KR20230120133A - 옥수수 습식 제분에서의 개선된 섬유질 세척 - Google Patents

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Abstract

습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터의 총 전분 수율 및/또는 글루텐 수율을 증가시키는 방법으로서, 옥수수 낟알 또는 옥수수 낟알 분획을 단백질 디설파이드 이소머라제 또는 티오레독신과 혼합하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.

Description

옥수수 습식 제분에서의 개선된 섬유질 세척
본 발명은 바람직하게는 섬유질 세척 중에, 옥수수 낟알을 효소 조성물과 접촉시켜 습식 제분 공정에서 상기 옥수수 낟알로부터의 전분 및/또는 글루텐 수율을 향상/증가시키는 방법에 관한 것이다.
통상적인 옥수수 습식 제분은 전분 및 배(germ), 글루텐(단백질), 및 섬유질을 포함하는 여러 부산물의 회수 및 정제를 위해 고안된 공정이다. 섬유질은 가장 가치가 적은 부산물이므로, 업계에서는 섬유질 분획을 줄이면서 전분과 글루텐과 같은 보다 가치 있는 산물의 수율을 높이기 위해 상당한 노력을 기울여왔다. 고품질 전분은 건조 전분, 변성 전분, 덱스트린, 감미제, 및 알코올과 같은 제품으로 추가 가공한 후 다양한 상업적 용도로 사용할 수 있어 가치가 높다. 글루텐은 일반적으로 옥수수 글루텐 밀(meal)(약 60% 단백질) 또는 옥수수 글루텐 사료(약 20% 단백질)와 같이 동물 사료로 사용된다.
습식 제분 공정은 사용되는 특정 제분 설비에 따라 크게 다를 수 있지만, 일반적으로 공정은 곡물 세정, 수침, 분쇄, 배 분리, 2차 분쇄, 섬유질 분리, 글루텐 분리, 및 전분 분리를 포함한다. 옥수수 낟알을 세정한 후, 일반적으로 시간과 온도가 제어되는 조건하에 물 또는 묽은 SO2 용액에 침지하여 옥수수 낟알을 연화시킨다. 이어서, 낟알을 분쇄하여 과피를 부수고 낟알의 나머지 부분으로부터 배를 분리한다. 주로 섬유질, 전분, 및 글루텐으로 구성된 나머지 슬러리를 미분쇄하고 섬유질 세척 공정에서 스크리닝하여 전분 및 글루텐으로부터 섬유질을 분리한 후, 세척/여과 공정에서 글루텐과 전분을 분리하고 전분을 정제할 수 있다.
습식 제분 공정의 수침 단계에 효소를 사용하는 것과 같이, 습식 제분 공정의 여러 단계에서 효소를 사용하는 것이 제안된 바 있다. 상업용 효소 제품 Steepzyme®(Novozymes A/S에서 시판)은 습식 제분 공정의 제1 단계, 즉 옥수수 낟알을 물에 침지하는 수침 단계에 적합한 것으로 나타났다.
보다 최근에는, 옥수수 습식 제분 중의 총 가공 시간을 크게 줄이고 가공제로서 이산화황을 사용할 필요가 없도록 프로테아제를 사용하는 변형된 습식 제분 공정인 "효소적 제분"이 개발되었다. Johnston et al., Cereal Chem, 81, p. 626-632 (2004).
US 6,566,125는 옥수수로부터 전분을 얻는 방법으로서, 옥수수 낟알을 물에 침지하여 불린 옥수수 낟알을 생성하는 단계, 불린 옥수수 낟알을 분쇄하여 분쇄된 옥수수 슬러리 생성하는 단계, 및 분쇄된 옥수수 슬러리를 효소(예를 들어, 프로테아제)와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다.
US 5,066,218은 곡물, 특히 옥수수의 제분 방법으로서, 곡물을 세정하는 단계, 곡물을 물에 담가 연화시키는 단계, 및 이어서 셀룰라제 효소로 곡물을 제분하는 단계를 포함하는 방법을 개시한다.
WO 2002/000731은 작물 낟알을 처리하는 공정으로서, 낟알을 물에 1~12시간 동안 침지하는 단계, 불린 낟알을 습식 제분하는 단계, 및 산성 프로테아제를 포함하는 하나 이상의 효소로 낟알을 처리하는 단계를 포함하는 공정을 개시한다.
WO 2002/000911은 전분 글루텐 분리 공정으로서, 제분 전분을 산성 프로테아제에 적용하는 단계를 포함하는 공정을 개시한다.
WO 2002/002644는 제분 공정의 전분 글루텐 분리 단계로부터 얻은 전분 슬러리를 세척하는 공정으로서, 유효량의 산성 프로테아제를 포함하는 수용액으로 전분 슬러리를 세척하는 단계를 포함하는 공정을 개시한다.
WO 2014/082566 및 WO 2014/082564는 습식 제분에 사용하기 위한 셀룰로스분해 조성물을 개시한다.
WO2016/095856은 자일라나제 및 아라비노푸라노시다제를 포함하는 조성물 및 옥수수 습식 제분 공정의 섬유질 세척에 있어서 이러한 조성물의 용도를 개시한다.
WO2019/023222는 섬유질 세척 단계에서 GH5 자일라나제 및 GH30 자일라나제를 셀룰라제와 조합하여 적용하는 습식 제분 공정을 개시한다.
WO2017/088820은 섬유질 세척 단계에서 알파-L-아라비노푸라노시다제(GH62)를 단독으로 또는 자일라나제(GH10)와 조합하여 첨가하여 섬유질로부터 옥수수 습식 제분시 전분 방출을 개선하기 위한 공정을 개시한다.
WO2018/053220은 효소 인큐베이션 전용 공간/탱크를 사용하여 섬유질 세척 단계에 효소를 적용하는 데 최적화된 습식 제분 공정의 일부로서 섬유질 세척 시스템을 개시한다.
옥수수 습식 제분, 옥수수 낟알의 수침/침지 중, 옥수수 낟알의 분쇄 중, 및 전분 글루텐 분리에서 효소 사용의 효과가 당업계에서 조사되었지만, 옥수수 습식 제분과 관련된 에너지 소비 및 비용을 낮추고 전분 및 글루텐의 수율을 증가시킬 수 있는 개선된 기술이 여전히 필요하다.
제1 양태에서, 본 발명은 습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터의 전분 수율 및/또는 글루텐 수율을 증가시키는 방법으로서, 분쇄된 옥수수 낟알 또는 분쇄된 낟알의 분획, 특히 섬유질이 풍부한 분획을 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 유효량의 폴리펩티드(예컨대, 티오레독신 펩티드 또는 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)(EC 5.3.4.1))와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매할 수 있는 티오레독신 펩티드 또는 단백질 디설파이드 활성을 갖는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매할 수 있는 티오레독신 펩티드 또는 단백질 디설파이드 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체, 벡터, 및 숙주 세포; 및 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
정의
효소의 정의:
단백질 디설파이드 이소머라제(PDI): 용어 "단백질 디설파이드 이소머라제"(본원에서 PDI라고도 함)(EC 5.3.4.1)는 단백질이 산화, 환원, 또는 이성질화에 의해 접힐 때 단백질 내 잔기 사이의 디설파이드 결합의 형성 및 파괴를 촉매하는 효소를 의미한다. PDI는 산화환원 단백질의 티오레독신 수퍼패밀리의 구성원이며, 일반적으로 적어도 3개의 도메인, 즉 적어도 하나의 비촉매 도메인에 의해 분리된, 각각 CXXC, 바람직하게는 CGHC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는 2개의 촉매 도메인을 포함한다(Perri et al., 2016, Front. Cell Dev.Biol. 3:80, Hatahet and Ruddock, 2007, FEBS Journal 274: 5223-5234). 일 구현예에서, 활성 부위 모티프는 CGHC, CTHC, CPHC, 및 CSMC로부터 선택된다. 촉매 도메인은 일반적으로 단백질 도메인 패밀리의 대규모 컬렉션인 Pfam 데이터베이스(Mistry, et al., 2020, "Pfam: The protein families database in 2021", Nucleic Acids Research, doi: 10.1093/nar/gkaa913; http://pfam.xfam.org/)에 의해 분류되는 단백질 도메인 패밀리 Pf00085(티오레독신, https://pfam.xfam.org/family/Thioredoxin)에 속한다. 비촉매 도메인은 Pfam 도메인 Pf13848(티오레독신_6 도메인, https://pfam.xfam.org/family/PF13848)에 속할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 공정에 적합한 PDI는 폴리펩티드 모티프 CGHC, CTHC, CPHC, 또는 CSMC, 바람직하게는 CGHC로 이루어진 활성 부위를 포함하는 적어도 하나의 Pf00085 도메인을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, PDI는 Pf00085, Pf13848, Pf00085의 순차 순서로 배열된 도메인을 갖는 3-도메인 구조를 포함한다. 3개의 도메인은 펩티드 링커에 의해 분리될 수 있다. PDI 활성은 폴리펩티드가 실시예 페이지 57~59의 분석 섹션(디티오트레이톨을 사용한 인슐린 환원 분석)에서 기술되고 실시예 7에서 적용된 인슐린 환원 분석(DTT 존재하에서 인슐린을 기질로 사용)에서 활성을 가짐을 의미한다.
티오레독신펩티드(Trx): 용어 티오레독신은 시스테인 티올-디설파이드 교환에 의해 단백질 디설파이드 결합의 환원을 촉매하는 단백질을 의미한다. 티오레독신은 다른 단백질의 환원을 촉진하여 항산화제로서 작용한다(Collet and Messens, 2010, Antioxid. Redox Signal. 13, 1205-1216). 티오레독신은 일반적으로 크기가 약 12 kD인 작은 옥시리덕타제 효소이며 디티올-디설파이드 활성 부위, 예를 들어 CGPC를 포함한다. 티오레독신은 보편적으로 존재하며 식물과 박테리아에서 포유류에 이르는 많은 유기체에서 발견된다. 리보뉴클레아제, 융모생식샘자극 호르몬, 응고 인자, 글루코코르티코이드 수용체, 및 인슐린을 비롯하여 티오레독신에 대한 여러 시험관내 기질이 확인되었다. 인슐린의 환원은 전형적으로 활성 검사로서 사용된다. 티오레독신은 아미노산 서열 수준에서 CXXC 모티프에 2개의 인접 시스테인이 존재하는 것을 특징으로 한다. 이러한 2개의 시스테인은 다른 단백질을 환원시키는 티오레독신 능력의 핵심이다. 티오레독신 단백질은 또한, 글루타레독신, PDI, 및 디설파이드 옥시다제와 같은 다른 단백질의 구성요소로서도 발견되는 티오레독신 폴드라고 하는 특징적인 3차 구조를 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 티오레독신 펩티드는 산화환원 단백질의 티오레독신 수퍼패밀리의 구성원이며, 일반적으로 CXXC 모티프, 바람직하게는 CGPC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는 촉매 도메인을 포함한다. 티오레독신-유사 펩티드는 Pfam 데이터베이스(http://pfam.xfam.org/)에 의해 분류되는 단백질 도메인 패밀리 Pf00085(티오레독신, https://pfam.xfam.org/family/Thioredoxin)에 속하는 도메인을 포함한다. 티오레독신 펩티드 활성은 Pf00085 도메인을 포함하는 펩티드가 실시예에서 기술되는 인슐린 환원 분석에서 활성을 가짐을 의미한다. 본 발명에 따른 티오레독신 펩티드는 실시예, 예를 들어 실시예 7에 개시된 인슐린 환원 분석(DTT 존재하에서 인슐린을 기질로 사용)에서 활성을 가져야 한다.
아라비노푸라노시다제/아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 폴리펩티드: 용어 "아라비노푸라노시다제"는 알파-L-아라비노시드에서 말단 비환원성 알파-L-아라비노푸라노시드 잔기의 가수분해를 촉매하는 알파 L-아라비노푸라노시드 아라비노푸라노하이드롤라제(EC 3.2.1.55)를 의미한다. 이 효소는 알파-L-아라비노푸라노시드, (1,3)- 및/또는 (1,2)- 및/또는 (1,5)-연결을 포함하는 알파-L-아라비난, 아라비노자일란, 및 아라비노갈락탄에 작용한다. 알파-L 아라비노푸라노시다제는 아라비노시다제, 알파-아라비노시다제, 알파-L-아라비노시다제, 알파아라비노푸라노시다제, 다당류 알파-L-아라비노푸라노시다제, 알파-L-아라비노푸라노시드 하이드롤라제, L-아라비노시다제, 또는 알파-L-아라비나나제로도 알려져 있다. 아라비노푸라노시다제 활성은 40℃에서 30분 동안 200 μl의 총 부피 중 100 mM 아세트산나트륨 pH 5의 ml당 5 mg의 중점도 밀 아라비노자일란(Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Ireland)을 사용한 다음, AMINEX® HPX-87H 컬럼 크로마토그래피(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)로 아라비노스 분석을 수행하여 결정될 수 있다. 아라비노푸라노시다제는 예를 들어 문헌[Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, 및 Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696]에 따른 GH43, GH62, GH51 패밀리에서 발견될 수 있다.
베타-글루코시다제/베타-글루코시다제 활성을 갖는 폴리펩티드: 용어 "베타-글루코시다제"는 베타-D-글루코스의 방출과 함께 말단 비환원성 베타-D-글루코스 잔기의 가수분해를 촉매하는 베타-D-글루코시드 글루코하이드롤라제(E.C. 3.2.1.21)를 의미한다. 베타-글루코시다제 활성은 문헌[Venturi et al.,2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66]의 절차에 따라 p-니트로페닐-베타-D-글루코피라노시드를 기질로서 사용하여 결정될 수 있다. 베타-글루코시다제 1 단위는 0.01% TWEEN® 20을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 중 기질로서의 1 mM p-니트로페닐-베타-D-글루코피라노시드로부터 25℃, pH 4.8에서 분당 생성되는 1.0 μ몰의 p-니트로페놀레이트 음이온으로 정의된다.
베타-자일로시다제/베타-자일로시다제 활성을 갖는 폴리펩티드: 용어 "베타-자일로시다제"는 비환원성 말단으로부터 연이은 D-자일로스 잔기를 제거하기 위해 짧은 베타 (1→4)-자일로올리고당류의 엑소-가수분해를 촉매하는 베타-D-자일로시드 자일로하이드롤라제(E.C. 3.2.1.37)를 의미한다. 베타-자일로시다제 활성은 pH 5, 40℃에서 0.01% TWEEN® 20을 함유하는 100 mM 시트르산나트륨 중 기질로서의 1 mM p-니트로페닐-베타-D-자일로시드를 사용하여 결정될 수 있다. 베타-자일로시다제 1 단위는 0.01% TWEEN® 20을 함유하는 100 mM 시트르산나트륨 중 1 mM p-니트로페닐-베타-D-자일로시드로부터 40℃, pH 5에서 분당 생성되는 1.0 μ몰의 p-니트로페놀레이트 음이온으로 정의된다.
셀로바이오하이드롤라제/셀로바이오하이드롤라제 활성을 갖는 폴리펩티드: 용어 "셀로바이오하이드롤라제"는 사슬의 환원성 말단(셀로바이오하이드롤라제 I) 또는 비환원성 말단(셀로바이오하이드롤라제 II)으로부터 셀로바이오스를 방출하는, 셀룰로스, 셀로올리고당, 또는 임의의 베타-1,4-연결 글루코스 함유 중합체에서 1,4-베타-D-글루코시드 연결의 가수분해를 촉매하는 1,4-베타-D-글루칸 셀로바이오하이드롤라제(E.C. 3.2.1.91 및 E.C. 3.2.1.176)를 의미한다(Teeri, 1997, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). 셀로바이오하이드롤라제 활성은 문헌[Lever et al., 1972, Anal. Biochem. 47: 273-279; van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288; 및 Tomme et al., 1988, Eur. J. Biochem. 170: 575-581]에 기재된 절차에 따라 결정될 수 있다.
셀룰로스분해 효소 또는 셀룰라제/셀룰라제 활성 또는 셀룰로스분해 활성을 갖는 폴리펩티드: 용어 "셀룰로스분해 효소" 또는 "셀룰라제"는 섬유질과 같은 셀룰로스를 포함하는 임의의 물질을 포함하는, 셀룰로스계 물질을 가수분해하는 하나 이상의(예를 들어, 여러) 효소를 의미한다. 셀룰로스분해 효소는 엔도글루카나제(E.C 3.2.1.4), 셀로바이오하이드롤라제(E.C 3.2.1.91 및 E.C 3.2.1.150), 베타-글루코시다제(E.C. 3.2.1.21), 또는 이들의 조합을 포함한다. 셀룰로스분해 효소 활성을 측정하기 위한 두 가지 기본 접근법은 문헌[Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481]에서 검토된 바와 같이 (1) 전체 셀룰로스분해 효소 활성의 측정, 및 (2) 개별 셀룰로스분해 효소(엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제, 및 베타-글루코시다제) 활성의 측정을 포함한다. 전체 셀룰로스분해 효소 활성은 Whatman №1 여과지 미정질 셀룰로스, 박테리아 셀룰로스, 조류 셀룰로스, 면, 전처리 리그노셀룰로스 등을 비롯한 불용성 기질을 사용하여 측정될 수 있다. 가장 일반적인 전체 셀룰로스분해 활성 분석법은 Whatman №1 여과지를 기질로 사용하는 여과지 분석법이다. 이 분석법은 IUPAC(International Union of Pure and Applied Chemistry)에 의해 확립되었다(Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).
셀룰로스분해 효소 활성은 다음과 같은 조건하에서 셀룰로스분해 효소에 의한 셀룰로스계 물질의 가수분해 동안 당 생성/방출의 증가를 측정하여 결정될 수 있다: 셀룰로스분해 효소 단백질이 첨가되지 않은 대조군 가수분해와 비교하여, 40℃~80℃, 예를 들어 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 또는 80℃와 같은 적합한 온도, 및 4~9, 예를 들어 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 또는 9.0과 같은 적합한 pH에서 3~7일 동안 전처리 옥수수대(PCS)(또는 다른 전처리 셀룰로스계 물질)에서 셀룰로스 g당 1~50 mg의 셀룰로스분해 효소 단백질. 전형적인 조건은 1 ml 반응물, 세척 또는 미세척 PCS, 5% 불용성 고형분(건조 중량), 50 mM 아세트산나트륨 pH 5, 1 mM MnSO4, 50℃, 55℃, 또는 60℃, 72시간, AMINEX® HPX-87H 컬럼 크로마토그래피(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)에 의한 당 분석이다.
엔도글루카나제: 용어 "엔도글루카나제"는 셀룰로스, 셀룰로스 유도체(예컨대, 카복시메틸 셀룰로스 및 하이드록시에틸 셀룰로스), 리케닌에서의 1,4-베타-D-글리코시드 연결, 혼합 베타-1,3 글루칸, 예컨대 곡류 베타-D-글루칸 또는 자일로글루칸, 및 셀룰로스계 성분을 함유하는 다른 식물 물질에서의 베타-1,4 결합의 엔도가수분해를 촉매하는 엔도-1,4-(1,3;1,4)-베타-D-글루칸 4-글루카노하이드롤라제(E.C. 3.2.1.4)를 의미한다. 엔도글루카나제 활성은 환원당 분석에 의해 결정되는 환원성 말단의 증가 또는 기질 점도의 감소를 측정함으로써 결정될 수 있다(Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). 본 발명의 목적을 위해, 엔도글루카나제 활성은 pH 5, 40℃에서 문헌[Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268]의 절차에 따라 카복시메틸 셀룰로스(CMC)를 기질로 사용하여 결정된다.
패밀리 61 글리코시드 하이드롤라제: 용어 "패밀리 61 글리코시드 하이드롤라제" 또는 "패밀리 GH61" 또는 "GH61"은 문헌[Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, 및 Henrissat and Bairoch, 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696]에 따른 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 61에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 패밀리의 효소는 원래, 하나의 패밀리 구성원에서 매우 약한 엔도-1,4-베타-D-글루카나제 활성의 측정에 기초하여 글리코시드 하이드롤라제 패밀리로서 분류되었다. 이러한 효소의 구조 및 작용 모드는 비표준형이고, 진정한 글리코시다제로서 간주될 수 없다. 그러나, 이들은 셀룰라제 또는 셀룰라제의 혼합물과 함께 사용될 때 리그노셀룰로스의 분해를 향상시키는 능력에 기초하여 CAZy 분류로 유지된다. GH61 폴리펩티드는 최근 용해성 다당류 모노옥시게나제로 분류되었으며(Quinlan et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 208: 15079-15084; Phillips et al., 2011, ACS Chem. Biol. 6: 1399-1406; Lin et al., 2012, Structure 20: 1051-1061), "보조 활성 9" 또는 "AA9" 폴리펩티드로 표기된다.
가수분해 효소 또는 하이드롤라제/하이드롤라제 활성을 갖는 폴리펩티드: "가수분해 효소"는 기질을 분해하기 위해 물을 사용하는 임의의 촉매 단백질을 의미한다. 가수분해 효소는 셀룰라제(EC 3.2.1.4), 자일라나제(EC 3.2.1.8), 아라비노푸라노시다제(EC 3.2.1.55(비환원성 말단 알파-L-아라비노푸라노시다제); EC 3.2.1.185(비환원성 말단 베타-L-아라비노푸라노시다제)), 셀로바이오하이드롤라제 I(EC 3.2.1.150), 셀로바이오하이드롤라제 II(E.C. 3.2.1.91), 셀로바이오시다제(E.C. 3.2.1.176), 베타-글루코시다제(E.C. 3.2.1.21), 베타-자일로시다제(EC 3.2.1.37)를 포함한다.
자일라나제/자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드: 용어 "자일라나제"는 자일란에서 1,4-베타-D-자일로시드 연결의 엔도가수분해를 촉매하는 1,4-베타-D-자일란-자일로하이드롤라제(E.C. 3.2.1.8)를 의미한다. 자일라나제 활성은 37℃에서 0.01% TRITON® X-100 및 200 mM 인산나트륨 pH 6 중 기질로서의 0.2% AZCL-아라비노자일란을 사용하여 결정될 수 있다. 자일라나제의 1 단위는 200 mM 인산나트륨 pH 6 중 기질로서의 0.2% AZCL-아라비노자일란으로부터 37℃, pH 6에서 분당 생성되는 1.0 μ몰의 아주린으로 정의된다. 자일라나제는 예를 들어 GH5, GH8, GH30, GH10, 및 GH11 패밀리에서 발견될 수 있다.
GH5 폴리펩티드: 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스(http://www.cazy.org/)에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 5의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
GH8 폴리펩티드: 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스(http://www.cazy.org/)에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 8의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
GH30 폴리펩티드: 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스(http://www.cazy.org/)에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 30의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
GH10 폴리펩티드: http://www.cazy.org/에서 이용가능한 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스(http://www.cazy.org/)에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 10의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. (Lombard, V.; Golaconda Ramulu, H.; Drula, E.; Coutinho, P. M.; Henrissat, B. (21 November 2013). "The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013". Nucleic Acids Research. 42 (D1): D490-D495; Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B (January 2009). "The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics". Nucleic Acids Res. 37 (Database issue): D233-8).
GH11 폴리펩티드는 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 11의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
GH62 폴리펩티드: 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 62의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
GH43 폴리펩티드: 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 43의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
GH51 폴리펩티드: 탄수화물-활성 효소(CAZymes) 데이터베이스에서 글리코시드 하이드롤라제 패밀리 51의 구성원으로 분류되는 폴리펩티드로서, 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다.
기타 정의:
본 명세서 문맥에서 용어는 당업자에게 통상적인 방식으로 사용된다. 이러한 용어 중 일부가 아래에 설명되어 있다:
접촉 시간: 하나 이상의 효소가 기질과 반응하기 위해서는 하나 이상의 효소가 기질과 접촉되어야 한다. "접촉 시간"은 하나 이상의 효소의 유효량이 기질 덩어리의 적어도 분획과 접촉하는 기간을 의미한다. 효소는 접촉 시간 동안 기질 덩어리 전부와 접촉하지 않을 수 있지만, 하나 이상의 효소를 기질 덩어리와 혼합하면 접촉 시간 동안 기질 덩어리의 분획에 대한 효소 촉매 가수분해 가능성이 생긴다.
옥수수 낟알: 예를 들어, 마치종 옥수수, 경립종 옥수수, 유부종 옥수수, 줄무늬 옥수수, 사탕 옥수수, 찰옥수수 등을 포함하는 다양한 옥수수 낟알이 알려져 있다.
일부 옥수수 낟알은 낟알에서 배를 보호하는 "과피"라고 하는 외피를 가지고 있다. 이는 물과 수증기에 강하고 곤충과 미생물에 바람직하지 않다. "과피"에 의해 덮이지 않는 유일한 낟알 영역은 옥수수 속대에 대한 낟알의 부착점인 "팁 캡"이다.
옥수수 낟알 또는 옥수수 낟알 분획: 이 용어는 습식 제분의 공정에 걸쳐 옥수수 낟알을 설명하기 위해 사용된다. 옥수수 낟알이 분해되어 가공될 때, 이 용어가 사용되는 경우 옥수수 낟알의 모든 분획 부분이 포함되는 것으로 간주된다. 이 용어는 예를 들어 불린 낟알, 분쇄된 낟알, 옥수수 낟알 덩어리, 제1 분획, 제2 분획, 옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획 등을 포함한다.
옥수수 낟알 덩어리: 바람직하게는 섬유질, 글루텐, 및 전분을 포함하는 덩어리를 언급하는 데 사용되며, 바람직하게는 작물 낟알을 증기찜 처리하고 분쇄하고 섬유질, 글루텐, 및 전분을 포함하는 덩어리를 배로부터 분리하여 달성된다. 옥수수 낟알 덩어리가 섬유질 세척을 통해 이동함에 따라, 제1 분획(s) 및 제2 분획(f)을 포함하는 여러 분획으로 분리된다. 따라서, "옥수수 낟알 덩어리의 분획" 및 "옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획"은 특히 이러한 제1 분획(s) 및 제2 분획(f)을 지칭한다.
cDNA: 용어 "cDNA"는 진핵 또는 원핵 세포로부터 수득되는 스플라이싱된 성숙 mRNA 분자로부터 역전사에 의해 제조될 수 있는 DNA 분자를 의미한다. cDNA에는 상응하는 게놈 DNA에 존재할 수 있는 인트론 서열이 없다. 초기의 1차 RNA 전사체는 스플라이싱된 성숙 mRNA로 나타나기 전에, 스플라이싱을 포함한 일련의 단계를 통해 가공되는 mRNA 전구체이다.
암호화 서열: 용어 "암호화 서열"은 폴리펩티드의 아미노산 서열을 직접 지정하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 암호화 서열의 경계는 일반적으로, ATG, GTG, 또는 TTG와 같은 시작 코돈으로 시작하여 TAA, TAG, 또는 TGA와 같은 정지 코돈으로 종결되는 오픈 리딩 프레임에 의해 결정된다. 암호화 서열은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA, 또는 이들의 조합일 수 있다.
제어 서열: 용어 "제어 서열"은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 각각의 제어 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 천연적(즉, 동일한 유전자에서 유래)이거나 이종성(즉, 상이한 유전자에서 유래)일 수 있거나, 또는 서로에 대해 천연적이거나 이종성일 수 있다. 이러한 제어 서열은 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 프로모터, 신호 펩티드 서열, 및 전사 종결자를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 최소한, 제어 서열은 프로모터와, 전사 및 변역 정지 신호를 포함한다. 제어 서열에는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 암호화 영역과 제어 서열의 라이게이션을 용이하게 하는 특정 제한 부위를 도입하기 위해 링커가 제공될 수 있다.
발현: 용어 "발현"은 전사, 전사후 변형, 번역, 번역후 변형, 및 분비를 포함하는(이에 한정되지 않음), 폴리펩티드의 생산에 관련된 임의의 단계를 포함한다.
발현 벡터: 용어 "발현 벡터"는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며 이의 발현을 제공하는 제어 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 선형 또는 원형 DNA 분자를 의미한다.
단편: 용어 "단편"은 성숙 폴리펩티드의 아미노 및/또는 카복시 말단에서 하나 이상의(예를 들어, 여러) 아미노산이 없는 폴리펩티드를 의미하며, 단편은 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매할 수 있는 효소 활성, 예를 들어 단백질 디설파이드 이소머라제 활성 또는 티오레독신 펩티드 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 단편은 Pfam 패밀리 Pf00085에 속하는 적어도 하나의 티오레독신 도메인을 포함한다.
배: "배"는 옥수수 낟알의 유일하게 살아있는 부분이다. 여기에는 낟알이 옥수수 식물로 성장하는 데 필요한 필수 유전 정보, 효소, 비타민, 및 미네랄이 들어 있다. 황색 마치종 옥수수에서, 배의 약 25%는 옥수수 오일이다. 배에 덮이거나 둘러싸인 배젖은 낟알 건조 중량의 약 82%를 차지하며, 종자 발아를 위한 에너지(전분)원 및 단백질원이다. 연질 및 경질의 두 가지 유형의 배젖이 존재한다. 경질 배젖에서, 전분은 서로 조밀하게 채워져 있다. 연질 배젖에서, 전분은 조밀하지 않다.
글루텐: 글루텐은 2개의 더 작은 단백질인 글루테닌 및 글리아딘으로 이루어지는 단백질이다. 본원에서 "글루텐"은 옥수수 낟알에서 발견되는 대부분의 단백질을 지칭한다. 특정 구현예에서, 글루텐은 불용성 단백질(주로 알파-자인, 베타-자인, 및 감마-자인으로 구성됨)을 지칭한다. 옥수수 습식 제분의 주요 글루텐 산물은 옥수수 글루텐 밀(meal)(대략 60% 단백질) 및 옥수수 글루텐 사료(대략 20% 단백질)이다.
분쇄: 용어 "분쇄"는 옥수수 낟알을 더 작은 구성요소로 분해하는 것을 의미한다.
이종성: 숙주 세포에 대해 용어 "이종성"은 폴리펩티드 또는 핵산이 숙주 세포에서 자연발생하지 않음을 의미한다. 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 용어 "이종성"은 폴리펩티드 또는 핵산의 제어 서열, 예를 들어 프로모터, 또는 도메인이 자연적으로는 폴리펩티드 또는 핵산과 회합되지 않음, 즉 제어 서열이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 이외의 유전자로부터 유래됨을 의미한다.
숙주 세포: 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체 또는 발현 벡터로 형질전환, 형질감염, 형질도입 등이 되기 쉬운 임의의 세포 유형을 의미한다. 용어 "숙주 세포"는 복제 중에 발생하는 돌연변이로 인해 모세포와 동일하지 않은 모세포의 임의의 자손을 포함한다.
단리된: "단리된"이라는 용어는 예를 들어 다른 단백질, 핵산, 세포 등을 비롯한(이에 한정되지 않음), 자연에서 발견될 때 자연적으로 회합되어 있는 적어도 하나의 다른 물질 또는 구성요소로부터 분리되는 폴리펩티드, 핵산, 세포, 또는 기타 특정 물질 또는 구성요소를 의미한다. 단리된 폴리펩티드는 분비된 폴리펩티드를 함유하는 배양액을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
인큐베이션 시간: 옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획이 스크리닝 없이 섬유질 세척 중에 가수분해 효소와 접촉하는 시간.
여러 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 내부에서 물질이 효소의 "영향을 받도록 놓아두는" 공간(V)을 포함하는 시스템, 또는 "인큐베이터"를 이용하며, 이러한 상황에서 인큐베이션 시간은 다음에 의해 결정될 수 있다:
대안적으로, 인큐베이터로의 유입류가 시간당 부피 단위로 표현되는 경우:
성숙 폴리펩티드: 용어 "성숙 폴리펩티드"는 N-말단 가공(예를 들어, 신호 펩티드 제거) 후 성숙한 형태의 폴리펩티드를 의미한다.
일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 516이다.
일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 21 내지 513이다.
일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 21 내지 516이다.
일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 21 내지 517이다.
일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 1 내지 110이다.
성숙 폴리펩티드 암호화 서열: 용어 "성숙 폴리펩티드 암호화 서열"은 단백질 디설파이드 이소머라제 활성 또는 티오레독신 활성을 갖는 성숙 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 6의 뉴클레오티드 61 내지 362, 419 내지 797, 868 내지 1307, 및 1363 내지 1732이다. 다른 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 7의 뉴클레오티드 61 내지 362, 427 내지 805, 877 내지 1316, 1372 내지 1744이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 20의 뉴클레오티드 61 내지 1548이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 21의 뉴클레오티드 61 내지 1539이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 22의 뉴클레오티드 61 내지 1548이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 23의 뉴클레오티드 61 내지 1551이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드 암호화 서열은 서열번호 24의 뉴클레오티드 1 내지 330이다.
천연: 용어 "천연"은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다.
제분 설비: "제분 설비"는 제분소에서 사용되는 모든 설비를 지칭한다. 습식 제분 공정은 이용가능한 제분 설비에 따라 달라진다. 제분 설비의 예는 수침 탱크, 증발기, 스크류 프레스, 회전식 건조기, 탈수 스크린, 원심분리기, 하이드로사이클론 등일 수 있다. 각각의 제분 설비/제분 라인의 크기 및 수는 제분소에 따라 다를 수 있고, 이는 제분 공정에 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 섬유질 세척 스크린 유닛의 수는 다를 수 있고, 원심분리기의 크기도 다를 수 있다.
핵산 구성체: 용어 "핵산 구성체"는 자연발생적 유전자로부터 단리되거나 또는 자연에 존재하지 않는 방식으로 핵산의 절편을 포함하도록 변형되거나 또는 합성된 단일가닥 또는 이중가닥의 핵산 분자로서, 하나 이상의 제어 서열을 포함하는 핵산 분자를 의미한다.
작동가능하게 연결된: "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 제어 서열이 암호화 서열의 발현을 지시하도록 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열에 대해 적절한 위치에 제어 서열이 배치되어 있는 구성을 의미한다.
체류 시간: 하나 이상의 가수분해 효소와 옥수수 낟알 또는 옥수수 낟알 분획이 섬유질 세척 절차 중에 반응하도록 허용되는 시간.
일부 구현예에서, 체류 시간은 제1 스크린 유닛(S1)에 수용된 옥수수 낟알 덩어리 및 이의 하나 이상의 분획이 다시 섬유질 세척 시스템을 떠나기 전에 유효량의 하나 이상의 가수분해 효소와 접촉되는 기간이다. 체류 시간 동안, 옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획은 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로부터 제1 분획(s1)의 일부로서 또는 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로부터 제2 분획(f4)의 일부로서 섬유질 세척 시스템을 떠나기 전에 공간(V)에서 하나 이상의 가수분해 효소와 함께 인큐베이션된다.
체류 시간은 바람직하게는 본 발명과 관련하여 정의된 바와 같은 섬유질 세척 시스템에서 고형 물질이 머무르는 평균 기간으로서 추정될 수 있다. 이는 다음과 같은 관계식에 의해 추정될 수 있다:
대안적으로, 시스템으로의 유입류가 시간당 부피 단위로 표현되는 경우:
시스템의 부피는 일반적으로 시스템 내 모든 공극의 부피의 합과 동일하게 설정된다. 그러나, 시스템 내 튜빙은 일반적으로 작게 만들어지므로, 튜빙의 부피를 무시하는 것이 바람직할 수 있다.
스크리닝: 용어 "스크리닝"은 옥수수 낟알 덩어리를 제1 분획(s)과 제2 분획(f)으로 분리하고 이들 분획을 하나의 스크린 유닛에서 다른 스크린 유닛으로 이동시키는 공정을 의미한다. 비스크리닝 기간은 옥수수 낟알 덩어리 또는 이의 분획을 효소와 함께 인큐베이션하기 위해 제공되는 비분리 기간이다.
서열 동일성: 2개의 아미노산 서열간 또는 2개의 뉴클레오티드 서열간 관련성은 매개변수 "서열 동일성"에 의해 기술된다.
본 발명의 목적을 위해, 2개의 아미노산 서열간 서열 동일성은 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)의 Needle 프로그램(바람직하게는 버전 6.6.0 이상)에서 구현되는 바와 같은 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 사용하여 "가장 긴 동일성"의 결과로서 결정된다. 사용되는 매개변수는 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EBLOSUM62(BLOSUM62의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 프로그램이 가장 긴 동일성을 보고하기 위해서는, 명령행에 -nobrief 옵션을 지정해야 한다. "가장 긴 동일성"으로 표지된 Needle의 결과는 다음과 같이 계산된다:
(동일한 잔기 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내 갭의 총 수)
본 발명의 목적을 위해, 2개의 폴리뉴클레오티드 서열간 서열 동일성은 EMBOSS 패키지(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, 상기 인용)의 Needle 프로그램(바람직하게는 버전 6.6.0 이상)에서 구현되는 바와 같은 Needleman-Wunsch 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, 상기 인용)을 사용하여 "가장 긴 동일성"의 결과로서 결정된다. 사용되는 매개변수는 갭 오픈 페널티 10, 갭 연장 페널티 0.5, 및 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스이다. Needle 프로그램이 가장 긴 동일성을 보고하기 위해서는, 명령행에 nobrief 옵션을 지정해야 한다. "가장 긴 동일성"으로 표지된 Needle의 결과는 다음과 같이 계산된다:
(동일한 데옥시리보뉴클레오티드 x 100)/(정렬 길이 - 정렬 내 갭의 총 수)
전분: 용어 "전분"은 아밀로스 및 아밀로펙틴으로 구성되며 (C6H10O5)n으로 표시되고(n은 임의의 수임), 저장 과립체 형태로 식물 조직에서 널리 발생하는 글루코스 단위로 구성된, 식물의 복합 다당류로 이루어진 임의의 물질을 의미한다.
수침 또는 침지: 용어 "수침"은 작물 낟알을 물 및 임의적으로 SO2로 침지하는 것으로 의미한다.
본 발명의 목적은 옥수수 습식 제분 공정에서 전분 및 글루텐 수율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은 분쇄된 옥수수 낟알 또는 분쇄된 낟알의 분획, 특히 섬유질이 풍부한 분획을 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 유효량의 폴리펩티드와 접촉시켜, 습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터 얻을 수 있는 전분 및/또는 글루텐 수율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 Pfam 패밀리 Pf00085에 속하는 적어도 Pfam 패밀리 도메인을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 티오레독신 폴리펩티드로도 알려져 있다. 특정 구현예에서, Pf00085 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)이다. 티오레독신 폴리펩티드 또는 PDI의 효과는 적어도 자일라나제 및/또는 셀룰라제 및 유효량의 SO2의 존재에 의해 더욱 개선될 수 있으며, 이는 섬유질로부터 결합된 전분과 글루텐의 방출을 더욱 증가시켜, 얻을 수 있는 전분 및/또는 글루텐 수율을 향상시킬 것이다.
습식 제분 공정:
옥수수 낟알은, 낟알을 열어서 낟알을 4개의 주요 성분인 전분, 배, 섬유질, 및 글루텐으로 분리하기 위해 습식 제분된다.
습식 제분 공정은 제분소마다 크게 다를 수 있지만, 통상적인 습식 제분은 일반적으로 하기 단계를 포함한다:
1. 수침
2. 분쇄
3. i) 배; 및 ii) 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 스트림으로의 분리
4. 미분쇄
5. 섬유질 세척, 압축, 및 건조
6. 전분/글루텐 분리, 및
7. 전분 세척.
수침, 분쇄, 및 배 분리
옥수수 낟알은 약 50℃, 예컨대 약 45℃ 내지 60℃의 온도에서 약 30분 내지 약 48시간, 바람직하게는 30분 내지 약 15시간, 예컨대 약 1시간 내지 약 6시간 동안 수중 침지에 의해 연화된다. 수침 동안, 낟알은 물을 흡수하여, 수분 수준이 15%에서 45%까지 증가하고 크기가 2배 넘게 증가한다. 예를 들어 0.1% 이산화황(SO2) 및/또는 NaHSO3를 물에 임의적으로 첨가하면, 따뜻한 환경에서 과도한 박테리아 성장이 방지된다. 옥수수가 팽윤되고 연화됨에 따라, 침지수의 약한 산도가 옥수수 내의 글루텐 결합을 느슨하게 하여 전분을 방출하기 시작한다. 옥수수 낟알이 수침된 후, 옥수수 낟알은 일반적으로 조분쇄 단계를 통해 균열이 생겨 배를 방출한다. 배는 옥수수 오일을 함유한다. 배는 엄밀하게 제어된 조건하에 다른 물질이 없는 배 부분을 "부유"시킴으로써 본질적으로 전분, 글루텐, 및 섬유질의 더 무거운 밀도의 혼합물로부터 분리된다. 이 방법은 이후 가공 단계에서 미량의 옥수수 오일의 임의의 유해 효과를 배제하는 작용을 한다. 이어서 배를 건조시키고 오일을 추출할 수 있다. 배를 분리한 후, 섬유질, 전분, 및 글루텐(단백질)을 포함하는 분쇄된 낟알 덩어리는 일반적으로 미분쇄 단계를 거친다.
섬유질 세척, 압축, 및 건조
최종 산물 내 임의의 섬유질을 절대 최소치로 유지하면서 최대 전분 및 글루텐을 회수하기 위해서는, 가공 중에 섬유질로부터 유리 전분 및 글루텐을 세척하는 것이 필요하다. 따라서, 미분쇄된 낟알 덩어리는 섬유질 세척 절차를 거친다. 이에 의해 유리 전분 및 글루텐은 스크리닝(세척) 중에 섬유질로부터 분리되고 제분 전분으로서 수집된다. 이어서 잔여 섬유질을 압착하여 수분 함량을 줄인다.
최종 산물 내 임의의 섬유질을 절대 최소치로 유지하면서 최대 전분 및 글루텐을 회수하기 위해서는, 가공 중에 섬유질 분획으로부터 유리 전분 및 글루텐을 세척하는 것이 필요하다. 일반적으로 침지, 분쇄, 및 옥수수 낟알로부터의 배 분리 후에 섬유질을 수집하고, 슬러리화하고, 스크리닝하여 옥수수 낟알 덩어리 중 임의의 잔여 전분 또는 글루텐을 회수한다. 이 공정은 본원에서 섬유질 세척 절차/단계로 지칭된다.
전분 글루텐 분리
제분 전분이라고 하는, 섬유질 세척 단계로부터의 전분-글루텐 현탁액은 전분과 글루텐으로 분리된다. 글루텐은 전분에 비해 낮은 밀도를 갖는다. 제분 전분을 원심분리기에 통과시킴으로써, 글루텐이 쉽게 분리된다.
전분 세척
전분 분리 단계로부터의 전분 슬러리는 일부 불용성 단백질 및 많은 가용물을 함유한다. 이들은 최고 품질의 전분(고순도 전분)이 제조될 수 있기 전에 제거되어야 한다. 1% 또는 2%의 단백질만 남은 전분을 희석하고, 8 내지 14회 세척하고, 재희석하고, 하이드로클론으로 다시 세척하여 마지막 미량의 단백질을 제거하고 일반적으로 순도가 99.5% 초과인 고품질 전분을 생산한다.
습식 제분 산물: 습식 제분은 비제한적으로 옥수수 담금액, 옥수수 글루텐 사료, 배, 옥수수 오일, 옥수수 글루텐 밀(meal), 옥수수 전분, 변성 옥수수 전분, 옥수수 시럽과 같은 시럽, 및 옥수수 에탄올을 생산하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 양태는 습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터 얻을 수 있는 총 전분 수율 및/또는 글루텐 수율을 증가시키는 방법으로서, 옥수수 낟알 또는 옥수수 낟알 분획을 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 유효량의 폴리펩티드를 포함하는 효소 조성물과 혼합하는 단계를 포함하는 방법을 제공하는 것이다. 일 구현예에서, 폴리펩티드는 Pfam 패밀리 Pf00085에 속하는 적어도 Pfam 패밀리 도메인을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 티오레독신 폴리펩티드로도 알려져 있다. 특정 구현예에서, Pf00085 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)이다. 적어도 하나의 단백질 디설파이드 이소머라제 또는 티오레독신 폴리펩티드는 임의적으로 하나 이상의 가수분해 효소와 조합될수 있으며, 상기 가수분해 효소 중 적어도 하나는 자일라나제 폴리펩티드 및/또는 셀룰라제 폴리펩티드 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아라비노푸라노시다제와 같은 다른 가수분해 효소가 또한 첨가될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 옥수수 낟알 또는 상기 옥수수 낟알의 분획은 옥수수 낟알 덩어리를 섬유질 세척 절차에 적용하는 단계 동안, 상기 단백질 디설파이드 이소머라제 또는 티오레독신 펩티드, 및 임의적으로 하나 이상의 가수분해 효소와 혼합된다.
옥수수 낟알 또는 옥수수 낟알 분획 중 전분 및/또는 글루텐의 일부는 섬유질 분획에 결합되어 습식 제분 공정 동안 절대 방출되지 않을 수 있다. 그러나, 옥수수 낟알에 존재하는 기질을 분해하기 위해 물을 사용할 수 있는 임의의 촉매 단백질을 포함할 수 있는 가수분해 효소의 첨가는 결합된 전분 및/또는 글루텐의 일부를 방출시켜 습식 제분 공정에서 전분 및/또는 글루텐의 총 수율을 증가시킬 수 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, 분쇄된 옥수수 낟알로부터의 전분 및 글루텐의 방출이 분쇄된 옥수수 낟알 덩어리 또는 분쇄된 낟알의 분획, 특히 섬유질이 풍부한 분획을 유효량의 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI) 또는 티오레독신과 접촉시킴으로써 증가될 수 있다는 것을 발견하였다. PDI의 효과는 PDI, 자일라나제, 셀룰라제, 및 SO2를 조합하여 사용함으로써 더욱 강화될 수 있다.
따라서 제1 양태에서, 본 발명은 습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터의 전분 수율 및/또는 글루텐 수율을 증가시키는 방법으로서, 분쇄된 옥수수 낟알 또는 분쇄된 낟알의 분획, 특히 섬유질이 풍부한 분획을 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 유효량의 폴리펩티드(예컨대, 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)(EC 5.3.4.1) 또는 티오레독신 펩티드)와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 존재하지 않거나 첨가되지 않는 공정에 비해 습식 제분 공정 중의 섬유질로부터 방출되는 전분 및/또는 글루텐의 양을 증가시킨다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 수침 시간 및 SO2 첨가를 감소시킨다.
습식 제분 공정에서 사용되는 특정 절차 및 설비는 다를 수 있지만, 공정의 주요 원리는 동일하게 유지된다(습식 제분 공정에 대한 설명 참조).
일 구현예에서, PDI 또는 티오레독신 펩티드가 특히 섬유질 세척 단계 중에 섬유질 분획에 존재하거나 첨가된다.
특정 일 구현예에서, 본 발명의 방법은
a) 옥수수 낟알을 물에 침지하여 불린 낟알을 생성하는 단계;
b) 불린 낟알을 분쇄하여 분쇄된 낟알을 생성하는 단계;
c) 분쇄된 낟알로부터 배를 분리하여 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 옥수수 낟알 덩어리를 생성하는 단계; 및
d) 옥수수 낟알 덩어리, 특히 미세 섬유질 분획과 같은 섬유질이 풍부한 분획을 섬유질 세척 절차에 적용하여 섬유질로부터 전분 및 글루텐을 분리하는 단계
를 포함하고,
적어도 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 단계 d) 전에 또는 중에 존재하거나 첨가된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 다음의 단계를 추가로 포함한다.
e) 글루텐으로부터 전분을 분리하는 단계; 및 임의적으로
f) 전분을 세척하는 단계.
본 발명의 방법의 일 구현예에서, PDI 또는 티오레독신 펩티드는 적어도 10 μg EP/g DS, 적어도 25 μg EP/g DS, 적어도 50 μg EP/g DS, 적어도 75 μg EP/g DS, 적어도 100 μg EP/g DS, 적어도 200 μg EP/g DS, 적어도 300 μg EP/g DS, 적어도 500 μg EP/g DS, 예컨대 10 내지 2000 μg EP/g DS, 25 내지 1000 μg EP/g DS, 50 내지 800 μg EP/g DS, 100 내지 500 μg EP/g DS 범위의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가된다.
본 발명에 따르면, 섬유질 세척 단계 중에 가수분해 효소의 효과를 극대화하기 위해, 섬유질 세척 중에 유효량의 SO2가 존재한다.
일 구현예에서, SO2는 적어도 200 ppm, 적어도 300 ppm, 적어도 400 ppm, 적어도 450 ppm, 적어도 500 ppm, 적어도 600 ppm, 적어도 700 ppm, 적어도 800 ppm의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가된다.
다른 구현예에서, SO2는 200~3000 ppm, 300~2000 ppm, 400~800 ppm 범위의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가된다.
본 발명에 따른 방법에서, PDI 또는 티오레독신 펩티드와 조합하여 추가의 효소 활성이 유리하게 추가될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 구현예는 유효량의 하나 이상의 가수분해 효소가 섬유질 세척 단계 전에 또는 중에 존재하거나 첨가되고, 상기 가수분해 효소 중 적어도 하나는 자일라나제 및/또는 셀룰라제로부터 선택되는 방법에 관한 것이다.
일 구현예에서, 자일라나제는 GH5 폴리펩티드, GH30 폴리펩티드, GH10 폴리펩티드, GH11 폴리펩티드, GH8 폴리펩티드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 가수분해 효소는 하나 이상의 셀룰라제를 포함한다. 셀룰라제는 엔도글루카나제(EG) 및 셀로바이오하이드롤라제(CBH)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다.
일 구현예에서, 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 I, 셀로바이오하이드롤라제 II, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다.
다른 구현예에서, 가수분해 효소는 아라비노푸라노시다제를 포함한다.
일 구현예에서, 아라비노푸라노시다제는 GH43 폴리펩티드, GH62 폴리펩티드, 및 GH51 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 일 구현예에서, 단계 c)로부터의 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 옥수수 낟알 덩어리는 단계 d)의 섬유질 세척 절차 전에 추가 분쇄 단계, 바람직하게는 미분쇄 단계를 거친다.
섬유질 세척 절차에 사용되는 특정 장비는 다를 수 있지만, 공정의 주요 원리는 동일하게 유지된다. WO2018/053220은 전용 효소 인큐베이션 공간/탱크를 포함하는 섬유질 세척 시스템을 기술한다. 본 개시내용 및 당업자의 일반적인 지식에 기초하여, 가수분해 효소가 작용하기에 충분한 인큐베이션 시간을 제공하는 섬유질 세척 시스템을 설계하는 것이 가능할 것이다. 일 구현예에서, 상기 옥수수 낟알 또는 상기 옥수수 낟알의 분획, 예를 들어 섬유질이 풍부한 분획은 상기 하나 이상의 가수분해 효소와 적어도 15분, 예컨대 적어도 20분, 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 35분, 적어도 40분, 적어도 45분, 적어도 50분, 적어도 55분, 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 110분, 또는 적어도 120분 동안 반응하도록 허용된다.
일 구현예에서, 상기 섬유질 세척 절차는 하나 이상의 가수분해 효소의 도입에 최적화된 섬유질 세척 시스템의 사용을 포함하며, 섬유질 세척 시스템은 35분 이상, 예컨대 40분 이상, 45분 이상, 50분 이상, 60분 이상, 70분 이상, 80분 이상, 90분 이상, 100분 이상, 110분 이상, 또는 120분 이상 및 48시간 미만, 예컨대 40시간 미만, 36시간 미만, 30시간 미만, 24시간 미만, 20시간 미만, 12시간 미만, 10시간 미만, 8시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만의 섬유질 세척 시스템 내 총 반응 시간(체류 시간)을 제공하도록 구성된 공간(V)을 포함한다. 일 구현예에서, 섬유질 세척 시스템 내 총 체류 시간은 35분 내지 48시간, 예컨대 35분 내지 24시간, 35분 내지 12시간, 35분 내지 6시간, 35분 내지 5시간, 35분 내지 4시간, 35분 내지 3시간, 35분 내지 2시간, 45분 내지 48시간, 45분 내지 24시간, 45분 내지 수 시간, 45분 내지 6시간, 45분 내지 5시간, 45분 내지 4시간, 45분 내지 3시간, 45분 내지 2시간 1~48시간, 1~24시간, 1~12시간, 1~6시간, 1~5시간, 1~4시간, 1~3시간, 1~2시간이다.
일 구현예에서, 섬유질 세척 시스템은
- 역류 세척 구성으로 유체 연결된 복수의 스크린 유닛(S1…S4)(각각의 스크린 유닛은 옥수수 낟알 덩어리와 액체의 스트림을 제1 분획(s)과 제2 분획(f)의 두 분획으로 분리하도록 구성되고, 상기 제2 분획(f)은 제1 분획(s)보다 더 많은 wt% 측정량의 섬유질을 함유함);
- 시스템에 배열된 공간으로서, 상기 제1 분획(s), 상기 제2 분획(f), 또는 혼합된 제1 및 제2 분획(s, f), 바람직하게는 제2 분획(f)만을 수용하도록 유체 연결되고, 공간에 수용된 하나의 분획 또는 두 분획 모두에 대한 인큐베이션 시간을 제공하도록 구성되고, 이에 의해 인큐베이션된 하나의 분획 또는 두 분획 모두를 하류 스크린 유닛(S4)으로 배출하는 공간(V)을 포함하며,
시스템은
- 옥수수 낟알 덩어리 및 액체를 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로 유입시키고,
- 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로부터 제1 분획(s1)을 전분을 함유하는 산물 스트림으로서 배출하고,
- 공정수를 유입시키고(바람직하게는 공정수를 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로 유입시키도록 배열됨),
- 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로부터 제2 분획(f4)을 원래의 옥수수 낟알 덩어리보다 더 적은 양의 전분 및 글루텐을 함유하는 세척된 옥수수 낟알 덩어리로서 배출하고,
- 가수분해 효소를 시스템 내로 도입하도록 구성된다.
일 구현예에서, 섬유질 세척 시스템 내에 구성된 상기 공간(V)에서의 인큐베이션 시간은 5분 이상, 예컨대 10분 이상, 15분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 45분 이상, 50분 이상, 60분 이상, 70분 이상, 80분 이상, 90분 이상, 100분 이상, 110분 이상, 또는 120분 이상 및 48시간 미만, 예컨대 40시간 미만, 36시간 미만, 30시간 미만, 24시간 미만, 20시간 미만, 12시간 미만, 10시간 미만, 8시간 미만, 6시간 미만, 5시간 미만, 4시간 미만, 3시간 미만이다.
일 구현예에서, 상기 공간(V)에서의 인큐베이션 시간은 35분 내지 48시간, 예컨대 35분 내지 24시간, 35분 내지 수 시간, 35분 내지 6시간, 35분 내지 5시간, 35분 내지 4시간, 35분 내지 3시간, 35분 내지 2시간, 45분 내지 48시간, 45분 내지 24시간, 45분 내지 12시간, 45분 내지 6시간, 45분 내지 5시간, 45분 내지 4시간, 45분 내지 3시간, 45분 내지 2시간 1~48시간, 1~24시간, 1~12시간, 1~6시간, 1~5시간, 1~4시간, 1~3시간, 1~2시간이다.
일 구현예에서, 상기 공간(V)에서의 인큐베이션 온도는 25℃ 내지 95℃, 예컨대 25 내지 90℃, 25 내지 85℃, 25 내지 80℃, 25 내지 75℃, 25 내지 70℃, 25 내지 65℃, 25 내지 60℃, 25 내지 55℃, 25 내지 53℃, 25 내지 52℃, 30 내지 90℃, 30 내지 85℃, 30 내지 80℃, 30 내지 75℃, 30 내지 70℃, 30 내지 65℃, 30 내지 60℃, 30 내지 55℃, 30 내지 53℃, 30 내지 52℃, 35 내지 90℃, 35 내지 85℃, 35 내지 80℃, 35 내지 75℃, 35 내지 70℃, 35 내지 65℃, 35 내지 60℃, 35 내지 55℃, 35 내지 53℃, 35 내지 52℃, 39 내지 90℃, 39 내지 85℃, 39 내지 80℃, 39 내지 75℃, 39 내지 70℃, 39 내지 65℃, 39 내지 60℃, 39 내지 55℃, 39 내지 53℃, 39 내지 52℃, 예컨대 46 내지 52℃이다.
또한, 공간의 치수(m3)는 바람직하게는 적어도 5분, 예컨대 적어도 10분, 적어도 15분, 적어도 20분 적어도 25분, 적어도 30분, 적어도 35분, 적어도 40분, 적어도 45분, 적어도 50분, 적어도 55분, 적어도 60분, 적어도 70분, 적어도 80분, 적어도 90분, 적어도 100분, 적어도 110분, 적어도 120분의 인큐베이션 시간을 제공하도록 구성된다.
인큐베이션을 위해 지정된 공간(V)은 바람직하게는 적어도 30 m3, 적어도 40 m3, 적어도 50 m3, 적어도 60 m3, 적어도 70, m3, 적어도 80, m3, 적어도 90, m3, 적어도 100 m3, 적어도 110 m3, 적어도 120 m3, 적어도 130 m3, 적어도 140 m3, 적어도 150 m3, 적어도 160 m3, 적어도 170 m3, 적어도 180 m3, 적어도 190 m3, 적어도 200 m3, 적어도 210 m3, 적어도 220 m3, 적어도 230 m3, 적어도 240 m3, 적어도 250 m3, 적어도 260 m3, 적어도 270 m3, 적어도 280 m3, 적어도 290 m3, 적어도 300 m3, 적어도 400 m3, 또는 적어도 500 m3의 부피를 갖는다. 인큐베이션 시간은 또한 적어도 100 m3, 적어도 110 m3, 적어도 120 m3, 적어도 130 m3, 적어도 140 m3, 적어도 150 m3, 적어도 160 m3, 적어도 170 m3, 적어도 180 m3, 적어도 190 m3, 적어도 200 m3, 적어도 210 m3, 적어도 220 m3, 적어도 230 m3, 적어도 240 m3, 적어도 250 m3, 적어도 260 m3, 적어도 270 m3, 적어도 280 m3, 적어도 290 m3, 적어도 300 m3, 적어도 400 m3, 적어도 500 m3의 총 부피 또는 결합 부피를 갖는 하나 초과의 공간(V)에서의 시간일 수 있다.
인큐베이션 시간 동안, 공간(V)에 수용된 유체가 스크리닝되지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 섬유질로부터 방출된 더 높은 비율의 전분 및/또는 단백질을 함유하는 것이 바람직하지만, 공간(V)에서 나가는 유체는 공간(V)에 수용된 유체와 동일한 조성, 예를 들어 동일한 전분 및 섬유질 조성을 갖는다.
효소와 섬유질 사이의 밀접한 접촉을 보장하기 위해, 예를 들어 회전자 또는 임펠러를 포함함으로써, 공간(V)에 들어 있는 물질을 교반하도록 상기 공간(V)을 구성하는 것이 바람직할 수 있다.
가장 상류 스크린 유닛(S1)의 하류 및 상기 가장 하류 스크린 유닛(S4)의 상류에 공간(V)을 배열하는 것이 바람직하다. 특히, 공간(V)은 두 번째로 가장 하류인 스크린 유닛(S3)에 유체를 공급하도록 배열된다.
단백질 디설파이드 이소머라제, EC 5.3.4.1.
일 구현예에서, PDI는 산화환원 단백질의 티오레독신 수퍼패밀리에 속하는 적어도 하나의 촉매 도메인을 포함하고, 이 도메인은 CXXC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함한다.
다른 구현예에서, PDI는 적어도 하나의 비촉매 도메인에 의해 분리된, 각각 CXXC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는 2개의 촉매 도메인을 포함한다.
CXXC 모티프는 특히 CGHC, CTHC, CPHC, 및 CSMC로 이루어진 군으로부터 선택되고, 가장 구체적으로는 CGHC이다.
특정 구현예에서, 티오레독신 도메인은 Pfam 패밀리 Pf00085 또는 Pf13848에 속한다.
다른 특정 구현예에서, PDI는 3-도메인 구조 Pf00085-Pf13848-Pf00085를 포함하며, 여기서 촉매 활성 도메인은 Pf00085로 표시된다.
티오레독신 펩티드
일 구현예에서, 티오레독신은 시스테인 티올-디설파이드 교환에 의해 다른 단백질의 환원을 촉진함으로써 항산화제로 작용하는 단백질이다. 이들은 단백질 디설파이드 결합의 환원을 촉매할 수 있는 효소이다. 다른 구현예에서, 티오레독신 펩티드는 활성 부위 모티프 CXXC, 특히 CGPC를 포함한다. 티오레독신 단백질은 또한, 티오레독신 폴드라고 하는 특징적인 3차 구조를 가지고 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 티오레독신 펩티드는 산화환원 단백질의 티오레독신 수퍼패밀리의 구성원이며, 일반적으로 CXXC, 바람직하게는 CGPC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는 촉매 도메인을 포함한다. 티오레독신 도메인은 Pfam 패밀리 Pf00085에 속한다(https://pfam.xfam.org/family/Thioredoxin).
PDI 또는 Trx 외에 본 발명의 방법에 적합한 가수분해 효소
일 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 가수분해 효소는 셀룰라제(EC 3.2.1.4), 자일라나제(EC 3.2.1.8), 아라비노푸라노시다제(EC 3.2.1.55(비환원성 말단 알파-L-아라비노푸라노시다제); EC 3.2.1.185(비환원성 말단 베타-L-아라비노푸라노시다제)), 셀로바이오하이드롤라제 I(EC 3.2.1.150), 셀로바이오하이드롤라제 II(E.C. 3.2.1.91), 셀로바이오시다제(E.C. 3.2.1.176), 베타-글루코시다제(E.C. 3.2.1.21), 베타-자일로시다제(EC 3.2.1.37), 및 프로테아제(E.C 3.4)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다.
바람직하게는 효소는 자일라나제 및/또는 셀룰라제로부터 선택된다.
일 구현예에서, 자일라나제는 GH5 폴리펩티드, GH30 폴리펩티드, GH10 폴리펩티드, GH11 폴리펩티드, GH8 폴리펩티드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 가수분해 효소는 하나 이상의 셀룰라제를 포함한다. 셀룰라제는 적어도 엔도글루카나제(EG) 및 셀로바이오하이드롤라제(CBH)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 구체적으로는, 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 I, 셀로바이오하이드롤라제 II, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함한다.
일 구현예에서, 가수분해 효소는 아라비노푸라노시다제를 추가로 포함한다. 아라비노푸라노시다제는 GH43 폴리펩티드, GH62 폴리펩티드, GH51 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히 GH62 폴리펩티드.
일 구현예에서, 하나 이상의 가수분해 효소는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)와 같이 셀룰라제 배경을 가진 유기체에서 발현된다. 이러한 구현예에 따르면, 본 발명에 따라 정의되는 자일라나제 및/또는 아라비노푸라노시다제 폴리펩티드는 트리코더마로부터의 내인성 셀룰라제와 함께 발현된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 가수분해 효소를 포함하는 효소 조성물은 트리코더마 레세이 또는 후미쿨라 인솔렌스(Humicula insolens)로부터 유래된 셀룰라제를 포함할 수 있다.
특정 일 구현예에서, 셀룰라제는 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)로부터 유래된 CBH I 및 CBH II를 갖는 트리코더마 레세이 배경 셀룰라제로부터 유래된다.
일 구현예에서, 셀룰라제 효소 조성물은 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 I(WO 2011/057140), 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 II(WO 2011/057140), 아스페르길루스 푸미가투스 베타-글루코시다제 변이체(WO 2012/044915), 및 페니실리움(Penicillium) 종(에머소니이(emersonii)) GH61 폴리펩티드(WO 2011/041397)를 함유하는 트리코더마 레세이 셀룰라제 제제와 함께 아스페르길루스 푸미가투스 GH10 자일라나제(WO 2006/078256) 및 아스페르길루스 푸미가투스 베타-자일로시다제(WO 2011/057140)를 포함하며, 엔도글루카나제 활성은 트리코더마 레세이 셀룰라제로부터 제공된다.
다른 구현예에서, 셀룰라제 효소 조성물은 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 I(WO 2011/057140), 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 II(WO 2011/057140), 아스페르길루스 푸미가투스 베타-글루코시다제 변이체(WO 2012/044915), 및 페니실리움(Penicillium) 종(에머소니이(emersonii)) GH61 폴리펩티드(WO 2011/041397)를 함유하는 트리코더마 레세이 셀룰라제 제제를 포함하며, 엔도글루카나제 활성은 트리코더마 레세이 셀룰라제로부터 제공된다.
일 구현예에서, 하나 이상의 가수분해 효소는 정제된다. 정제된 효소는 본 발명의 다른 구현예에 기재된 바와 같은 효소 조성물에 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 가수분해 효소는 액체 조성물에 존재한다. 조성물은 균질 또는 비균질일 수 있다.
일 구현예에서, 하나 이상의 가수분해 효소는 고체 조성물에 존재한다.
일 구현예에서, 상기 옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획과 혼합되는 하나 이상의 가수분해 효소의 유효량은 습식 제분 공정에 유입되는 옥수수 낟알 미터 톤(MT)당 효소 단백질(EP) 0.005~0.5 kg, 예컨대 0.010~0.5 kg EP/MT 옥수수 낟알, 예컨대 0.05~0.5 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.075~0.5 kg/MT 또는 0.1~0.5 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.005~0.4 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.01~0.4 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.05~0.4 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.075~0.4 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.1~0.4 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.005~0.3 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.01~0.3 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.05~0.3 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.075~0.3 kg/MT 또는 0.1~0.3 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.005~0.2 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.010~0.2 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.05~0.2 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.075~0.2 kg/MT 또는 0.1~0.2 kg/MT 옥수수 낟알, 또는 예컨대 0.075~0.10 kg/MT 옥수수 낟알 또는 0.075~0.11 kg/MT 옥수수 낟알이다.
바람직한 구현예에서, 효소 조성물은 트리코더마 레세이 ATCC 26921의 배양과 같은 트리코더마 레세이의 배양으로부터 수득되는 셀룰라제를 포함한다. 적합한 셀룰라제는 예를 들어 Novozymes A/S에서 상품명 Celluclast®로 입수가능하다.
자일라나제 활성을 갖는 폴리펩티드
자일라나제는 본 발명에 따른 방법에 적용하기에 적합하다. 자일라나제 폴리펩티드는 패밀리 GH5, GH10, GH30, GH11, 및 GH8로부터 선택될 수 있다.
보다 구체적인 구현예는 GH5 자일라나제 효소가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 8의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 8의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 자일라나제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 8의 아미노산 1 내지 551이다.
다른 특정 구현예는 GH5 자일라나제 효소가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 9의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 9의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 자일라나제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 9의 아미노산 1 내지 551이다.
다른 특정 구현예는 GH10 자일라나제가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 자일라나제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 11의 아미노산 21 내지 405이다.
다른 특정 구현예는 GH10 자일라나제가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 자일라나제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 10의 아미노산 20 내지 319이다.
아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 폴리펩티드
다른 특정 구현예는 GH62 아라비노푸라노시다제가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 12의 아미노산 27 내지 332이다.
다른 특정 구현예는 GH62 아라비노푸라노시다제가 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른 방법에 관한 것이다:
(a) 서열번호 13의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 13의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편.
일 구현예에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 13의 아미노산 17 내지 325이다.
단백질 디설파이드 이소머라제(PDI) 활성 또는 티오레독신 활성을 갖는 폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드에 관한 것이며, 바람직하게는 PDI 활성은 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 PDI 활성의 적어도 75%, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 활성의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 일 양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드와 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산만큼 상이하다.
폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 PDI 활성을 갖는 이의 단편이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 516이다.
일 양태에서, PDI 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 20의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는, 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드에 관한 것이며, 바람직하게는 PDI 활성은 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 PDI 활성의 적어도 75%, 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 활성의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 일 양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드와 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산만큼 상이하다. 폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 PDI 활성을 갖는 이의 단편이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 21 내지 513이다.
일 양태에서, PDI 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 21의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는, 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드에 관한 것이며, 바람직하게는 PDI 활성은 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드의 PDI 활성의 적어도 75%, 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드의 활성의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 일 양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드와 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산만큼 상이하다.
폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 PDI 활성을 갖는 이의 단편이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 21 내지 516이다.
일 양태에서, PDI 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 22의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는, 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드에 관한 것이며, 바람직하게는 PDI 활성은 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드의 PDI 활성의 적어도 75%, 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드의 활성의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 일 양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드와 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산만큼 상이하다.
폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 PDI 활성을 갖는 이의 단편이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 21 내지 517이다.
일 양태에서, PDI 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 23의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 티오레독신 펩티드 활성을 갖는, 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 티오레독신 폴리펩티드에 관한 것이며, 바람직하게는 티오레독신 활성은 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드의 티오레독신 활성의 적어도 75%, 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드의 활성의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%이다. 일 양태에서, 폴리펩티드는 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드와 최대 10개, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산만큼 상이하다.
폴리펩티드는 바람직하게는 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 티오레독신 펩티드 활성을 갖는 이의 단편이다. 일 양태에서, 성숙 폴리펩티드는 서열번호 5의 아미노산 1 내지 110이다.
일 양태에서, 티오레독신 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 24의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다.
단백질 디설파이드 이소머라제 활성 또는 티오레독신 펩티드 활성을 갖는 폴리펩티드의 공급원
본 발명의 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 폴리펩티드는 임의의 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 소정 공급원과 관련하여 본원에서 사용되는 "~로부터 수득"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드가 공급원에 의해 생성되거나 공급원으로부터의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 균주에 의해 생성됨을 의미한다. 일 양태에서, 소정 공급원으로부터 수득된 폴리펩티드는 세포외로 분비된다.
다른 양태에서, 폴리펩티드는 서모아스쿠스(Themoascus), 특히 서모아스쿠스 크루스타세우스(Thermoascus crustaceus)의 균주로부터 수득되는 폴리펩티드, 예를 들어 서모아스쿠스 크루스타세우스 CBS181.67로부터 수득되는 폴리펩티드이다.
다른 양태에서, 폴리펩티드는 케이토마이세스(Keithomyces), 특히 케이토마이세스 카르네우스(Keithomyces carneus)의 균주로부터 수득되는 폴리펩티드이다.
다른 양태에서, 폴리펩티드는 아스페르길루스(Aspergillus), 특히 아스페르길루스 스피눌로스포루스(Aspergillus spinulosporus)의 균주로부터 수득되는 폴리펩티드이다.
다른 양태에서, 폴리펩티드는 서모아스쿠스, 특히 서모아스쿠스 아우란티아쿠스(Thermoascus aurantiacus)의 균주로부터 수득되는 폴리펩티드이다.
다른 양태에서, 폴리펩티드는 아스페르길루스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus)로부터 수득되는 폴리펩티드, 예를 들어 아스페르길루스 아쿨레아투스 CBS101.43으로부터 수득되는 폴리펩티드이다.
상기 종들에 대해 본 발명은 알려진 종 이름에 관계없이 완전한 상태와 불완전한 상태 둘 다, 및 다른 분류학적 균등물, 예를 들어 무성생식형을 포괄함이 이해될 것이다. 당업자는 적절한 균등물의 동일성을 쉽게 인식할 것이다.
이러한 종의 균주는 ATCC(American Type Culture Collection), DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), CBS(Centraalbureau Voor Schimmelcultures), 및 NRRL(Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)과 같은 여러 배양 컬렉션에서 공개적으로 쉽게 접근할 수 있다.
폴리펩티드는 상기 언급한 프로브를 사용하여 자연(예를 들어, 토양, 퇴비, 물 등)으로부터 단리된 미생물 또는 천연 재료(예를 들어, 토양, 퇴비, 물 등)로부터 직접 얻은 DNA 샘플을 포함한 다른 공급원으로부터 확인되고 수득될 수 있다. 자연 서식지로부터 직접 미생물 및 DNA를 단리하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이후 다른 미생물 또는 혼합 DNA 샘플의 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 유사하게 스크리닝하여 수득될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 프로브에 의해 검출되면, 당업자에게 알려진 기술을 이용해 폴리뉴클레오티드를 단리하거나 클로닝할 수 있다(예를 들어, 상기 인용 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조).
폴리뉴클레오티드
본 발명은 또한, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 20의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 21의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 22의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 23의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명은 서열번호 24의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드를 단리하거나 클로닝하는 데 사용되는 기술은 당업계에 알려져 있으며, 게놈 DNA 또는 cDNA, 또는 이들의 조합으로부터의 단리를 포함한다. 게놈 DNA로부터의 폴리뉴클레오티드의 클로닝은 예를 들어 구조적 특징을 공유하는 클로닝된 DNA 단편을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크리닝 또는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York] 참조. 리가제 연쇄 반응(LCR), 라이게이션 활성화 전사(LAT), 및 폴리뉴클레오티드 기반 증폭(NASBA)과 같은 다른 핵산 증폭 절차가 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 서모아스쿠스, 케이토마이세스, 또는 아스페르길루스, 또는 관련 유기체의 균주로부터 클로닝될 수 있고, 따라서 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 폴리펩티드 암호화 영역의 종 변이체일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 변형은 해당 폴리펩티드와 실질적으로 유사한 폴리펩티드를 합성하는 데 필요할 수 있다. 폴리펩티드와 "실질적으로 유사한"이라는 용어는 폴리펩티드의 비자연발생적 형태를 나타낸다. 이러한 폴리펩티드는 천연원으로부터 단리된 폴리펩티드와는 일부 조작된 방식에서 상이할 수 있다(예를 들어, 비활성(specific activity), 열안정성, 최적 pH 등이 상이한 변이체). 변이체는 서열번호 6 또는 서열번호 7의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열 또는 이의 cDNA 서열, 예를 들어 이의 하위 서열로 제시된 폴리뉴클레오티드에 기초하고/하거나, 폴리펩티드의 아미노산 서열 변화를 일으키지 않지만 효소 생산을 목적으로 하는 숙주 유기체의 코돈 사용에 해당하는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해, 또는 상이한 아미노산 서열을 야기할 수 있는 뉴클레오티드 치환의 도입에 의해 구성될 수 있다. 뉴클레오티드 치환에 대한 일반적인 설명은 예를 들어 문헌[Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107] 참조.
핵산 구성체
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체로서, 폴리뉴클레오티드가 제어 서열과 양립가능한 조건하에 적합한 숙주 세포에서 암호화 서열의 발현을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 핵산 구성체에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드는 폴리펩티드의 발현을 제공하는 다양한 방식으로 조작될 수 있다. 발현 벡터에 따라, 폴리뉴클레오티드를 벡터에 삽입하기 전에 조작하는 것이 바람직하거나 필요할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용해 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.
제어 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 폴리뉴클레오티드인 프로모터일 수 있다. 프로모터는 폴리펩티드의 발현을 매개하는 전사 제어 서열을 포함한다. 프로모터는 돌연변이 프로모터, 절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터를 포함하여 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 숙주 세포에 대해 상동성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 암호화하는 유전자로부터 수득될 수 있다. 일 구현예에서, 제어 서열은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 천연적이거나 이종성이다.
박테리아 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하기에 적합한 프로모터의 예에는 바실루스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 알파-아밀라제 유전자(amyQ), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 알파-아밀라제 유전자(amyL), 바실루스 리케니포르미스 페니실리나제 유전자(penP), 바실루스 스테아로서모필루스(Bacillus stearothermophilus) 말토제닉 아밀라제 유전자(amyM), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자(sacB), 바실루스 서브틸리스 xylA 및 xylB 유전자, 바실루스 튜린겐시스(Bacillus thuringiensis) cryIIIA 유전자(Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), E. coli lac 오페론, E. coli trc 프로모터(Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), 스트렙토마이세스 코엘리컬러(Streptomyces coelicolor) 아가라제 유전자(dagA), 및 원핵 베타-락타마제 유전자(Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731)로부터 수득되는 프로모터뿐만 아니라 tac 프로모터(DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25)가 있다. 추가의 프로모터는 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria", Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; 및 Sambrook et al., 1989, 상기 인용]에 기재되어 있다. 탠덤 프로모터의 예는 WO 99/43835에 개시되어 있다.
사상 진균 숙주 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하기에 적합한 프로모터의 예에는 아스페르길루스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 아세트아미다제, 아스페르길루스 니제르(Aspergillus niger) 중성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니제르 산 안정성 알파-아밀라제, 아스페르길루스 니제르 또는 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 글루코아밀라제(glaA), 아스페르길루스 오리재(Aspergillus oryzae) TAKA 아밀라제, 아스페르길루스 오리재 알칼리성 프로테아제, 아스페르길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라제, 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 트립신-유사 프로테아제(WO 96/00787), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum) 아밀로글루코시다제(WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼 다리아(Daria)(WO 00/56900), 푸사리움 베네나툼 퀸(Quinn)(WO 00/56900), 리조무코르 미에헤이(Rhizomucor miehei) 리파제, 리조무코르 미에헤이 아스파트산 프로테이나제, 트리코더마 레세이 베타-글루코시다제, 트리코더마 레세이 셀로바이오하이드롤라제 I, 트리코더마 레세이 셀로바이오하이드롤라제 II, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 I, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 II, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 III, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 V, 트리코더마 레세이 자일라나제 I, 트리코더마 레세이 자일라나제 II, 트리코더마 레세이 자일라나제 III, 트리코더마 레세이 베타-자일로시다제, 및 트리코더마 레세이 번역 연장 인자에 대한 유전자로부터 수득되는 프로모터뿐만 아니라 NA2-tpi 프로모터(아스페르길루스 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자로부터의 비번역 리더에 의해 비번역 리더가 대체된 아스페르길루스 중성 알파-아밀라제 유전자로부터의 변형된 프로모터; 비제한적 예는 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리재 트리오스 포스페이트 이소머라제 유전자로부터의 비번역 리더에 의해 비번역 리더가 대체된 아스페르길루스 니제르 중성 알파-아밀라제 유전자로부터의 변형된 프로모터를 포함함); 및 이의 돌연변이 프로모터, 절단된 프로모터, 및 하이브리드 프로모터가 있다. 다른 프로모터는 미국 특허 6,011,147호에 기재되어 있다.
효모 숙주에서 유용한 프로모터는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비시애 갈락토키나제(GAL1), 사카로마이세스 세레비시애 알코올 데하이드로게나제/글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH1, ADH2/GAP), 사카로마이세스 세레비시애 트리오스 포스페이트 이소머라제(TPI), 사카로마이세스 세레비시애 메탈로티오네인(CUP1), 및 사카로마이세스 세레비시애 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 유용한 기타 프로모터는 문헌[Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488]에 기재되어 있다.
제어 서열은 또한 전사를 종결시키기 위해 숙주 세포에 의해 인식되는 전사 종결자일 수 있다. 종결자는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능하는 임의의 종결자가 본 발명에 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 바람직한 종결자는 바실루스 클라우시이(Bacillus clausii) 알칼리성 프로테아제(aprH), 바실루스 리케니포르미스 알파-아밀라제(amyL), 및 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) 리보좀 RNA(rrnB)에 대한 유전자로부터 수득된다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 종결자는 아스페르길루스 니둘란스 아세트아미다제, 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스페르길루스 니제르 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니제르 알파-글루코시다제, 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제, 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제, 트리코더마 레세이 베타-글루코시다제, 트리코더마 레세이 셀로바이오하이드롤라제 I, 트리코더마 레세이 셀로바이오하이드롤라제 II, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 I, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 II, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 III, 트리코더마 레세이 엔도글루카나제 V, 트리코더마 레세이 자일라나제 I, 트리코더마 레세이 자일라나제 II, 트리코더마 레세이 자일라나제 III, 트리코더마 레세이 베타-자일로시다제, 및 트리코더마 레세이 번역 연장 인자에 대한 유전자로부터 수득된다.
효모 숙주 세포에 바람직한 종결자는 사카로마이세스 세레비시애 에놀라제, 사카로마이세스 세레비시애 시토크롬 C(CYC1), 및 사카로마이세스 세레비시애 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제에 대한 유전자로부터 수득된다. 효모 숙주 세포에 유용한 기타 종결자는 상기 인용 문헌[Romanos et al., 1992]에 기재되어 있다.
제어 서열은 또한 유전자의 발현을 증가시키는 프로모터 하류 및 유전자 암호화 서열 상류의 mRNA 안정화 영역일 수 있다.
적합한 mRNA 안정화 영역의 예는 바실루스 튜린겐시스 cryIIIA 유전자(WO 94/25612) 및 바실루스 서브틸리스 SP82 유전자(Hue et al., 1995, J. Bacteriol. 177: 3465-3471)로부터 수득된다.
제어 서열은 또한 숙주 세포에 의한 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역인 리더일 수 있다. 리더는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동가능하게 연결된다. 숙주 세포에서 기능하는 임의의 리더가 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 리더는 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제 및 아스페르길루스 니둘란스 트리오스 포스페이트 이소머라제의 유전자로부터 수득된다.
효모 숙주 세포에 적합한 리더는 사카로마이세스 세레비시애 에놀라제(ENO-1), 사카로마이세스 세레비시애 3-포스포글리세레이트 키나제, 사카로마이세스 세레비시애 알파-인자, 및 사카로마이세스 세레비시애 알코올 데하이드로게나제/글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제(ADH2/GAP)의 유전자로부터 수득된다.
제어 서열은 또한 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동가능하게 연결되며, 전사될 경우, 폴리아데노신 잔기를 전사된 mRNA에 부가하는 신호로서 숙주 세포에 의해 인식되는 서열인 폴리아데닐화 서열일 수 있다. 숙주 세포에서 기능하는 임의의 폴리아데닐화 서열이 사용될 수 있다.
사상 진균 숙주 세포에 바람직한 폴리아데닐화 서열은 아스페르길루스 니둘란스 안트라닐레이트 신타제, 아스페르길루스 니제르 글루코아밀라제, 아스페르길루스 니제르 알파-글루코시다제, 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제, 및 푸사리움 옥시스포룸 트립신-유사 프로테아제의 유전자로부터 수득된다.
효모 숙주 세포에 유용한 폴리아데닐화 서열은 문헌[Guo and Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990]에 기재되어 있다.
제어 서열은 또한 폴리펩티드의 N-말단에 연결된 신호 펩티드를 암호화하며 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 보내는 신호 펩티드 암호화 영역일 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열의 5'-말단은 폴리펩티드를 암호화하는 암호화 서열의 분절과 함께 번역 해독틀에서 자연적으로 연결된 신호 펩티드 암호화 서열을 본질적으로 포함할 수 있다. 대안적으로, 암호화 서열의 5'-말단은 암호화 서열에 대해 이종성인 신호 펩티드 암호화 서열을 포함할 수 있다. 이종성 신호 펩티드 암호화 서열은 암호화 서열이 자연적으로 신호 펩티드 암호화 서열을 포함하지 않는 경우에 필요할 수 있다. 대안적으로, 이종성 신호 펩티드 암호화 서열은 단순히 폴리펩티드의 분비를 향상시키기 위해 천연 신호 펩티드 암호화 서열을 대체할 수 있다. 그러나, 발현된 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로로 보내는 임의의 신호 펩티드 암호화 서열이 사용될 수 있다.
박테리아 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 암호화 서열은 바실루스 NCIB 11837 말토제닉 아밀라제, 바실루스 리케니포르미스 서브틸리신, 바실루스 리케니포르미스 베타-락타마제, 바실루스 스테아로서모필루스 알파-아밀라제, 바실루스 스테아로서모필루스 중성 프로테아제(nprT, nprS, nprM), 및 바실루스 서브틸리스 prsA에 대한 유전자로부터 수득되는 신호 펩티드 암호화 서열이다. 추가의 신호 펩티드는 문헌[Simonen and Palva, 1993, Microbiol. Rev. 57: 109-137]에 기재되어 있다.
사상 진균 숙주 세포에 효과적인 신호 펩티드 암호화 서열은 아스페르길루스 니제르 중성 아밀라제, 아스페르길루스 니제르 글루코아밀라제, 아스페르길루스 오리재 TAKA 아밀라제, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 셀룰라제, 후미콜라 인솔렌스 엔도글루카나제 V, 후미콜라 라누기노사(Humicola lanuginosa) 리파제, 및 리조무코르 미에헤이 아스파트산 프로테이나제에 대한 유전자로부터 수득되는 신호 펩티드 암호화 서열이다.
효모 숙주 세포에 유용한 신호 펩티드는 사카로마이세스 세레비시애 알파-인자 및 사카로마이세스 세레비시애 인버타제에 대한 유전자로부터 수득된다. 기타 유용한 신호 펩티드 암호화 서열은 상기 인용 문헌[Romanos et al., 1992]에 기재되어 있다.
제어 서열은 또한 폴리펩티드의 N-말단에 위치한 프로펩티드를 암호화하는 프로펩티드 암호화 서열일 수 있다. 생성되는 폴리펩티드는 프로엔자임 또는 프로폴리펩티드(또는 일부 경우에는 효소원)로 알려져 있다. 프로폴리펩티드는 일반적으로 불활성이며, 프로폴리펩티드로부터 프로펩티드의 촉매성 또는 자가촉매성 절단에 의해 활성 폴리펩티드로 전환될 수 있다. 프로펩티드 암호화 서열은 바실루스 서브틸리스 알칼리성 프로테아제(aprE), 바실루스 서브틸리스 중성 프로테아제(nprT), 마이셀리오프토라 서모필라(Myceliophthora thermophila) 락카제(WO 95/33836), 리조무코르 미에헤이 아스파트산 프로테이나제, 및 사카로마이세스 세레비시애 알파-인자에 대한 유전자로부터 수득될 수 있다.
신호 펩티드 및 프로펩티드 서열이 둘 다 존재하는 경우, 프로펩티드 서열은 폴리펩티드의 N-말단 옆에 위치하고 신호 펩티드 서열은 프로펩티드 서열의 N-말단 옆에 위치한다.
또한 숙주 세포의 성장 대비 폴리펩티드의 발현을 조절하는 조절 서열을 부가하는 것이 바람직할 수 있다. 조절 서열의 예는 조절 화합물의 존재를 포함하는 화학적 또는 물리적 자극에 반응하여 유전자 발현을 개시 또는 중단시키는 것들이다. 원핵생물 시스템의 조절 서열은 lac, tac, 및 trp 작동인자 시스템을 포함한다. 효모에서는 ADH2 시스템 또는 GAL1 시스템이 사용될 수 있다. 사상 진균에서는 아스페르길루스 니제르 글루코아밀라제 프로모터, 아스페르길루스 오리재 TAKA 알파-아밀라제 프로모터, 및 아스페르길루스 오리재 글루코아밀라제 프로모터, 트리코더마 레세이 셀로바이오하이드롤라제 I 프로모터, 및 트리코더마 레세이 셀로바이오하이드롤라제 II 프로모터가 사용될 수 있다. 조절 서열의 다른 예는 유전자 증폭을 가능하게 하는 것들이다. 진핵생물 시스템에서, 이러한 조절 서열은 메토트렉세이트의 존재하에 증폭되는 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자, 및 중금속으로 증폭되는 메탈로티오네인 유전자를 포함한다. 이러한 경우에, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절 서열에 작동가능하게 연결될 것이다.
발현 벡터
본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프로모터, 및 전사 및 번역 정지 신호를 포함하는 재조합 발현 벡터에 관한 것이다. 다양한 뉴클레오티드 및 제어 서열을 함께 연결하여, 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 치환이 가능한 하나 이상의 편리한 제한 부위를 포함할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제조할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체를 발현에 적절한 벡터에 삽입하여 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 발현 벡터의 생성에 있어서, 암호화 서열은 암호화 서열이 발현에 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연결되도록 벡터에 위치한다.
재조합 발현 벡터는 재조합 DNA 절차에 편리하게 적용할 수 있고 폴리뉴클레오티드의 발현을 일으킬 수 있는 임의의 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스)일 수 있다. 벡터의 선택은 일반적으로 벡터가 도입될 숙주 세포와 벡터의 양립 가능성에 따라 달라질 것이다. 벡터는 선형 또는 닫힌 원형 플라스미드일 수 있다.
벡터는 자가 복제가능한 벡터, 즉 염색체 복제와는 독립적으로 복제되는 염색체외 개체, 예를 들어 플라스미드, 염색체외 요소, 미니염색체, 또는 인공 염색체로서 존재하는 벡터일 수 있다. 벡터는 자가 복제를 보장하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 숙주 세포에 도입시 게놈에 통합되어 통합 염색체와 함께 복제되는 것일 수 있다. 또한, 단일 벡터 또는 플라스미드, 또는 숙주 세포 게놈에 도입될 전체 DNA 또는 트랜스포존을 함께 포함하는 2개 이상의 벡터 또는 플라스미드가 사용될 수 있다.
벡터는 바람직하게는 형질전환, 형질감염, 형질도입 등이 이루어진 세포의 용이한 선택을 가능하게 하는 하나 이상의 선별 마커를 포함한다. 선별 마커는 살생물제 또는 바이러스 내성, 중금속 내성, 영양요구균에 대한 원영양성 등을 제공하는 유전자 산물에 대한 유전자이다.
박테리아 선별 마커의 예에는 바실루스 리케니포르미스 또는 바실루스 서브틸리스 dal 유전자, 또는 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신, 또는 테트라사이클린 내성과 같은 항생제 내성을 부여하는 마커가 있다. 효모 숙주 세포에 적합한 마커는 ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, 및 URA3를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 사상 진균 숙주 세포에 사용하기 위한 선별 마커는 adeA(포스포리보실아미노이미다졸-석시노카복사미드 신타제), adeB(포스포리보실-아미노이미다졸 신타제), amdS(아세트아미다제), argB(오르니틴 카바모일트랜스퍼라제), bar(포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제), hph(하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제), niaD(니트레이트 리덕타제), pyrG(오로티딘-5'-포스페이트 데카보실라제), sC(설페이트 아데닐트랜스퍼라제), 및 trpC(안트라닐레이트 신타제), 뿐만 아니라 이들의 등가물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 아스페르길루스 세포에 사용하기에 바람직한 것은 아스페르길루스 니둘란스 또는 아스페르길루스 오리재 amdS 및 pyrG 유전자 및 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 바(Streptomyces hygroscopicus bar) 유전자이다. 트리코더마 세포에 사용하기에 바람직한 것은 adeA, adeB, amdS, hph, 및 pyrG 유전자이다.
선별 마커는 WO 2010/039889에 기재된 바와 같은 이중 선별 마커 시스템일 수 있다. 일 양태에서, 이중 선별 마커는 hph-tk 이중 선별 마커 시스템이다.
벡터는 바람직하게는, 벡터를 숙주 세포 게놈에 통합시킬 수 있거나 게놈과는 독립적으로 세포에서 벡터를 자율적으로 복제시킬 수 있는 요소를 포함한다.
숙주 세포 게놈에 통합하는 경우, 벡터는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 상동성 또는 비상동성 재조합을 통해 게놈에 통합시키기 위한 벡터의 임의의 다른 요소에 의존할 수 있다. 대안적으로, 벡터는 염색체의 정확한 위치에서 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 게놈에 통합되도록 지시하기 위한 추가의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 정확한 위치에서의 통합 가능성을 높이기 위해, 통합 요소는 상동성 재조합의 확률을 높이도록 해당 표적 서열에 대해 높은 수준의 서열 동일성을 갖는 충분한 수의 핵산, 예컨대 100 내지 10,000개의 염기쌍, 400 내지 10,000개의 염기쌍, 및 800 내지 10,000개의 염기쌍을 포함해야 한다. 통합 요소는 숙주 세포 게놈의 표적 서열과 상동성인 임의의 서열일 수 있다. 또한, 통합 요소는 비암호화 또는 암호화 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 다른 한편, 벡터는 비상동성 재조합에 의해 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다.
자율 복제의 경우, 벡터는 해당 숙주 세포에서 벡터가 자율적으로 복제할 수 있도록 하는 복제 기점을 추가로 포함할 수 있다. 복제 기점은 세포에서 기능하는 자율 복제를 매개하는 임의의 플라스미드 복제인자일 수 있다. 용어 "복제 기점" 또는 "플라스미드 복제인자"는 플라스미드 또는 벡터가 생체내 복제할 수 있도록 하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
박테리아 복제 기점의 예에는 E. 콜라이에서 복제를 가능하게 하는 pBR322, pUC19, pACYC177, 및 pACYC184와, 바실루스에서 복제를 가능하게 하는 pUB110, pE194, pTA1060, 및 pAMβ1 플라스미드의 복제 기점이 있다.
효모 숙주 세포에 사용하기 위한 복제 기점의 예에는 2 마이크론 복제 기점, ARS1, ARS4, ARS1과 CEN3의 조합, 및 ARS4와 CEN6의 조합이 있다.
사상 진균 세포에 유용한 복제 기점의 예에는 AMA1 및 ANS1이 있다(Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). AMA1 유전자의 단리 및 이러한 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 구성은 WO 00/24883에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 둘 이상의 카피를 숙주 세포에 삽입하여 폴리펩티드의 생성을 증가시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드 카피 수의 증가는 적어도 하나의 추가 카피 서열을 숙주 세포 게놈에 통합시킴으로써, 또는 증폭가능한 선별 마커 유전자를 폴리뉴클레오티드와 함께 포함시킴으로써 획득될 수 있으며, 적절한 선별 제제의 존재하에 세포를 배양함으로써 선별 마커의 증폭된 카피를 포함하는 세포, 및 이에 의해 폴리뉴클레오티드의 추가 카피를 선택할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터를 구성하기 위해 상기 요소들을 라이게이션하는 데 사용되는 절차는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 상기 인용 문헌[Sambrook et al., 1989] 참조).
숙주 세포
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 생성을 지시하는 하나 이상의 제어 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체 또는 벡터는 구성체 또는 벡터가 앞서 기재된 바와 같은 염색체 통합체로서 또는 자가복제성 염색체외 벡터로서 유지되도록 숙주 세포에 도입된다. 숙주 세포의 선택은 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 및 그 공급원에 따라 크게 달라질 것이다.
일부 구현예에서, 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포에 대해 이종성이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 제어 서열 중 적어도 하나는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대해 이종성이다.
일부 구현예에서, 재조합 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 적어도 2개의 카피, 예를 들어 3개, 4개, 또는 5개의 카피를 포함한다.
숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산에 유용한 임의의 미생물 또는 식물 세포, 예를 들어 원핵 세포 또는 진균 세포일 수 있다.
원핵 숙주 세포는 임의의 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아일 수 있다. 그람 양성 박테리아는 바실루스(Bacillus), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 지오바실루스(Geobacillus), 락토바실루스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 오세아노바실루스(Oceanobacillus), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 그람 음성 박테리아는 캄필로박터(Campylobacter), E. 콜라이(E. coli), 플라보박테리움(Flavobacterium), 푸소박테리움(Fusobacterium), 헬리코박터(Helicobacter), 리오박터(Ilyobacter), 네이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 및 우레아플라스마(Ureaplasma)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
박테리아 숙주 세포는 바실루스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실루스 아밀로리퀘파시엔스, 바실루스 브레비스(Bacillus brevis), 바실루스 서큘란스(Bacillus circulans), 바실루스 클라우시이, 바실루스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실루스 피르무스(Bacillus firmus), 바실루스 라우투스(Bacillus lautus), 바실루스 렌투스(Bacillus lentus), 바실루스 리케니포르미스, 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실루스 퓨밀루스(Bacillus pumilus), 바실루스 스테아로서모필루스, 바실루스 서브틸리스, 및 바실루스 튜린겐시스 세포를 포함하는(이에 한정되지 않음) 임의의 바실루스 세포일 수 있다.
박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스(Streptococcus equisimilis), 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 우베리스(Streptococcus uberis), 및 스트렙토코쿠스 에퀴(Streptococcus equi) 아종 주에피데미쿠스(Zooepidemicus) 세포를 포함하는(이에 한정되지 않음) 임의의 스트렙토코쿠스 세포일 수 있다.
박테리아 숙주 세포는 또한 스트렙토마이세스 아크로모게네스(Streptomyces achromogenes), 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis), 스트렙토마이세스 코엘리컬러, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus), 및 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포를 포함하는(이에 한정되지 않음) 임의의 스트렙토마이세스 세포일 수 있다.
바실루스 세포에 DNA를 도입하는 것은 원형질체 형질전환(예를 들어, 문헌[Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115] 참조), 적격 세포 형질전환(예를 들어, 문헌[Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, 또는 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221] 참조), 전기천공(예를 들어, 문헌[Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751] 참조), 또는 접합(예를 들어, 문헌[Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278] 참조)에 의해 수행될 수 있다. E. 콜라이 세포에 DNA를 도입하는 것은 원형질체 형질전환(예를 들어, 문헌[Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580] 참조) 또는 전기천공(예를 들어, 문헌[Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145] 참조)에 의해 수행될 수 있다. 스트렙토마이세스 세포에 DNA를 도입하는 것은 원형질체 형질전환, 전기천공(예를 들어, 문헌[Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405] 참조), 접합(예를 들어, 문헌[Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585] 참조), 또는 형질도입(예를 들어, 문헌[Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294] 참조)에 의해 수행될 수 있다. 슈도모나스 세포에 DNA를 도입하는 것은 전기천공(예를 들어, 문헌[Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397] 참조) 또는 접합(예를 들어, 문헌[Pinedo and Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57] 참조)에 의해 수행될 수 있다. 스트렙토코쿠스 세포에 DNA를 도입하는 것은 자연적 적격성(예를 들어, 문헌[Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297] 참조), 원형질체 형질전환(예를 들어, 문헌[Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207] 참조), 전기천공(예를 들어, 문헌[Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804] 참조), 또는 접합(예를 들어, 문헌[Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436] 참조)에 의해 수행될 수 있다. 그러나, DNA를 숙주 세포에 도입하기 위한 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다.
숙주 세포는 진균 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "진균"은 아스코마이코타(Ascomycota), 바시디오마이코타(Basidiomycota), 키트리디오마이코타(Chytridiomycota) 및 자이고마이코타(Zygomycota) 문, 뿐만 아니라 우마이코타(Oomycota) 및 모든 유사분열 진균(문헌[Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK]에 정의된 바와 같음)을 포함한다.
진균 숙주 세포는 효모 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "효모"는 자낭포자 효모(엔도마이세탈레스(Endomycetales)), 담자포자 효모, 및 불완전 진균에 속하는 효모(블라스토마이세스(Blastomycetes))를 포함한다. 효모의 분류는 향후 변경될 수 있으므로, 본 발명의 목적을 위해, 효모는 문헌[Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980)]에 기술된 바와 같이 정의될 것이다.
효모 숙주 세포는 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 또는 야로위아(Yarrowia) 세포, 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 사카로마이세스 칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 세레비시애, 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 더글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 또는 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 세포일 수 있다.
진균 숙주 세포는 사상 진균 세포일 수 있다. "사상 진균"은 아문 유마이코타 및 우마이코타(상기 인용 문헌[Hawksworth et al., 1995]에 정의된 바와 같음)의 모든 사상 형태를 포함한다. 사상 진균은 일반적으로 키틴, 셀룰로스, 글루칸, 키토산, 만난, 및 기타 복합 다당류로 구성된 균사 벽을 특징으로 한다. 영양 성장은 균사 신장에 의해 이루어지고, 탄소 이화작용은 절대 호기성이다. 대조적으로, 사카로마이세스 세레비시애와 같은 효모에 의한 영양 성장은 단세포 엽상체의 발아에 의해 이루어지고, 탄소 이화작용은 발효적일 수 있다.
사상 진균 숙주 세포는 아크레모니움(Acremonium), 아스페르길루스, 오레오바시디움(Aureobasidium), 비저칸데라(Bjerkandera), 세리포리옵시스(Ceriporiopsis), 크리소스포리움(Chrysosporium), 코프리누스(Coprinus), 코리올루스(Coriolus), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 필리바시디움(Filibasidium), 푸사리움, 후미콜라, 마그나포르테(Magnaporthe), 무코르(Mucor), 마이셀리오프토라(Myceliophthora), 네오칼리마스틱스(Neocallimastix), 뉴로스포라(Neurospora), 파에실로마이세스(Paecilomyces), 페니실리움, 파네로카에테(Phanerochaete), 플레비아(Phlebia), 피로마이세스(Piromyces), 플루로투스(Pleurotus), 쉬조필룸(Schizophyllum), 탈라로마이세스(Talaromyces), 서모아스쿠스, 티엘라비아(Thielavia), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 트라메테스(Trametes), 또는 트리코더마 세포일 수 있다.
예를 들어, 사상 진균 숙주 세포는 아스페르길루스 아와모리, 아스페르길루스 포에티두스(Aspergillus foetidus), 아스페르길루스 푸미가투스, 아스페르길루스 자포니쿠스(Aspergillus japonicus), 아스페르길루스 니둘란스, 아스페르길루스 니제르, 아스페르길루스 오리재, 비저칸데라 아두스타(Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나(Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아(Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스(Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타(Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사(Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 서브루파(Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 서브버미스포라(Ceriporiopsis subvermispora), 크리소스포리움 이놉스(Chrysosporium inops), 크리소스포리움 케라티노필룸(Chrysosporium keratinophilum), 크리소스포리움 루크노웬스(Chrysosporium lucknowense), 크리소스포리움 메르다리움(Chrysosporium merdarium), 크리소스포리움 판니콜라(Chrysosporium pannicola), 크리소스포리움 퀸스란디쿰(Chrysosporium queenslandicum), 크리소스포리움 트로피쿰(Chrysosporium tropicum), 크리소스포리움 조나툼(Chrysosporium zonatum), 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스(Coriolus hirsutus), 푸사리움 박트리디오이데스(Fusarium bactridioides), 푸사리움 세레알리스(Fusarium cerealis), 푸사리움 크룩웰렌스(Fusarium crookwellense), 푸사리움 쿨모룸(Fusarium culmorum), 푸사리움 그라미네아룸(Fusarium graminearum), 푸사리움 그라미눔(Fusarium graminum), 푸사리움 헤테로스포룸(Fusarium heterosporum), 푸사리움 네군디(Fusarium negundi), 푸사리움 옥시스포룸, 푸사리움 레티쿨라툼(Fusarium reticulatum), 푸사리움 로세움(Fusarium roseum), 푸사리움 삼부시눔(Fusarium sambucinum), 푸사리움 사르코크로움(Fusarium sarcochroum), 푸사리움 스포로트리키오이데스(Fusarium sporotrichioides), 푸사리움 설푸레움(Fusarium sulphureum), 푸사리움 토룰로숨(Fusarium torulosum), 푸사리움 트리코테시오이데스(Fusarium trichothecioides), 푸사리움 베네나툼(Fusarium venenatum), 후미콜라 인솔렌스, 후미콜라 라누기노사, 무코르 미에헤이(Mucor miehei), 마이셀리오프토라 서모필라, 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 페니실리움 푸르푸로게눔(Penicillium purpurogenum), 파네로카에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디아타(Phlebia radiata), 플루로투스 에린기이(Pleurotus eryngii), 탈라로마이세스 에머소니이(Talaromyces emersonii), 티엘라비아 테레스트리스(Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사(Trametes villosa), 트라메테스 베르시컬러(Trametes versicolor), 트리코더마 하르지아눔(Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌기이(Trichoderma koningii), 트리코더마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레세이, 또는 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 세포일 수 있다.
진균 세포는 그 자체로 알려진 방식으로 원형질체 형성, 원형질체의 형질전환, 및 세포벽 재생을 수반하는 프로세스에 의해 형질전환될 수 있다. 아스페르길루스 및 트리코더마 숙주 세포의 형질전환에 적합한 절차는 문헌[EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, and Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422]에 기재되어 있다. 푸사리움 종의 형질전환에 적합한 방법은 문헌[Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, 및 WO 96/00787]에 기재되어 있다. 효모는 문헌[Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; 및 Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920]에 기재된 절차를 사용하여 형질전환될 수 있다.
생산 방법
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, (a) 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건하에 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.
숙주 세포는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 폴리펩티드의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어, 세포는 폴리펩티드가 발현 및/또는 단리될 수 있는 조건하에 적합한 배지에서 진탕 플라스크 배양에 의해, 또는 실험실 또는 산업용 발효기에서의 소규모 또는 대규모 발효(연속식, 회분식, 유가식, 또는 고상 발효를 포함)에 의해 배양될 수 있다. 배양은 당업계에 알려진 절차를 사용하여, 탄소원 및 질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적 공급업체로부터 입수할 수 있거나, 공개된 조성(예를 들어, ATCC(American Type Culture Collection) 카탈로그에 공개된 조성)에 따라 제조될 수 있다. 폴리펩티드가 영양 배지 내로 분비되는 경우, 폴리펩티드는 배지로부터 직접 회수될 수 있다. 폴리펩티드가 분비되지 않는 경우, 폴리펩티드는 세포 용해액으로부터 회수될 수 있다.
폴리펩티드는 폴리펩티드에 특이적인 당업계에 알려진 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출 방법은 특정 항체의 사용, 효소 산물의 형성, 또는 효소 기질의 소실을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 폴리펩티드 활성을 측정하기 위해 효소 분석법이 사용될 수 있다.
폴리펩티드는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 회수될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 수집, 원심분리, 여과, 추출, 분무건조, 증발, 또는 침전을 포함하는(이에 한정되지 않음) 통상적인 절차에 의해 발효 배지로부터 회수될 수 있다. 일 양태에서, 폴리펩티드를 포함하는 전체 발효 배양액이 회수된다.
크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환, 친화성, 소수성, 크로마토포커싱, 및 크기 배제), 전기영동 절차(예를 들어, 분취 등전 포커싱), 차등 용해도(예를 들어, 황산암모늄 침전), SDS-PAGE, 또는 추출을 포함하는(이에 한정되지 않음) 당업계에 알려진 다양한 절차를 통해 폴리펩티드를 정제하여(예를 들어, 문헌[Protein Purification, Janson and Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989] 참조) 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
효소 조성물
본 발명에 따른 방법에 사용하기 위한 효소 조성물은 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 효소, 예컨대 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)(EC 5.3.4.1) 또는 티오레독신 펩티드를 주요 효소 성분으로서 포함할 수 있다(예를 들어, 단일성분 조성물). 대안적으로, 조성물은 자일라나제, 셀로바이오하이드롤라제, 셀룰라제, 엔도글루카나제, 및/또는 아라비노푸라노시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의(예를 들어, 여러) 효소와 같은 다중 효소 활성을 포함할 수 있다.
조성물은 당업계에 알려진 방법에 따라 제조될 수 있고, 액체 또는 건조 조성물의 형태일 수 있다. 조성물은 당업계에 알려진 방법에 따라 안정화될 수 있다.
액체 제형
본 발명은 또한 본 발명의 단백질 디설파이드 이소머라제 또는 티오레독신 펩티드를 포함하는 액체 조성물에 관한 것이다. 조성물은 효소 안정화제(이의 예는 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 글리세롤, 당 또는 당 알코올, 락트산, 가역적 프로테아제 억제제, 붕산 또는 붕산 유도체, 예를 들어 방향족 보레이트 에스테르, 또는 4-포르밀페닐 보론산과 같은 페닐 보론산 유도체를 포함함)를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 조성물의 부피를 증가시키기 위해 충전제 또는 담체 물질이 포함된다. 적합한 충전제 또는 담체 물질은 설페이트, 카보네이트, 및 실리케이트의 다양한 염뿐만 아니라 활석, 점토 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 액체 조성물에 적합한 충전제 또는 담체 물질은 물 또는 폴리올 및 디올을 포함하는 저분자량 1차 및 2차 알코올을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 알코올의 예는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 및 이소프로판올을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5% 내지 약 90%의 이러한 물질을 함유한다.
일 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는 액체 제형에 관한 것이다:
(A) 본 발명의 [효소] 활성을 갖는 0.001% 내지 25% w/w의 하나 이상의 폴리펩티드; 및
(B) 물.
다른 구현예에서, 액체 제형은 20% 내지 80% w/w의 폴리올을 포함한다. 일 구현예에서, 액체 제형은 0.001% 내지 2.0% w/w의 보존제를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 액체 제형에 관한 것이다:
(A) 본 발명의 [효소] 활성을 갖는 0.001% 내지 25% w/w의 하나 이상의 폴리펩티드;
(B) 20% 내지 80% w/w의 폴리올;
(C) 임의적으로 0.001% 내지 2.0% w/w의 보존제; 및
(D) 물.
다른 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 액체 제형에 관한 것이다:
(A) 본 발명의 [효소] 활성을 갖는 0.001% 내지 25% w/w의 하나 이상의 폴리펩티드;
(B) 0.001% 내지 2.0% w/w의 보존제;
(C) 임의적으로 20% 내지 80% w/w의 폴리올; 및
(D) 물.
다른 구현예에서, 액체 제형은 폴리올, 염화나트륨, 벤조산나트륨, 소르브산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 황산마그네슘, 티오황산나트륨, 탄산칼슘, 시트르산나트륨, 덱스트린, 글루코스, 수크로스, 소르비톨, 락토스, 전분, PVA, 아세테이트, 및 포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된, 바람직하게는 황산나트륨, 덱스트린, 셀룰로스, 티오황산나트륨, 카올린, 및 탄산칼슘으로부터 선택된 제형화제와 같은 하나 이상의 제형화제를 포함한다. 일 구현예에서, 폴리올은 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜(MPG), 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 1,2-프로필렌 글리콜 또는 1,3-프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 약 600 미만의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 약 600 미만의 평균 분자량을 갖는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 글리세롤, 소르비톨, 및 프로필렌 글리콜(MPG), 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 액체 제형은 20%~80%의 폴리올(즉, 폴리올의 총량), 예를 들어 25%~75%의 폴리올, 30%~70%의 폴리올, 35%~65%의 폴리올, 또는 40%~60%의 폴리올을 포함한다. 일 구현예에서, 액체 제형은 20%~80%의 폴리올, 예를 들어 25%~75%의 폴리올, 30%~70%의 폴리올, 35%~65%의 폴리올, 또는 40%~60%의 폴리올을 포함하고, 폴리올은 글리세롤, 소르비톨, 프로필렌 글리콜(MPG), 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 1,2-프로필렌 글리콜 또는 1,3-프로필렌 글리콜, 디프로필렌 글리콜, 약 600 미만의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 약 600 미만의 평균 분자량을 갖는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 액체 제형은 20%~80%의 폴리올(즉, 폴리올의 총량), 예를 들어 25%~75%의 폴리올, 30%~70%의 폴리올, 35%~65%의 폴리올, 또는 40%~60%의 폴리올을 포함하고, 폴리올은 글리세롤, 소르비톨, 및 프로필렌 글리콜(MPG)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 보존제는 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 및 벤조산칼륨, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 액체 제형은 0.02% 내지 1.5% w/w의 보존제, 예를 들어 0.05% 내지 1.0% w/w의 보존제, 또는 0.1% 내지 0.5% w/w의 보존제를 포함한다. 일 구현예에서, 액체 제형은 0.001% 내지 2.0% w/w의 보존제(즉, 보존제의 총량), 예를 들어 0.02% 내지 1.5% w/w의 보존제, 0.05% 내지 1.0% w/w의 보존제, 또는 0.1% 내지 0.5% w/w의 보존제를 포함하고, 보존제는 소르브산나트륨, 소르브산칼륨, 벤조산나트륨, 및 벤조산칼륨, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 액체 제형은 하나 이상의 추가 효소, 예를 들어 하이드롤라제, 이소머라제, 리가제, 리아제, 옥시리덕타제, 및 트랜스퍼라제를 추가로 포함한다. 하나 이상의 추가 효소는 바람직하게는 아세틸자일란 에스테라제, 아실글리세롤 리파제, 아밀라제, 알파-아밀라제, 베타-아밀라제, 아라비노푸라노시다제, 셀로바이오하이드롤라제, 셀룰라제, 페룰로일 에스테라제, 갈락타나제, 알파-갈락타나제, 베타-갈락타나제, 베타-글루카나제, 베타-글루코시다제, 리소포스포리파제, 리소자임, 알파-만노시다제, 베타-만노시다제(만나나제), 피타제, 포스포리파제 A1, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 D, 프로테아제, 풀루라나제, 펙틴 에스테라제, 트리아실글리세롤 리파제, 자일라나제, 베타-자일로시다제, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
발효 배양액 제형 또는 세포 조성물
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 발효 배양액 제형 또는 세포 조성물에 관한 것이다. 발효 배양액 제형 또는 세포 조성물은 발효 공정에 사용되는 추가 성분, 예를 들어 세포(관심 폴리펩티드를 생산하는 데 사용되는 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 함유하는 숙주 세포를 포함), 세포 잔해, 바이오매스, 발효 배지, 및/또는 발효 산물을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 유기산, 사멸 세포 및/또는 세포 자해, 및 배양 배지를 함유하는 세포-사멸된 전체 배양액이다.
본원에서 사용되는 용어 "발효 배양액"은 회수 및/또는 정제가 진행되지 않거나 최소한으로 진행되는 세포 발효에 의해 생성된 제제를 지칭한다. 예를 들어, 발효 배양액은 단백질 합성(예를 들어, 숙주 세포에 의한 효소의 발현) 및 세포 배양 배지로의 분비를 가능하게 하는 탄소 제한 조건하에 인큐베이션된 미생물 배양물이 포화 상태까지 성장하는 경우에 생성된다. 발효 배양액은 발효 종료시 유래된 발효 물질의 비분별 또는 분별 내용물을 함유할 수 있다. 일반적으로, 발효 배양액은 분별되지 않으며, 미생물 세포(예를 들어, 사상 진균 세포)가 예를 들어 원심분리에 의해 제거된 후에 존재하는 소비된 배양 배지 및 세포 잔해를 포함한다. 일부 구현예에서, 발효 배양액은 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소, 및 생존가능 미생물 세포 및/또는 생존불능 미생물 세포를 함유한다.
일부 구현예에서, 발효 배양액 제형 또는 세포 조성물은 1 내지 5개 탄소의 적어도 하나의 유기산 및/또는 이의 염을 포함하는 제1 유기산 성분 및 6개 이상 탄소의 적어도 하나의 유기산 및/또는 이의 염을 포함하는 제2 유기산 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 유기산 성분은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 이의 염, 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물이고, 제2 유기산 성분은 벤조산, 시클로헥산카복실산, 4-메틸발레르산, 페닐아세트산, 이의 염, 또는 이들 중 둘 이상의 혼합물이다.
일 양태에서, 조성물은 유기산을 함유하고, 임의적으로 사멸 세포 및/또는 세포 잔해를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 사멸 세포 및/또는 세포 잔해는 세포-사멸된 전체 배양액으로부터 제거되어 이러한 성분이 없는 조성물을 제공한다.
발효 배양액 제형 또는 세포 조성물은 소르비톨, 염화나트륨, 소르브산칼륨, 및 당업계에 알려진 그 외의 것을 포함하여(이에 한정되지 않음), 보존제 및/또는 항미생물제(예를 들어, 정균제)를 추가로 포함할 수 있다.
세포-사멸된 전체 배양액 또는 조성물은 발효 종료시 유래된 발효 물질의 비분별 내용물을 함유할 수 있다. 일반적으로, 세포-사멸된 전체 배양액 또는 조성물은 단백질 합성을 가능하게 하는 탄소 제한 조건하에 인큐베이션된 미생물 세포(예를 들어, 사상 진균 세포)가 포화 상태까지 성장한 후에 존재하는 소비된 배양 배지 및 세포 잔해를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포-사멸된 전체 배양액 또는 조성물은 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소, 및 사멸된 사상 진균 세포를 함유한다. 일부 구현예에서, 세포-사멸된 전체 배양액 또는 조성물에 존재하는 미생물 세포는 당업계에 알려진 방법을 사용하여 투과 및/또는 용해될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 전체 배양액 또는 세포 조성물은 일반적으로 액체이지만, 불용성 성분, 예컨대 사멸 세포, 세포 잔해, 배양 배지 성분, 및/또는 불용성 효소를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 불용성 성분을 제거하여 정화된 액체 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 전체 배양액 제형 및 세포 조성물은 WO 90/15861 또는 WO 2010/096673에 기재된 방법에 의해 생산될 수 있다.
본 발명은 하기 넘버링된 구현예에서 추가로 개시된다.
구현예 [1]. 습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터의 전분 수율 및/또는 글루텐 수율을 증가시키는 방법으로서, 분쇄된 옥수수 낟알, 특히 분쇄된 낟알의 섬유질이 풍부한 분획을 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 유효량의 폴리펩티드(예컨대, 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)(EC 5.3.4.1) 또는 티오레독신 펩티드)와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
구현예 [2]. 구현예 1에 있어서, 습식 제분 공정 중의 분쇄된 낟알에서 방출되는 전분 및/또는 글루텐, 특히 불용성 전분 및 글루텐의 양이 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 존재하지 않거나 첨가되지 않은 공정에 비해 증가되는, 방법.
구현예 [3]. 구현예 2에 있어서, 건조 고형분 그램당 방출 단백질 mg(mg/gDS)으로 측정된 증가는 PDI 무첨가에 비해 적어도 0.5% 포인트, 적어도 0.75% 포인트, 적어도 1.0% 포인트, 적어도 1.5% 포인트, 적어도 2.5% 포인트, 예컨대 적어도 5.0% 포인트이고, 섬유질 세척은 3.5~5.5 범위의 pH, 예컨대 pH 4.0, 4.5, 또는 5.0, 및 적어도 300 μg EP/gDS의 효소 용량에서 수행되는, 방법.
구현예 [4]. 구현예 1 내지 구현예 3 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI 또는 티오레독신 펩티드가 특히 섬유질 세척 단계 중에 섬유질 분획에 존재하거나 첨가되는, 방법.
구현예 [5]. 구현예 1 내지 구현예 4 중 어느 한 구현예에 있어서,
a) 옥수수 낟알을 물에 침지하여 불린 낟알을 생성하는 단계;
b) 불린 낟알을 분쇄하여 분쇄된 낟알을 생성하는 단계;
c) 분쇄된 낟알로부터 배를 분리하여 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 옥수수 낟알 덩어리를 생성하는 단계; 및
d) 옥수수 낟알 덩어리, 특히 미세 섬유질 분획을 섬유질 세척 절차에 적용하여 섬유질로부터 전분 및 글루텐을 분리하는 단계
를 포함하고,
적어도 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 단계 d) 전에 또는 중에 존재하거나 첨가되는, 방법.
구현예 [6]. 구현예 4에 있어서,
e) 글루텐으로부터 전분을 분리하는 단계; 및 임의적으로
f) 전분을 세척하는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
구현예 [7]. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI 또는 티오레독신 펩티드가 적어도 10 μg EP/g DS, 적어도 25 μg EP/g DS, 적어도 50 μg EP/g DS, 적어도 75 μg EP/g DS, 적어도 100 μg EP/g DS, 적어도 200 μg EP/g DS, 적어도 300 μg EP/g DS, 적어도 500 μg EP/g DS, 예컨대 10 내지 2000 μg EP/g DS, 25 내지 1000 μg EP/g DS, 50 내지 800 μg EP/g DS, 100 내지 500 μg EP/g DS 범위의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가되는, 방법.
구현예 [8]. 구현예 1 내지 구현예 6 중 어느 한 구현예에 있어서, SO2가 적어도 200 ppm, 적어도 300 ppm, 적어도 400 ppm, 적어도 450 ppm, 적어도 500 ppm, 적어도 600 ppm, 적어도 700 ppm, 적어도 800 ppm, 예컨대 200~3000 ppm, 300~2000 ppm, 400~800 ppm 범위의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가되는, 방법.
구현예 [9]. 구현예 1 내지 구현예 8 중 어느 한 구현예에 있어서, 유효량의 하나 이상의 가수분해 효소가 섬유질 세척 단계 전에 또는 중에 존재하거나 첨가되고, 상기 가수분해 효소 중 적어도 하나는 자일라나제 및/또는 셀룰라제로부터 선택되는, 방법.
구현예 [10]. 구현예 1 내지 구현예 9 중 어느 한 구현예에 있어서, 자일라나제는 GH5 폴리펩티드, GH8 폴리펩티드, GH30 폴리펩티드, GH10 폴리펩티드, GH11 폴리펩티드, GH8 폴리펩티드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [11]. 구현예 1 내지 구현예 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 가수분해 효소는 하나 이상의 셀룰라제를 포함하는, 방법.
구현예 [12]. 구현예 10에 있어서, 셀룰라제는 엔도글루카나제(EG), 셀로바이오하이드롤라제(CBH), 베타-글루코시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하는, 방법.
구현예 [13]. 구현예 11에 있어서, 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 I, 셀로바이오하이드롤라제 II, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하는, 방법.
구현예 [14]. 구현예 11 내지 구현예 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 셀룰라제는 트리코더마 레세이로부터 유래된, 방법.
구현예 [15]. 구현예 11 내지 구현예 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 셀룰라제는 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 I, 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 II, 아스페르길루스 푸미가투스 베타-글루코시다제 변이체, 및 페니실리움 종(에머소니이) GH61 폴리펩티드를 함유하는 트리코더마 레세이 셀룰라제 제제와 함께 아스페르길루스 푸미가투스 GH10 자일라나제, 아스페르길루스 푸미가투스 베타-자일로시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [16]. 구현예 15에 있어서, 셀룰라제는
i) 서열번호 14의 GH10 자일라나제, 서열번호 15의 베타-자일로시다제, 서열번호 16의 셀로바이오하이드롤라제 I, 서열번호 17의 셀로바이오하이드롤라제 II, 서열번호 18의 베타-글루코시다제, 서열번호 19의 GH61;
또는
ii) 서열번호 14에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 15에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 16에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 17에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 18에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 19에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드;
및
iii) 트리코더마 레세이로부터 유래된 적어도 하나의 엔도글루카나제
를 포함하는 조성물로부터 선택되는, 방법.
구현예 [17]. 구현예 1 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예에 있어서, 가수분해 효소는 아라비노푸라노시다제를 포함하는, 방법.
구현예 [18]. 구현예 17에 있어서, 아라비노푸라노시다제는 GH43 폴리펩티드, GH62 폴리펩티드, 및 GH51 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [19]. 구현예 1 내지 구현예 18 중 어느 한 구현예에 있어서, 단계 c)로부터의 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 옥수수 낟알 덩어리는 단계 d)의 섬유질 세척 절차 전에 추가 분쇄 단계, 바람직하게는 미분쇄 단계를 거치는, 방법.
구현예 [20]. 구현예 1 내지 구현예 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 섬유질 세척 절차는 섬유질 세척 시스템을 사용하여 수행되고, 섬유질 세척 시스템은 역류 세척 구성으로 유동적으로 연결된 복수의 스크린 유닛(S1…S4)(각각의 스크린 유닛은 옥수수 낟알 덩어리와 액체의 스트림을 제1 분획(s)과 제2 분획(f)의 두 분획으로 분리하도록 구성되고, 상기 제2 분획(f)은 제1 분획(s)보다 더 많은 wt% 측정량의 섬유질을 함유함) 및 임의적으로, 시스템에 배열된 공간으로서, 상기 제1 분획(s) 중 하나, 상기 제2 분획(f) 중 하나, 또는 혼합된 제1 및 제2 분획(s, f), 바람직하게는 제2 분획(f)만을 수용하도록 유동적으로 연결되고, 공간에 수용된 하나의 분획 또는 두 분획 모두에 대한 인큐베이션 시간을 제공하도록 구성되고, 이에 의해 인큐베이션된 하나의 분획 또는 두 분획 모두를 하류 스크린 유닛(S4)으로 배출하는 공간(V)을 포함하며,
시스템은
- 옥수수 낟알 덩어리 및 액체를 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로 유입시키고,
- 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로부터 제1 분획(s1)을 전분을 함유하는 산물 스트림으로서 배출하고,
- 공정수를 유입시키고(바람직하게는 공정수를 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로 유입시키도록 배열됨),
- 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로부터 제2 분획(f4)을 원래의 옥수수 낟알 덩어리보다 더 적은 양의 전분 및 글루텐을 함유하는 세척된 옥수수 낟알 덩어리로서 배출하고,
- 임의적으로 가수분해 효소를 시스템 내로 도입하도록 구성되는, 방법.
구현예 [21]. 구현예 20에 있어서, 상기 섬유질 세척 절차는 35분 이상 48시간 미만의 섬유질 세척 시스템 내 총 체류 시간을 제공하도록 구성된 공간(V)/탱크를 포함하는 섬유질 세척 시스템의 사용을 포함하는, 방법.
구현예 [22]. 구현예 20 또는 구현예 21에 있어서, 상기 공간(V)은 50~1000 m3 범위의 부피를 갖는, 방법.
구현예 [23]. 구현예 20 내지 구현예 22 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 공간(V)은 80 내지 250 m3 범위의 부피를 갖는, 방법.
구현예 [24]. 구현예 20 내지 구현예 23 중 어느 한 구현예에 있어서, 섬유질 세척 시스템 내에 구성된 상기 공간(V)/탱크에서의 인큐베이션 시간은 5분 이상 48시간 미만, 예컨대 35분 내지 24시간, 35분 내지 수 시간, 35분 내지 6시간, 35분 내지 5시간, 35분 내지 4시간, 35분 내지 3시간, 35분 내지 2시간, 45분 내지 48시간, 45분 내지 24시간, 45분 내지 12시간, 45분 내지 6시간, 45분 내지 5시간, 45분 내지 4시간, 45분 내지 3시간, 45분 내지 2시간인, 방법.
구현예 [25]. 구현예 1 내지 구현예 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 인큐베이션 온도는 25℃ 내지 95℃, 예컨대 25 내지 90℃, 25 내지 85℃, 25 내지 80℃, 25 내지 75℃, 25 내지 70℃, 25 내지 65℃, 25 내지 60℃, 25 내지 55℃, 25 내지 53℃, 25 내지 52℃, 30 내지 90℃, 30 내지 85℃, 30 내지 80℃, 30 내지 75℃, 30 내지 70℃, 30 내지 65℃, 30 내지 60℃, 30 내지 55℃, 30 내지 53℃, 30 내지 52℃, 35 내지 90℃, 35 내지 85℃, 35 내지 80℃, 35 내지 75℃, 35 내지 70℃, 35 내지 65℃, 35 내지 60℃, 35 내지 55℃, 35 내지 53℃, 35 내지 52℃, 39 내지 90℃, 39 내지 85℃, 39 내지 80℃, 39 내지 75℃, 39 내지 70℃, 39 내지 65℃, 39 내지 60℃, 39 내지 55℃, 39 내지 53℃, 39 내지 52℃, 바람직하게는 46 내지 52℃인, 방법.
구현예 [26]. 구현예 1 내지 구현예 25 중 어느 한 구현예에 있어서, 하나 이상의 가수분해 효소는 트리코더마 레세이와 같이 셀룰라제 배경을 가진 유기체에서 발현되는, 방법.
구현예 [27]. 구현예 1 내지 구현예 26 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 분쇄된 옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획과 혼합/접촉되는 하나 이상의 가수분해 효소의 유효량은 습식 제분 공정에 유입되는 옥수수 낟알 미터 톤당 효소 단백질 0.005~0.5 kg인, 방법.
구현예 [28]. 구현예 1 내지 구현예 27 중 어느 한 구현예에 있어서, SO2의 공급원은 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), NaHSO3, 및/또는 SO2 가스 첨가로부터 선택되는, 방법.
구현예 [29]. 구현예 1 내지 구현예 28 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI 또는 티오레독신 펩티드는 산화환원 단백질의 티오레독신 수퍼패밀리에 속하는 적어도 하나의 촉매 도메인을 포함하고, 이 도메인은 CXXC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는, 방법.
구현예 [30]. 구현예 29에 있어서, PDI는 적어도 하나의 비촉매 도메인에 의해 분리된, 각각 CXXC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는 2개의 촉매 도메인을 포함하는, 방법.
구현예 [31]. 구현예 29 또는 구현예 30에 있어서, CXXC 모티프는 CGHC, CTHC, CPHC, CGPC, 및 CSMC로 이루어진 군으로부터 선택되는(특히 CGHC 또는 CGPC인), 방법.
구현예 [32]. 구현예 29 내지 구현예 31 중 어느 한 구현예에 있어서, 촉매 도메인은 Pf00085 패밀리에 속하는, 방법.
구현예 [33]. 구현예 29 내지 구현예 32 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI는 중앙의 Pf13848 도메인이 2개(N-말단에 하나 C-말단에 다른 하나)의 Pf00085 도메인에 의해 플랭킹된 3-도메인 구조 Pf00085-Pf13848-Pf00085를 포함하는, 방법.
구현예 [34]. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI는
(a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의(여러) 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [35]. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI는
(a) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [36]. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI는
(a) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [37]. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서, PDI는
(a) 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [38]. 구현예 1 내지 구현예 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 티오레독신 펩티드는
(a) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
(c) 티오레독신 펩티드 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [39]. 구현예 1 내지 구현예 38 중 어느 한 구현예에 있어서, 자일라나제는
(a) 서열번호 8의 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 자일라나제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [40]. 구현예 1 내지 구현예 39 중 어느 한 구현예에 있어서, 자일라나제는
(a) 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 자일라나제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [41]. 구현예 1 내지 구현예 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 아라비노푸라노시다제는
(a) 서열번호 13의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [42]. 구현예 1 내지 구현예 41 중 어느 한 구현예에 있어서, 자일라나제는
(a) 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 자일라나제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [43]. 구현예 1 내지 구현예 42 중 어느 한 구현예에 있어서, 아라비노푸라노시다제는
(a) 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 [44]. 구현예 1 내지 구현예 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 셀룰라제는 트리코더마 레세이 또는 후미쿨라 인솔렌스로부터 유래된, 방법.
구현예 [45]. 구현예 1 내지 구현예 44 중 어느 한 구현예에 있어서, 셀룰라제는 아스페르길루스 푸미가투스로부터의 CBH I 및 CBH II를 갖는 트리코더마 레세이 배경 셀룰라제로부터 유래된, 방법.
구현예 [46]. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
(a) 서열번호 1에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 1의 아미노산 21 내지 516에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
(e) 서열번호 20의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
(f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
구현예 [47]. 구현예 46에 있어서, 서열번호 1에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [48]. 구현예 46 또는 구현예 47에 있어서, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [49]. 구현예 46에 있어서, 서열번호 1 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 516을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
구현예 [50]. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
(a) 서열번호 2에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 2의 아미노산 21 내지 513에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
(e) 서열번호 21의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
(f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
구현예 [51]. 구현예 46에 있어서, 서열번호 2에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [52]. 구현예 50 또는 구현예 51에 있어서, 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [53]. 구현예 50에 있어서, 서열번호 1 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 2의 아미노산 21 내지 513을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
구현예 [54]. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
(a) 서열번호 3에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 3의 아미노산 21 내지 516에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
(e) 서열번호 22의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
(f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
구현예 [55]. 구현예 54에 있어서, 서열번호 3에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [56]. 구현예 54 또는 구현예 55에 있어서, 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [57]. 구현예 54에 있어서, 서열번호 3 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 3의 아미노산 21 내지 516을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
구현예 [58]. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
(a) 서열번호 4에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 4의 아미노산 21 내지 517에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
(e) 서열번호 23의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
(f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
구현예 [59]. 구현예 58에 있어서, 서열번호 4에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [60]. 구현예 58 또는 구현예 59에 있어서, 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [61]. 구현예 58에 있어서, 서열번호 1 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 4의 아미노산 21 내지 517을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
구현예 [62]. 단백질 디설파이드 결합을 감소시키는 능력을 갖는 단리 또는 정제된 티오레독신 폴리펩티드로서,
(a) 서열번호 5에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(b) 서열번호 5의 아미노산 1 내지 110에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(c) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
(d) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
(e) 서열번호 24의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
(f) 티오레독신 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
구현예 [63]. 구현예 62에 있어서, 서열번호 5에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [64]. 구현예 62 또는 구현예 63에 있어서, 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
구현예 [65]. 구현예 62에 있어서, 서열번호 5 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 5의 아미노산 1 내지 110을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
구현예 [66]. 구현예 46 내지 구현예 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 습식 제분 공정 중의 분쇄된 낟알의 섬유질이 풍부한 분획으로부터 방출되는 전분 및/또는 글루텐, 특히 불용성 전분 및 글루텐의 양이 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 섬유질 세척 단계에서 존재하지 않거나 첨가되지 않은 공정에 비해 증가되는, 폴리펩티드.
구현예 [67]. 구현예 46 내지 구현예 66 중 어느 한 구현예의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
구현예 [68]. 구현예 67에 있어서, 구현예 10의 자일라나제 및/또는 구현예 11 내지 구현예 16 중 어느 한 구현예의 셀룰라제를 추가로 포함하는 조성물.
구현예 [69]. 구현예 46 내지 구현예 66 중 어느 한 구현예의 폴리펩티드를 포함하는 전체 배양액 제형 또는 세포 배양 조성물.
구현예 [70]. 구현예 46 내지 구현예 66 중 어느 한 구현예의 폴리펩티드를 암호화하는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
구현예 [71]. 구현예 70의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체 또는 발현 벡터로서, 폴리뉴클레오티드가 발현 숙주에서 폴리펩티드의 생성을 지시하는 하나 이상의 이종성 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 핵산 구성체 또는 발현 벡터.
구현예 [72]. 폴리펩티드의 생성을 지시하는 하나 이상의 이종성 제어 서열에 작동가능하게 연결된 구현예 70의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포.
구현예 [73]. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성 또는 티오레독신 펩티드 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건하에 구현예 72의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
실시예
분석
디티오트레이톨을 사용한 인슐린 환원 분석
원리
소 인슐린에서 2개의 시스틴을 디티오트레이톨(DTT)의 존재하에 PDI를 사용하여 환원시킨다. 반응 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량분석법(MALDI MS)으로 온전한 인슐린의 소실 및 2개 펩티드의 형성을 분석한다.
화학물질
중탄산암모늄(ABC), Fluka 09830
에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 이나트륨염, Merck 1.08418
암모늄 아세테이트, Sigma-Aldrich 32301
디티오트레이톨(DTT), Sigma D0632
소 췌장의 인슐린, Sigma I5500
트리플루오로아세트산(TFA), Sigma 302031
2',5'-디하이드록시아세토페논(DHAP), Sigma D107603
아세토니트릴, Sigma 34888
시약
ABC 버퍼: 10 mM 중탄산암모늄, pH 7
EDTA 용액: 100 mM EDTA, pH 8
아세테이트 버퍼: 25 mM 암모늄 아세테이트, pH 5
기질 스톡: ABC 버퍼 중 10 mg/mL 인슐린
기질 작업액: 100 μL 기질 스톡 + 20 μL EDTA 용액 + 780 μL 25 mM 아세테이트 버퍼. EDTA 첨가 후, 용액이 투명해질 때까지 기다린 후에 아세테이트 버퍼 첨가.
DTT 용액: Milli Q 순수 중 200 mM DTT
정지 시약: Milli Q 순수 중 2% (V/V) TFA
매트릭스: 아세토니트릴 중 20 mg/mL DHAP
물질
MALDI MS: Bruker UltrafleXtremeTM
Bruker AnchorChip MALDI 표적 플레이트
Biosan Plate Thermoshaker PST 100-HL
효소
단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)
절차
1) 효소 작업액(일반적으로 0~100 μg 효소 단백질/mL, 분석시 0~10 ppm) 및 새로 제조된 기질 작업액을 준비한다
2) 90 μL의 기질 작업액과 10 μL의 효소 작업액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 혼합한다. 효소 블랭크의 경우, 효소 용액 대신 10 μL의 Milli Q 순수를 첨가한다.
3) 1 μL의 DTT 용액 또는 블랭크 1 μL Milli Q 순수(시약 블랭크)를 첨가하여 반응을 개시시킨다
4) 550 rpm으로 진탕하면서 40℃에서 10분 동안 플레이트를 인큐베이션한다
5) 인큐베이션 후, 100 μL의 정지 시약을 첨가하여 반응을 정지시킨다
6) MALDI MS 분석을 위해, 2 μL의 샘플을 4 μL의 DHAP와 혼합하고, 0.7 μL를 표적 플레이트로 옮긴다. 포지티브 선형 모드에서 질량 스펙트럼을 얻는다. 이온 소스 1 및 2를 각각 20 kV 및 18.8 kV로 설정한다(딜레이: 11340 ns, 샘플링 시간: 6.4 ns). 각 스펙트럼은 샘플 스팟당 5000개 샷의 누적 평균이고 이온 질량 범위는 500~7000으로 설정됨.
7) 효소의 활성은 효소 블랭크 및 시약 블랭크의 스펙트럼과 비교하여, 온전한 소 인슐린의 질량 피크 면적 감소(질량 범위 5670~6000) 및 질량 범위 2300~2450과 3325~3500 각각에서 2개의 A 및 B 펩티드 사슬의 출현 증가로서 관찰될 수 있다. (온전한 인슐린과 두 펩티드 모두의 여러 나트륨 부가물에 해당하는 피크가 관찰될 수 있고 이들은 사용된 질량 범위에 포함된다는 점에 유의해야 한다.)
8) 필요한 경우, 상이한 효소 농도로 분석을 실행하여 표준 곡선을 준비할 수 있다. 사슬 A(또는 B)의 이온 피크 면적과 온전한 소 인슐린에 대한 이온의 이온 피크 면적 사이의 비를 계산하고 효소 농도에 대해 비를 플롯팅한다.
아황산염을 사용한 인슐린 환원 분석
원리
소 인슐린에서 2개의 시스틴을 아황산염의 존재하에 PDI를 사용하여 환원시킨다. 반응 후, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 질량분석법(MALDI MS)으로 온전한 인슐린의 소실 및 2개 펩티드의 형성을 분석한다.
화학물질
중탄산암모늄(ABC), Fluka 09830
에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 이나트륨염, Merck 1.08418
암모늄 아세테이트, Sigma-Aldrich 32301
메타중아황산나트륨, Merck 31448
소 췌장의 인슐린, Sigma I5500
트리플루오로아세트산(TFA), Sigma 302031
2',5'-디하이드록시아세토페논(DHAP), Sigma D107603
아세토니트릴, Sigma 34888
시약
ABC 버퍼: 10 mM 중탄산암모늄, pH 7
EDTA 용액: 100 mM EDTA, pH 8
아세테이트 버퍼: 25 mM 암모늄 아세테이트, pH 5
기질 스톡: ABC 버퍼 중 10 mg/mL 인슐린
기질 작업액: 100 μL 기질 스톡 + 20 μL EDTA 용액 + 780 μL 25 mM 아세테이트 버퍼. EDTA 첨가 후, 용액이 투명해질 때까지 기다린 후에 아세테이트 버퍼 첨가.
아황산염 용액: Milli Q 순수 중 60 mM 메타중아황산나트륨
정지 시약: Milli Q 순수 중 2% (V/V) TFA
매트릭스: 아세토니트릴 중 20 mg/mL DHAP
물질
MALDI MS: Bruker UltrafleXtremeTM
Bruker AnchorChip MALDI 표적 플레이트
Biosan Plate Thermoshaker PST 100-HL
효소
단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)(서모아스쿠스 크루스타세우스(P73RVY))
절차
1) 효소 작업액(일반적으로 0~100 μg 효소 단백질/mL, 분석시 0~10 ppm) 및 새로 제조된 기질 작업액 및 새로 제조된 아황산염 용액을 준비한다.
2) 90 μL의 기질 작업액과 10 μL의 효소 작업액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에서 혼합한다. 효소 블랭크의 경우, 효소 용액 대신 10 μL의 Milli Q 순수를 첨가한다.
3) 5 μL의 아황산염 용액 또는 블랭크 5 μL Milli Q 순수(시약 블랭크)를 첨가하여 반응을 개시시킨다
4) 550 rpm으로 진탕하면서 40℃에서 30분 동안 플레이트를 인큐베이션한다
5) 인큐베이션 후, 100 μL의 정지 시약을 첨가하여 반응을 정지시킨다
6) MALDI MS 분석을 위해, 2 μL의 샘플을 4 μL의 DHAP와 혼합하고, 0.7 μL를 표적 플레이트로 옮긴다. 포지티브 선형 모드에서 질량 스펙트럼을 얻는다. 이온 소스 1 및 2를 각각 20 kV 및 18.8 kV로 설정한다(딜레이: 11340 ns, 샘플링 시간: 6.4 ns). 각 스펙트럼은 샘플 스팟당 5000개 샷의 누적 평균이고 이온 질량 범위는 500~7000으로 설정됨.
7) 효소의 활성은 효소 블랭크 및 시약 블랭크의 스펙트럼과 비교하여, 온전한 소 인슐린의 질량 피크 면적 감소(질량 범위 5670~6000) 및 질량 범위 2300~2640과 3325~3630 각각에서 2개의 A 및 B 펩티드 사슬의 출현 증가로서 관찰될 수 있다. (온전한 인슐린과 두 펩티드 모두의 여러 나트륨 부가물에 해당하는 피크가 관찰될 수 있고 이들은 사용된 질량 범위에 포함된다는 점에 유의해야 한다. 또한, 형성된 A 및 B 펩티드 사슬은 환원 형태와 SO3-잔기가 부가된 형태의 혼합물로 존재하며, 두 형태 모두 질량 범위 설정에 포함된다.)
8) 필요한 경우, 상이한 효소 농도로 분석을 실행하여 표준 곡선을 준비할 수 있다. 사슬 A(또는 B)의 이온 피크 면적과 온전한 소 인슐린에 대한 이온의 이온 피크 면적 사이의 비를 계산하고 효소 농도에 대해 비를 플롯팅한다.
균주
균주 서모아스쿠스 아우란티아쿠스는 토양(중국 윈난, 1998년)으로부터 단리되었다. 균주 서모아스쿠스 크루스타세우스는 식물(미국 캘리포니아)로부터 단리되었다(CBS181.67). 균주를 확인하고 ITS의 DNA 시퀀싱을 기반으로 분류를 지정하였다(표 1).
실시예 1: 서모아스쿠스 아우란티아쿠스 로부터 단백질 디설파이드 이소머라제의 클로닝(서열번호 4)
서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 단백질 디설파이드 이소머라제를 서모아스쿠스 아우란티아쿠스로부터 단리된 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시키고 발현 벡터 pDAU724(WO2018/113745)에 클로닝하였다.
최종 발현 플라스미드를 아스페르길루스 오리재 DAU785 발현 숙주(WO95/002043)에 형질전환시켰다. 100 μl의 원형질체를 단백질 디설파이드 이소머라제 유전자를 포함하는 2.5~10 μg의 발현 플라스미드와 혼합하고, 300 μl의 60% PEG 4000, 10 mM CaCl2, 및 10mM Tris-HCl pH 7.5와 가볍게 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 선별을 위해 원형질체를 100 mM 질산나트륨이 보충된 수크로스 플레이트에 펼쳤다.
단백질 디설파이드 이소머라제 발현 구성체를 포함하는 하나의 재조합 A. 오리재 클론을 선별하고, 80 rpm 교반하에 30℃에서 3일 동안 진탕 플라스크 중의 2400 ml YPM(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 및 2% 말토스)에서 배양하였다. 0.22 μm 1리터 바틀탑 진공 필터(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 여과하여 효소 함유 상청액을 채취하였다.
실시예 2: 서모아스쿠스 크루스타세우스 로부터 단백질 디설파이드 이소머라제의 클로닝(서열번호 1)
서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 단백질 디설파이드 이소머라제를 서모아스쿠스 크루스타세우스로부터 단리된 게놈 DNA로부터 PCR 증폭시키고 발현 벡터 pDAU724(WO2018/113745)에 클로닝하였다.
최종 발현 플라스미드를 아스페르길루스 오리재 DAU785 발현 숙주(WO95/002043)에 형질전환시켰다. 100 μl의 원형질체를 단백질 디설파이드 이소머라제 유전자를 포함하는 2.5~10 μg의 발현 플라스미드와 혼합하고, 300 μl의 60% PEG 4000, 10 mM CaCl2, 및 10mM Tris-HCl pH 7.5와 가볍게 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하고, 선별을 위해 원형질체를 100 mM 질산나트륨이 보충된 수크로스 플레이트에 펼쳤다.
단백질 디설파이드 이소머라제 발현 구성체를 포함하는 하나의 재조합 A. 오리재 클론을 선별하고, 80 rpm 교반하에 30℃에서 3일 동안 진탕 플라스크 중의 2400 ml YPM(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 및 2% 말토스)에서 배양하였다. 0.22 μm 1리터 바틀탑 진공 필터(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)를 사용하여 여과하여 효소 함유 상청액을 채취하였다.
실시예 3: 섬유질 세척에서 PDI 첨가의 효과
옥수수 습식 제분 공정에서 섬유질 압착 후의 굵은 과피 섬유질을 기질로 사용하고, 공정 관련 조건(즉, pH 4~5, 40~48℃, 및 400 ppm 이산화황)에서 효소와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 60 μm 기공 크기 필터를 통해 섬유질을 진공 여과하였다. 섬유질 케이크를 물에 재현탁하고 2차로 여과하였다. 추출된 고체 단백질 및 전분을 수집하고 원심분리로 철저히 세척하였다. 수집된 여과액으로부터 추출된 전분 및 글루텐을 함유하는 생성된 펠릿 중의 단백질 양을 LECO에 의한 총 질소 측정과 6.25의 질소-단백질 변환 계수(Jones, USDA Circular No 183, 1931)를 사용하여 결정하고, 초기 섬유질 건조 고형분의 중량으로 정규화하였다.
화학물질
굵은 과피 섬유질 샘플
메타중아황산나트륨, Merck art. 31448
아세트산나트륨, Sigma Aldrich, S8625
시약
아황산염: Na2S2O5 + H2O -> 2Na+ + 2HSO3 -의 반응에 따라 메타중아황산나트륨(Na2S2O5)을 버퍼에 첨가함으로써 아황산수소가 생성된다. 따라서 593.6 mg/L의 메타중아황산염으로부터 400 ppm의 SO2가 제조되었다.
버퍼: 0.1 M 아세트산나트륨 버퍼, pH 4.0
물질
Infors-HT Multitron Pro 인큐베이션 셰이커
Avanti J-E 원심분리기
Millipore steriflip 튜브탑 필터 유닛, 60 μm 기공 크기(Merck, 주문번호 SCNY0060)
EZ-2 Elite 용매 증발기
LECO 질소 측정기 FP628
효소
PDI A: 서열번호 1로 개시된, 서모아스쿠스 크루스타세우스로부터의 단백질 디설파이드 이소머라제
PDI B: 서열번호 2로 개시된, 케이토마이세스 카르네우스로부터 유래된 단백질 디설파이드 이소머라제
PDI C: 서열번호 3으로 개시된, 아스페르길루스 스피눌로스포루스로부터 유래된 단백질 디설파이드 이소머라제
PDI D: 서열번호 4로 개시된, 서모아스쿠스 아우란티아쿠스로부터 유래된 단백질 디설파이드 이소머라제
서열번호 5로 개시된, 아스페르길루스 아쿨레아투스로부터 유래된 Trx 티오레독신 티오레독신 펩티드
GH5 자일라나제 A: 크리세오박테이움(Chryseobacterium) sp-10696으로부터 유래되고 서열번호 8로 개시된 GH5 자일라나제
GH10 자일라나제 B: 아스페르길루스 니제르로부터 유래되고 서열번호 10으로 개시된 GH10 자일라나제
GH62 아라비노푸라노시다제 A: 아스페르길루스 니제르로부터 유래되고 서열번호 12로 개시된 GH62 아라비노푸라노시다제
셀룰라제 A/Celluclast 1.5 L: 트리코더마 레세이로부터 유래된 셀룰라제 혼합물 이 셀룰라제 조성물은 T. 레세이에서 발현되는 모든 셀룰라제 활성, 예를 들어 엔도글루카나제 및 셀로바이오하이드롤라제를 포함할 것이다. Sigma Aldrich로부터 상업적으로 입수가능, Celluclast 1.5 L
15 mL 섬유질 세척 분석에 대한 절차
1. 굵은 섬유질 샘플을 버퍼(pH 4~5, 0.02 M 아세트산나트륨 최종 농도)에 5%의 건조 고형분을 함유하는 15 mL 슬러리로 재현탁하였다. 총 섬유질 건조 중량의 양을 기록하였다(중량섬유질). (정확한 pH는 실시예에 명시되어 있음)
2. 이 슬러리 효소에 자일라나제와 셀룰라제의 혼합물(효소의 정확한 양은 실시예에 명시되어 있음), 및 400 ppm의 SO2(최종 농도)를 첨가하였다.
3. 샘플을 40~48℃ 온도(정확한 온도는 실시예에 명시되어 있음)의 인큐베이션 셰이커에서 600 rpm으로 4시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 인큐베이션 후, 섬유질을 Millipore Steriflip 필터 유닛에서 진공 여과하였다.
5. 유지된 섬유질을 증류수를 사용하여 20 mL의 부피로 재현탁하고, 철저히 볼텍싱하고, 2차로 진공 여과하였다.
6. 추출된 전분 및 글루텐을 함유하는 2개의 여과액을 모았다.
7. (6)의 합한 여과액을 원심분리하였다(3,500 rpm, 20분).
8. 원심분리 후, 전분 및 글루텐 펠릿에 영향을 주지 않도록 50 mL 혈청 피펫을 사용하여 상청액을 천천히 제거하였다. 단계 5~8을 한 번 더 반복하였다.
9. (8)의 펠릿을 각 세척 단계에서 20 mL의 증류수로 2회 세척하여, 용해된 성분을 제거하였다.
10. 세척 및 상청액의 최종 제거 후, 펠릿을 포함하여 총 10 mL의 부피가 남았다. 용매 증발기(방법: 수성, 최고 62℃, 2시간, 3,000 rpm, 5 mbar)를 사용하여 과잉의 물을 제거하였다.
11. 냉각 후 샘플을 칭량하고(중량펠릿), 격렬하게 볼텍싱하여 균질성을 달성하였다.
12. (11)의 슬러리 170 μL를 보어가 넓은 팁을 사용하여 LECO 주석 캡슐(NC9804300, Fisher Scientific)에 피펫팅하고, 정확한 중량을 기록하였다(중량슬러리).
13. LECO FP628을 사용하여 샘플을 총 질소(TotN)에 대해 분석하고, 6.25의 질소-단백질 계수(Jones, USDA Circular No 183, 1931)를 사용하여 샘플 중의 단백질 백분율로 변환하였다.
14. 단백질 백분율 및 펠릿의 총 중량을 사용하여 총 단백질 방출량을 계산하였다. 방출된 단백질의 그램을 이어서 초기 섬유질 건조 고형분의 그램으로 다시 정규화한다.
계산
서열번호 1, 서모아스쿠스 크루스타세우스로부터의 단백질 디설파이드 이소머라제의 성능을 표 2에 나타낸 실험 조건으로 15 mL 섬유질 세척 분석을 사용하여 시험하였다. 방출된 단백질의 양을 표 3에 나타내었다. 결과는 각 조건에서 3회의 개별 실험에 기초한다.
결과는 평균 ± 표준 편차(n=3)로 표시된다.
서열번호 2, 케이토마이세스 카르네우스로부터의 단백질 디설파이드 이소머라제의 성능을 표 4에 나타낸 실험 조건으로 15 mL 섬유질 세척 분석을 사용하여 시험하였다. 방출된 단백질의 양을 표 5에 나타내었다. 결과는 각 조건에서 3회의 개별 실험에 기초한다.
결과는 평균 ± 표준 편차(n=3)로 표시된다.
실시예 4:
효소:
단백질 디설파이드 이소머라제 A: 서모아스쿠스 크루스타세우스로부터 유래된 단백질 디설파이드 이소머라제(서열번호 1)
GH10 자일라나제 B: 아스페르길루스 니제르로부터 유래된 GH10 자일라나제(서열번호 10)
GH62 아라비노푸라노시다제 A: 아스페르길루스 니제르로부터 유래된 GH62 아라비노푸라노시다제(서열번호 12)
셀룰라제 A: 트리코더마 레세이로부터 유래된 셀룰라제 혼합물. 이 셀룰라제 조성물은 T. 레세이에서 발현되는 모든 셀룰라제 활성, 예를 들어 엔도글루카나제 및 셀로바이오하이드롤라제를 포함할 것이다. Sigma Aldrich로부터 상업적으로 입수가능, Celluclast 1.5 L
단백질 디설파이드 이소머라제 A와 조합하여 셀룰라제 A, GH10 자일라나제 B 및 GH62 아라비노푸라노시다제 A를 포함하는 블렌드를 사용하여, 섬유질 건조 기질 그램당 1000 μg 효소 단백질의 용량으로 48℃에서 120분 동안 400 ppm 아황산수소(HSO3 -) 함유 20 mM 아세트산나트륨의 pH 4.0에서 인큐베이션하는 0.5 g 배지 처리량(MTP) 섬유질 분석(15mL 섬유질 세척 분석)을 5% 섬유질 건조 물질로 수행하였다. 블렌드는 효소 단백질을 기준으로 30%의 단백질 디설파이드 이소머라제 A, 10.5%의 GH10 자일라나제 B, 3.5%의 GH62 아라비노푸라노시다제 A, 및 나머지 56%의 셀룰라제 A로 구성된다. Na2S2O5 + H2O -> 2Na+ + 2HSO3 -의 반응에 따라 메타중아황산나트륨(Na2S2O5)을 버퍼에 첨가함으로써 아황산수소가 생성된다. 비교를 위해, 80%의 셀룰라제 A, 15%의 GH10 자일라나제 A, 및 5%의 GH62 아라비노푸라노시다제 A만을 함유하는 블렌드(단백질 디설파이드 이소머라제 A 불포함)를 저용량(700 μg EP/g-ds 섬유질) 및 고용량(1000 μg EP/g-ds 섬유질)으로 포함시켰다. 16.79%의 잔여 전분 및 10.00%의 잔여 단백질을 함유하는 옥수수 섬유질을 MTP 섬유질 분석에서 기질로 사용하였다. 아래 명시된 처리로 옥수수 섬유질로부터의 전분 + 글루텐(건조 물질) 및 개별 단백질 방출을 측정하였다.
따라서, 셀룰라제 A + GH10 자일라나제 B + GH62 아라비노푸라노시다제 A 외에 단백질 디설파이드 이소머라제 A를 첨가하면 옥수수 습식 제분 공정에서 전분 + 글루텐 및 단백질의 수율을 크게 높일 수 있다.
실시예 5 섬유질 세척에서 단백질 디설파이드 이소머라제를 사용하여 증가된 단백질 방출
표 7의 조건으로 2회의 실험에 걸쳐 15 mL 섬유질 세척 분석을 수행한다. 모든 처리에 트리코더마 레세이 셀룰라제와 자일라나제 A의 블렌드를 투입하였다. 자일라나제 A에 대한 트리코더마 레세이 셀룰라제의 비는 효소 단백질 밀리그램을 기준으로 약 90:10이었다. 적절한 처리에 각 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)를 첨가한 반면, 대조군은 셀룰라제 및 자일라나제 A만을 함유하였다. LECO FP628을 사용하여 총 질소를 측정하고 초기 섬유질 건조 고형분의 그램(gDS)으로 정규화하였다. 시험된 PDI 다양성을 표 2에 나타내고 여러 실험에 걸친 단백질 방출의 결과를 표 3에 나타내었다.
실시예 6 대규모 섬유 세척 분석에서 옥수수 섬유질로부터의 단백질 수율 증가에 대한 단일 티오레독신 도메인의 효과
대규모 옥수수 섬유질 세척 분석(5 그램 분석):
5 그램 옥수수 섬유질 분석은 일반적으로, 습식 제분 플랜트로부터 수득된 습식 섬유질 샘플을 공정 관련 조건(pH 3.5~4, 약 48~52℃ 온도)에서 1 내지 4시간의 기간에 걸쳐 효소의 존재하에 인큐베이션하는 것을 포함한다. 인큐베이션 후, 섬유질을 75 미크론 이하의 스크린 위로 옮겨 압착하였고, 여과액은 분리된 전분 및 글루텐으로 주로 이루어진다. 세척 공정을 스크린 위에서 여러 회 반복하고, 세척액을 초기 여과액과 함께 수집하였다. 수집된 여과액을 밤새 침전시킨 후, 진공을 통해 상청액을 흡인하였다. 남은 여과액과 불용성 물질을 50 mL 튜브에 붓고, Avanti J-E에서 3,500 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 전분과 글루텐을 펠릿화하였다. 상청액을 따라내고, 남은 펠릿을 Labconco 동결 건조기에서 밤새 또는 모든 수분이 제거될 때까지 동결 건조시켰다. SPEX SamplePrep Genogrinder를 사용하여 1750 rpm으로 1분 동안 샘플을 분쇄하였다. 100 내지 150 밀리그램의 샘플을 칭량하고 기록하였다. LECO FP628을 사용하여 샘플을 총 질소에 대해 분석하고, 6.25의 질소-단백질 계수를 사용하여 샘플 중의 단백질 백분율로 변환하였다(Jones, D. B. (1931). Factors for converting percentage of nitrogen in foods and feeds into percentages of proteins. USDA Circular, 183, 1-22). 단백질 백분율 및 펠릿의 총 중량을 사용하여 총 단백질 방출량을 계산하였다. 방출된 단백질의 그램을 이어서 초기 섬유질 건조 고형분의 그램으로 다시 정규화하였다.
400 ppm의 이산화황과 함께 48℃에서 2시간 동안 섬유질을 인큐베이션하는 5 그램 섬유질 분석을 pH 4에서 수행하였다. 모든 처리에 트리코더마 레세이 셀룰라제와 GH5 자일라나제 A의 블렌드로 구성된 효소 조성물을 투입하였다. GH5 자일라나제 A에 대한 트리코더마 레세이의 비는 효소 단백질 밀리그램을 기준으로 약 90:10이었다. 적절한 처리에 각 실험 효소, 서열번호 1 또는 5를 첨가한 반면, 대조군은 트리코더마 레세이 셀룰라제와 GH5 자일라나제 A의 블렌드만을 함유하였다. LECO FP628을 사용하여 총 질소를 측정하고 초기 섬유질 건조 고형분의 그램(gDS)으로 정규화하였다. 시험된 PDI 다양성을 표 10에 나타내고 여러 실험에 걸친 단백질 방출의 결과를 표 11에 나타내었다.
실시예 7
서모아스쿠스 크루스타세우스로부터의 PDI(서열번호 1)의 활성을 0 내지 10 μg/mL의 PDI(분석시 농도) 및 2 mM의 DTT를 사용하여 인슐린 활성 분석에 기술된 바와 같이 분석하였다. 온전한 인슐린에 대한 A 펩티드 사슬의 생성된 질량 피크 면적 및 온전한 인슐린에 대한 B 펩티드의 질량 피크 면적을 표 12에 나타내었다.
효소 또는 DTT의 부재시 소 인슐린의 매우 적은 양의 시스틴이 감소하는 반면, PDI의 존재시 상당량의 시스틴이 감소되어 인슐린을 A 펩티드와 B 펩티드로 분리시킨다.
실시예 8
서모아스쿠스 크루스타세우스로부터의 PDI(서열번호 1)의 활성을 0 내지 10 μg/mL의 PDI(분석시 농도) 및 2.9 mM의 아황산염을 사용하여 인슐린 활성 분석에 기술된 바와 같이 분석하였다. 온전한 인슐린에 대한 A 펩티드 사슬의 생성된 질량 피크 면적 및 온전한 인슐린에 대한 B 펩티드의 질량 피크 면적을 표 13에 나타내었다.
효소 또는 아황산염의 부재시 소 인슐린의 매우 적은 양의 시스틴이 감소하는 반면, PDI의 존재시 상당량의 시스틴이 감소되어 인슐린을 A 펩티드와 B 펩티드로 분리시킨다.
SEQUENCE LISTING <110> Novozymes A/S <120> Improved fiber-wash in corn wet-milling <130> 15201-WO-PCT[2] <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 516 <212> PRT <213> Thermoascus crustaceus <400> 1 Met Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ala Leu Ser Leu Leu Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Ala Ser Ala Ala Asp Ala Glu Ser Asp Val Arg Ser Leu Lys Lys 20 25 30 Asp Thr Phe Asp Asp Phe Ile Lys Glu His Asp Leu Val Leu Ala Glu 35 40 45 Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Gln Ala Leu Ala Pro Glu Tyr 50 55 60 Glu Ala Ala Ala Ser Glu Leu Lys Glu Lys Asn Ile Pro Leu Ala Lys 65 70 75 80 Val Asp Cys Thr Glu Glu Ala Asp Leu Cys Lys Glu His Gly Val Glu 85 90 95 Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Ser Val Lys Pro 100 105 110 Tyr Pro Gly Ala Arg Lys Ser Ala Ala Ile Val Ser Tyr Met Val Lys 115 120 125 Gln Ser Leu Pro Ala Val Ser Thr Val Thr Lys Glu Asn Leu Glu Glu 130 135 140 Phe Lys Thr Met Asp Lys Val Val Ile Ile Gly Tyr Ile Ala Pro Asp 145 150 155 160 Asp Lys Thr Ser Asn Glu Thr Phe Thr Ala Phe Ala Asp Ser Lys Arg 165 170 175 Asp Asp Tyr Leu Phe Ala Ala Thr Asn Asp Ala Ala Leu Ala Lys Ala 180 185 190 Glu Gly Val Lys Gln Pro Ser Ile Val Leu Tyr Lys Asp Phe Asp Glu 195 200 205 Lys Lys Asp Val Phe Asp Gly Lys Phe Asp Gln Glu Thr Met Leu Ser 210 215 220 Trp Val Lys Thr Ala Ser Thr Pro Leu Val Gly Glu Ile Gly Pro Glu 225 230 235 240 Thr Tyr Ala Gly Tyr Met Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Phe Ile Phe 245 250 255 Ala Glu Thr Pro Glu Glu Arg Gln Lys Leu Ala Ala Asp Phe Lys Pro 260 265 270 Ile Ala Glu Lys His Arg Gly Ala Ile Asn Ile Val Thr Ile Asp Ala 275 280 285 Lys Ala Phe Gly Ala Tyr Ala Gly Asn Leu Asn Leu Asp Pro Gln Lys 290 295 300 Phe Pro Cys Phe Ala Ile His Asp Thr Val Lys Asn Ala Lys Phe Pro 305 310 315 320 Tyr Asp Gln Ser Lys Glu Val Asn Ala Lys Asp Ile Gly Gln Phe Val 325 330 335 Gln Glu Val Leu Asp Gly Lys Val Glu Pro Ser Ile Lys Ser Glu Pro 340 345 350 Ile Pro Glu Thr Gln Glu Gly Ser Val Thr Val Val Val Ala His Ser 355 360 365 Tyr Arg Glu Leu Val Ile Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Leu Glu Phe 370 375 380 Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr Glu 385 390 395 400 Glu Leu Gly Arg Leu Tyr Ala Glu Asn Pro Asp Leu Ala Ser Lys Val 405 410 415 Thr Val Ala Lys Ile Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp Glu Ile 420 425 430 Gln Gly Phe Pro Thr Ile Lys Leu Phe Pro Ala Gly Ala Lys Asp Ser 435 440 445 Pro Val Asp Tyr Ala Gly Ser Arg Thr Val Glu Asp Leu Ala Asn Phe 450 455 460 Ile Lys Glu Asn Gly Lys His Lys Val Asp Ala Leu Ser Ala Ala Thr 465 470 475 480 Ala Lys Pro Glu Gln Gly Gly Asp Val Thr Ser Thr Pro Ser Ile Ser 485 490 495 Ser Glu Thr Thr Ala Glu Thr Ala Ala Pro Thr Thr Asp Gly Ser Glu 500 505 510 His Asp Glu Leu 515 <210> 2 <211> 513 <212> PRT <213> Keithomyces carneus <400> 2 Met His His Lys Arg Ile Ala Phe Gly Leu Leu Ala Ala Phe Ala Ser 1 5 10 15 Leu Ala Ser Ala Glu Asp Thr Ser Asp Val His Gln Leu Thr Glu Lys 20 25 30 Thr Phe Asp Asp Phe Val Lys Ala Asn Pro Leu Val Leu Ala Glu Phe 35 40 45 Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Glu Tyr Glu 50 55 60 Glu Ala Ala Thr Thr Leu Lys Glu Lys Asn Ile Lys Leu Ala Lys Ile 65 70 75 80 Asp Cys Thr Glu Glu Ala Asp Leu Cys Gln Lys His Gly Val Glu Gly 85 90 95 Tyr Pro Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Ser Val Thr Pro Tyr 100 105 110 Asn Gly Gln Arg Lys Ala Ala Gly Ile Thr Ser Tyr Met Val Lys Gln 115 120 125 Ser Leu Pro Ala Val Ser Val Leu Thr Lys Asp Thr Leu Glu Glu Phe 130 135 140 Lys Thr Ala Asp Lys Val Val Val Val Ala Tyr Ile Ala Ala Asp Asp 145 150 155 160 Lys Ala Ser Asn Glu Thr Phe Thr Gly Val Ala Asp Lys Leu Arg Asp 165 170 175 Asn Phe Leu Phe Gly Gly Val Asn Asp Ala Ala Val Ala Glu Ala Glu 180 185 190 Gly Val Lys Phe Pro Ser Ile Val Leu Tyr Lys Ser Phe Asp Glu Gly 195 200 205 Lys Asn Thr Phe Thr Glu Lys Phe Glu Ala Glu Ala Ile Glu Lys Phe 210 215 220 Thr Lys Thr Ser Ala Thr Pro Leu Ile Gly Glu Val Gly Pro Glu Thr 225 230 235 240 Tyr Ala Asp Tyr Met Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Tyr Ile Phe Ala 245 250 255 Glu Thr Gln Glu Glu Arg Asp Ser Leu Ser Lys Asp Leu Lys Pro Val 260 265 270 Ala Glu Lys Tyr Lys Gly Lys Ile Asn Phe Ala Thr Ile Asp Ala Lys 275 280 285 Ala Phe Gly Ala His Ala Gly Asn Leu Asn Leu Gln Thr Asp Lys Phe 290 295 300 Pro Ala Phe Ala Ile His Glu Thr Val Lys Asn Gln Lys Phe Pro Phe 305 310 315 320 Asp Gln Glu Lys Lys Ile Thr Lys Asp Ala Ile Ala Lys Phe Ala Asp 325 330 335 Glu Tyr Ser Ala Gly Lys Ile Glu Pro Ser Ile Lys Ser Glu Pro Ile 340 345 350 Pro Glu Asn Gln Asp Gly Pro Val Ser Ile Ile Val Ala Lys Asn Tyr 355 360 365 Glu Gln Ile Val Leu Asp Asp Thr Lys Asp Val Leu Val Glu Phe Tyr 370 375 380 Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr Asp Gln 385 390 395 400 Leu Gly Glu Ala Tyr Lys Asn Ser Glu Phe Lys Asp Lys Val Val Ile 405 410 415 Ala Lys Val Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp Glu Val Ser Gly 420 425 430 Phe Pro Thr Ile Lys Leu Phe Pro Ala Gly Lys Lys Ser Glu Pro Val 435 440 445 Thr Tyr Asn Gly Ala Arg Thr Val Glu Asp Leu Ile Glu Phe Ile Lys 450 455 460 Glu Asn Gly Lys Tyr Lys Ala Ala Val Pro Phe Lys Glu Glu Ala Thr 465 470 475 480 Glu Glu Ala Ala Pro Ala Ala Thr Glu Glu Lys Ala Glu Asp Lys Val 485 490 495 Glu Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asp Glu Asp His Asp Glu 500 505 510 Leu <210> 3 <211> 516 <212> PRT <213> Aspergillus spinulosporus <400> 3 Met Arg Ser Phe Gly Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Val Ser Ala Ala Asp Ser Gln Ser Glu Thr Pro Ser Asp Val Ile 20 25 30 Ser Leu Thr Lys Glu Thr Phe Asn Asp Phe Leu Ala Glu His Asp Leu 35 40 45 Val Leu Ala Glu Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu 50 55 60 Ala Pro Gln Tyr Glu Glu Ala Ala Thr Glu Leu Lys Ala Lys Asn Ile 65 70 75 80 Ala Leu Val Lys Val Asp Cys Thr Ala Glu Glu Asp Val Cys Arg Glu 85 90 95 Gln Glu Val Thr Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Pro Asp 100 105 110 Asn Val Lys Pro Tyr Gln Gly Ala Arg Lys Thr Glu Ala Ile Val Ser 115 120 125 Tyr Met Val Lys Gln Ser Leu Pro Ala Val Ser Thr Val Thr Ala Glu 130 135 140 Thr Leu Glu Asp Phe Lys Thr Met Asp Lys Ile Val Val Val Gly Tyr 145 150 155 160 Phe Ala Glu Asp Asp Lys Glu Ser Ser Glu Ala Tyr Thr Ala Phe Ala 165 170 175 Glu Ser Gln Arg Asp Asn Tyr Leu Phe Ala Ser Thr Asn Asp Ala Ala 180 185 190 Val Ala Ser Ala Glu Asn Val Lys Gln Pro Ser Ile Val Leu Tyr Lys 195 200 205 Asp Phe Asp Glu Lys Lys Ala Val Tyr Asp Gly Ser Leu Asp Ser Glu 210 215 220 Ala Leu Leu Ser Trp Val Lys Thr Ala Ser Thr Pro Leu Val Gly Glu 225 230 235 240 Val Gly Pro Glu Thr Tyr Ser Gly Tyr Ile Ala Ala Gly Ile Pro Leu 245 250 255 Ala Tyr Ile Phe Ala Glu Thr Gln Glu Glu Arg Thr Lys Phe Ala Glu 260 265 270 Glu Phe Lys Pro Ile Ala Glu Lys His Arg Gly Ala Ile Asn Ile Ala 275 280 285 Thr Ile Asp Ala Lys Ala Phe Gly Ala His Ala Gly Asn Leu Asn Leu 290 295 300 Asp Pro Lys Thr Phe Pro Ala Phe Ala Ile Gln Asp Pro Ala Lys Asn 305 310 315 320 Ala Lys Tyr Pro Tyr Asp Gln Thr Lys Glu Ile Ser Ala Lys Asp Val 325 330 335 Gly Lys Phe Ile Gln Asp Val Leu Glu Gly Lys Val Glu Pro Ser Ile 340 345 350 Lys Ser Glu Pro Val Pro Glu Thr Gln Glu Gly Pro Val Thr Val Val 355 360 365 Val Ala His Ser Tyr Lys Asp Leu Val Ile Glu Asn Asp Lys Asp Val 370 375 380 Leu Leu Glu Phe Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala 385 390 395 400 Pro Lys Tyr Asp Glu Leu Ala Glu Leu Tyr Ala Lys Asn Glu Asp Phe 405 410 415 Ala Ser Lys Val Thr Ile Ala Lys Ile Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val 420 425 430 Pro Asp Ser Ile Thr Gly Phe Pro Thr Ile Lys Leu Phe Pro Ala Gly 435 440 445 Ser Lys Asp Ala Pro Val Glu Tyr Ser Gly Ser Arg Thr Val Glu Asp 450 455 460 Leu Ala Asn Phe Val Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Gly Val Asp Ala Phe 465 470 475 480 Ala Ala Gln Ser Glu Glu Ala Glu Glu Ala Glu Glu Val Ala Glu Asp 485 490 495 Ala Thr Glu Thr Ala Ser Asp Ala Glu Pro Ser Ala Glu Lys Pro Glu 500 505 510 His Asp Glu Leu 515 <210> 4 <211> 517 <212> PRT <213> Thermoascus aurantiacus <400> 4 Met Arg Ser Phe Gly Pro Leu Ala Leu Ser Leu Leu Gly Ala Ala Ala 1 5 10 15 Val Ala Ser Ala Ala Asn Ala Glu Ser Asp Val Val Ser Leu Lys Lys 20 25 30 Asp Thr Phe Glu Asp Phe Ile Lys Glu His Asp Leu Val Leu Ala Glu 35 40 45 Phe Phe Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Gln Ala Leu Ala Pro Glu Tyr 50 55 60 Glu Ala Ala Ala Ser Glu Leu Lys Ala Lys Asn Ile Pro Leu Val Lys 65 70 75 80 Val Asp Cys Thr Glu Glu Ala Asp Leu Cys Lys Asp Tyr Gly Val Glu 85 90 95 Gly Tyr Pro Thr Leu Lys Val Phe Arg Gly Leu Asp Ser Ile Lys Pro 100 105 110 Tyr Gln Gly Ala Arg Lys Ser Gly Ala Ile Val Ser Tyr Met Val Lys 115 120 125 Gln Ser Leu Pro Ala Val Ser Thr Val Thr Lys Glu Asn Leu Glu Glu 130 135 140 Phe Lys Thr Met Asp Lys Val Val Ile Ile Gly Tyr Ile Ala Ala Glu 145 150 155 160 Asp Lys Ala Ser Asn Glu Thr Phe Thr Ala Leu Ala Glu Ser Lys Arg 165 170 175 Asp Asp Tyr Leu Phe Ala Val Thr Ser Asp Pro Thr Leu Ala Lys Thr 180 185 190 Glu Gly Val Lys Gln Pro Ser Ile Val Leu Tyr Lys Asp Phe Asp Glu 195 200 205 Lys Lys Asp Val Phe Asp Gly Lys Phe Asp Lys Glu Ala Ile Ile Ser 210 215 220 Trp Ile Lys Thr Ala Ser Thr Pro Leu Val Gly Glu Ile Gly Pro Glu 225 230 235 240 Thr Tyr Ala Gly Tyr Met Ser Ala Gly Ile Pro Leu Ala Phe Ile Phe 245 250 255 Ala Glu Thr Gln Glu Glu Arg Gln Lys Phe Ala Ala Asp Phe Lys Pro 260 265 270 Ile Ala Glu Lys His Arg Gly Ala Ile Asn Ile Val Thr Ile Asp Ala 275 280 285 Lys Ala Phe Gly Ala Tyr Ala Gly Asn Leu Asn Leu Asp Ala Gln Lys 290 295 300 Phe Pro Ala Phe Ala Ile His Asp Thr Val Lys Asn Ala Lys Tyr Pro 305 310 315 320 Tyr Asp Gln Ser Lys Glu Val Asn Ala Lys Asp Ile Ala Gln Phe Val 325 330 335 Gln Asp Val Leu Asp Gly Lys Val Glu Pro Ser Ile Lys Ser Glu Pro 340 345 350 Ile Pro Glu Thr Gln Glu Gly Pro Val Thr Val Val Val Ala His Ser 355 360 365 Tyr Gln Glu Leu Val Ile Asp Asn Asp Lys Asp Val Leu Leu Glu Phe 370 375 380 Tyr Ala Pro Trp Cys Gly His Cys Lys Ala Leu Ala Pro Lys Tyr Glu 385 390 395 400 Glu Leu Ala Arg Leu Tyr Ala Glu Asn Pro Asp Leu Ala Ser Lys Val 405 410 415 Thr Ile Ala Lys Ile Asp Ala Thr Ala Asn Asp Val Pro Asp Glu Ile 420 425 430 Gln Gly Phe Pro Thr Ile Lys Leu Phe Pro Ala Gly Ser Lys Asp Ser 435 440 445 Pro Ile Asp Tyr Thr Gly Ser Arg Thr Val Glu Asp Leu Ala Asn Phe 450 455 460 Val Lys Glu Asn Gly Lys 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Asp Lys 210 215 220 Thr Met His Glu Leu Tyr Leu Trp Pro Phe Ala Asp Ala Val Arg Ala 225 230 235 240 Gly Val Gly Ala Val Met Cys Ser Tyr Asn Gln Ile Asn Asn Ser Tyr 245 250 255 Gly Cys Gln Asn Ser Gln Thr Leu Asn Lys Leu Leu Lys Ala Glu Leu 260 265 270 Gly Phe Gln Gly Phe Val Met Ser Asp Trp Gly Ala His His Ser Gly 275 280 285 Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Leu Asp Met Ser Met Pro Gly Asp Ile 290 295 300 Ser Phe Asp Asp Gly Leu Ser Phe Trp Gly Thr Asn Leu Thr Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Asn Gly Thr Val Pro Ala Trp Arg Val Asp Asp Met Ala Val 325 330 335 Arg Ile Met Thr Ala Tyr Tyr Lys Val Gly Arg Asp Arg Leu Arg Ile 340 345 350 Pro Pro Asn Phe Ser Ser Trp Thr Arg Asp Glu Tyr Gly Trp Glu His 355 360 365 Ser Ala Val Ser Glu Gly Ala Trp Thr Lys Val Asn Asp Phe Val Asn 370 375 380 Val Gln Arg Ser His Ser Gln Ile Ile Arg Glu Ile Gly Ala Ala Ser 385 390 395 400 Thr Val Leu Leu Lys Asn Thr Gly Ala Leu Pro Leu Thr Gly Lys Glu 405 410 415 Val Lys Val Gly Val Leu Gly Glu Asp Ala Gly Ser Asn Pro Trp Gly 420 425 430 Ala Asn Gly Cys Pro Asp Arg Gly Cys Asp Asn Gly Thr Leu Ala Met 435 440 445 Ala Trp Gly Ser Gly Thr Ala Glu Phe Pro Tyr Leu Val Thr Pro Glu 450 455 460 Gln Ala Ile Gln Arg Glu Val Ile Ser Asn Gly Gly Asn Val Phe Ala 465 470 475 480 Val Thr Asp Asn Gly Ala Leu Ser Gln Met Ala Asp Val Ala Ser Gln 485 490 495 Ser Ser Val Ser Leu Val Phe Val Asn Ala Asp Ser Gly Glu Gly Tyr 500 505 510 Ile Ser Val Asp Gly Asn Glu Gly Asp Arg Lys Asn Leu Thr Leu Trp 515 520 525 Lys Asn Gly Glu Ala Val Ile Asp Thr Val Val Ser His Cys Asn Asn 530 535 540 Thr Ile Val Val Ile His Ser Val Gly Pro Val Leu Ile Asp Arg Trp 545 550 555 560 Tyr Asp Asn Pro Asn Val Thr Ala Ile Ile Trp Ala Gly Leu Pro Gly 565 570 575 Gln Glu Ser Gly Asn Ser Leu Val Asp Val Leu Tyr Gly Arg Val Asn 580 585 590 Pro Ser Ala Lys Thr Pro Phe Thr Trp Gly Lys Thr Arg Glu Ser Tyr 595 600 605 Gly Ala Pro Leu Leu Thr Glu Pro Asn Asn Gly Asn Gly Ala Pro Gln 610 615 620 Asp Asp Phe Asn Glu Gly Val Phe Ile Asp Tyr Arg His Phe Asp Lys 625 630 635 640 Arg Asn Glu Thr Pro Ile Tyr Glu Phe Gly His Gly Leu Ser Tyr Thr 645 650 655 Thr Phe Gly Tyr Ser His Leu Arg Val Gln Ala Leu Asn Ser Ser Ser 660 665 670 Ser Ala Tyr Val Pro Thr Ser Gly Glu Thr Lys Pro Ala Pro Thr Tyr 675 680 685 Gly Glu Ile Gly Ser Ala Ala Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gly Leu Lys 690 695 700 Arg Ile Thr Lys Phe Ile Tyr Pro Trp Leu Asn Ser Thr Asp Leu Glu 705 710 715 720 Asp Ser Ser Asp Asp Pro Asn Tyr Gly Trp Glu Asp Ser Glu Tyr Ile 725 730 735 Pro Glu Gly Ala Arg Asp Gly Ser Pro Gln Pro Leu Leu Lys Ala Gly 740 745 750 Gly Ala Pro Gly Gly Asn Pro Thr Leu Tyr Gln Asp Leu Val Arg Val 755 760 765 Ser Ala Thr Ile Thr Asn Thr Gly Asn Val Ala Gly Tyr Glu Val Pro 770 775 780 Gln Leu Tyr Val Ser Leu Gly Gly Pro Asn Glu Pro Arg Val Val Leu 785 790 795 800 Arg Lys Phe Asp Arg Ile Phe Leu Ala Pro Gly Glu Gln Lys Val Trp 805 810 815 Thr Thr Thr Leu Asn Arg Arg Asp Leu Ala Asn Trp Asp Val Glu Ala 820 825 830 Gln Asp Trp Val Ile Thr Lys Tyr Pro Lys Lys Val His Val Gly Ser 835 840 845 Ser Ser Arg Lys Leu Pro Leu Arg Ala Pro Leu Pro Arg Val Tyr 850 855 860 <210> 19 <211> 253 <212> PRT <213> Penicillium emersonii <400> 19 Met Leu Ser Ser Thr Thr Arg Thr Leu Ala Phe Thr Gly Leu Ala Gly 1 5 10 15 Leu Leu Ser Ala Pro Leu Val Lys Ala His Gly Phe Val Gln Gly Ile 20 25 30 Val Ile Gly Asp Gln Phe Tyr Ser Gly Tyr Ile Val Asn Ser Phe Pro 35 40 45 Tyr Glu Ser Asn Pro Pro Pro Val Ile Gly Trp Ala Thr Thr Ala Thr 50 55 60 Asp Leu Gly Phe Val Asp Gly Thr Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Ile Ile 65 70 75 80 Cys His Arg Asn Ala Thr Pro Ala Pro Leu Thr Ala Pro Val Ala Ala 85 90 95 Gly Gly Thr Val Glu Leu Gln Trp Thr Pro Trp Pro Asp Ser His His 100 105 110 Gly Pro Val Ile Thr Tyr Leu Ala Pro Cys Asn Gly Asn Cys Ser Thr 115 120 125 Val Asp Lys Thr Thr Leu Glu Phe Phe Lys Ile Asp Gln Gln Gly Leu 130 135 140 Ile Asp Asp Thr Ser Pro Pro Gly Thr Trp Ala Ser Asp Asn Leu Ile 145 150 155 160 Ala Asn Asn Asn Ser Trp Thr Val Thr Ile Pro Asn Ser Val Ala Pro 165 170 175 Gly Asn Tyr Val Leu Arg His Glu Ile Ile Ala Leu His Ser Ala Asn 180 185 190 Asn Lys Asp Gly Ala Gln Asn Tyr Pro Gln Cys Ile Asn Ile Glu Val 195 200 205 Thr Gly Gly Gly Ser Asp Ala Pro Glu Gly Thr Leu Gly Glu Asp Leu 210 215 220 Tyr His Asp Thr Asp Pro Gly Ile Leu Val Asp Ile Tyr Glu Pro Ile 225 230 235 240 Ala Thr Tyr Thr Ile Pro Gly Pro Pro Glu Pro Thr Phe 245 250 <210> 20 <211> 1551 <212> DNA <213> Thermoascus crustaceus <400> 20 atgcggtctt tcggacccct ggctctcagc ctgctcggtg ctgcagcagt cgcctccgct 60 gccgacgcag agtccgacgt ccgctcgctc aagaaagata cgttcgatga tttcatcaag 120 gagcatgacc ttgttctagc agagttcttc gcgccttggt gtggtcattg tcaggccctt 180 gcccccgaat atgaggctgc tgcctccgag ttaaaggaga agaacattcc tctagctaag 240 gtcgactgca cggaggaggc ggatctgtgc aaggagcatg gcgttgaggg ttatcccact 300 ctcaaggtct tccgtggcct tgactcggtc aagccgtacc caggagctcg gaagtccgca 360 gccattgttt catacatggt taagcagtct ctgccggccg tgtccaccgt gaccaaggag 420 aatctcgagg agttcaagac gatggataag gtagtcatca tcggatacat cgctcctgat 480 gacaaaactt ccaacgagac gttcacggct ttcgctgatt cgaagcggga tgactacctt 540 tttgccgcca ctaacgacgc tgctctggca aaggcagaag gagttaagca gccttctatt 600 gtgctctaca aggattttga tgagaaaaag gatgtttttg acggaaaatt cgaccaagag 660 acgatgctca gctgggtaaa aacagctagc acccctcttg ttggtgagat cggtccggag 720 acctatgcgg gatacatgtc ggctggaatt cccttggcgt ttatctttgc ggagacaccg 780 gaggagcgtc agaagctcgc tgccgacttc aagcccatcg cggagaagca caggggtgct 840 atcaacattg tcacgattga tgctaaggcg tttggcgctt acgccggcaa cctgaacctt 900 gacccccaaa agtttccctg cttcgccatc catgacaccg tgaagaacgc caagttccct 960 tacgatcagt ccaaggaagt aaacgcgaag gatatcggcc agtttgtcca ggaagtcctt 1020 gatggcaagg tcgagcctag catcaagtcc gagccaatcc ctgaaaccca agagggctct 1080 gttaccgttg tggtcgccca tagctaccgg gagctggtga ttgacaatga caaggatgtt 1140 ctccttgagt tctatgctcc atggtgcgga cactgcaaag ctctcgctcc gaagtacgag 1200 gagcttggac gcctttatgc ggagaatcct gacctcgcat ccaaggtcac cgttgccaaa 1260 atcgatgcga cagctaatga tgttcccgat gagattcaag gctttcccac aatcaagctc 1320 ttccctgctg gcgccaagga ctccccggtt gactacgctg gatccagaac tgtcgaggat 1380 ctcgcgaact ttatcaaaga gaacggcaag cacaaggtgg atgctcttag tgctgctact 1440 gcaaagcccg agcagggtgg tgatgttact agtactccat cgatctcttc agaaacgacc 1500 gctgagactg ctgccccgac aaccgatgga tctgagcacg atgagctgta a 1551 <210> 21 <211> 1542 <212> DNA <213> Keithomyces carneus <400> 21 atgcatcaca agcgtattgc cttcggcctc ttggccgcct ttgcctctct ggcctctgcc 60 gaggacacct ccgacgttca ccagttgacc gagaagactt ttgacgattt cgtcaaggcc 120 aaccccttgg ttctcgccga gttctttgct ccctggtgcg gacactgcaa ggccctcgct 180 cccgagtatg aagaggctgc aacaacgctc aaggagaaga acatcaagct ggccaagatc 240 gactgcaccg aagaggccga cctctgccag aagcacggcg tcgagggcta ccccaccctc 300 aaggtcttcc gtggtcttga cagcgtcacc ccttacaatg gtcagcgcaa ggctgctggt 360 atcacctcat acatggtcaa gcagtctctg cctgccgtct ctgtcctgac caaggacacc 420 cttgaggagt tcaagactgc cgacaaggtt gttgttgttg cctacatcgc tgccgatgac 480 aaggcctcca atgagacctt cacaggtgtt gctgataagc tccgcgacaa cttcctgttt 540 ggtggtgtca acgatgccgc cgtcgctgag gccgagggcg tcaagttccc ctccattgtt 600 ctgtacaagt ctttcgacga gggcaagaac accttcacag agaagttcga ggccgaggcc 660 atcgagaagt tcaccaagac ttccgccacc cctctgattg gcgaggtcgg ccccgagacc 720 tacgctgact acatgtctgc cggcattccc ctggcttaca tcttcgccga gacccaggag 780 gagcgtgaca gcctctccaa ggatctcaag cctgttgctg agaagtacaa gggcaagatc 840 aacttcgcca ccattgacgc aaaggctttc ggtgctcacg ccggcaacct gaacctccag 900 actgacaagt tccctgcctt tgccatccac gagaccgtca agaaccagaa gttccccttc 960 gaccaggaga agaaaatcac aaaggacgcc attgccaagt ttgctgatga gtactcagct 1020 ggcaagattg agcctagcat caagtcggag cccattcctg agaaccagga cggtcccgtc 1080 agcatcattg tcgccaagaa ctacgaacag attgttcttg acgacaccaa ggatgtcctt 1140 gttgagttct acgccccctg gtgcggtcac tgcaaggctc ttgctcccaa gtacgaccag 1200 cttggtgagg cctacaagaa ctccgagttc aaggacaagg ttgtcattgc caaggtcgat 1260 gctaccgcta acgatgtccc tgatgaggtt tctggtttcc ccaccatcaa gctgttcccc 1320 gctggcaaga agtccgagcc tgtcacttac aacggcgctc gtactgtcga ggacctgatc 1380 gagttcatca aggagaacgg caagtacaag gctgccgtcc ccttcaagga ggaggccact 1440 gaggaggctg cccccgccgc taccgaggag aaggctgaag acaaggtcga ggaggagaag 1500 aaggaggaga agaaggaaga tgaggaccac gacgagctgt aa 1542 <210> 22 <211> 1551 <212> DNA <213> Aspergillus spinulosporus <400> 22 atgcgttcct tcggaccgtg ggcgctgagc cttctagggg cagcagcagc agtttctgct 60 gcggattccc agtccgaaac accatcggac gtcatatcgt tgaccaagga gactttcaat 120 gatttcctgg cggagcatga cctagtcctt gcggagtttt tcgcgccctg gtgtggtcac 180 tgcaaagctc tagcacctca atacgaagaa gcagctaccg agttgaaggc caaaaatatc 240 gcattggtca aggttgactg cactgcggag gaggatgttt gtagggagca ggaagtgacc 300 ggttacccta cccttaaggt cttccgcggc cctgataatg tgaagcccta tcaaggagct 360 cggaagacag aagcaattgt ctcgtacatg gtgaaacaat cgctccctgc ggtttccact 420 gtgactgcgg aaacccttga ggacttcaag accatggaca agatcgttgt tgtcggctat 480 ttcgctgagg atgataagga atcgtctgaa gcttacacgg ccttcgctga gagccagagg 540 gataactatt tgtttgcttc taccaatgac gctgcggttg ctagcgctga aaatgtgaag 600 cagccttcca ttgtgctcta caaagacttt gatgagaaaa aagccgtcta cgatggatcg 660 ctcgactctg aagccctgct cagctgggtg aagaccgcca gcactcccct cgtgggcgag 720 gttgggcctg agacctactc tgggtacatc gcggccggca tccccctggc ttacatattc 780 gccgagaccc aggaagagcg cactaagttc gctgaggagt tcaaacccat tgcagagaag 840 cacaggggtg ctatcaacat agccacaatt gacgccaagg cttttggtgc ccatgccgga 900 aacctcaacc ttgaccccaa gacgttccct gcctttgcca tccaggatcc cgcgaagaac 960 gcgaagtacc cgtacgacca aactaaggaa atctcagcca aggatgtcgg caagtttatt 1020 caggatgtcc tagagggcaa ggttgaaccc agcatcaagt ctgaacccgt gcctgaaact 1080 caagaaggtc ctgtcacagt tgtggtggcc cactcataca aggatcttgt gatcgagaac 1140 gacaaggatg tccttcttga gttctacgca ccatggtgcg gacattgcaa ggcccttgcc 1200 cccaaatatg atgaattggc cgagttgtac gcgaagaacg aagatttcgc atctaaggtc 1260 actattgcaa agattgacgc gacggccaac gacgtccctg actctatcac cggtttcccg 1320 accatcaaat tattccctgc tgggtccaaa gatgcccctg tcgaatattc gggttctcgt 1380 accgtggagg acctcgcaaa cttcgtcaaa gagaacggca aatacggagt tgatgctttc 1440 gccgctcagt ccgaggaggc cgaggaggcc gaggaggttg cggaagatgc tacagagacc 1500 gctagcgatg ctgagccttc cgctgaaaag cctgagcatg atgagctttg a 1551 <210> 23 <211> 1554 <212> DNA <213> Thermoascus aurantiacus <400> 23 atgcggtctt tcggaccctt ggctttaagc ctccttggcg ccgctgcggt cgcctcagct 60 gccaacgcag agtcggacgt cgtttcgctc aagaaggata cgttcgaaga ttttataaag 120 gagcatgacc tcgtgctggc ggagttcttc gctccttggt gtggtcattg ccaggccctc 180 gcccccgaat atgaggctgc cgcctcggag ttgaaggcga agaacattcc tctggtaaag 240 gttgactgta cggaagaggc ggatctgtgc aaggactatg gtgttgaggg ttatcccacc 300 ctcaaggtct tccgtggcct tgactcgatt aagccatacc aaggagctcg aaagtccgga 360 gcgatcgttt cgtatatggt taagcagtct ctgccggcag tgtccacagt gaccaaggag 420 aatcttgagg agttcaagac catggacaag gtcgtcatca ttggatacat tgctgctgaa 480 gataaagctt ccaacgagac tttcacagct ctcgcggagt cgaaacggga tgactacctt 540 tttgctgtta ccagcgaccc tacgttagca aagacagaag gtgttaagca gccttctatt 600 gtcctctaca aggatttcga cgagaaaaag gatgtcttcg atggaaaatt cgacaaagag 660 gcaattatta gctggattaa aacagccagt acacctctcg ttggcgagat tggcccggag 720 acctatgcag gatatatgtc ggccggaatt cctctggcgt ttatctttgc ggaaacgcag 780 gaggagcggc aaaagtttgc cgccgacttc aagcctattg cggagaagca caggggtgct 840 atcaacattg tcactattga cgctaaagcg ttcggcgctt atgccgggaa tctgaatctt 900 gatgctcaga aattcccggc cttcgccatc catgacaccg tgaagaacgc taagtaccct 960 tacgatcagt ccaaggaagt aaatgcgaag gatattgccc agtttgtgca agatgtccta 1020 gatggcaagg tcgagcctag catcaagtcc gaaccgattc ctgaaaccca agagggtcca 1080 gttaccgtcg tagtcgccca tagctaccag gagctagtga ttgataacga caaggatgtc 1140 ctcctcgagt tctatgcccc gtggtgcggg cactgcaaag ctctcgctcc aaagtacgag 1200 gagctcgcac gcctttatgc ggagaaccct gacctagcgt ccaaggtcac cattgccaaa 1260 atcgatgcga cggcaaacga tgtacccgat gagattcaag gcttccccac gataaagctc 1320 ttccctgccg gctctaagga ctctccgatt gactacaccg gatccagaac tgtggaggac 1380 cttgcaaact tcgttaagga gaacgggaag cacaaggtag acgctcttag cgctggtact 1440 aaaaagcccc agcagggcgg tgatgttact agtgctccat cgatttcttc ggaaaaaacc 1500 gccgagactg tcgccccgac aagagatggc cctgtggatc atgatgagct gtaa 1554 <210> 24 <211> 333 <212> DNA <213> Aspergillus aculeatus <400> 24 atgtctgacc acggcaaggt tcaccagatc acttccactg cggagttcag agagaaggtc 60 accaactccc aggacgccat tgtcctcgac tgcttcgcca cgtggtgcgg tccctgcaag 120 gccatcgccc ccaaggtcgc cgctttcagc gaacaatacc cccaggccaa gttctacttg 180 atcgacgtcg acgagctctc tgatgtcgct gccgaactcg gtgtccgcgc catgcccacc 240 ttcatgctgt tcaagggcgg cgagaaggtc aaggacgttg tcggtgccaa cccccccgct 300 cttgaggccg gtatcaaggc tctcctcgca tag 333

Claims (73)

  1. 습식 제분 공정에서 옥수수 낟알로부터의 전분 수율 및/또는 글루텐 수율을 증가시키는 방법으로서, 분쇄된 옥수수 낟알, 특히 분쇄된 낟알의 섬유질이 풍부한 분획을 산화, 환원, 또는 이성질화를 포함하는 단백질 디설파이드 결합의 변화를 촉매하는 유효량의 폴리펩티드(예컨대, 단백질 디설파이드 이소머라제(PDI)(EC 5.3.4.1) 또는 티오레독신 펩티드)와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 습식 제분 공정 중의 분쇄된 낟알에서 방출되는 전분 및/또는 글루텐, 특히 불용성 전분 및 글루텐의 양이 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 존재하지 않거나 첨가되지 않은 공정에 비해 증가되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 건조 고형분 그램당 방출 단백질 mg(mg/gDS)으로 측정된 증가는 PDI 무첨가에 비해 적어도 0.5% 포인트, 적어도 0.75% 포인트, 적어도 1.0% 포인트, 적어도 1.5% 포인트, 적어도 2.5% 포인트, 예컨대 적어도 5.0% 포인트이고, 섬유질 세척은 3.5~5.5 범위의 pH, 예컨대 pH 4.0, 4.5, 또는 5.0, 및 적어도 300 μg EP/gDS의 효소 용량에서 수행되는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, PDI 또는 티오레독신 펩티드가 특히 섬유질 세척 단계 중에 섬유질 분획에 존재하거나 첨가되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 옥수수 낟알을 물에 침지하여 불린 낟알을 생성하는 단계;
    b) 불린 낟알을 분쇄하여 분쇄된 낟알을 생성하는 단계;
    c) 분쇄된 낟알로부터 배를 분리하여 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 옥수수 낟알 덩어리를 생성하는 단계; 및
    d) 옥수수 낟알 덩어리, 특히 미세 섬유질 분획을 섬유질 세척 절차에 적용하여 섬유질로부터 전분 및 글루텐을 분리하는 단계
    를 포함하고,
    적어도 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 단계 d) 전에 또는 중에 존재하거나 첨가되는, 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    e) 글루텐으로부터 전분을 분리하는 단계; 및 임의적으로
    f) 전분을 세척하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, PDI 또는 티오레독신 펩티드가 적어도 10 μg EP/g DS, 적어도 25 μg EP/g DS, 적어도 50 μg EP/g DS, 적어도 75 μg EP/g DS, 적어도 100 μg EP/g DS, 적어도 200 μg EP/g DS, 적어도 300 μg EP/g DS, 적어도 500 μg EP/g DS, 예컨대 10 내지 2000 μg EP/g DS, 25 내지 1000 μg EP/g DS, 50 내지 800 μg EP/g DS, 100 내지 500 μg EP/g DS 범위의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, SO2가 적어도 200 ppm, 적어도 300 ppm, 적어도 400 ppm, 적어도 450 ppm, 적어도 500 ppm, 적어도 600 ppm, 적어도 700 ppm, 적어도 800 ppm, 예컨대 200~3000 ppm, 300~2000 ppm, 400~800 ppm 범위의 양으로 섬유질 세척 중에 존재하거나 첨가되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 가수분해 효소가 섬유질 세척 단계 전에 또는 중에 존재하거나 첨가되고, 상기 가수분해 효소 중 적어도 하나는 자일라나제 및/또는 셀룰라제로부터 선택되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나제는 GH5 폴리펩티드, GH8 폴리펩티드, GH30 폴리펩티드, GH10 폴리펩티드, GH11 폴리펩티드, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해 효소는 하나 이상의 셀룰라제를 포함하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서, 셀룰라제는 엔도글루카나제(EG), 셀로바이오하이드롤라제(CBH), 베타-글루코시다제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하는, 방법.
  13. 제11항에 있어서, 셀룰라제는 엔도글루카나제, 셀로바이오하이드롤라제 I, 셀로바이오하이드롤라제 II, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 포함하는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라제는 트리코더마 레세이(Trichoderma reesei)로부터 유래된, 방법.
  15. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라제는 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 셀로바이오하이드롤라제 I, 아스페르길루스 푸미가투스 셀로바이오하이드롤라제 II, 아스페르길루스 푸미가투스 베타-글루코시다제 변이체, 및 페니실리움(Penicillium) 종(에머소니이(emersonii)) GH61 폴리펩티드를 함유하는 트리코더마 레세이 셀룰라제 제제와 함께 아스페르길루스 푸미가투스 GH10 자일라나제, 아스페르길루스 푸미가투스 베타-자일로시다제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 셀룰라제는
    i) 서열번호 14의 GH10 자일라나제, 서열번호 15의 베타-자일로시다제, 서열번호 16의 셀로바이오하이드롤라제 I, 서열번호 17의 셀로바이오하이드롤라제 II, 서열번호 18의 베타-글루코시다제, 서열번호 19의 GH61;
    또는
    ii) 서열번호 14에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 15에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 16에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 17에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 18에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드, 서열번호 19에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%의 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    및
    iii) 트리코더마 레세이로부터 유래된 적어도 하나의 엔도글루카나제
    를 포함하는 조성물로부터 선택되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 가수분해 효소는 아라비노푸라노시다제를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 아라비노푸라노시다제는 GH43 폴리펩티드, GH62 폴리펩티드, 및 GH51 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 c)로부터의 섬유질, 전분, 및 글루텐을 포함하는 옥수수 낟알 덩어리는 단계 d)의 섬유질 세척 절차 전에 추가 분쇄 단계, 바람직하게는 미분쇄 단계를 거치는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 섬유질 세척 절차는 섬유질 세척 시스템을 사용하여 수행되고, 섬유질 세척 시스템은 역류 세척 구성으로 유동적으로 연결된 복수의 스크린 유닛(S1…S4)(각각의 스크린 유닛은 옥수수 낟알 덩어리와 액체의 스트림을 제1 분획(s)과 제2 분획(f)의 두 분획으로 분리하도록 구성되고, 상기 제2 분획(f)은 제1 분획(s)보다 더 많은 wt% 측정량의 섬유질을 함유함) 및 임의적으로, 시스템에 배열된 공간으로서, 상기 제1 분획(s) 중 하나, 상기 제2 분획(f) 중 하나, 또는 혼합된 제1 및 제2 분획(s, f), 바람직하게는 제2 분획(f)만을 수용하도록 유동적으로 연결되고, 공간에 수용된 하나의 분획 또는 두 분획 모두에 대한 인큐베이션 시간을 제공하도록 구성되고, 이에 의해 인큐베이션된 하나의 분획 또는 두 분획 모두를 하류 스크린 유닛(S4)으로 배출하는 공간(V)을 포함하며,
    시스템은
    - 옥수수 낟알 덩어리 및 액체를 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로 유입시키고,
    - 가장 상류 스크린 유닛(S1)으로부터 제1 분획(s1)을 전분을 함유하는 산물 스트림으로서 배출하고,
    - 공정수를 유입시키고(바람직하게는 공정수를 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로 유입시키도록 배열됨),
    - 가장 하류 스크린 유닛(S4)으로부터 제2 분획(f4)을 원래의 옥수수 낟알 덩어리보다 더 적은 양의 전분 및 글루텐을 함유하는 세척된 옥수수 낟알 덩어리로서 배출하고,
    - 임의적으로 가수분해 효소를 시스템 내로 도입하도록 구성되는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 섬유질 세척 절차는 35분 이상 48시간 미만의 섬유질 세척 시스템 내 총 체류 시간을 제공하도록 구성된 공간(V)/탱크를 포함하는 섬유질 세척 시스템의 사용을 포함하는, 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 공간(V)은 50~1000 m3 범위의 부피를 갖는, 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공간(V)은 80 내지 250 m3 범위의 부피를 갖는, 방법.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유질 세척 시스템 내에 구성된 상기 공간(V)/탱크에서의 인큐베이션 시간은 5분 이상 48시간 미만, 예컨대 35분 내지 24시간, 35분 내지 수 시간, 35분 내지 6시간, 35분 내지 5시간, 35분 내지 4시간, 35분 내지 3시간, 35분 내지 2시간, 45분 내지 48시간, 45분 내지 24시간, 45분 내지 12시간, 45분 내지 6시간, 45분 내지 5시간, 45분 내지 4시간, 45분 내지 3시간, 45분 내지 2시간인, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션 온도는 25℃ 내지 95℃, 예컨대 25 내지 90℃, 25 내지 85℃, 25 내지 80℃, 25 내지 75℃, 25 내지 70℃, 25 내지 65℃, 25 내지 60℃, 25 내지 55℃, 25 내지 53℃, 25 내지 52℃, 30 내지 90℃, 30 내지 85℃, 30 내지 80℃, 30 내지 75℃, 30 내지 70℃, 30 내지 65℃, 30 내지 60℃, 30 내지 55℃, 30 내지 53℃, 30 내지 52℃, 35 내지 90℃, 35 내지 85℃, 35 내지 80℃, 35 내지 75℃, 35 내지 70℃, 35 내지 65℃, 35 내지 60℃, 35 내지 55℃, 35 내지 53℃, 35 내지 52℃, 39 내지 90℃, 39 내지 85℃, 39 내지 80℃, 39 내지 75℃, 39 내지 70℃, 39 내지 65℃, 39 내지 60℃, 39 내지 55℃, 39 내지 53℃, 39 내지 52℃, 바람직하게는 46 내지 52℃인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 가수분해 효소는 트리코더마 레세이와 같이 셀룰라제 배경을 가진 유기체에서 발현되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분쇄된 옥수수 낟알 덩어리의 하나 이상의 분획과 혼합/접촉되는 하나 이상의 가수분해 효소의 유효량은 습식 제분 공정에 유입되는 옥수수 낟알 미터 톤당 효소 단백질 0.005~0.5 kg인, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, SO2의 공급원은 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), NaHSO3, 및/또는 SO2 가스 첨가로부터 선택되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, PDI 또는 티오레독신 펩티드는 산화환원 단백질의 티오레독신 수퍼패밀리에 속하는 적어도 하나의 촉매 도메인을 포함하고, 이 도메인은 CXXC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, PDI는 적어도 하나의 비촉매 도메인에 의해 분리된, 각각 CXXC 모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 활성 부위를 포함하는 2개의 촉매 도메인을 포함하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, CXXC 모티프는 CGHC, CTHC, CPHC, CGPC, 및 CSMC로 이루어진 군으로부터 선택되는(특히 CGHC 또는 CGPC인), 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 촉매 도메인은 Pf00085 패밀리에 속하는, 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, PDI는 중앙의 Pf13848 도메인이 2개(N-말단에 하나 C-말단에 다른 하나)의 Pf00085 도메인에 의해 플랭킹된 3-도메인 구조 Pf00085-Pf13848-Pf00085를 포함하는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PDI는
    (a) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 하나 이상의(여러) 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
    (c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PDI는
    (a) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
    (c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PDI는
    (a) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
    (c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  37. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, PDI는
    (a) 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
    (c) PDI 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 티오레독신 펩티드는
    (a) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 하나 이상의 위치에 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함하는 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드의 변이체; 및
    (c) 티오레독신 펩티드 활성을 갖는 (a) 또는 (b)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나제는
    (a) 서열번호 8의 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 자일라나제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나제는
    (a) 서열번호 11의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 자일라나제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 아라비노푸라노시다제는
    (a) 서열번호 13의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나제는
    (a) 서열번호 10의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 자일라나제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 아라비노푸라노시다제는
    (a) 서열번호 12의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 예를 들어 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 아라비노푸라노시다제 활성을 갖는 (a)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라제는 트리코더마 레세이 또는 후미쿨라 인솔렌스(Humicula insolens)로부터 유래된, 방법.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라제는 아스페르길루스 푸미가투스로부터의 CBH I 및 CBH II를 갖는 트리코더마 레세이 배경 셀룰라제로부터 유래된, 방법.
  46. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
    (a) 서열번호 1에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 1의 아미노산 21 내지 516에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
    (e) 서열번호 20의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
    (f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  47. 제46항에 있어서, 서열번호 1에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 서열번호 1의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  49. 제46항에 있어서, 서열번호 1 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 1의 아미노산 21 내지 516을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
  50. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
    (a) 서열번호 2에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 2의 아미노산 21 내지 513에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
    (e) 서열번호 21의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
    (f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  51. 제50항에 있어서, 서열번호 2에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  52. 제50항 또는 제51항에 있어서, 서열번호 2의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  53. 제50항에 있어서, 서열번호 1 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 2의 아미노산 21 내지 513을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
  54. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
    (a) 서열번호 3에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 3의 아미노산 21 내지 516에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
    (e) 서열번호 22의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
    (f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  55. 제54항에 있어서, 서열번호 3에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  56. 제54항 또는 제55항에 있어서, 서열번호 3의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  57. 제54항에 있어서, 서열번호 3 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 3의 아미노산 21 내지 516을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
  58. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 단리 또는 정제된 폴리펩티드로서,
    (a) 서열번호 4에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 4의 아미노산 21 내지 517에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
    (e) 서열번호 23의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
    (f) 단백질 디설파이드 이소머라제 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  59. 제58항에 있어서, 서열번호 4에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 서열번호 4의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  61. 제58항에 있어서, 서열번호 1 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 4의 아미노산 21 내지 517을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
  62. 단백질 디설파이드 결합을 감소시키는 능력을 갖는 단리 또는 정제된 티오레독신 폴리펩티드로서,
    (a) 서열번호 5에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (b) 서열번호 5의 아미노산 1 내지 110에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (c) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드;
    (d) 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가됨으로써 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드;
    (e) 서열번호 24의 성숙 폴리펩티드 암호화 서열에 대해 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드; 및
    (f) 티오레독신 활성을 갖는 (a), (b), (c), (d), 또는 (e)의 폴리펩티드의 단편
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드.
  63. 제62항에 있어서, 서열번호 5에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 서열번호 5의 성숙 폴리펩티드에 대해 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드.
  65. 제62항에 있어서, 서열번호 5 또는 이의 성숙 폴리펩티드를 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되거나; 또는 서열번호 5의 아미노산 1 내지 110을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성되는 폴리펩티드.
  66. 제46항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 습식 제분 공정 중의 분쇄된 낟알의 섬유질이 풍부한 분획으로부터 방출되는 전분 및/또는 글루텐, 특히 불용성 전분 및 글루텐의 양이 PDI 또는 티오레독신 펩티드가 섬유질 세척 단계에서 존재하지 않거나 첨가되지 않은 공정에 비해 증가되는, 폴리펩티드.
  67. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  68. 제67항에 있어서, 제10항의 자일라나제 및/또는 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항의 셀룰라제를 추가로 포함하는 조성물.
  69. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 전체 배양액 제형 또는 세포 배양 조성물.
  70. 제46항 내지 제66항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 암호화하는 단리 또는 정제된 폴리뉴클레오티드.
  71. 제70항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산 구성체 또는 발현 벡터로서, 폴리뉴클레오티드가 발현 숙주에서 폴리펩티드의 생성을 지시하는 하나 이상의 이종성 제어 서열에 작동가능하게 연결된, 핵산 구성체 또는 발현 벡터.
  72. 폴리펩티드의 생성을 지시하는 하나 이상의 이종성 제어 서열에 작동가능하게 연결된 제70항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  73. 단백질 디설파이드 이소머라제 활성 또는 티오레독신 펩티드 활성을 갖는 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서, 폴리펩티드의 생산에 도움이 되는 조건하에 제72항의 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의적으로 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 방법.
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