより得られる。トウモロコシ穀粒塊が繊維洗浄を経ると、第１の画分（ｓ）及び第２の画分（ｆ）を含むいくつかの画分に分離される。したがって、「トウモロコシ穀粒塊の画分」及び「トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分」とは、とりわけ、これら第１の画分（ｓ）及び第２の画分（ｆ）を指す。
ｃＤＮＡ：用語「ｃＤＮＡ」とは、真核細胞又は原核細胞から得られた成熟してスプライシングされたｍＲＮＡ分子からの逆転写により調製され得るＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在し得るイントロン配列を欠いている。最初の一次ＲＮＡ転写物は、成熟してスプライシングされたｍＲＮＡとして現れる前にスプライシングを含む一連の工程により加工されているｍＲＮＡの前駆体である。
コード配列：用語「コード配列」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接指定するポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は、一般に、ＡＴＧ、ＧＴＧ又はＴＴＧなどの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ又はＴＧＡなどの停止コドンで終わるオープンリーディングフレームによって決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそれらの組合せであり得る。
制御配列：用語「制御配列」とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって、天然（即ち同一遺伝子に由来）若しくは異種（即ち異なる遺伝子に由来）であり得るか、又は互いに天然若しくは異種であり得る。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナルペプチド配列及び転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列としては、プロモータ並びに転写停止シグナル及び翻訳停止シグナルが挙げられる。制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的でリンカーを備え得る。
発現：用語「発現」とは、ポリペプチドの生成に関与するあらゆる工程（例えば、限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変及び分泌）を含む。
発現ベクター：用語「発現ベクター」とは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む直鎖状又は環状のＤＮＡ分子であって、この分子の発現をもたらす制御配列に作動可能に連結されている直鎖状又は環状のＤＮＡ分子を意味する。
断片：用語「断片」とは、成熟型ポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に１つ以上（例えば、いくつか）のアミノ酸が存在しないポリペプチドを意味し、断片は、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒することができる酵素活性、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性又はチオレドキシンペプチド活性を有する。一実施形態では、断片は、ＰｆａｍファミリーＰｆ０００８５に属する少なくとも１つのチオレドキシンドメインを含む。
胚：「胚」とは、トウモロコシ穀粒の唯一生きている部分である。胚は、穀粒がトウモロコシ植物に成長するのに不可欠な遺伝情報、酵素、ビタミン及びミネラルを含有する。黄色デントコーンでは、胚芽の約２５パーセントがコーンオイルである。胚芽に被覆され又は取り囲まれている内胚乳は、穀粒乾燥重量の約８２パーセントを構成し、発芽種子のエネルギー源（デンプン）及びタンパク質源である。内胚乳には、軟質及び硬質の２種類がある。硬質内胚乳では、デンプンは、密に詰まっている。軟質内胚乳では、デンプンは、ほぐれている。
グルテン：グルテンは、２つのより小さいタンパク質であるグルテニン及びグリアジンで構成されるタンパク質である。本明細書において、「グルテン」とは、トウモロコシ穀粒に見られるタンパク質の大部分を指す。特定の実施形態では、グルテンは、不溶性タンパク質（主にアルファゼイン、ベータゼイン及びガンマゼインからなる）を指す。トウモロコシ湿潤製粉からのグルテンの主な製品は、コーングルテンミール（およそ６０％のタンパク質）及びコーングルテンフィード（およそ２０％のタンパク質）である。
粉砕又は粉砕すること：用語「粉砕すること」とは、トウモロコシ穀粒をより小さい構成成分に分解することを指す。
異種：宿主細胞に対する用語「異種」とは、宿主細胞で天然に存在しないポリペプチド又は核酸を意味する。ポリペプチド又は核酸に対する用語「異種」とは、制御配列、例えばプロモータ又はポリペプチド若しくは核酸のドメインがポリペプチド又は核酸に天然に結合しないこと、即ち、制御配列が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号５の成熟型ポリペプチドをコードする遺伝子以外の遺伝子に由来するものであることを意味する。
宿主細胞：用語「宿主細胞」とは、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」とは、複製中に生じる突然変異に起因して親細胞と同一ではない、親細胞のあらゆる子孫を包含する。
単離された：用語「単離された」とは、ポリペプチド、核酸、細胞又は自然界に見出されるものとしてそれが自然に関連する少なくとも１つの他の材料若しくは構成成分から分離された他の特定の材料若しくは成分を意味し、限定されないが、例えば他のタンパク質、核酸、細胞などが含まれる。単離ポリペプチドは、分泌ポリペプチドを含む培養ブロスを含むが、これに限定されない。
インキュベーション時間：繊維洗浄中、トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分が、スクリーニングされることなく加水分解酵素と接触している時間である。
多くの好ましい実施形態では、本発明による方法は、材料が酵素によって「影響を受ける」空間（Ｖ）又は「インキュベータ」を含むシステムを利用し、そのような状況では、インキュベーション時間は、以下によって決定され得る。
代わりに、インキュベータへの流入が単位時間当たりの容積で表される場合、
である。
成熟型ポリペプチド：用語「成熟型ポリペプチド」とは、Ｎ末端プロセシング（例えば、シグナルペプチドの除去）後のその成熟した形態のポリペプチドを意味する。
一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２１～５１６である。
一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２１～５１３である。
一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸２１～５１６である。
一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２１～５１７である。
一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１～１１０である。
成熟型ポリペプチドコード配列：用語「成熟型ポリペプチドコード配列」とは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性又はチオレドキシン活性を有する成熟型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。一態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号６のヌクレオチド６１～３６２、４１９～７９７、８６８～１３０７及び１３６３～１７３２である。別の態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号７のヌクレオチド６１～３６２、４２７～８０５、８７７～１３１６、１３７２～１７４４である。一態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号２０のヌクレオチド６１～１５４８である。一態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号２１のヌクレオチド６１～１５３９である。一態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号２２のヌクレオチド６１～１５４８である。一態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号２３のヌクレオチド６１～１５５１である。一態様では、成熟型ポリペプチドコード配列は、配列番号２４のヌクレオチド１～３３０である。
天然：用語「天然」とは、宿主細胞に天然に存在する核酸又はポリペプチドを意味する。
製粉装置：「製粉装置」は、製粉機により使用される全ての装置を指す。湿潤製粉プロセスは、使用可能な製粉装置に応じて異なる。製粉装置の例は、浸漬タンク、エバポレータ、スクリュープレス、ローターリ乾燥機、脱水スクリーン、遠心分離機、ハイドサイクロン等であり得る。各製粉装置／製粉ラインのサイズ及び数は、製粉機によって変動し得、これは、製粉プロセスに影響を及ぼすであろう。例えば、繊維洗浄スクリーンユニットの数は、変動し得、遠心分離機のサイズについても同様である。
核酸構築物：用語「核酸構築物」とは、単鎖又は二重鎖のいずれかの核酸分子を意味し、これは、天然の遺伝子から単離されているか、又はそうでなければ自然に存在しないように核酸のセグメントを含有するよう修飾されているか若しくは１つ以上の制御配列を含む合成物である。
作動可能に連結される：用語「作動可能に連結される」とは、制御配列がコード配列を発現させるように、ポリヌクレオチドのコード配列と相対的に適切な位置に制御配列が位置する構造を意味する。
保持時間：１つ以上の加水分解酵素と、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒の一部とを繊維洗浄手順中に反応させる時間である。
いくつかの実施形態では、保持時間は、第１のスクリーンユニット（Ｓ１）に受け入れられたトウモロコシ穀粒塊及びその１つ以上の画分が、繊維洗浄システムを再び出る前に１つ以上の加水分解酵素の有効量と接触する期間である。保持時間中、トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分は、最上流スクリーンユニット（Ｓ１）からの第１の画分（ｓ１）の一部又は最下流スクリーンユニット（Ｓ４）からの第２の画分（ｆ４）の一部として繊維洗浄システムを出る前に、空間（Ｖ）内で１つ以上の加水分解酵素と共にインキュベートされる。
保持時間は、本発明に関連して定義されるように、好ましくは固形物が繊維洗浄システム中で費やす平均時間として推定され得る。これは、以下の関係によって推定され得る。
代わりに、システムへの流入が単位時間当たりの容積で表される場合、
である。
システムの容積は、典型的には、このシステム中の全ての空間の体積の合計と等しく設定されているが、このシステム中の管は、典型的には、小さく作られていることから、この管の体積を無視することが好ましい場合がある。
スクリーニングされた：用語「スクリーニングされた」又は「スクリーニング」とは、トウモロコシ穀粒塊の第１の画分ｓ及び第２の画分ｆへの分離のプロセスと、これらの画分の１つのスクリーンユニットから別への移動のプロセスとを指す。非スクリーニング時間は、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と酵素とのインキュベーションのために提供される非分離時間である。
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって説明される。
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくは、バージョン６．６．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３－４５３）を用いて、「最長の同一性」の出力として決定される。使用されるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅプログラムが最長の同一性を報告するために、－ｎｏｂｒｉｅｆオプションをコマンドラインに指定しなければならない。「最長の同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力は、以下のとおりに計算される：
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの合計数）。
本発明の目的では、２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性は、好ましくは、バージョン６．６．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ；Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記参照）のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているような、ニードルマン－ブンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記参照）を用いて、「最長の同一性」の出力として決定される。使用されるパラメータは、ギャップ開始ペナルティが１０、ギャップ伸長ペナルティが０．５及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅプログラムが最長の同一性を報告するために、ｎｏｂｒｉｅｆオプションをコマンドラインに指定しなければならない。「最長の同一性」と標識されたＮｅｅｄｌｅの出力は、以下のとおりに計算される：
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント中のギャップの総数）。
デンプン：用語「デンプン」とは、アミロース及びアミロペクチンからなり、（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｎとして表され、ここで、ｎが任意の数である、貯蔵顆粒の形態で植物組織に広く存在するグルコース単位から構成される植物の複合多糖類からなる任意の材料を意味する。
浸漬する（ｓｔｅｅｐｉｎｇ）又は浸漬する（ｓｏａｋｉｎｇ）：用語「浸漬する」とは、作物の穀粒を水及び任意選択的にＳＯ２に浸漬させることを意味する。
トウモロコシ湿潤製粉プロセスからのデンプン及びグルテンの収量を改善する方法を提供することが本発明の目的である。
特に、本発明の目的は、粉砕トウモロコシ穀粒又は粉砕穀粒の一部、特に繊維豊富画分を、有効量の、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒するポリペプチドと接触させることにより、湿潤製粉プロセスでトウモロコシ穀粒から得ることができるデンプン及び／又はグルテン収量を改善する方法を提供することである。一実施形態では、ポリペプチドは、ＰｆａｍファミリーＰｆ０００８５に属する少なくともＰｆａｍファミリードメインを含む。このようなポリペプチドは、チオレドキシンポリペプチドとしても知られている。特定の実施形態では、Ｐｆ０００８５ドメインを含むポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である。チオレドキシンポリペプチド又はＰＤＩの効果は、少なくともキシラナーゼ及び／又はセルラーゼ並びに有効量のＳＯ２の存在によって更に改善され得、これは、繊維からの結合デンプン及びグルテンの放出を更に増加させ、したがって得ることができるデンプン及び／又はグルテンの収量を改善する。
湿潤製粉プロセス：
トウモロコシ穀粒を湿潤製粉して、この穀粒を開いて以下の４つの主成分に分離する：デンプン、胚、繊維及びグルテン。
湿潤製粉プロセスは、製粉機毎に有意に変動し得るが、従来の湿潤製粉は、通常、以下の工程を含む。
１．浸漬させる工程、
２．粉砕する工程、
３．（ｉ）胚、並びに（ｉｉ）繊維、デンプン及びグルテンを含む流れに分離する工程、
４．微粉砕する工程、
５．繊維を洗浄し、圧搾し、乾燥させる工程、
６．デンプン／グルテン分離の工程、及び
７．デンプンを洗浄する工程。
浸漬、粉砕及び胚の分離
トウモロコシ穀粒を約５０℃（例えば、約４５℃～６０℃）の温度において約３０分間～約４８時間（好ましくは３０分間～約１５時間、例えば約１時間～約６時間など）にわたり水中に浸漬させることにより軟化させる。浸漬中、この穀粒は、水を吸収し、その水分レベルは、１５パーセントから４５パーセントに上昇し、サイズが２倍超になる。この水への例えば０．１パーセントの二酸化硫黄（ＳＯ２）及び／又はＮａＨＳＯ３の任意選択的な添加により、暖かい環境での過度の細菌増殖が防止される。トウモロコシが膨らんで柔らかくなると、浸漬水の弱酸性がトウモロコシ内のグルテン結合を緩め始め、デンプンが放出される。トウモロコシ穀粒が浸漬した後、通常、過程の粉砕工程により、トウモロコシ穀粒を割って胚を放出させる。胚は、コーンオイルを含有する。この胚を、本質的に、厳密に制御された条件下において、他の物質を含まない胚セグメントを「浮遊させる」ことにより、デンプン、グルテン及び繊維の高密度混合物から分離する。この方法は、後の加工工程における微量のコーンオイルのいかなる悪影響も排除するのに役立つ。その後、胚を乾燥させて油を抽出し得る。胚を分離した後、繊維、デンプン及びグルテン（タンパク質）を含む粉砕された粉砕穀粒塊を、通常、微粉砕工程に供する。
繊維を洗浄し、圧搾し、乾燥させる工程
最終製品中の任意の繊維を最小限に抑えながら、最大のデンプン及びグルテンの回収率を得るために、加工中に遊離デンプン及びグルテンを繊維から洗い流す必要がある。したがって、微粉砕穀粒塊を繊維洗浄手順に供する。それにより、遊離したデンプン及びグルテンがスクリーニング（洗浄）中に繊維から分離され、製粉デンプンとして収集される。次いで、残存する繊維を圧搾して、含水量を減少させる。
最終製品中の任意の繊維を最小限に抑えながら、最大のデンプン及びグルテンの回収量を得るために、加工中に遊離デンプン及びグルテンを繊維画分から洗い流す必要がある。繊維は、典型的には、浸漬させ、粉砕し、且つトウモロコシ穀粒からの胚の分離後に収集し、スラリー化し、次いでスクリーニングして、トウモロコシ穀粒塊中の任意の残余デンプン又はグルテンを再利用する。このプロセスは、本明細書では、繊維洗浄手順／工程と称される。
デンプングルテンの分離
製粉デンプンと称される、繊維洗浄工程からのデンプン－グルテン懸濁液は、デンプン及びグルテンに分離される。グルテンは、デンプンと比較して密度が低い。製粉デンプンを遠心分離機に通過させることにより、グルテンは、容易に遠心脱水される、
デンプンの洗浄
デンプン分離工程からのデンプンスラリーは、いくらかの不溶性タンパク質及び多くの可溶性物質を含む。最高品質のデンプン（高純度デンプン）を製造する前に、それらを除去する必要がある。わずかに１又は２パーセントのタンパク質が残存しているデンプンを希釈し、８～１４回洗浄し、再希釈し、ハイドロクロンで再度洗浄して最後の微量のタンパク質を除去し、高品質のデンプン（典型的には９９．５％超の純度）を生成する。
湿潤製粉の生成物：湿潤製粉を使用して、コーンスティープリカー、コーングルテンフィード、胚、コーンオイル、コーングルテンミール、コーンスターチ、変性コーンスターチ、コーンシロップなどのシロップ及びコーンエタノールを生成し得るが、これらに限定されない。
本発明の一態様は、湿潤製粉プロセスにおいてトウモロコシ穀粒から得ることができる総デンプン収量及び／又は総グルテン収量を増加させる方法であって、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒の画分を、有効量の、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒するポリペプチドを含む酵素組成物と混合することを含む方法を提供する。一実施形態では、ポリペプチドは、ＰｆａｍファミリーＰｆ０００８５に属する少なくともＰｆａｍファミリードメインを含む。このようなポリペプチドは、チオレドキシンポリペプチドとしても知られている。特定の実施形態では、Ｐｆ０００８５ドメインを含むポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）である。少なくとも１つのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はチオレドキシンポリペプチドは、任意選択的に、１つ以上の加水分解酵素と組み合わされ得、前記加水分解酵素の少なくとも１つは、キシラナーゼポリペプチド及び／若しくはセルラーゼポリペプチド又はそれらの組合せからなる群から選択される。アラビノフラノシダーゼなどの他の加水分解酵素も添加し得る。好ましい実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒の画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供する工程中、前記タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はチオレドキシンペプチド、任意選択的に１つ以上の加水分解酵素と混合される。
トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分中のデンプン及び／又はグルテンの一部は、繊維画分に結合され得、且つ湿潤製粉プロセス中に決して放出されなくてもよい。しかしながら、トウモロコシ穀粒に存在する基質を、水を使用して分解し得る任意の触媒タンパク質が含まれ得る加水分解酵素の添加は、結合デンプン及び／又はグルテンの一部を放出し得、したがって湿潤製粉プロセスにおけるデンプン及び／又はグルテンの総収量が増加される。
本発明者らは、驚くべきことに、粉砕トウモロコシ穀粒塊又は粉砕穀粒の一部、特に繊維豊富画分を有効量のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）又はチオレドキシンと接触させることにより、粉砕トウモロコシ穀粒からのデンプン及びグルテンの放出を増加させ得ることを見出した。ＰＤＩ、キシラナーゼ、セルラーゼ及びＳＯ２を併用することにより、ＰＤＩの効果を更に増強することができる。
したがって、第１の態様では、本発明は、湿潤製粉プロセスにおいてトウモロコシ穀粒からのデンプン収量及び／又はグルテン収量を増加させる方法であって、粉砕トウモロコシ穀粒又は粉砕穀粒の画分、特に繊維豊富画分を、有効量の、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒するポリペプチド、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）又はチオレドキシンペプチドと接触させることを含む方法に関する。
一実施形態では、本発明の方法は、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドが存在しない／添加されないプロセスと比較して、湿潤製粉プロセス中に繊維から放出されるデンプン及び／又はグルテンの量の増加をもたらす。
別の実施形態では、本発明の方法は、浸漬時間及びＳＯ２添加の減少をもたらす。
湿潤製粉プロセスで用いられる特定の手順及び装置は、変動し得るが、工程の主な原理は、同じままである（湿潤製粉プロセスの説明を参照されたい）。
一実施形態では、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、特に繊維洗浄工程中に存在する／繊維画分に添加される。
特定の一実施形態では、本発明の方法は、
ａ）トウモロコシ穀粒を水に浸漬させて、浸漬穀粒を生成する工程と、
ｂ）浸漬穀粒を粉砕して、粉砕穀粒を生成する工程と、
ｃ）粉砕穀粒から胚を分離して、繊維、デンプン及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を生成する工程と、
ｄ）トウモロコシ穀粒塊、特に微細繊維画分などの繊維豊富画分を繊維洗浄手順に供し、繊維からデンプン及びグルテンを分離する工程と
を含み、少なくともＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、工程ｄ）前又は中に存在する／添加される。
一実施形態では、上記方法は、
ｅ）グルテンからデンプンを分離する工程と、任意選択的に、
ｆ）デンプンを洗浄する工程と
を更に含む。
本発明の方法の一実施形態では、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、繊維洗浄中、少なくとも１０μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも２５μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも５０μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも７５μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも１００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも２００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも３００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも５００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、例えば１０～２０００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、２５～１０００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、５０～８００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、１００～５００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳの範囲の量で存在する／添加される。
本発明によれば、繊維洗浄工程中の加水分解酵素の効果を最大にするために、有効量のＳＯ２が繊維洗浄中に存在する。
一実施形態では、ＳＯ２は、繊維洗浄中、少なくとも２００ｐｐｍ、少なくとも３００ｐｐｍ、少なくとも４００ｐｐｍ、少なくとも４５０ｐｐｍ、少なくとも５００ｐｐｍ、少なくとも６００ｐｐｍ、少なくとも７００ｐｐｍ、少なくとも８００ｐｐｍの量で存在する／添加される。
別の実施形態では、ＳＯ２は、繊維洗浄中、２００～３０００ｐｐｍ、３００～２０００ｐｐｍ、４００～８００ｐｐｍの範囲の量で存在する／添加される。
本発明にかかる方法では、更なる酵素活性をＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドと組み合わせて有利に添加し得る。したがって、本発明の更なる実施形態は、有効量の１つ以上の加水分解酵素が繊維洗浄工程前又は中に存在し／添加され、前記加水分解酵素の少なくとも１つがキシラナーゼ及び／又はセルラーゼから選択される、方法に関する。
キシラナーゼは、一実施形態では、ＧＨ５ポリペプチド、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ１０ポリペプチド、ＧＨ１１ポリペプチド、ＧＨ８ポリペプチド又はそれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態では、加水分解酵素は、１つ以上のセルラーゼを含む。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）からなる群から選択される１つ以上の酵素を含む。
一実施形態では、セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む。
別の実施形態では、加水分解酵素は、アラビノフラノシダーゼを含む。
アラビノフラノシダーゼは、一実施形態では、ＧＨ４３ポリペプチド、ＧＨ６２ポリペプチド及びＧＨ５１ポリペプチドからなる群から選択され得る。
本発明の方法の特定の一実施形態では、工程ｃ）からの繊維、デンプン及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊は、工程ｄ）での繊維洗浄手順前に更なる粉砕工程、好ましくは微粉砕工程に供される。
繊維洗浄手順で使用される特定の装置は、変動し得るが、プロセスの主な原則は、同じままである。国際公開第２０１８／０５３２２０号パンフレットは、専用の酵素インキュベーション空間／タンクを含む繊維洗浄システムについて記載している。本開示及び当業者の一般知識に基づいて、加水分解酵素が機能するのに十分なインキュベーション時間をもたらす繊維洗浄システムを設計することが可能であろう。一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分、例えば繊維豊富画分は、前記１つ以上の加水分解酵素と、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも１５分間反応される。
一実施形態では、前記繊維洗浄手順は、１つ以上の加水分解酵素の導入のために最適化された繊維洗浄システムの使用を含み、繊維洗浄システムは、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも３５分間及び４０時間未満、３６時間未満、３０時間未満、２４時間未満、２０時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満など、４８時間未満の繊維洗浄システム中の総反応時間（保持時間）を提供するように構成された空間（Ｖ）を含む。一実施形態では、繊維洗浄システム中の総保持時間は、３５分間～４８時間、例えば３５分間～２４時間、３５分間～１２時間、３５分間～６時間、３５分間～５時間、３５分間～４時間、３５分間～３時間、３５分間～２時間、４５分間～４８時間、４５分間～２４時間、４５分間～時間、４５分間～６時間、４５分間～５時間、４５分間～４時間、４５分間～３時間、４５分間～２時間、１～４８時間、１～２４時間、１～１２時間、１～６時間、１～５時間、１～４時間、１～３時間、１～２時間などである。
一実施形態では、繊維洗浄システムは、
－ 向流洗浄構成で流体連結されている複数のスクリーンユニット（Ｓ１．．．Ｓ４）であって、各スクリーンユニットは、トウモロコシ穀粒塊と液体との流れを２つの画分：第１の画分（ｓ）及び第２の画分（ｆ）に分離するように構成され、第２の画分（ｆ）は、第１の画分（ｓ）を上回る、重量％で測定された量の繊維を含有する、複数のスクリーンユニット（Ｓ１．．．Ｓ４）、
－ システム内に配置され、且つ前記第１の画分（ｓ）、前記第２の画分（ｆ）又は混合された第１及び第２の画分（ｓ、ｆ）、好ましくは第２の画分（ｆ）のみを受け入れるように流体連結され、及び空間内に受け入れられた一方又は両方の画分に対してインキュベーション時間を提供するように構成され、且つそれによりインキュベートされた一方又は両方の画分を下流のスクリーンユニット（Ｓ４）に排出する空間（Ｖ）
を含み、システムは、
－ トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流スクリーンユニット（Ｓ１）に注入すること、
－ 最上流スクリーンユニット（Ｓ１）からの第１の画分（ｓ１）を、デンプンを含有する生成物流として排出すること、
－ プロセス水を注入することであって、好ましくはプロセス水を最下流スクリーンユニット（Ｓ４）に注入するように配置される、注入すること、
－ 最下流スクリーンユニット（Ｓ４）から、第２の画分（ｆ４）を、最初のトウモロコシ穀粒塊を下回る量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として排出すること、
－ システムに加水分解酵素を導入すること
を行うように構成される。
一実施形態では、繊維洗浄システム内に構成された前記空間（Ｖ）内のインキュベーション時間は、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも５分間及び４０時間未満、３６時間未満、３０時間未満、２４時間、２０時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満など、４８時間未満である。
一実施形態では、前記空間（Ｖ）内のインキュベーション時間は、３５分間～４８時間、例えば３５分間～２４時間、３５分間～時間、３５分間～６時間、３５分間～５時間、３５分間～４時間、３５分間～３時間、３５分間～２時間、４５分間～４８時間、４５分間～２４時間、４５分間～１２時間、４５分間～６時間、４５分間～５時間、４５分間～４時間、４５分間～３時間、４５分間～２時間、１～４８時間、１～２４時間、１～１２時間、１～６時間、１～５時間、１～４時間、１～３時間、１～２時間などである。
一実施形態では、前記空間（Ｖ）内のインキュベーション温度は、２５～９５℃、例えば２５～９０℃、２５～８５℃、２５～８０℃、２５～７５℃、２５～７０℃、２５～６５℃、２５～６０℃、２５～５５℃、２５～５３℃、２５～５２℃、３０～９０℃、３０～８５℃、３０～８０℃、３０～７５℃、３０～７０℃、３０～６５℃、３０～６０℃、３０～５５℃、３０～５３℃、３０～５２℃、３５～９０℃、３５～８５℃、３５～８０℃、３５～７５℃、３５～７０℃、３５～６５℃、３５～６０℃、３５～５５℃、３５～５３℃、３５～５２℃、３９～９０℃、３９～８５℃、３９～８０℃、３９～７５℃、３９～７０℃、３９～６５℃、３９～６０℃、３９～５５℃、３９～５３℃、３９～５２℃、例えば４６～５２℃である。
更に、空間の寸法（ｍ３）は、好ましくは、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間、少なくとも１２０分間などの少なくとも５分間のインキュベーション時間を提供するように構成される。
インキュベーションのために指定された空間（Ｖ）は、好ましくは、少なくとも３０ｍ３、少なくとも４０ｍ３、少なくとも５０ｍ３、少なくとも６０ｍ３、少なくとも７０、ｍ３、少なくとも８０、ｍ３、少なくとも９０、ｍ３、少なくとも１００ｍ３、少なくとも１１０ｍ３、少なくとも１２０ｍ３、少なくとも１３０ｍ３、少なくとも１４０ｍ３、少なくとも１５０ｍ３、少なくとも１６０ｍ３、少なくとも１７０ｍ３、少なくとも１８０ｍ３、少なくとも１９０ｍ３、少なくとも２００ｍ３、少なくとも２１０ｍ３、少なくとも２２０ｍ３、少なくとも２３０ｍ３、少なくとも２４０ｍ３、少なくとも２５０ｍ３、少なくとも２６０ｍ３、少なくとも２７０ｍ３、少なくとも２８０ｍ３、少なくとも２９０ｍ３、少なくとも３００ｍ３、少なくとも４００ｍ３又は少なくとも５００ｍ３の体積を有する。インキュベーション時間は、総容積又は合わせた容積が少なくとも１００ｍ３、少なくとも１１０ｍ３、少なくとも１２０ｍ３、少なくとも１３０ｍ３、少なくとも１４０ｍ３、少なくとも１５０ｍ３、少なくとも１６０ｍ３、少なくとも１７０ｍ３、少なくとも１８０ｍ３、少なくとも１９０ｍ３、少なくとも２００ｍ３、少なくとも２１０ｍ３、少なくとも２２０ｍ３、少なくとも２３０ｍ３、少なくとも２４０ｍ３、少なくとも２５０ｍ３、少なくとも２６０ｍ３、少なくとも２７０ｍ３、少なくとも２８０ｍ３、少なくとも２９０ｍ３、少なくとも３００ｍ３、少なくとも４００ｍ３、少なくとも５００ｍ３である２つ以上の空間Ｖにおけるものでもあり得る。
インキュベーション時間中、空間Ｖに受け入れられた流体は、スクリーニングされないことが好ましい。したがって、空間Ｖを出る流体は、空間Ｖに受け入れられる流体と例えばデンプン及び繊維の同一組成を有するが、好ましくは繊維から放出されたより高い比率のデンプン及び／又はタンパク質を含有する。
酵素と繊維間の密着を確実にするために、ロータ又はインペラを含むことなどにより、前記空間Ｖに含有される物質の撹拌のために空間Ｖを構成することが好ましい場合がある。
空間Ｖが最上流スクリーンユニットＳ１の下流且つ前記最下流スクリーンユニットＳ４の上流に配置されることが好ましく、特に、空間Ｖは、最下流から２番目のスクリーンユニットＳ３に流体を供給するように配置される。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、ＥＣ５．３．４．１。
一実施形態では、ＰＤＩは、レドックスタンパク質のチオレドキシンスーパーファミリーに属する少なくとも１つの触媒ドメインを含み、このドメインは、ＣＸＸＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位を含む。
別の実施形態では、ＰＤＩは、少なくとも１つの非触媒ドメインによって分離されている、ＣＸＸＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位をそれぞれ含む２つの触媒ドメインを含む。
ＣＸＸＣモチーフは、特に、ＣＧＨＣ、ＣＴＨＣ、ＣＰＨＣ及びＣＳＭＣ、最もとりわけＣＧＨＣからなる群から選択される。
特定の実施形態では、チオレドキシンドメインは、ＰｆａｍファミリーＰｆ０００８５又はＰｆ１３８４８のいずれかに属する。
別の特定の実施形態では、ＰＤＩは、触媒活性ドメインがＰｆ０００８５で示される、３ドメイン構造Ｐｆ０００８５－Ｐｆ１３８４８－Ｐｆ０００８５を含む。
チオレドキシンペプチド
一実施形態では、チオレドキシンは、システインチオール－ジスルフィド交換による他のタンパク質の還元を促進することによって抗酸化剤として作用するタンパク質である。それらは、タンパク質ジスルフィド結合の還元を触媒することができる酵素である。別の実施形態では、チオレドキシンペプチドは、活性部位モチーフＣＸＸＣ、特にＣＧＰＣを含む。チオレドキシンタンパク質は、チオレドキシンフォールドと称される特徴的な三次構造も有する。したがって、本発明によれば、チオレドキシンペプチドは、レドックスタンパク質のチオレドキシンスーパーファミリーのメンバーであり、典型的にはＣＸＸＣ、好ましくはＣＧＰＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位を含む触媒ドメインを含む。チオレドキシンドメインは、ＰｆａｍファミリーＰｆ０００８５に属する（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／ｆａｍｉｌｙ／Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）。
ＰＤＩ又はＴｒｘに加えて本発明の方法に適した加水分解酵素
一実施形態では、本発明の方法での使用に好適な加水分解酵素は、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端アルファ－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端ベータ－Ｌ－アラビノフラノシダーゼ）、セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、ベータ－グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、ベータ－キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）及びプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ３．４）からなる群から選択される１つ以上の酵素を含む。
好ましくは、酵素は、キシラナーゼ及び／又はセルラーゼから選択される。
一実施形態では、キシラナーゼは、ＧＨ５ポリペプチド、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ１０ポリペプチド、ＧＨ１１ポリペプチド、ＧＨ８ポリペプチド又はそれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態では、加水分解酵素は、１つ以上のセルラーゼを含む。セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）及びセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）からなる群から少なくとも選択され得る。より具体的には、セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ又はそれらの組合せからなる群から選択される、１つ以上の酵素を含む。
一実施形態では、加水分解酵素は、アラビノフラノシダーゼを更に含む。アラビノフラノシダーゼは、ＧＨ４３ポリペプチド、ＧＨ６２ポリペプチド、ＧＨ５１ポリペプチドからなる群から選択され得る。特に、ＧＨ６２ポリペプチドである。
一実施形態では、１つ以上の加水分解酵素は、セルラーゼバックグラウンドを有する生物（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）など）において発現される。これらの実施形態によれば、本発明に従って定義されているキシラナーゼ及び又はアラビノフラノシダーゼポリペプチドは、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来の内在性セルラーゼと一緒に発現される。
一実施形態では、１つ以上の加水分解酵素を含む酵素組成物は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｕｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来するセルラーゼを含み得る。
特定の一実施形態では、セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）バックグラウンドセルラーゼに由来し、且つアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に由来するＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ ＩＩを有する。
一実施形態では、セルラーゼ酵素組成物は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ（国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－グルコシダーゼバリアント（国際公開第２０１２／０４４９１５号パンフレット）及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）（エメルソニイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチド（国際公開第２０１１／０４１３９７号パンフレット）を含有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼ調製物を有する、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ１０キシラナーゼ（国際公開第２００６／０７８２５６号パンフレット）及びアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－キシロシダーゼ（国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）を含み、エンドグルカナーゼ活性は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼから提供される。
別の特定の実施形態では、セルラーゼ酵素組成物は、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ（国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ（国際公開第２０１１／０５７１４０号パンフレット）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－グルコシダーゼバリアント（国際公開第２０１２／０４４９１５号パンフレット）及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）（エメルソニイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチド（国際公開第２０１１／０４１３９７号パンフレット）を含有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼ調製物を含み、エンドグルカナーゼ活性は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼから提供される。
一実施形態では、１つ以上の加水分解酵素は、精製される。精製された酵素は、本発明の他の実施形態に記載される酵素組成物で使用され得る。
一実施形態では、１つ以上の加水分解酵素は、液体組成物である。この組成物は、同種又は異種であり得る。
一実施形態では、１つ以上の加水分解酵素は、固体組成物である。
一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分と混合される１つ以上の加水分解酵素の有効量は、湿潤製粉プロセスに入る０．００５～０．５ｋｇの酵素タンパク質（ＥＰ）／メートルトン（ＭＴ）トウモロコシ穀粒であり、例えば０．０１０～０．５ｋｇ ＥＰ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、例えば０．０５～０．５ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０７５～０．５ｋｇ／ＭＴ、又は０．１～０．５ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．００５～０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０１～０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０５～０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０７５～０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．１～０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．００５～０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０１～０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０５～０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０７５～０．３ｋｇ／ＭＴ、又は０．１～０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．００５～０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０１０～０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０５～０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒、又は０．０７５～０．２ｋｇ／ＭＴ、又は０．１～０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、又は例えば０．０７５～０．１０ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、又は０．０７５～０．１１ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒である。
好ましい実施形態では、酵素組成物は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の培養物（例えば、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ ２６９２１の培養物など）から得られるセルラーゼを含む。例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ製の商品名Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）などの好適なセルラーゼが利用可能である。
キシラナーゼ活性を有するポリペプチド
キシラナーゼは、本発明にかかる方法に適用するのに適している。キシラナーゼポリペプチドは、ＧＨ５、ＧＨ１０、ＧＨ３０、ＧＨ１１及びＧＨ８ファミリーから選択され得る。
より具体的な実施形態は、ＧＨ５キシラナーゼ酵素が、
（ａ）配列番号８の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号８の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、本発明にかかる方法に関する。
成熟型ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号８のアミノ酸１～５５１である。
別の特定の実施形態は、ＧＨ５キシラナーゼ酵素が、
（ａ）配列番号９の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号９の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、本発明にかかる方法に関する。
成熟型ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号９のアミノ酸１～５５１である。
別の特定の実施形態は、ＧＨ１０キシラナーゼが、
（ａ）配列番号１１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号１１の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、本発明にかかる方法に関する。
成熟型ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号１１のアミノ酸２１～４０５である。
別の特定の実施形態は、ＧＨ１０キシラナーゼが、
（ａ）配列番号１０の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号１０の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、本発明にかかる方法に関する。
成熟型ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号１０のアミノ酸２０～３１９である。
アラビノフラノシダーゼ活性を有するポリペプチド
別の特定の実施形態は、ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼが、
（ａ）配列番号１２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号１２の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）アラビノフラノシダーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、本発明にかかる方法に関する。
成熟型ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号１２のアミノ酸２７～３３２である。
別の特定の実施形態は、ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼが、
（ａ）配列番号１３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号１３の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）アラビノフラノシダーゼ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、本発明にかかる方法に関する。
成熟型ポリペプチドは、一実施形態では、配列番号１３のアミノ酸１７～３２５である。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）活性又はチオレドキシン活性を有するポリペプチド
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリペプチドに関し、好ましくは、ＰＤＩ活性は、配列番号１の成熟型ポリペプチドのＰＤＩ活性の少なくとも７５％、配列番号１の成熟型ポリペプチドの活性の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％である。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１の成熟型ポリペプチドと最大１０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸だけ異なる。
ポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列若しくはその成熟型ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなるか、又はＰＤＩ活性を有するその断片である。一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸２１～５１６である。
一実施形態では、ＰＤＩ活性を有するポリペプチドは、配列番号２０の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリペプチドに関し、好ましくは、ＰＤＩ活性は、配列番号２の成熟型ポリペプチドのＰＤＩ活性の少なくとも７５％、配列番号２の成熟型ポリペプチドの活性の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％である。一態様では、ポリペプチドは、配列番号２の成熟型ポリペプチドと最大１０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸だけ異なる。ポリペプチドは、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列若しくはその成熟型ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなるか、又はＰＤＩ活性を有するその断片である。一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２１～５１３である。
一実施形態では、ＰＤＩ活性を有するポリペプチドは、配列番号２１の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリペプチドに関し、好ましくは、ＰＤＩ活性は、配列番号３の成熟型ポリペプチドのＰＤＩ活性の少なくとも７５％、配列番号３の成熟型ポリペプチドの活性の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％である。一態様では、ポリペプチドは、配列番号３の成熟型ポリペプチドと最大１０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸だけ異なる。
ポリペプチドは、好ましくは、配列番号３のアミノ酸配列若しくはその成熟型ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなるか、又はＰＤＩ活性を有するその断片である。一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸２１～５１６である。
一実施形態では、ＰＤＩ活性を有するポリペプチドは、配列番号２２の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリペプチドに関し、好ましくは、ＰＤＩ活性は、配列番号４の成熟型ポリペプチドのＰＤＩ活性の少なくとも７５％、配列番号４の成熟型ポリペプチドの活性の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％である。一態様では、ポリペプチドは、配列番号４の成熟型ポリペプチドと最大１０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸だけ異なる。
ポリペプチドは、好ましくは、配列番号４のアミノ酸配列若しくはその成熟型ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなるか、又はＰＤＩ活性を有するその断片である。一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２１～５１７である。
一実施形態では、ＰＤＩ活性を有するポリペプチドは、配列番号２３の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態では、本発明は、チオレドキシンペプチド活性を有する配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製チオレドキシンポリペプチドに関し、好ましくは、チオレドキシン活性は、配列番号５の成熟型ポリペプチドのチオレドキシン活性の少なくとも７５％、配列番号５の成熟型ポリペプチドの活性の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％である。一態様では、ポリペプチドは、配列番号５の成熟型ポリペプチドと最大１０アミノ酸、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸だけ異なる。
ポリペプチドは、好ましくは、配列番号５のアミノ酸配列若しくはその成熟型ポリペプチドを含むか、それから本質的になるか若しくはそれからなるか、又はチオレドキシンペプチド活性を有するその断片である。一態様では、成熟型ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１～１１０である。
一実施形態では、チオレドキシン活性を有するポリペプチドは、配列番号２４の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性又はチオレドキシンペプチド活性を有するポリペプチドの供給源
本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の好適な供給源から得ることができる。本発明の目的のために、所与の供給源に関連して本明細書で使用される用語「から得られる」とは、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが供給源又は供給源由来のポリヌクレオチドが挿入された株によって生成されることを意味するものとする。一態様では、所与の供給源から得られたポリペプチドは、細胞外に分泌される。
別の態様では、ポリペプチドは、サーモアスカス属（Ｔｈｅｍｏａｓｃｕｓ）の株、特にサーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）から得られるポリペプチド、例えばサーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）ＣＢＳ１８１．６７から得られるポリペプチドである。
別の態様では、ポリペプチドは、ケイソマイセス属（Ｋｅｉｔｈｏｍｙｃｅｓ）の株、特にケイソマイセス・カルネウス（Ｋｅｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｎｅｕｓ）から得られるポリペプチドである。
別の態様では、ポリペプチドは、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株、特にアスペルギルス・スピヌロスポルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｉｎｕｌｏｓｐｏｒｕｓ）から得られるポリペプチドである。
別の態様では、ポリペプチドは、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）の株、特にサーモアスカス・アウランティアクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）から得られるポリペプチドである。
別の態様では、ポリペプチドは、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）から得られるポリペプチド、例えばアスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）ＣＢＳ１０１．４３から得られるポリペプチドである。
前述の種に関して、本発明は、完全及び不完全な状態の両方並びにそれらが知られている種の名称に関わらず、他の分類学上の均等物、例えばアナモルフを包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同等性を容易に理解するであろう。
これらの種の株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ Ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）及びＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）の農業研究用特許培養株コレクションなどのいくつかの培養コレクションで一般に容易にアクセスできる。
ポリペプチドは、自然界（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離された微生物を含む他の供給源又は上述したプローブを用いて天然材料（例えば、土壌、堆肥、水など）から直接得られたＤＮＡ試料から同定し、得ることができる。微生物及びＤＮＡを自然生息地から直接単離する技術は、当技術分野で周知である。次に、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、別の微生物又は混合されたＤＮＡ試料のゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリを同様にスクリーニングすることによって得ることができる。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがプローブを用いて検出されると、そのポリヌクレオチドは、当業者に公知の技術を利用することにより単離又はクローニングされ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，上記参照）。
ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドにも関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号２０の成熟型ポリペプチドコード配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号２１の成熟型ポリペプチドコード配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号２２の成熟型ポリペプチドコード配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号２３の成熟型ポリペプチドコード配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリヌクレオチドに関する。
一実施形態では、本発明は、配列番号２４の成熟型ポリペプチドコード配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する単離又は精製ポリヌクレオチドに関する。
ポリヌクレオチドを単離するか又はクローン化するために使用される技術は、当技術分野で知られ、ゲノムＤＮＡ若しくはｃＤＮＡ又はその組合せからの単離を含む。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリの抗体スクリーニングを用いて、共有の構造的特徴を有するクローニングされたＤＮＡ断片を検出することにより行われ得る。例えば、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）及びポリヌクレオチドに基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅手順が使用され得る。ポリヌクレオチドは、サーモアスカス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、ケイソマイセス属（Ｋｅｉｔｈｏｍｙｃｅｓ）若しくはアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の株又は関連生物からクローニングされ得、したがって例えばポリヌクレオチドの領域をコードするポリペプチドの種のバリアントであり得る。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドを合成するために必要であり得る。ポリペプチドに「実質的に類似した」という用語は、ポリペプチドの天然に存在しない形態を指す。これらのポリペプチドは、その天然の供給源から単離されたポリペプチド（例えば、比活性、熱安定性、最適ｐＨ又は同類のものが異なるバリアント）と何らかの工学的方法で異なり得る。バリアントは、配列番号６若しくは配列番号７の成熟型ポリペプチドコード配列として提示されるポリヌクレオチド又は例えばそれらの部分配列などのそのｃＤＮＡ配列に基づいて、且つ／又はポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらさないが、酵素の生成が意図される宿主生物のコドン使用頻度に対応するヌクレオチド置換の導入又は異なるアミノ酸配列を生じ得るヌクレオチド置換の導入によって構築され得る。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えば、Ｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２：９５－１０７を参照されたい。
核酸構築物
本発明は、本発明のポリヌクレオチドであって、制御配列に適合する条件下において好適な宿主細胞におけるコード配列の発現を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含む核酸構築物にも関する。
ポリヌクレオチドは、様々な方法で操作されて、ポリペプチドの発現を提供し得る。ベクターに挿入する前に、発現ベクターに応じてポリヌクレオチドを操作することが望ましいか又は必要であり得る。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを変性するための技法は、当技術分野でよく知られている。
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドであるプロモータであり得る。プロモータは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、突然変異体、短縮型及びハイブリッドプロモータを含む宿主細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであり得、且つ宿主と同種又は異種のいずれかの細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。一実施形態では、制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して天然又は異種である。
細菌宿主細胞中で本発明のポリヌクレオチドの転写を誘導するのに適したプロモータの例は、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）アルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）マルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）レバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｘｙｌＡ遺伝子及びｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（Ａｇａｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３：９７－１０７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｃプロモータ（Ｅｇｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｇｅｎｅ ６９：３０１－３１５）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）及び原核生物ベータラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：３７２７－３７３１）から得られるプロモータ並びにｔａｃプロモータ（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１－２５）である。更なるプロモータは、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２４２：７４－９４中の”Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ”；及びＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、上記参照で説明されている。タンデムプロモータの例は、国際公開第９９／４３８３５号パンフレット中に開示されている。
糸状菌宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドの転写を誘導するための好適なプロモータの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アルファアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の酸安定性アルファ－アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のアミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のＤａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）のＱｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のベータ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のベータ－キシロシダーゼ及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の翻訳伸長因子並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモータ（その非翻訳リーダーがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置換されているアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の中性アルファ－アミラーゼ遺伝子由来の改変プロモータ）の遺伝子から得られるプロモータであり、非限定的な例としては、その非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置換されているアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アルファ－アミラーゼ遺伝子由来の改変プロモータ並びにそれらの突然変異プロモータ、切断型プロモータ及びハイブリッドプロモータが挙げられる。他のプロモータは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載される。
酵母宿主において、有用なプロモータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のメタロチオネイン（ＣＵＰ１）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の３－ホスホグリセリン酸キナーゼに関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８により記載されている。
制御配列は、転写を終了するために宿主細胞によって認識される転写ターミネータでもあり得る。ターミネータは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のターミネータが本発明で使用され得る。
細菌宿主細胞のために好ましいターミネータは、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルファアミラーゼ（ａｍｙＬ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のリボソームＲＮＡ（ｒｒｎＢ）に関する遺伝子から得られる。
糸状真菌宿主細胞のために好ましいターミネータは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸合成酵素、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のアルファグルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のベータ－グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のキシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のベータ－キシロシダーゼ及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の翻訳伸長因子に関する遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のために好ましいターミネータは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のシトクロムＣ（ＣＹＣ１）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素に関する遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネータは、上記参照のＲｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２により記載されている。
制御配列は、プロモータの下流及び遺伝子の発現を増強する遺伝子のコード配列の上流のｍＲＮＡ安定化剤領域でもあり得る。
好適なｍＲＮＡ安定化領域の例は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）のｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子（国際公開第９４／２５６１２号パンフレット）及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＳＰ８２遺伝子（Ｈｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７；３４６５－３４７１）から得られるものである。
制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダーでもあり得る。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のリーダーが使用され得る。
糸状真菌宿主細胞に好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものである。
酵母宿主細胞のために好適なリーダーは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルファ因子及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）に関する遺伝子から得られる。
制御配列は、ポリアデニル化配列、ポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結された配列でもあり得、転写される場合、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される。宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列が使用され得る。
糸状真菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のアルファグルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものである。
酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ，１９９５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１５：５９８３－５９９０によって記載されている。
制御配列は、ポリペプチドのＮ末端に連結するシグナルペプチドをコードしてポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導するシグナルペプチドコード領域でもあり得る。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、翻訳リーディングフレーム内でポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと天然に連結された、シグナルペプチドコード配列を本質的に含有し得る。代わりに、コード配列の５’末端は、コード配列に対して異種のシグナルペプチドコード配列を含有し得る。異種シグナルペプチドコード配列は、コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合に必要とされる場合がある。代わりに、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード配列が異種シグナルペプチドコード配列に単純に置き換わる場合がある。しかしながら、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導するあらゆるシグナルペプチドコード配列が使用され得る。
細菌宿主細胞のために効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ＮＣＩＢ １１８３７マルトース産生アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のサブチリシン、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のベータラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のアルファアミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）及びバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｐｒｓＡに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。更なるシグナルペプチドは、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ，１９９３，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５７：１０９－１３７により説明されている。
糸状真菌宿主細胞のために効果的なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のセルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のエンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）のリパーゼ及びリゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼに関する遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
酵母宿主細胞のために有用なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルファ因子及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のインベルターゼに関する遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，上記参照により記載されている。
制御配列は、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列でもあり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合により酵素前駆体）として知られる。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断により、活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード配列は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）のラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアルファ因子に関する遺伝子から得ることができる。
シグナルペプチド配列とプロペプチド配列との両方が存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのＮ末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のＮ末端の隣に位置する。
宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現を調節する制御配列を付加することも望ましい場合がある。制御配列の例は、制御化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオン又はオフにするものである。原核生物系での制御配列として、ｌａｃオペレータ系、ｔａｃオペレータ系及びｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母では、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系が有用であり得る。糸状菌類では、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコアミラーゼプロモータ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアルファアミラーゼプロモータ及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のグルコアミラーゼプロモータ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩプロモータ及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）のセロビオヒドロラーゼＩＩプロモータが使用され得る。制御配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にする配列である。真核生物系では、これらの制御配列として、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及び重金属により増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、制御配列に作動可能に連結されるであろう。
発現ベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチド、プロモータ、転写及び翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。種々のヌクレオチド及び制御配列が共に結合され、１つ以上の都合良い制限部位を含み得る組換え発現ベクターが生成されて、このような部位における、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換が可能になり得る。代わりに、発現に適切なベクターにポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む核酸構築物を挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現させ得る。発現ベクターを作製する際、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結するようにコード配列をベクター内に配置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順を都合よく受けることが可能であり、且つポリヌクレオチドの発現をもたらすことが可能である任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの親和性に応じて異なる。ベクターは、直鎖又は閉じた環状プラスミドであり得る。
ベクターは、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体又は人工染色体など、自己複製ベクター、即ち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクターであり得る。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有し得る。代わりに、ベクターは、宿主細胞に導入される際にゲノム中に統合され、且つ内部に統合された１つ以上の染色体と共に複製されるものであり得る。更に、単一のベクター若しくはプラスミド又は一緒になって宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含有する２つ以上のベクター若しくはプラスミド或いはトランスポゾンを用い得る。
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入などされた細胞の選択を容易にする１つ以上の選択可能マーカを含有することが好ましい。選択可能マーカは、遺伝子であって、その生成物が、殺生物剤又はウイルス抵抗性、重金属に対する抵抗性、栄養要求体に対する原栄養性及び同類のものをもたらす、遺伝子である。
細菌性選択可能マーカの例は、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）若しくはバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｄａｌ遺伝子又はアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカである。酵母宿主細胞に好適なマーカとしては、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１及びＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞に使用される選択可能マーカとしては、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール－スクシノカルボキサミドシンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシル－アミノイミダゾールシンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニリルトランスフェラーゼ）及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）並びにそれらの均等物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞中での使用に好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のａｍｄＳ遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子並びにストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞中での使用に好ましいのは、ａｄｅＡ遺伝子、ａｄｅＢ遺伝子、ａｍｄＳ遺伝子、ｈｐｈ遺伝子及びｐｙｒＧ遺伝子である。
選択可能マーカは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載されるような二重選択可能マーカーシステムであり得る。一態様では、二重選択可能マーカは、ｈｐｈ－ｔｋの二重選択可能マーカ系である。
ベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組込み又はゲノムと独立して細胞内でのベクターの自己複製を可能にする要素を含有する。
宿主細胞ゲノムへの組込みでは、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノムへの組込みのために、ポリペプチド又はベクターの任意の他の要素をコードするポリヌクレオチドの配列に依存し得る。代わりに、ベクターは、染色体中の正確な位置での宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを誘導するための追加のポリヌクレオチドを含有する場合がある。正確な位置での組込みの可能性を高めるために、組込み要素は、十分な数の核酸（例えば、１００～１０，０００個の塩基対、４００～１０，０００個の塩基対及び８００～１０，０００個の塩基対など）を含有するべきであり、この核酸は、相同組換えの可能性を高めるために、対応する標的配列に対する配列同一性が高い。組込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であり得る。更に、組込み要素は、ポリヌクレオチドをコードしなくても又はしてもよい。一方で、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
自律的な複製の場合、ベクターは、問題の宿主細胞中でベクターが自律的に複製することを可能にする複製起点を更に含み得る。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであり得る。「複製起点」又は「プラスミドレプリケータ」という用語は、プラスミド又はベクターがインビボで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。
細菌性複製起点の例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７及びｐＡＣＹＣ１８４並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０及びｐＡＭβ１の複製起点である。
酵母宿主細胞内で用いられる複製起源の例は、２ミクロンの複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３との組合せ及びＡＲＳ４とＣＥＮ６との組合せである。
糸状菌細胞で有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１及びＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ ９８：６１－６７；Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：９１６３－９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離並びにこの遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築を、国際公開第００／２４８８３号パンフレットで開示されている方法に従って達成し得る。
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入して、ポリペプチドの生成を増加させ得る。ポリヌクレオチドのコピー数を増大させることは、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むか、又はポリヌクレオチドに増幅可能な選択可能マーカ遺伝子を含めることによって達成することができ、適切な選択可能剤の存在下において細胞を培養することにより、増幅されたコピーの選択可能マーカ遺伝子を含む細胞、したがって更なるコピーのポリヌクレオチドを含む細胞を選択することができる。
上記の要素を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、上記参照のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
宿主細胞
本発明は、本発明のポリペプチドの生成を誘導する１つ以上の制御配列に作動可能に連結された、本発明のポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞にも関する。ポリヌクレオチドを含む構築物又はベクターを宿主細胞に導入することで、構築物又はベクターが、前述したように染色体組込み体若しくは自己複製染色体外ベクターとして維持されるようにする。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存する。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、組換え宿主細胞に対して異種である。
いくつかの実施形態では、１つ以上の制御配列の少なくとも１つは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して異種である。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、少なくとも２コピー、例えば３、４又は５コピーの本発明のポリヌクレオチドを含む。
宿主細胞は、本発明のポリペプチドの組換え生成に有用な任意の微生物細胞又は植物細胞、例えば原核細胞又は真菌細胞であり得る。
原核宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であり得る。グラム陽性細菌としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）及びストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。グラム陰性細菌としては、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ロータス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞を含む任意のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞であり得る。
細菌宿主細胞は、限定されるものではないが、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）及びストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）の細胞を含む任意のストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞でもあり得る。
細菌性宿主細胞は、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）及びストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）細胞が挙げられるが、これらに限定されない任意のストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞でもあり得る。
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、以下により行われ得る：プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１１－１１５を参照されたい）、コンピテント細胞形質転換（例えば、Ｙｏｕｎｇ ａｎｄ Ｓｐｉｚｉｚｅｎ，１９６１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．８１：８２３－８２９又はＤｕｂｎａｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｏｆｆ－Ａｂｅｌｓｏｎ，１９７１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５６：２０９－２２１を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、Ｓｈｉｇｅｋａｗａ ａｎｄ Ｄｏｗｅｒ，１９８８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：７４２－７５１を参照されたい）又はコンジュゲーション（例えば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｔｈｏｒｎｅ，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９；５２７１－５２７８を参照されたい）によって実施され得る。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞へのＤＮＡの導入は、以下により行われ得る：プロトプラスト形質転換（例えば、Ｈａｎａｈａｎ，１９８３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７－５８０を参照されたい）又はエレクトロポレーション（例えば、Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７－６１４５）。ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、以下により行われ得る：プロトプラス形質転換、エレクトロポレーション（例えば、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（Ｐｒａｈａ）４９：３９９－４０５を参照されたい）、コンジュゲーション（例えば、Ｍａｚｏｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：３５８３－３５８５を参照されたい）又は形質導入（例えば、Ｂｕｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：６２８９－６２９４を参照されたい）。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、以下により行われ得る：エレクトロポレーション（例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６４：３９１－３９７を参照されたい）又はコンジュゲーション（例えば、Ｐｉｎｅｄｏ ａｎｄ Ｓｍｅｔｓ，２００５，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：５１－５７を参照されたい）。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）細胞へのＤＮＡの導入は、以下により行われ得る：天然コンピテンス（ｎａｔｕｒａｌ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ）（例えば、Ｐｅｒｒｙ ａｎｄ Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３２：１２９５－１２９７を参照されたい）、プロトプラスト形質転換（例えば、Ｃａｔｔ ａｎｄ Ｊｏｌｌｉｃｋ，１９９１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ ６８：１８９－２０７を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えば、Ｂｕｃｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３８００－３８０４を参照されたい）又はコンジュゲーション（例えば、Ｃｌｅｗｅｌｌ，１９８１，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．４５：４０９－４３６を参照されたい）。しかしながら、宿主細胞にＤＮＡを導入するための当技術分野で知られる任意の方法が使用され得る。
宿主細胞は、真菌細胞であり得る。「真菌」は、本明細書で使用される場合、子嚢菌門（ｐｈｙｌａ Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）、ツボカビ門（Ｃｈｙｔｒｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）及び接合菌門（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）並びに卵菌類（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）及び全ての栄養胞子形成菌（ｍｉｔｏｓｐｏｒｉｃ ｆｕｎｇｉ）（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫで定義されている）を含む。
真菌宿主細胞は、酵母細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「酵母」としては、有子嚢胞子酵母（エンドミセス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、担子菌酵母及び不完全菌類（不完全酵母菌綱（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））に属する酵母が挙げられる。酵母の分類は将来変る場合があることから、本発明の目的のために、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，ａｎｄ Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．９，１９８０）で説明されているように定義されるべきである。
酵母菌宿主細胞は、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロマイセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロマイセス・オビホルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞などのカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クリベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）細胞であり得る。
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であり得る。「糸状菌類」は、真菌亜門（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）及び卵菌亜門（Ｏｏｍｙｃｏｔａ）の全ての糸状形態を含む（上記参照のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９５により定義されているとおり）。糸状菌類は、一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複雑な多糖で構成される菌糸体の壁を特徴とする。栄養成長は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化作用は、偏性好気性である。対照的に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母による栄養生長は、単細胞葉状体の出芽によるものであり、炭素異化は、発酵性であり得る。
糸状真菌宿主細胞は、以下であり得る：アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ビルカンデラ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、コリオルス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィロバシディウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロケーテ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、フレビア（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、プレウロタス（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、シゾフィラム（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、シーラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トイポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の細胞。
例えば、糸状真菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ブエルカンデラ・アズスタ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレギエア（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ギルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・サブバーミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラティノフィラム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クリソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クイーンスランジクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピクム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナツム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｚｏｎａｔｕｍ）、コプリヌス・シネレウス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、コリオルス・ヒルスツス（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクテリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クロークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクランツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・プルプロゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フレビア・ラジアタ（Ｐｈｌｅｂｉａ ｒａｄｉａｔａ）、プレウロツス・エリンギイ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｅｒｙｎｇｉｉ）、タラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トラメテス・ビロサ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｉｌｌｏｓａ）、トラメテス・ベルシコロル（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）細胞であり得る。
真菌細胞は、それ自体知られているプロセスにおいて、プロトプラストの形成、プロトプラストの形質転換及び細胞壁の再生を含む方法により形質転換され得る。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞及びトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に適した手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：１４７０－１４７４及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１４１９－１４２２で説明されている。フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に適した方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ ７８：１４７－１５６及び国際公開第９６／００７８７号パンフレットにより説明されている。酵母を、以下により説明されている手順を用いて形質転換し得る：Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ，Ｉｎ Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．ａｎｄ Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｉ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ １９４，ｐｐ １８２－１８７、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３；及びＨｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２０。
生成方法
本発明は、（ａ）ポリペプチドの生成を導く条件下において本発明の組換え宿主細胞を培養することと、任意選択的に、（ｂ）ポリペプチドを回収することとを含む、本発明のポリペプチドを生成する方法にも関する。
宿主細胞は、当技術分野で公知の方法を用いて、ポリペプチドの生成に適した栄養培地で培養される。例えば、この細胞を、好適な培地中且つポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下において、振盪フラスコ培養により培養し得るか、又は実験用若しくは工業用の発酵槽中での小規模若しくは大規模の発酵（例えば、連続式、バッチ式、フェドバッチ式若しくは固体状態の発酵を含む）により培養し得る。この培養を、当技術分野で知られる手順を用いて、炭素源及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行う。好適な培地は、商業的供給者から入手可能であるか、又は公開されている組成物に従って調製され得る（例えば、米国培養細胞系統保存機関のカタログ中）。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは、培地から直接回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、ポリペプチドは、細胞溶解産物から回収され得る。
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的である、当技術分野で公知の方法を用いて検出され得る。これらの検出法としては、特異抗体の使用、酵素生成物の形成又は酵素基質の消失が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵素アッセイを使用して、ポリペプチドの活性が決定され得る。
ポリペプチドは、当技術分野で公知である方法を用いて回収され得る。例えば、ポリペプチドは、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿を含むが、これらに限定されない従来の手順によって発酵培地から回収され得る。一態様では、ポリペプチドを含む全発酵ブロスを回収する。
ポリペプチドは、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気穿孔手順（例えば、分取用等電点電気泳動）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含むが、これに限定されない、当技術分野で公知の様々な手順によって精製され、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。
酵素組成物
本発明にかかる方法で使用するための酵素組成物は、主要な酵素構成成分としてのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）又はチオレドキシンペプチド、例えば一成分組成物など、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒する酵素を含み得る。代わりに、この組成物は、複数の酵素活性を含み得、例えばキシラナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ及び／又はアラビノフラノシダーゼからなる群から選択される１つ以上（例えば、いくつか）の酵素などを含み得る。
組成物は、当技術分野で公知の方法に従って調製され得、液体又は乾燥組成物の形態であり得る。組成物は、当技術分野で公知の方法に従って安定化され得る。
液体製剤
本発明は、本発明のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ又はチオレドキシンペプチドを含む液体組成物にも関する。組成物は、酵素安定化剤を含み得る（例として、プロピレングリコール若しくはグリセリンなどのポリオール、糖若しくは糖アルコール、乳酸、可逆的プロテアーゼ阻害剤、ホウ酸若しくは例えば芳香族ホウ酸エステルなどのホウ酸誘導体又は４－ホルミルフェニルボロン酸などのフェニルボロン酸誘導体が挙げられる）。
いくつかの実施形態では、そのような組成物の体積を増加させるために、充填材又はキャリア材料が含まれる。好適な充填材又はキャリア材料として、硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩などの様々な塩並びにタルク、粘土などが挙げられるが、これらに限定されない。液体組成物に適した充填材又はキャリア材料には、水又はポリオール及びジオールを含む低分子量の第一級及び第二級アルコールが含まれるが、これらに限定されない。こうしたアルコールの例として、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、組成物は、約５％～約９０％のそのような材料を含有する。
一態様では、本発明は、
（Ａ）本発明の［酵素］活性を有する０．００１ｗ／ｗ％～２５ｗ／ｗ％の１つ以上のポリペプチドと、
（Ｂ）水と
を含む液体製剤に関する。
別の実施形態では、液体製剤は、２０ｗ／ｗ％～８０ｗ／ｗ％のポリオールを含む。一実施形態では、液体製剤は、０．００１ｗ／ｗ％～２．０ｗ／ｗ％の保存剤を含む。
別の実施形態では、本発明は、
（Ａ）本発明の［酵素］活性を有する０．００１ｗ／ｗ％～２５ｗ／ｗ％の１つ以上のポリペプチドと、
（Ｂ）２０ｗ／ｗ％～８０ｗ／ｗ％のポリオールと、
（Ｃ）任意選択的に、０．００１ｗ／ｗ％～２．０ｗ／ｗ％の保存剤と、
（Ｄ）水と
を含む液体製剤に関する。
別の実施形態では、本発明は、
（Ａ）本発明の［酵素］活性を有する０．００１ｗ／ｗ％～２５ｗ／ｗ％の１つ以上のポリペプチドと、
（Ｂ）０．００１ｗ／ｗ％～２．０ｗ／ｗ％の保存剤と、
（Ｃ）任意選択的に、２０ｗ／ｗ％～８０ｗ／ｗ％のポリオールと、
（Ｄ）水と
を含む液体製剤に関する。
別の実施形態では、液体製剤は、１種以上の配合剤、例えばポリオール、塩化ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、チオ硫酸ナトリウム、炭酸カルシウム、クエン酸ナトリウム、デキストリン、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ＰＶＡ、酢酸塩及びリン酸塩からなる群から選択され、好ましくは硫酸ナトリウム、デキストリン、セルロース、チオ硫酸ナトリウム、カオリン及び炭酸カルシウムからなる群から選択される製剤などを含む。一実施形態では、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール又は１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、約６００未満の平均分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び約６００未満の平均分子量を有するポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）からなる群から選択される、より好ましくはグリセロール、ソルビトール及びプロピレングリコール（ＭＰＧ）又はその任意の組合せからなる群から選択される。
別の実施形態では、液体製剤は、２０％～８０％のポリオール（即ちポリオールの総量）、例えば２５％～７５％のポリオール、３０％～７０％のポリオール、３５％～６５％のポリオール又は４０％～６０％のポリオールを含む。一実施形態では、液体製剤は、２０％～８０％のポリオール、例えば２５％～７５％のポリオール、３０％～７０％のポリオール、３５％～６５％のポリオール又は４０％～６０％のポリオールを含み、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール（ＭＰＧ）、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、１，２－プロピレングリコール若しくは１，３－プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、平均分子量が約６００未満のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び平均分子量が約６００未満のポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）からなる群から選択される。一実施形態では、液体製剤は、２０％～８０％のポリオール（即ちポリオールの総量）、例えば２５％～７５％のポリオール、３０％～７０％のポリオール、３５％～６５％のポリオール又は４０％～６０％のポリオールを含み、ポリオールは、グリセロール、ソルビトール及びプロピレングリコール（ＭＰＧ）からなる群から選択される。
別の実施形態では、保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一実施形態では、液体製剤は、０．０２ｗ／ｗ％～１．５ｗ／ｗ％の保存剤、例えば０．０５ｗ／ｗ％～１．０ｗ／ｗ％の保存剤又は０．１ｗ／ｗ％～０．５ｗ／ｗ％の保存剤を含む。一実施形態では、液体製剤は、０．００１ｗ／ｗ％～２．０ｗ／ｗ％の保存剤（即ち保存剤の総量）、例えば０．０２ｗ／ｗ％～１．５ｗ／ｗ％の保存剤、０．０５ｗ／ｗ％～１．０ｗ／ｗ％の保存剤又は最も好ましくは０．１ｗ／ｗ％～０．５ｗ／ｗ％の保存剤を含み、保存剤は、ソルビン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム及び安息香酸カリウム又はそれらの任意の組合せからなる群から選択される。
別の実施形態では、液体製剤は、１つ以上の追加の酵素、例えばヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、リアーゼ、オキシドレダクターゼ及びトランスフェラーゼを更に含む。１つ以上の追加の酵素は、好ましくは、アセチルキシランエステラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、アミラーゼ、アルファアミラーゼ、ベータアミラーゼ、アラビノフラノシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、フェルロイルエステラーゼ、ガラクタナーゼ、アルファガラクトシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ベータグルカナーゼ、ベータ－グルコシダーゼ、リゾホスホリパーゼ、リソチーム、アルファマンノシダーゼ、ベータマンノシダーゼ（マンナナーゼ）、フィターゼ、ホスホリパーゼＡ１、ホスホリパーゼＡ２、ホスホリパーゼＤ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ペクチンエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、キシラナーゼ、ベータ－キシロシダーゼ又はその任意の組合せからなる群から選択される。
発酵ブロス調合物又は細胞組成物
本発明は、本発明のポリペプチドを含む発酵ブロス調合物又は細胞組成物にも関する。発酵ブロス調合物又は細胞組成物は、例えば、細胞（目的のポリペプチドを生成するのに使用される、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を含有する宿主細胞を含む）、細胞片、バイオマス、発酵培地及び／又は発酵生成物など、発酵プロセスに使用される追加の成分を更に含む。いくつかの実施形態では、組成物は、有機酸、死細胞及び／又は細胞片並びに培養培地を含有する、死滅した細胞の全ブロスである。
本明細書で使用される用語「発酵ブロス」とは、細胞発酵により生成される調製物を指し、これは、回収及び／又は精製を全く受けないか又は最小限にのみ受ける。例えば、発酵ブロスは、微生物培地を飽和まで成長させ、タンパク質合成（例えば、宿主細胞による酵素の発現）及び細胞培地への分泌を可能にする炭素制限条件下でインキュベートする場合、生成される。発酵ブロスは、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画内容物又は分画内容物を含有し得る。典型的には、発酵ブロスは、未分画であり、微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）を例えば遠心分離により除去した後に存在する使用済み培地及び細胞屑を含む。いくつかの実施形態では、発酵ブロスは、使用済み細胞培養培地、細胞外酵素並びに生存及び／又は非生存微生物細胞を含有する。いくつかの実施形態では、発酵ブロス調合物又は細胞組成物は、少なくとも１つの１～５個の炭素の有機酸を含む第１の有機酸構成成分及び／又はその塩並びに少なくとも１つの６個以上の炭素の有機酸を含む第２の有機酸構成成分及び／又はその塩を含む。
いくつかの実施形態では、第１の有機酸構成成分は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、それらの塩又は前述の２つ以上の混合物及び第２の有機酸構成成分は、安息香酸、シクロヘキサンカルボン酸、４－メチル吉草酸、フェニル酢酸、それらの塩又は前述の２つ以上の混合物である。
一態様では、組成物は、有機酸を含有し、且つ任意選択により死細胞及び／又は細胞片を更に含有する。いくつかの実施形態では、死細胞及び／又は細胞片は、これらの構成成分を含まない組成物を得るために、細胞死滅全ブロスから除去される。
発酵ブロス調合物又は細胞組成物は、ソルビトール、塩化ナトリウム、ソルビン酸カリウム及び当技術分野で公知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない、保存剤及び／又は抗菌（例えば、静菌）剤を更に含み得る。
細胞死滅全ブロス又は組成物は、発酵の終了時に得られる発酵材料の未分画内容物を含有し得る。典型的には、細胞死滅全ブロス又は組成物は、使用済み培養培地と、微生物細胞（例えば、糸状菌細胞）を飽和まで増殖させ、炭素限定条件下においてインキュベートしてタンパク質を合成させた後に存在する細胞片とを含有する。いくつかの実施形態では、細胞死滅の全ブロス又は組成物は、使用済みの細胞培養培地、細胞外酵素及び死滅した糸状菌細胞を含有する。いくつかの実施形態では、細胞死滅の全ブロス又は組成物中に存在する微生物細胞は、当技術分野で知られる方法を用いて透過処理され、且つ／又は溶解され得る。
本明細書に記載されるとおりの全ブロス又は細胞組成物は、典型的には液体であるが、死細胞、細胞片、培地構成成分及び／又は不溶性酵素などの不溶性成分を含有し得る。いくつかの実施形態では、不溶性構成成分を除去して、清澄化した液体組成物を得ることができる。
本発明の全ブロス配合物及び細胞組成物は、国際公開第９０／１５８６１号パンフレット又は国際公開第２０１０／０９６６７３号パンフレットに記載されている方法によって生成され得る。
本発明は、以下の付番された実施形態で更に開示される。
実施形態［１］．湿潤製粉プロセスにおいてトウモロコシ穀粒からのデンプン収量及び／又はグルテン収量を増加させる方法であって、粉砕トウモロコシ穀粒、特に粉砕穀粒の繊維豊富画分を、有効量の、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒するポリペプチド、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）又はチオレドキシンペプチドと接触させることを含む方法。
実施形態［２］．湿潤製粉プロセス中、粉砕穀粒から放出されるデンプン及び／又はグルテン、特に不溶性デンプン及びグルテンの量は、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドが存在しない／添加されないプロセスと比較して増加する、実施形態１に記載の方法。
実施形態［３］．乾燥固体１グラム当たりの放出されるタンパク質ｍｇ（ｍｇ／ｇＤＳ）として測定される増加は、ＰＤＩの添加なしと比較して少なくとも０．５％ポイント、少なくとも０．７５％ポイント、少なくとも１．０％ポイント、少なくとも１．５％ポイント、少なくとも２．５％ポイント、例えば少なくとも５．０％ポイントであり、繊維洗浄は、３．５～５．５の範囲のｐＨ、例えばｐＨ４．０、４．５又は５．０及び少なくとも３００μｇ ＥＰ／ｇＤＳの酵素投与量で行われる、実施形態２に記載の方法。
実施形態［４］．ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、特に繊維洗浄工程中に存在する／繊維画分に添加される、実施形態１～３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［５］．ａ）トウモロコシ穀粒を水に浸漬させて、浸漬穀粒を生成する工程と、
ｂ）浸漬穀粒を粉砕して、粉砕穀粒を生成する工程と、
ｃ）粉砕穀粒から胚を分離して、繊維、デンプン及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を生成する工程と、
ｄ）トウモロコシ穀粒塊、特に微細繊維画分を繊維洗浄手順に供し、繊維からデンプン及びグルテンを分離する工程と
を含み、少なくともＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、工程ｄ）前又は中に存在する／添加される、実施形態１～４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［６］．ｅ）グルテンからデンプンを分離する工程と、任意選択的に、
ｆ）デンプンを洗浄する工程と
を更に含む、実施形態４に記載の方法。
実施形態［７］．ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、繊維洗浄中、少なくとも１０μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも２５μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも５０μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも７５μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも１００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも２００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも３００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも５００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、例えば１０～２０００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、２５～１０００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、５０～８００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、１００～５００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳの範囲の量で存在する／添加される、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［８］．ＳＯ２は、繊維洗浄中、少なくとも２００ｐｐｍ、少なくとも３００ｐｐｍ、少なくとも４００ｐｐｍ、少なくとも４５０ｐｐｍ、少なくとも５００ｐｐｍ、少なくとも６００ｐｐｍ、少なくとも７００ｐｐｍ、少なくとも８００ｐｐｍ、例えば２００～３０００ｐｐｍ、３００～２０００ｐｐｍ、４００～８００ｐｐｍの範囲などの量で存在する／添加される、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［９］．有効量の１つ以上の加水分解酵素は、繊維洗浄工程前又は中に存在し／添加され、前記加水分解酵素の少なくとも１つは、キシラナーゼ及び／又はセルラーゼから選択される、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［１０］．キシラナーゼは、ＧＨ５ポリペプチド、ＧＨ８ポリペプチド、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ１０ポリペプチド、ＧＨ１１ポリペプチド、ＧＨ８ポリペプチド又はそれらの組合せからなる群から選択される、実施形態１～９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［１１］．加水分解酵素は、１つ以上のセルラーゼを含む、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［１２］．セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）及びベータ－グルコシダーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む、実施形態１０に記載の方法。
実施形態［１３］．セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む、実施形態１１に記載の方法。
実施形態［１４］．セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来する、実施形態１１～１３に記載の方法。
実施形態［１５］．セルラーゼは、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－グルコシダーゼバリアント及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）（エメルソニイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチドを含有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼ調製物を有する、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ１０キシラナーゼ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－キシロシダーゼからなる群から選択される、実施形態１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［１６］．セルラーゼは、
ｉ）配列番号１４のＧＨ１０キシラナーゼ、配列番号１５のベータ－キシロシダーゼ、配列番号１６のセロビオヒドロラーゼＩ、配列番号１７のセロビオヒドロラーゼＩＩ、配列番号１８のベータ－グルコシダーゼ、配列番号１９のＧＨ６１、又は
ｉｉ）配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、及び
ｉｉｉ）トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の少なくとも１つのエンドグルカナーゼ
を含む組成物から選択される、実施形態１５に記載の方法。
実施形態［１７］．加水分解酵素は、アラビノフラノシダーゼを含む、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［１８］．アラビノフラノシダーゼは、ＧＨ４３ポリペプチド、ＧＨ６２ポリペプチド及びＧＨ５１ポリペプチドからなる群から選択される、実施形態１７に記載の方法。
実施形態［１９］．工程ｃ）からの繊維、デンプン及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊は、工程ｄ）での繊維洗浄手順前に更なる粉砕工程、好ましくは微粉砕工程に供される、実施形態１～１８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２０］．前記繊維洗浄手順は、向流洗浄構成で流体連結されている複数のスクリーンユニット（Ｓ１．．．Ｓ４）を含む繊維洗浄システムを使用して行われ、各スクリーンユニットは、トウモロコシ穀粒塊と液体との流れを２つの画分：第１の画分（ｓ）及び第２の画分（ｆ）に分離するように構成され、前記第２の画分（ｆ）は、第１の画分（ｓ）を上回る、重量％で測定された量の繊維を含み、及び任意選択的に、空間（Ｖ）は、システム内に配置され、且つ前記第１の画分（ｓ）の１つ、前記第２の画分（ｆ）の１つ又は混合された第１及び第２の画分（ｓ、ｆ）、好ましくは第２の画分（ｆ）のみを受け入れるように流体連結され、及び空間内に受け入れられた一方又は両方の画分に対してインキュベーション時間を提供するように構成され、且つそれによりインキュベートされた一方又は両方の画分を下流のスクリーンユニット（Ｓ４）に排出し、システムは、
－ トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流スクリーンユニット（Ｓ１）に注入することと、
－ 最上流スクリーンユニット（Ｓ１）からの第１の画分（ｓ１）を、デンプンを含有する生成物流として排出することと、
－ プロセス水を注入することであって、好ましくはプロセス水を最下流スクリーンユニット（Ｓ４）に注入するように配置される、注入することと、
－ 最下流スクリーンユニット（Ｓ４）から、第２の画分（ｆ４）を、最初のトウモロコシ穀粒塊を下回る量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として排出することと、
－ 任意選択的に、システムに加水分解酵素を導入することと
を行うように構成される、実施形態１～１９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２１］．前記繊維洗浄手順は、繊維洗浄システムであって、繊維洗浄システムにおける少なくとも３５分間且つ４８時間未満の総保持時間を提供するように構成された空間（Ｖ）／タンクを含む繊維洗浄システムの使用を含む、実施形態２０に記載の方法。
実施形態［２２］．前記空間（Ｖ）は、５０～１０００ｍ３の範囲の体積を有する、実施形態２０又は２１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２３］．前記空間（Ｖ）は、８０及び２５０ｍ３の範囲の体積を有する、実施形態２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２４］．繊維洗浄システム内に構成された前記空間（Ｖ）／タンク内のインキュベーション時間は、少なくとも５分間且つ４８時間未満、例えば３５分間～２４時間、３５分間～時間、３５分間～６時間、３５分間～５時間、３５分間～４時間、３５分間～３時間、３５分間～２時間、４５分間～４８時間、４５分間～２４時間、４５分間～１２時間、４５分間～６時間、４５分間～５時間、４５分間～４時間、４５分間～３時間、４５分間～２時間である、実施形態２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２５］．インキュベーション温度は、２５℃～９５℃、例えば２５～９０℃、２５～８５℃、２５～８０℃、２５～７５℃、２５～７０℃、２５～６５℃、２５～６０℃、２５～５５℃、２５～５３℃、２５～５２℃、３０～９０℃、３０～８５℃、３０～８０℃、３０～７５℃、３０～７０℃、３０～６５℃、３０～６０℃、３０～５５℃、３０～５３℃、３０～５２℃、３５～９０℃、３５～８５℃、３５～８０℃、３５～７５℃、３５～７０℃、３５～６５℃、３５～６０℃、３５～５５℃、３５～５３℃、３５～５２℃、３９～９０℃、３９～８５℃、３９～８０℃、３９～７５℃、３９～７０℃、３９～６５℃、３９～６０℃、３９～５５℃、３９～５３℃、３９～５２℃、好ましくは４６～５２℃である、実施形態１～２４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２６］．１つ以上の加水分解酵素は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２７］．前記粉砕トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分と混合／接触される１つ以上の加水分解酵素の有効量は、０．００５～０．５ｋｇの酵素タンパク質／湿潤製粉プロセスに入るトウモロコシ穀粒のメートルトンである、実施形態１～２６のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２８］．ＳＯ２源は、二亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、ＮａＨＳＯ３及び／又はＳＯ２ガスの添加から選択される、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［２９］．ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、レドックスタンパク質のチオレドキシンスーパーファミリーに属する少なくとも１つの触媒ドメインを含み、このドメインは、ＣＸＸＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位を含む、実施形態１～２８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３０］．ＰＤＩは、少なくとも１つの非触媒ドメインによって分離されている、ＣＸＸＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位をそれぞれ含む２つの触媒ドメインを含む、実施形態２９に記載の方法。
実施形態［３１］．ＣＸＸＣモチーフは、ＣＧＨＣ、ＣＴＨＣ、ＣＰＨＣ、ＣＧＰＣ及びＣＳＭＣ、特にＣＧＨＣ又はＣＧＰＣからなる群から選択される、実施形態２９又は３０に記載の方法。
実施形態［３２］．触媒ドメインは、ファミリーＰｆ０００８５に属する、実施形態２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３３］．ＰＤＩは、３ドメイン構造Ｐｆ０００８５－Ｐｆ１３８４８－Ｐｆ０００８５を含み、中央Ｐｆ１３８４８ドメインは、２つのＰｆ０００８５ドメインであって、一方がＮ末端にあり、及び他方がＣ末端にある、２つのＰｆ０００８５ドメインによって隣接される、実施形態２９～３２に記載の方法。
実施形態［３４］．リパーゼＰＤＩは、
（ａ）配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上（いくつか）の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号１の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、実施形態１～３３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３５］．リパーゼＰＤＩは、
（ａ）配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号２の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、実施形態１～３３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３６］．リパーゼＰＤＩは、
（ａ）配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号３の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、実施形態１～３３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３７］．リパーゼＰＤＩは、
（ａ）配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号４の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、実施形態１～３３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３８］．チオレドキシンペプチドは、
（ａ）配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号５の成熟型ポリペプチドのバリアントと、
（ｃ）チオレドキシンペプチド活性を有する（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される、実施形態１～３３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［３９］．キシラナーゼは、
（ａ）配列番号８のポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、実施形態１～３８のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４０］．キシラナーゼは、
（ａ）配列番号１１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、実施形態１～３９のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４１］．アラビノフラノシダーゼは、
（ａ）配列番号１３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）アラビノフラノシダーゼ活性を有する（ａ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、実施形態１～４０のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４２］．キシラナーゼは、
（ａ）配列番号１０の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、実施形態１～４１のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４３］．アラビノフラノシダーゼは、
（ａ）配列番号１２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
（ｂ）アラビノフラノシダーゼ活性を有する（ａ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、実施形態１～４２のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４４］．セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｕｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来する、実施形態１～４３のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４５］．セルラーゼは、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に由来するＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ ＩＩを有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）バックグラウンドセルラーゼに由来する、実施形態１～４４のいずれか一項に記載の方法。
実施形態［４６］．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸２１～５１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｃ）配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｄ）配列番号１の成熟型ポリペプチドから、配列番号１の成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
（ｅ）配列番号２０の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
（ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
実施形態［４７］．配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態４６に記載のポリペプチド。
実施形態［４８］．配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態４６又は４７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態［４９］．配列番号１若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号１のアミノ酸２１～５１６を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、実施形態４６に記載のポリペプチド。
実施形態［５０］．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２１～５１３と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｃ）配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｄ）配列番号２の成熟型ポリペプチドから、配列番号２の成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
（ｅ）配列番号２１の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
（ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
実施形態［５１］．配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態４６に記載のポリペプチド。
実施形態［５２］．配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態５０又は５１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態［５３］．配列番号１若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号２のアミノ酸２１～５１３を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、実施形態５０に記載のポリペプチド。
実施形態［５４］．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号３のアミノ酸２１～５１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｃ）配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｄ）配列番号３の成熟型ポリペプチドから、配列番号３の成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
（ｅ）配列番号２２の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
（ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
実施形態［５５］．配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態５４に記載のポリペプチド。
実施形態［５６］．配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態５４又は５５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態［５７］．配列番号３若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号３のアミノ酸２１～５１６を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、実施形態５４に記載のポリペプチド。
実施形態［５８］．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号４のアミノ酸２１～５１７と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｃ）配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｄ）配列番号４の成熟型ポリペプチドから、配列番号４の成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
（ｅ）配列番号２３の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
（ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
実施形態［５９］．配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態５８に記載のポリペプチド。
実施形態［６０］．配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態５８又は５９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態［６１］．配列番号１若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号４のアミノ酸２１～５１７を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、実施形態５８に記載のポリペプチド。
実施形態［６２］．タンパク質ジスルフィド結合を還元する能力を有する単離又は精製チオレドキシンポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｂ）配列番号５のアミノ酸１～１１０と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｃ）配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
（ｄ）配列番号５の成熟型ポリペプチドから、配列番号５の成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
（ｅ）配列番号２４の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
（ｆ）チオレドキシン活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のポリペプチドの断片と
からなる群から選択される単離又は精製チオレドキシンポリペプチド。
実施形態［６３］．配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態６２に記載のポリペプチド。
実施形態［６４］．配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態６２又は６３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態［６５］．配列番号５若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号５のアミノ酸１～１１０を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、実施形態６２に記載のポリペプチド。
実施形態［６６］．湿潤製粉プロセス中、粉砕穀粒の繊維豊富画分から放出されるデンプン及び／又はグルテン、特に不溶性デンプン及びグルテンの量は、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドが繊維洗浄工程において存在しない／添加されないプロセスと比較して増加する、実施形態４６～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
実施形態［６７］．実施形態４６～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
実施形態［６８］．実施形態１０に記載のキシラナーゼ及び／又は実施形態１１～１６に記載のセルラーゼを更に含む、実施形態６７に記載の組成物。
実施形態［６９］．実施形態４６～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む全ブロス配合物又は細胞培養組成物。
実施形態［７０］．実施形態４６～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離又は精製ポリヌクレオチド。
実施形態［７１］．実施形態７０に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターであって、ポリヌクレオチドは、発現宿主においてポリペプチドの生成を誘導する１つ以上の異種制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物又は発現ベクター。
実施形態［７２］．実施形態７０に記載のポリヌクレオチドであって、ポリペプチドの生成を誘導する１つ以上の異種制御配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
実施形態［７３］．タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性又はチオレドキシンペプチド活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、実施形態７２に記載の組換え宿主細胞を、ポリペプチドの生成を導く条件下で培養することと、任意選択的にポリペプチドを回収することとを含む方法。
アッセイ
ジチオスレイトールによるインスリン還元アッセイ
原理
ウシインスリン中の２つのシスチンは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存在下においてＰＤＩにより還元される。反応後、インタクトなインスリンの消失及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）による２つのペプチドの形成を分析する。
化学物質
重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）、Ｆｌｕｋａ ０９８３０
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジナトリウム塩、Ｍｅｒｃｋ １．０８４１８
酢酸アンモニウム、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ３２３０１
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｓｉｇｍａ Ｄ０６３２
ウシ膵臓由来のインスリン、Ｓｉｇｍａ Ｉ５５００
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｓｉｇｍａ ３０２０３１
２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）、Ｓｉｇｍａ Ｄ１０７６０３
アセトニトリル、Ｓｉｇｍａ ３４８８８
試薬
ＡＢＣ緩衝液：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７
ＥＤＴＡ溶液：１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８
酢酸緩衝液：２５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５
基質ストック：ＡＢＣ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬインスリン
基質作動溶液：１００μＬ基質ストック＋２０μＬ ＥＤＴＡ溶液＋７８０μＬ ２５ｍＭ酢酸緩衝液。ＥＤＴＡを添加した後、溶液が透明になるまで待ち、続いて酢酸緩衝液を添加する
ＤＴＴ溶液：Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中の２００ｍＭ ＤＴＴ
停止試薬：Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中の２％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡ
マトリックス：アセトニトリル中の２０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＡＰ
材料
ＭＡＬＤＩ ＭＳ：Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（商標）
Ｂｒｕｋｅｒ ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ ＭＡＬＤＩターゲットプレート
Ｂｉｏｓａｎ Ｐｌａｔｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ ＰＳＴ １００－ＨＬ
酵素
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）
手順
１）酵素作動溶液（典型的には、０～１００μｇ酵素タンパク質／ｍＬ、アッセイ中に０～１０ｐｐｍが得られる）及び新たに調製した基質作動溶液を調製する。
２）９０μＬ基質作動溶液及び１０μＬ酵素作動溶液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で混合する。酵素ブランクでは、酵素溶液の代わりに１０μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水を添加する。
３）１μＬのＤＴＴ溶液を加えるか、又はブランクでは１μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水（試薬ブランク）を加えることによって反応を開始する。
４）プレートを４０℃で１０分間インキュベートし、５５０ｒｐｍで振盪する。
５）インキュベーション後、１００μＬの停止試薬を添加することによって反応を停止させる。
６）ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析のために、２μＬの試料を４μＬのＤＨＡＰと混合し、０．７μＬを標的プレートに移す。質量スペクトルは、正の線形モードで得られる。イオン源１及びイオン源２は、２０ｋＶ及び１８．８ｋＶに設定され、それぞれ１１３４０ｎｓの遅延及び６．４ｎｓのサンプリングレートである。各スペクトルは、１試料スポット当たり５０００ショットの累積平均であり、イオン質量範囲は、５００～７０００に設定されている。
７）酵素の活性は、酵素ブランク及び試薬ブランクのスペクトルと比較して、それぞれインタクトなウシインスリンの質量ピーク面積の減少（質量範囲５６７０～６０００）並びに質量範囲２３００～２４５０及び質量範囲３３２５～３５００での２つのＡペプチド鎖及びＢペプチド鎖の出現における増加として観察することができる（インタクトなインスリン及び２つのペプチドの両方のいくつかのナトリウム付加物に対応するピークを観察することができ、これらは使用される質量範囲に含まれることに、留意すべきである）。
８）必要に応じて、異なる酵素濃度でアッセイを実行することにより、標準曲線を調製することができる。鎖Ａ（又はＢ）のイオンピーク面積と、インタクトなウシインスリンのイオンに対するイオンピーク面積との比を計算し、その比を酵素濃度に対してプロットする。
亜硫酸塩によるインスリン還元アッセイ
原理
ウシインスリン中の２つのシスチンは、亜硫酸塩の存在下においてＰＤＩにより還元される。反応後、インタクトなインスリンの消失及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ ＭＳ）による２つのペプチドの形成を分析する。
化学物質
重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）、Ｆｌｕｋａ ０９８３０
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジナトリウム塩、Ｍｅｒｃｋ １．０８４１８
酢酸アンモニウム、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ３２３０１
二亜硫酸ナトリウム、Ｍｅｒｃｋ ３１４４８
ウシ膵臓由来のインスリン、Ｓｉｇｍａ Ｉ５５００
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｓｉｇｍａ ３０２０３１
２’，５’－ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）、Ｓｉｇｍａ Ｄ１０７６０３
アセトニトリル、Ｓｉｇｍａ ３４８８８
試薬
ＡＢＣ緩衝液：１０ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ７
ＥＤＴＡ溶液：１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８
酢酸緩衝液：２５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ５
基質ストック：ＡＢＣ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬインスリン
基質作動溶液：１００μＬ基質ストック＋２０μＬ ＥＤＴＡ溶液＋７８０μＬ ２５ｍＭ酢酸緩衝液。ＥＤＴＡを添加した後、溶液が透明になるまで待ち、続いて酢酸緩衝液を添加する
亜硫酸塩溶液：Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中の６０ｍＭ二亜硫酸ナトリウム
停止試薬：Ｍｉｌｌｉ Ｑ水中の２％（Ｖ／Ｖ）ＴＦＡ
マトリックス：アセトニトリル中の２０ｍｇ／ｍＬ ＤＨＡＰ
材料
ＭＡＬＤＩ ＭＳ：Ｂｒｕｋｅｒ ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（商標）
Ｂｒｕｋｅｒ ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ ＭＡＬＤＩターゲットプレート
Ｂｉｏｓａｎ Ｐｌａｔｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｈａｋｅｒ ＰＳＴ １００－ＨＬ
酵素
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（Ｔｈｅｒｍａａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ（Ｐ７３ＲＶＹ））
手順
１）酵素作動溶液（典型的には０～１００μｇ酵素タンパク質／ｍＬ、アッセイ中に０～１０ｐｐｍが得られる）並びに新たに調製した基質作業溶液及び新たに調製した亜硫酸塩溶液を調製する。
２）９０μＬ基質作動溶液及び１０μＬ酵素作動溶液を、９６ウェルマイクロタイタープレート中で混合する。酵素ブランクでは、酵素溶液の代わりに１０μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水を添加する。
３）５μＬの亜硫酸塩溶液を加えるか、又はブランクでは５μＬのＭｉｌｌｉ Ｑ水（試薬ブランク）を加えることによって反応を開始する。
４）プレートを４０℃で３０分間インキュベートし、５５０ｒｐｍで振盪する。
５）インキュベーション後、１００μＬの停止試薬を添加することによって反応を停止させる。
６）ＭＡＬＤＩ ＭＳ分析のために、２μＬの試料を４μＬのＤＨＡＰと混合し、０．７μＬを標的プレートに移す。質量スペクトルは、正の線形モードで得られる。イオン源１及びイオン源２は、２０ｋＶ及び１８．８ｋＶに設定され、それぞれ１１３４０ｎｓの遅延及び６．４ｎｓのサンプリングレートである。各スペクトルは、１試料スポット当たり５０００ショットの累積平均であり、イオン質量範囲は、５００～７０００に設定されている。
７）酵素の活性は、酵素ブランク及び試薬ブランクのスペクトルと比較して、それぞれインタクトなウシインスリンの質量ピーク面積の減少（質量範囲５６７０～６０００）並びに質量範囲２３００～２６４０及び質量範囲３３２５～３６３０での２つのＡペプチド鎖及びＢペプチド鎖の出現における増加として観察することができる（インタクトなインスリン及び２つのペプチドの両方のいくつかのナトリウム付加物に対応するピークを観察することができ、これらは使用される質量範囲に含まれることに、留意すべきである。加えて、形成されたＡペプチド鎖及びＢペプチド鎖は、還元型と、ＳＯ３残基が付加された型との混合物として存在し、両方の型は質量範囲セットに含まれる）。
８）必要に応じて、異なる酵素濃度でアッセイを実行することにより、標準曲線を調製することができる。鎖Ａ（又はＢ）のイオンピーク面積と、インタクトなウシインスリンのイオンに対するイオンピーク面積との比を計算し、その比を酵素濃度に対してプロットする。
株
サーモアスカス・アウランティアクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）株は、１９９８年に中国雲南省の土壌から単離された。サーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）株は、米国カリフォルニア州の植物（ＣＢＳ１８１．６７）から単離された。株を同定し、ＩＴＳのＤＮＡ配列決定に基づいて分類系統を付与した（表１）。
実施例１：サーモアスカス・アウランティアクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）（配列番号４）からのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのクローニング
配列番号７のヌクレオチド配列を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを、サーモアスカス・アウランティアクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＤＡＵ７２４にクローニングした（国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレット）。
最終発現プラスミドを、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＤＡＵ７８５発現宿主に形質転換した（国際公開第９５／００２０４３号パンフレット）。１００μＬのプロトプラストを、２．５μｇ～１０μｇのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子を含む発現プラスミド及び３００μＬの６０％ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５と混合し、穏やかに混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートし、選択のために１００ｍＭ硝酸ナトリウムを補充したスクロースプレート上にプロトプラストを広げた。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ発現構築物を含有する１つの組換えＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）クローンを選択し、振盪フラスコ中の２４００ｍＬのＹＰＭ（１％酵母抽出物、２％ペプトン及び２％マルトース）中において３０℃で３日間、８０ｒｐｍの撹拌下で培養した。０．２２μｍの１リットルボトルトップ真空フィルタ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ））を用いた濾過により、酵素含有上清を採取した。
実施例２：サーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）（配列番号１）からのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼのクローニング
配列番号６のヌクレオチド配列を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを、サーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）から単離したゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、発現ベクターｐＤＡＵ７２４にクローニングした（国際公開第２０１８／１１３７４５号パンフレット）。
最終発現プラスミドを、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＤＡＵ７８５発現宿主に形質転換した（国際公開第９５／００２０４３号パンフレット）。１００μＬのプロトプラストを、２．５μｇ～１０μｇのタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ遺伝子を含む発現プラスミド及び３００μＬの６０％ＰＥＧ ４０００、１０ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．５と混合し、穏やかに混合した。混合物を室温で３０分間インキュベートし、選択のために１００ｍＭ硝酸ナトリウムを補充したスクロースプレート上にプロトプラストを広げた。
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ発現構築物を含有する１つの組換えＡ．オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）クローンを選択し、振盪フラスコ中の２４００ｍＬのＹＰＭ（１％酵母抽出物、２％ペプトン及び２％マルトース）中において３０℃で３日間、８０ｒｐｍの撹拌下で培養した。０．２２μｍの１リットルボトルトップ真空フィルタ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ））を用いた濾過により、酵素含有上清を採取した。
実施例３：繊維洗浄におけるＰＤＩ添加の効果
トウモロコシ湿潤製粉プロセスにおける繊維プレス後の粗果皮繊維を、基質として使用し、且つプロセス関連条件（即ちｐＨ４～５、４０～４８℃及び４００ｐｐｍの二酸化硫黄）で酵素と共にインキュベートした。インキュベーション後、繊維を孔径６０μｍのフィルタにより真空濾過した。繊維ケークを水中に再懸濁し、再び濾過した。抽出した固体タンパク質及びデンプンを収集し、遠心分離によって十分に洗浄した。収集した濾液からの抽出されたデンプン及びグルテンを含有する得られたペレット中のタンパク質の量を、ＬＥＣＯによる全窒素の測定及び６．２５（Ｊｏｎｅｓ、ＵＳＤＡ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｎｏ １８３、１９３１）の窒素－タンパク質変換係数の使用によって決定し、出発繊維乾燥固体の重量に対して正規化した。
化学物質
粗果皮繊維試料
二亜硫酸ナトリウム、Ｍｅｒｃｋ ａｒｔ．３１４４８
酢酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ８６２５
試薬
亜硫酸塩：亜硫酸水素塩を、Ｎａ２Ｓ２Ｏ５＋Ｈ２Ｏ→２Ｎａ＋＋２ＨＳＯ３ －の反応後、二亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）を緩衝液に添加することによって産生する。このようにして、４００ｐｐｍのＳＯ２を、５９３，６ｍｇ／Ｌのメタ重亜硫酸塩から調製した。
緩衝液：０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．０
材料
Ｉｎｆｏｒｓ－ＨＴ Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ Ｐｒｏインキュベーションシェーカ
Ａｖａｎｔｉ Ｊ－Ｅ遠心分離機
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ管トップフィルターユニット、孔径６０μｍ（Ｍｅｒｃｋ、注文番号ＳＣＮＹ００６０）
ＥＺ－２ Ｅｌｉｔｅ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ
ＬＥＣＯ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＦＰ６２８
酵素
ＰＤＩ Ａ：配列番号１として開示される、サーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
ＰＤＩ Ｂ：配列番号２として開示される、ケイソマイセス・カルネウス（Ｋｅｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｎｅｕｓ）由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
ＰＤＩ Ｃ：配列番号３として開示される、アスペルギルス・スピヌロスポルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｉｎｕｌｏｓｐｏｒｕｓ）由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
ＰＤＩ Ｄ：配列番号４として開示される、サーモアスカス・アウランティアクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
配列番号５として開示される、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）由来のＴｒｘチオレドキシンチオレドキシン（Ｔｒｘ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎＴｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）ペプチド
ＧＨ５キシラナーゼＡ：クリセオバクテリウムｓｐ－１０６９６に由来し、配列番号８として開示される、ＧＨ５キシラナーゼ
ＧＨ１０キシラナーゼＢ：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来であり配列番号１０として開示される、ＧＨ１０キシラナーゼ
ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼＡ：アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来であり配列番号１２として開示される、ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼ
セルラーゼＡ／Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ １．５Ｌ：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ混合物。このセルラーゼ組成物は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）によって発現される全てのセルラーゼ活性を含むであろう（例えば、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼ）。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ １．５Ｌから市販
１５ｍＬ繊維洗浄アッセイの手順
１．粗繊維試料を、緩衝液（ｐＨ４～５、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム最終濃度）中に懸濁して、５％乾燥固体を含有する１５ｍＬスラリーを得た。総繊維乾燥重量の量を記録した（重量ｆｉｂｅｒ）（正確なｐＨは実施例に明記されている）。
２．このスラリーに、キシラナーゼとセルラーゼとの混合物（酵素の正確な量は実施例で指定されている）及び４００ｐｐｍのＳＯ２（最終濃度）を添加した。
３．試料を、４０～４８℃の温度（実施例で指定された正確な温度）のインキュベーションシェーカ中において、６００ｒｐｍで４時間インキュベートした。
４．インキュベーション後、繊維をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐフィルタユニットで真空濾過した。
５．保持した繊維を、蒸留水で２０ｍＬの体積に再懸濁し、十分にボルテックスし、再び真空濾過に供する。
６．抽出されたデンプン及びグルテンを含有する２つの濾液をプールした。
７．（６）からの合わせた濾液を遠心分離した（３，５００ｒｐｍ、２０分）。
８．遠心分離後、上清を、デンプン及びグルテンのペレットを乱さないように、５０ｍＬの血清用ピペットを用いて緩慢に除去した。工程５～工程８をもう一度繰り返した。
９．（８）からのペレットを、各洗浄工程において２０ｍＬの蒸留水を用いて２回洗浄して、可溶化構成成分を除去した。
１０．洗浄及び上清の最終的な除去の後、ペレットを含む１０ｍＬの総体積が残った。過剰な水を、Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒを用いて除去した（方法：水性、最大６２℃、２時間、３，０００ｒｐｍ、５ｍｂａｒ）。
１１．冷却の際、試料を秤量し（重量ｐｅｌｌｅｔ）、均一性を達成するために激しくボルテックスした。
１２．（１１）からのスラリー１７０μＬを、ＬＥＣＯスズカプセル（ＮＣ９８０４３００、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中へ広口径チップを用いてピペッティングし、正確な重量を記録した（重量ｓｌｕｒｒｙ）。
１３．試料を、ＬＥＣＯ ＦＰ６２８を用いて全窒素（ＴｏｔＮ）について分析し、６．２５（Ｊｏｎｅｓ、ＵＳＤＡ Ｃｉｒｃｕｌａｒ Ｎｏ １８３、１９３１）の窒素－タンパク質因子を使用して試料のタンパク質パーセントに変換した。
１４．タンパク質放出の総量は、ペレットのタンパク質パーセント及び最終重量を用いて計算した。次いで、放出されたタンパク質のグラムを、繊維乾燥固体の出発グラムに正規化して戻す。
計算：
配列番号１のサーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）に由来するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの性能を、表２に示す実験条件で１５ｍＬ繊維洗浄アッセイを用いて試験した。放出されたタンパク質の量を表３に示す。結果は、各条件での３回の別々の実験に基づく。
結果を平均±標準偏差として示す（ｎ＝３）。
配列番号２のケイソマイセス・カルネウス（Ｋｅｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｎｅｕｓ）に由来するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの性能を、表４に示す実験条件で１５ｍＬ繊維洗浄アッセイを用いて試験した。放出されたタンパク質の量を表５に示す。結果は、各条件での３回の別々の実験に基づく。
結果を平均±標準偏差として示す（ｎ＝３）。
実施例４：
酵素：
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ：配列番号１であるサーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）に由来する、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
ＧＨ１０キシラナーゼＢ：配列番号１０であるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来する、ＧＨ１０キシラナーゼ
ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼＡ：配列番号１２であるアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来する、ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼ
セルラーゼＡ：トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のセルラーゼ混合物。このセルラーゼ組成物は、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）によって発現される全てのセルラーゼ活性を含むであろう（例えば、エンドグルカナーゼ及びセロビオヒドロラーゼ）。Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ １．５Ｌから市販
０．５ｇの培地スループット（ＭＴＰ）繊維アッセイ（１５ｍＬ繊維洗浄アッセイ）を、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡと組み合わせて、セルラーゼＡ、ＧＨ１０キシラナーゼＢ及びＧＨ６２アラビノフラノシダーゼＡを含むブレンドを用いて、４００ｐｐｍの亜硫酸水素塩（ＨＳＯ３ －）を有する２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ４．０で４８℃において１２０分間、繊維乾燥物質の１グラム当たり１０００μｇの酵素タンパク質の用量でインキュベートする、５％繊維乾燥物質を用いて行った。ブレンドは、酵素タンパク質に基づいて、３０％タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡ、１０．５％のＧＨ１０キシラナーゼＢ、３．５％のＧＨ６２アラビノフラノシダーゼＡ及び残り５６％のセルラーゼＡからなる。亜硫酸水素塩を、Ｎａ２Ｓ２Ｏ５＋Ｈ２Ｏ→２Ｎａ＋＋２ＨＳＯ３ －の反応後、二亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）を緩衝液に添加することによって産生する。比較のために、低用量（７００μｇのＥＰ／ｇ－ｄｓ繊維）及び高用量（１０００μｇのＥＰ／ｇ－ｄｓ繊維）の両方で、８０％のセルラーゼＡ、１５％のＧＨ１０キシラナーゼＡ及び５％のＧＨ６２アラビノフラノシダーゼＡのみ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡを含まない）を含有するブレンドを含めた。１６．７９％の残留デンプン及び１０．００％の残留タンパク質があるトウモロコシ繊維を、ＭＴＰ繊維アッセイの基質として使用した。以下の特定の処理における、デンプン＋グルテン（乾燥物質）及びトウモロコシ繊維からの個々のタンパク質の放出を測定した。
したがって、セルラーゼＡ＋ＧＨ１０キシラナーゼＢ＋ＧＨ６２アラビノフラノシダーゼＡの上にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡを添加すると、トウモロコシ湿潤製粉プロセスにおいて、デンプン＋グルテン及びタンパク質の収量を有意に増加させることができる。
実施例５ 繊維洗浄におけるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの使用によるタンパク質放出の増加
１５ｍＬの繊維洗浄アッセイを、表７の条件を用いて２回の実験にわたって行う。全ての処理は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼ及びキシラナーゼＡのブレンドを受けた。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼ対キシラナーゼＡの比は、ミリグラム酵素タンパク質基準でおよそ９０：１０であった。各タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）を適切な処理に添加した一方、対照は、セルラーゼ及びキシラナーゼＡのみを含有した。ＬＥＣＯ ＦＰ６２８を用いて全窒素を決定し、繊維乾燥固体の出発グラム（ｇＤＳ）に対して正規化した。試験したＰＤＩ多様性を表２に示し、いくつかの実験にわたるタンパク質放出の結果を表３に示す。
実施例６ 大規模繊維洗浄アッセイにおけるトウモロコシ繊維からのタンパク質収量増加における単一チオレドキシンドメインの有効性
大規模トウモロコシ繊維洗浄アッセイ（５グラムのアッセイ）：
５グラムのトウモロコシ繊維アッセイは、一般に、プロセスに妥当な条件（ｐＨ３．５～４、温度およそ４８～５２℃）で１時間～４時間の期間にわたり、酵素の存在下において、湿潤製粉植物から得られた湿潤繊維試料をインキュベートする工程を含む。インキュベーション後、繊維を、７５ミクロン以下のスクリーンに移し入れて圧搾し、主に分離されたデンプン及びグルテンからなる濾液を収集する。洗浄プロセスをスクリーン上で数回繰り返し、洗浄物を最初の濾液と共に収集した。収集した濾液を一晩静置した後、上清を真空によって吸引した。残りの濾液及び不溶物を、５０ｍＬの管に注ぎ、Ａｖａｎｔｉ Ｊ－Ｅ中、３，５００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、デンプン及びグルテンをペレット化した。上清をデカントし、残ったペレットを、Ｌａｂｃｏｎｃｏ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｉｅｒで一晩又は全ての水分が除去されるまで凍結乾燥した。試料を、ＳＰＥＸ ＳａｍｐｌｅＰｒｅｐ Ｇｅｎｏｇｒｉｎｄｅｒを用いて１７５０ｒｐｍで１分間粉砕した。１００～１５０ミリグラムの試料を秤量して記録した。試料を、ＬＥＣＯ ＦＰ６２８を用いて全窒素について流し、６．２５の窒素－タンパク質因子を使用して、試料のタンパク質パーセントに変換した（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｂ．（１９３１）。食品及び飼料中の窒素の割合を、タンパク質の割合に変換するための因子。ＵＳＤＡ Ｃｉｒｃｕｌａｒ，１８３，１－２２．）。タンパク質放出の総量は、ペレットのタンパク質パーセント及び最終重量を用いて計算した。次いで、放出されたタンパク質のグラムを、繊維乾燥固体の出発グラムに正規化して戻した。
５グラム繊維アッセイをｐＨ４で実行し、繊維を４８℃で２時間、４００ｐｐｍの二酸化硫黄によりインキュベートした。全ての処理は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼとＧＨ５キシラナーゼＡとのブレンドで構成される酵素組成物を受けた。トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）とＧＨ５キシラナーゼＡとの比は、ミリグラム酵素タンパク質基準でおよそ９０：１０であった。各実験酵素（配列番号１又は５）を適切な処理に添加した一方、対照は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼとＧＨ５キシラナーゼＡとのブレンドのみを含有していた。ＬＥＣＯ ＦＰ６２８を用いて全窒素を決定し、繊維乾燥固体（ｇＤＳ）の出発グラムに正規化した。試験したＰＤＩ多様性を表１０に示し、いくつかの実験にわたるタンパク質放出の結果を表１１に示す。
実施例７
サーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）由来のＰＤＩ（配列番号１）の活性を、０～１０μｇ／ｍＬのＰＤＩ（アッセイ中濃度）及び２ｍＭのＤＴＴを用いて、インスリン活性アッセイに記載されるように実行した。インタクトなインスリンに対するＡペプチド鎖の得られた質量ピーク面積及びインタクトなインスリンに対するＢペプチド鎖の質量ピーク面積を表１２に示す。
酵素又はＤＴＴのいずれかが存在しない場合、ウシインスリン中のごく少量のシスチンが還元される一方、ＰＤＩの存在下では、有意な量のシスチンが還元されて、インスリンがＡペプチド及びＢペプチドに分離される。
実施例８
サーモアスカス・クラスタセウス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ ｃｒｕｓｔａｃｅｕｓ）由来のＰＤＩ（配列番号１）の活性を、０～１０μｇ／ｍＬのＰＤＩ（アッセイ中濃度）及び２．９ｍＭの亜硫酸塩を用いて、インスリン活性アッセイに記載されるように実行した。インタクトなインスリンに対するＡペプチド鎖の得られた質量ピーク面積及びインタクトなインスリンに対するＢペプチド鎖の質量ピーク面積を表１３に示す。
酵素又は亜硫酸塩のいずれかが存在しない場合、ウシインスリン中のごく少量のシスチンが還元される一方、ＰＤＩの存在下では、有意な量のシスチンが還元されて、インスリンがＡペプチド及びＢペプチドに分離される。

Claims (73)

  1. 湿潤製粉プロセスにおいてトウモロコシ穀粒からのデンプン収量及び／又はグルテン収量を増加させる方法であって、粉砕トウモロコシ穀粒、特に前記粉砕穀粒の繊維豊富画分を、有効量の、酸化、還元又は異性化を含むタンパク質ジスルフィド結合の変化を触媒するポリペプチド、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（ＥＣ５．３．４．１）又はチオレドキシンペプチドと接触させることを含む方法。
  2. 前記湿潤製粉プロセス中、粉砕穀粒から放出されるデンプン及び／又はグルテン、特に不溶性デンプン及びグルテンの量は、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドが存在しない／添加されないプロセスと比較して増加する、請求項１に記載の方法。
  3. 乾燥固体１グラム当たりの放出されるタンパク質ｍｇ（ｍｇ／ｇＤＳ）として測定される前記増加は、ＰＤＩの添加なしと比較して少なくとも０．５％ポイント、少なくとも０．７５％ポイント、少なくとも１．０％ポイント、少なくとも１．５％ポイント、少なくとも２．５％ポイント、例えば少なくとも５．０％ポイントであり、繊維洗浄は、３．５～５．５の範囲のｐＨ、例えばｐＨ４．０、４．５又は５．０及び少なくとも３００μｇ ＥＰ／ｇＤＳの酵素投与量で行われる、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、特に繊維洗浄工程中に存在する／繊維画分に添加される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ａ）前記トウモロコシ穀粒を水に浸漬させて、浸漬穀粒を生成する工程と、
    ｂ）前記浸漬穀粒を粉砕して、粉砕穀粒を生成する工程と、
    ｃ）前記粉砕穀粒から胚を分離して、繊維、デンプン及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を生成する工程と、
    ｄ）前記トウモロコシ穀粒塊、特に微細繊維画分を繊維洗浄手順に供し、前記繊維からデンプン及びグルテンを分離する工程と
    を含み、少なくともＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、工程ｄ）前又は中に存在する／添加される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ｅ）前記グルテンから前記デンプンを分離する工程と、任意選択的に、
    ｆ）前記デンプンを洗浄する工程と
    を更に含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、繊維洗浄中、少なくとも１０μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも２５μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも５０μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも７５μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも１００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも２００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも３００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、少なくとも５００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、例えば１０～２０００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、２５～１０００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、５０～８００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳ、１００～５００μｇ ＥＰ／ｇ ＤＳの範囲の量で存在する／添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. ＳＯ２は、繊維洗浄中、少なくとも２００ｐｐｍ、少なくとも３００ｐｐｍ、少なくとも４００ｐｐｍ、少なくとも４５０ｐｐｍ、少なくとも５００ｐｐｍ、少なくとも６００ｐｐｍ、少なくとも７００ｐｐｍ、少なくとも８００ｐｐｍ、例えば２００～３０００ｐｐｍ、３００～２０００ｐｐｍ、４００～８００ｐｐｍの範囲などの量で存在する／添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 有効量の１つ以上の加水分解酵素は、前記繊維洗浄工程前又は中に存在し／添加され、前記加水分解酵素の少なくとも１つは、キシラナーゼ及び／又はセルラーゼから選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記キシラナーゼは、ＧＨ５ポリペプチド、ＧＨ８ポリペプチド、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ１０ポリペプチド、ＧＨ１１ポリペプチド又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記加水分解酵素は、１つ以上のセルラーゼを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記セルラーゼは、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）及びベータ－グルコシダーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記セルラーゼは、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼＩ、セロビオヒドロラーゼＩＩ又はそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の酵素を含む、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）に由来する、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記セルラーゼは、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－グルコシダーゼバリアント及びペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）（エメルソニイ（ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ））ＧＨ６１ポリペプチドを含有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼ調製物を有する、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ＧＨ１０キシラナーゼ、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）ベータ－キシロシダーゼからなる群から選択される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記セルラーゼは、
    ｉ）配列番号１４のＧＨ１０キシラナーゼ、配列番号１５のベータ－キシロシダーゼ、配列番号１６のセロビオヒドロラーゼＩ、配列番号１７のセロビオヒドロラーゼＩＩ、配列番号１８のベータ－グルコシダーゼ、配列番号１９のＧＨ６１、又は
    ｉｉ）配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、配列番号１９と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％の同一性を有するポリペプチド、及び
    ｉｉｉ）トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来の少なくとも１つのエンドグルカナーゼ
    を含む組成物から選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記加水分解酵素は、アラビノフラノシダーゼを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記アラビノフラノシダーゼは、ＧＨ４３ポリペプチド、ＧＨ６２ポリペプチド及びＧＨ５１ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 工程ｃ）からの繊維、デンプン及びグルテンを含む前記トウモロコシ穀粒塊は、工程ｄ）での前記繊維洗浄手順前に更なる粉砕工程、好ましくは微粉砕工程に供される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記繊維洗浄手順は、向流洗浄構成で流体連結されている複数のスクリーンユニット（Ｓ１．．．Ｓ４）を含む繊維洗浄システムを使用して行われ、各スクリーンユニットは、トウモロコシ穀粒塊と液体との流れを２つの画分：第１の画分（ｓ）及び第２の画分（ｆ）に分離するように構成され、前記第２の画分（ｆ）は、前記第１の画分（ｓ）を上回る、重量％で測定された量の繊維を含有し、及び任意選択的に、空間（Ｖ）は、前記システム内に配置され、且つ前記第１の画分（ｓ）の１つ、前記第２の画分（ｆ）の１つ又は混合された第１及び第２の画分（ｓ、ｆ）、好ましくは第２の画分（ｆ）のみを受け入れるように流体連結され、及び前記空間内に受け入れられた一方又は両方の画分に対してインキュベーション時間を提供するように構成され、且つ前記それによりインキュベートされた一方又は両方の画分を下流のスクリーンユニット（Ｓ４）に排出し、前記システムは、
    － トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流スクリーンユニット（Ｓ１）に注入することと、
    － 前記最上流スクリーンユニット（Ｓ１）からの前記第１の画分（ｓ１）を、デンプンを含有する生成物流として排出することと、
    － プロセス水を注入することであって、好ましくはプロセス水を最下流スクリーンユニット（Ｓ４）に注入するように配置される、注入することと、
    － 最下流スクリーンユニット（Ｓ４）から、前記第２の画分（ｆ４）を、前記最初のトウモロコシ穀粒塊を下回る量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として排出することと、
    － 任意選択的に、前記システムに加水分解酵素を導入することと
    を行うように構成される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記繊維洗浄手順は、繊維洗浄システムであって、前記繊維洗浄システムにおける少なくとも３５分間且つ４８時間未満の総保持時間を提供するように構成された空間（Ｖ）／タンクを含む繊維洗浄システムの使用を含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記空間（Ｖ）は、５０～１０００ｍ３の範囲の体積を有する、請求項２０又は２１に記載の方法。
  23. 前記空間（Ｖ）は、８０及び２５０ｍ３の範囲の体積を有する、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記繊維洗浄システム内に構成された前記空間（Ｖ）／タンク内の前記インキュベーション時間は、少なくとも５分間且つ４８時間未満、例えば３５分間～２４時間、３５分間～時間、３５分間～６時間、３５分間間～５時間、３５分間～４時間、３５分間～３時間、３５分間～２時間、４５分間～４８時間、４５分間～２４時間、４５分間～１２時間、４５分間～６時間、４５分間～５時間、４５分間～４時間、４５分間～３時間、４５分間～２時間である、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. インキュベーション温度は、２５℃～９５℃、例えば２５～９０℃、２５～８５℃、２５～８０℃、２５～７５℃、２５～７０℃、２５～６５℃、２５～６０℃、２５～５５℃、２５～５３℃、２５～５２℃、３０～９０℃、３０～８５℃、３０～８０℃、３０～７５℃、３０～７０℃、３０～６５℃、３０～６０℃、３０～５５℃、３０～５３℃、３０～５２℃、３５～９０℃、３５～８５℃、３５～８０℃、３５～７５℃、３５～７０℃、３５～６５℃、３５～６０℃、３５～５５℃、３５～５３℃、３５～５２℃、３９～９０℃、３９～８５℃、３９～８０℃、３９～７５℃、３９～７０℃、３９～６５℃、３９～６０℃、３９～５５℃、３９～５３℃、３９～５２℃、好ましくは４６～５２℃である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記１つ以上の加水分解酵素は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記粉砕トウモロコシ穀粒塊の１つ以上の画分と混合／接触される１つ以上の加水分解酵素の前記有効量は、０．００５～０．５ｋｇの酵素タンパク質／前記湿潤製粉プロセスに入るトウモロコシ穀粒のメートルトンである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. ＳＯ２源は、二亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ５）、ＮａＨＳＯ３及び／又はＳＯ２ガスの添加から選択される、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドは、レドックスタンパク質のチオレドキシンスーパーファミリーに属する少なくとも１つの触媒ドメインを含み、前記ドメインは、ＣＸＸＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記ＰＤＩは、少なくとも１つの非触媒ドメインによって分離されている、ＣＸＸＣモチーフを有することによって特徴付けられる活性部位をそれぞれ含む２つの触媒ドメインを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記ＣＸＸＣモチーフは、ＣＧＨＣ、ＣＴＨＣ、ＣＰＨＣ、ＣＧＰＣ及びＣＳＭＣ、特にＣＧＨＣ又はＣＧＰＣからなる群から選択される、請求項２９又は３０に記載の方法。
  32. 前記触媒ドメインは、ファミリーＰｆ０００８５に属する、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ＰＤＩは、３ドメイン構造Ｐｆ０００８５－Ｐｆ１３８４８－Ｐｆ０００８５を含み、中央のＰｆ１３８４８ドメインは、２つのＰｆ０００８５ドメインであって、一方がＮ末端にあり、及び他方がＣ末端にある、２つのＰｆ０００８５ドメインによって隣接される、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ＰＤＩは、
    （ａ）配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）１つ以上（いくつか）の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号１の前記成熟型ポリペプチドのバリアントと、
    （ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＰＤＩは、
    （ａ）配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号２の前記成熟型ポリペプチドのバリアントと、
    （ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＰＤＩは、
    （ａ）配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号３の前記成熟型ポリペプチドのバリアントと、
    （ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＰＤＩは、
    （ａ）配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号４の前記成熟型ポリペプチドのバリアントと、
    （ｃ）ＰＤＩ活性を有する（ａ）又は（ｂ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記チオレドキシンペプチドは、
    （ａ）配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）１つ以上の位置に置換、欠失及び／又は挿入を含む、配列番号５の前記成熟型ポリペプチドのバリアントと、
    （ｃ）チオレドキシンペプチド活性を有する（ａ）又は（ｂ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記キシラナーゼは、
    （ａ）配列番号８のポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
    （ｂ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）の前記ポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、請求項１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記キシラナーゼは、
    （ａ）配列番号１１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
    （ｂ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）の前記ポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記アラビノフラノシダーゼは、
    （ａ）配列番号１３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
    （ｂ）アラビノフラノシダーゼ活性を有する（ａ）の前記ポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記キシラナーゼは、
    （ａ）配列番号１０の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
    （ｂ）キシラナーゼ活性を有する（ａ）の前記ポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記アラビノフラノシダーゼは、
    （ａ）配列番号１２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド、
    （ｂ）アラビノフラノシダーゼ活性を有する（ａ）の前記ポリペプチドの断片
    からなる群から選択される、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記セルラーゼは、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）又はフミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｕｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）に由来する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記セルラーゼは、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）に由来するＣＢＨ Ｉ及びＣＢＨ ＩＩを有するトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）バックグラウンドセルラーゼに由来する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
    （ａ）配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）配列番号１のアミノ酸２１～５１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｃ）配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｄ）配列番号１の成熟型ポリペプチドから、配列番号１の前記成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
    （ｅ）配列番号２０の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
    （ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
  47. 配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項４６に記載のポリペプチド。
  48. 配列番号１の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項４６又は４７に記載のポリペプチド。
  49. 配列番号１若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号１のアミノ酸２１～５１６を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項４６に記載のポリペプチド。
  50. タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
    （ａ）配列番号２と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸２１～５１３と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｃ）配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｄ）配列番号２の成熟型ポリペプチドから、配列番号２の前記成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
    （ｅ）配列番号２１の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
    （ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
  51. 配列番号２と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項５０に記載のポリペプチド。
  52. 配列番号２の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項５０又は５１に記載のポリペプチド。
  53. 配列番号１若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号２のアミノ酸２１～５１３を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５０に記載のポリペプチド。
  54. タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
    （ａ）配列番号３と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）配列番号３のアミノ酸２１～５１６と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｃ）配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｄ）配列番号３の成熟型ポリペプチドから、配列番号３の前記成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
    （ｅ）配列番号２２の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
    （ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
  55. 配列番号３と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項５４に記載のポリペプチド。
  56. 配列番号３の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項５４又は５５に記載のポリペプチド。
  57. 配列番号３若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号３のアミノ酸２１～５１６を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５４に記載のポリペプチド。
  58. タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する単離又は精製ポリペプチドであって、
    （ａ）配列番号４と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）配列番号４のアミノ酸２１～５１７と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｃ）配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｄ）配列番号４の成熟型ポリペプチドから、配列番号４の前記成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
    （ｅ）配列番号２３の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
    （ｆ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される単離又は精製ポリペプチド。
  59. 配列番号４と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項５８に記載のポリペプチド。
  60. 配列番号４の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項５８又は５９に記載のポリペプチド。
  61. 配列番号１若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号４のアミノ酸２１～５１７を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項５８に記載のポリペプチド。
  62. タンパク質ジスルフィド結合を還元する能力を有する単離又は精製チオレドキシンポリペプチドであって、
    （ａ）配列番号５と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｂ）配列番号５のアミノ酸１～１１０と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｃ）配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドと、
    （ｄ）配列番号５の成熟型ポリペプチドから、配列番号５の前記成熟型ポリペプチド中の１つ又はいくつかのアミノ酸の置換、欠失又は付加によって誘導されるポリペプチドと、
    （ｅ）配列番号２４の配列をコードする成熟型ポリペプチドと少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、
    （ｆ）チオレドキシン活性を有する（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）の前記ポリペプチドの断片と
    からなる群から選択される単離又は精製チオレドキシンポリペプチド。
  63. 配列番号５と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項６２に記載のポリペプチド。
  64. 配列番号５の成熟型ポリペプチドと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、請求項６２又は６３に記載のポリペプチド。
  65. 配列番号５若しくはその成熟型ポリペプチド又は配列番号５のアミノ酸１～１１０を含むか、それから本質的になるか又はそれからなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
  66. 湿潤製粉プロセス中、粉砕穀粒の繊維豊富画分から放出されるデンプン及び／又はグルテン、特に不溶性デンプン及びグルテンの量は、ＰＤＩ又はチオレドキシンペプチドが繊維洗浄工程において存在しない／添加されないプロセスと比較して増加する、請求項４６～６５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  67. 請求項４６～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む組成物。
  68. 請求項１０に記載のキシラナーゼ及び／又は請求項１１～１６のいずれか一項に記載のセルラーゼを更に含む、請求項６７に記載の組成物。
  69. 請求項４６～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む全ブロス配合物又は細胞培養組成物。
  70. 請求項４６～６６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離又は精製ポリヌクレオチド。
  71. 請求項７０に記載のポリヌクレオチドを含む核酸構築物又は発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドは、発現宿主において前記ポリペプチドの生成を誘導する１つ以上の異種制御配列に作動可能に連結されている、核酸構築物又は発現ベクター。
  72. 請求項７０に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリペプチドの生成を誘導する１つ以上の異種制御配列に作動可能に連結されているポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞。
  73. タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ活性又はチオレドキシンペプチド活性を有するポリペプチドを生成する方法であって、請求項７２に記載の組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成を導く条件下で培養することと、任意選択的に前記ポリペプチドを回収することとを含む方法。
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