BR112020001523A2 - gh5 e gh30 em moagem a úmido - Google Patents

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Abstract

O presente pedido refere-se a métodos para melhorar o rendimento de amido e/ou rendimento de glúten totais de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, em que o método compreende misturar por adição grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho com uma composição de enzimas que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas, em que pelo menos uma das ditas enzimas hidrolíticas é selecionada dentre o grupo que consiste em um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GH5 ou uma combinação dos mesmos.

Description

GH5 e GH30 EM MOAGEM A ÚMIDO
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] Apresente invenção refere-se a um método para melhorar o rendimento de amido e/ou glúten de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, colocando-se os ditos grãos de milho em contato com uma composição enzimática que compreende um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GH5 ou uma combinação dos mesmos, de preferência, durante a lavagem de fibra.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] —Amoagem a úmido convencional do milho é um processo projetado para a recuperação e purificação de amido e diversos coprodutos incluindo germe, glúten (proteína) e fibra. A fibra é o coproduto menos valioso, então a indústria tem colocado esforço substancial no aumento do rendimento dos produtos mais valiosos, tais como amido e glúten, ao mesmo tempo que diminui a fração de fibra. O amido de alta qualidade é valioso na medida em que o mesmo pode ser usado para uma variedade de propósitos comerciais após o processamento adicional a produtos, tais como amido seco, amido modificado, dextrinas, adoçantes e álcool. Glúten é usualmente usado para ração animal, como farinha de glúten de milho (cerca de 60% de proteína) ou ração de glúten de milho (cerca de 20% de proteína).
[003] O processo de moagem a úmido pode variar significativamente dependendo do equipamento de moinho usado, mas usualmente o processo inclui: limpeza de grão, maceração, trituração, separação de germe, uma segunda trituração, separação de fibras, separação de glúten e separação de amido. Após a limpeza dos grãos de milho, os mesmos são tipicamente amolecidos pelo embebimento em água ou em uma solução diluída de SO? sob condições controladas de tempo e temperatura. Então, os grãos são triturados para quebrar o pericarpo, e o germe é separado do resto do grão. A pasta fluida restante, que consiste principalmente em fibra, amido e glúten, é finamente triturada e peneirada em um processo de lavagem de fibra, para separar a fibra do amido e glúten, antes de o glúten e o amido serem separados, e o amido pode ser purificado em um processo de lavagem/filtração.
[004] O uso de enzimas em diversas etapas do processo de moagem a úmido foi sugerido, tal como o uso de enzimas para a etapa de maceração de processos de moagem a úmido. O produto de enzima comercial Steepzyme€6 (disponível junto à Novozymes A/S) se mostrou adequado para a primeira etapa nos processos de moagem a úmido, isto é, a etapa de maceração em que os grãos de milho são embebidos em água.
[005] Mais recentemente, "moagem enzimática", um processo de moagem a úmido modificado que usa proteases para reduzir significativamente o tempo de processamento total durante a moagem a úmido de milho e elimina a necessidade de dióxido de enxofre como um agente de processamento, foi desenvolvida. Johnston et al., Cereal Chem, 81, páginas 626 a 632 (2004).
[006] O documento nº US 6.566.125 revela um método para obter amido do mais que evolve embeber grãos de maís em água para produzir grãos de maís embebidos, triturar os grãos de maís embebidos para produzir pasta fluida de maís triturada e incubar a pasta fluida de mais triturada com enzima (por exemplo, protease).
[007] —O documento nº US 5.066.218 revela um método para moer grãos, especialmente milho, que compreende limpar o grão, macerar o grão em água para amolecer o mesmo e, então, moer o grão com uma enzima celulase.
[008] O documento nº WO 2002/000731 revela um processo para tratar grãos de cultura que compreende embeber os grãos em água por 1 a 12 horas, moer a úmido os grãos embebidos e tratar os grãos com uma ou mais enzimas incluindo uma protease ácida.
[009] — O documento nº WO 2002/000911 revela um processo de separação de glúten de amido que compreende submeter amido moído a uma protease ácida.
[010] O documento nº WO 2002/002644 revela um processo para lavar uma pasta fluida de amido obtida a partir da etapa de separação de glúten de amido de um processo de moagem que compreende lavar a pasta fluida de amido com uma solução aquosa que compreende uma quantidade eficaz de protease ácida.
[011] Os documentos nº WO 2014/082566 e WO 2014/082564 revelam composições celulolíticas para uso na moagem a úmido.
[012] “Embora atécnica tenha investigado o efeito de usar enzimas na moagem a úmido de milho, durante a maceração/embebimento de grãos de milho, durante a trituração dos grãos de milho e na separação de glúten de amido, ainda há uma necessidade de uma tecnologia de enzima melhorada que pode baixar o gasto de energia e os custos associados à moagem a úmido de milho e fornecer um rendimento aumentado de amido e glúten.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[013] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para melhorar o rendimento de amido e/ou rendimento glúten totais que podem ser obtidos a partir de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, sendo que o método compreende: Misturar por adição grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho com uma composição de enzimas que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas, em que pelo menos uma das ditas enzimas hidrolíticas é selecionada dentre o grupo que consiste em um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GH5 e uma combinação dos mesmos.
[014] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição de enzimas que compreende um polipeptídeo GH30 isolado, um polipeptídeo GH5 isolado ou ambos, assim como o uso de tais composições de enzimas para melhorar o rendimento de amido e/ou rendimento de glúten totais que podem ser obtidos a partir de grãos de milho em um processo de moagem a úmido.
[015] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a composições que compreendem amido de milho, glúten de milho ou fibra de milho, sendo que as ditas composições são obteníveis pelo método descrito em um primeiro aspecto e nas modalidades da invenção.
[016] Em outros aspectos, a presente invenção refere-se a polipeptídeos com atividade de xilanase e a polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos.
[017] Em um quarto aspecto, a invenção refere-se a polipeptídeos isolados que têm atividade de xilanase selecionados a partir do grupo que consiste em: (a) Um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou 12; (b) Um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeos maduros da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11; (c) Uma variante do polipeptíideo maduro da SEQ ID NO: 10 ou 12 que compreende uma substituição, seleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (d) Um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de xilanase.
[018] Em um quinto aspecto, a invenção refere-se a uma composição que compreende um polipeptídeo de acordo com o quarto aspecto da invenção.
[019] A invenção também se refere a construtos de ácido nucleico ou vetores de expressão que compreendem um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do quarto aspecto da invenção ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionada a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[020] A presente invenção e, em particular, as modalidades preferenciais de acordo com a invenção serão descritas em mais detalhes em referência às figuras anexas. As figuras mostram modos de implantar a presente invenção e não devem ser interpretadas como sendo limitantes a outras modalidades possíveis abrangidas pelo escopo do conjunto de reivindicações anexo.
[021] A Figura 1 ilustra esquematicamente uma primeira modalidade de um sistema de lavagem de fibras com contracorrente de acordo com a presente invenção.
[022] A Figura 2 ilustra esquematicamente uma modalidade adicional de um sistema de acordo com a presente invenção.
[023] A Figura3 ilustra esquematicamente uma unidade de peneira com uma incubadora embutida.
[024] A Figura 4 ilustra esquematicamente uma unidade de peneira na forma de um hidrociclone.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[025] É um objetivo da presente invenção fornecer um método para melhorar os rendimentos de amido e/ou glúten que podem ser obtidos a partir de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, tratando-se os grãos de milho com uma composição de enzima hidrolítica, de preferência, durante o procedimento de lavagem de fibra. Os inventores da presente invenção concluíram surpreendentemente que o tratamento enzimático de grãos de milho com um polipeptídeo GH5 ou um polipeptídeo GH30 ou uma combinação dos mesmos melhora a liberação de amido e glúten ligados da fibra e, assim, melhora os rendimentos de amido e/ou glúten que podem ser obtidos.
O processo de moagem a úmido:
[026] —Osgrãos de milho são moídos a úmido a fim de abrir os grãos e separar os grãos em seus quatro constituintes principais: amido, germe, fibra e glúten.
[027] O processo de moagem a úmido pode variar significativamente de moinho para moinho, entretanto, a moagem a úmido convencional usualmente compreende as seguintes etapas:
1. Maceração e separação de germe,
2. Procedimento de lavagem de fibra
3. Separação de amido/glúten, e
4. Lavagem de amido.
Maceração, trituração e separação de germe
[028] Os grãos de milho são amolecidos por embebimento em água por entre cerca de 30 minutos a cerca de 48 horas, preferencialmente 30 minutos a cerca de 15 horas, tal como cerca de 1 hora a cerca de 6 horas a uma temperatura de cerca de 50 ºC, tal como entre cerca de 45 “ºC a 60 ºC. Durante a maceração, os grãos absorvem água, aumentando seus níveis de umidade de 15 por cento a 45 por cento e mais do que dobrando em tamanho. A adição opcional de, por exemplo, 0,1 por cento de dióxido de enxofre (SO>) e/ou NaHSO; à água impede a proliferação excessiva de bactérias no ambiente quente. Na medida em que o milho incha e amolece, a acidez moderada da água de maceração começa a soltar as ligações de glúten dentro do milho e liberar o amido. Após os grãos de milho serem macerados, os mesmos são quebrados para liberar o germe. O germe contém óleo de milho. O germe é separado da mistura de densidade mais pesada de amido, glúten e fibra essencialmente pela "flutuação" do segmento de germe livre de outras substâncias sob condições estreitamente controladas. Esse método serve para eliminar qualquer efeito adverso dos vestígios de óleo de milho nas etapas de processamento posteriores.
Procedimento de lavagem de fibra
[029] Para obter máxima recuperação de amido e glúten, ao mesmo tempo que se mantém qualquer fibra no produto final a um mínimo absoluto, é necessário lavar o amido e glúten livres da fibra durante o processamento. A fibra é coletada, transformada em pasta fluida e peneirada para recuperar qualquer glúten ou amido residual.
Separação de glúten de amido
[030] A suspensão de amido-glúten da etapa de lavagem de fibra, chamada de amido moído, é separada em amido e glúten. Glúten tem uma baixa densidade em comparação ao amido. Passando-se o amido moído através de uma centrífuga, o glúten é prontamente removido por centrifugação.
Lavagem de amido
[031] A pastafluidade amido da etapa de separação de amido contém alguma proteína insolúvel e muitos solúveis. Os mesmos têm que ser removidos antes de um amido de qualidade superior (amido de alta pureza) poder ser produzido. O amido, com apenas um ou dois por cento de proteína restante, é diluído, lavado 8 a 14 vezes, rediluído e lavado novamente em hidrociclones para remover o último vestígio de proteína e produzir amido de alta qualidade, tipicamente mais do que 99,5% puro.
[032] Produtos de moagem a úmido: A moagem a úmido pode ser usado para produzir, sem limitação, licor de maceração de milho, alimento de glúten de milho, germe, óleo de milho, farinha de glúten de milho, amido de milho, amido de milho modificado, xaropes, tal como xarope de milho, e etanol de milho.
Definição de enzimas:
[033] Enzima celulolítica ou celulase/polipeptídeo com atividade de celulase ou atividade celulolítica: Os termos "enzima celulolítica", "celulase" e polipeptídeo com atividade de celulase ou atividade celulolítica são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a uma ou mais (por exemplo, diversas) enzimas que hidrolisam um material celulósico, que compreende qualquer material que compreende celulose, tal como fibra. As enzimas celulolíticas incluem endoglucanase (ou endoglucanases) (E.C 3.2.1.4), celobio-hidrolase (ou celobio-
hidrolases) (E.C 3.2.1.91 e E.C 3.2.1.150), beta-glicosidase (ou beta-glicosidases) (E.C.
3.2.1.21) ou combinações das mesmas. As duas abordagens básicas para medir a atividade de enzima celulolítica incluem: (1) medir a atividade de enzima celulolítica total e (2) medir as atividades de enzimas celulolíticas individuais (endoglucanases, celobio- hidrolases e beta-glicosidases) conforme analisado em Zhang et al. 2006, Biotechnology Advances 24: 452 a 481. A atividade de enzima celulolítica total pode ser medida com o uso de substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman nº 1, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O ensaio mais comum da atividade celulolítica total é o ensaio de papel de filtro com o uso de papel de filtro Whatman nº como o substrato. O ensaio foi estabelecido pela International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Pure Appl. Chem. 59: 257 a 268).
[034] A atividade de enzima celulolítica pode ser também determinada medindo-se o aumento na produção/liberação de açúcares durante a hidrólise de um material celulósico por enzima celulolítica (ou enzimas) sob as seguintes condições: 1 a 50 mg de proteína de enzima celulolítica/g de celulose em palha de milho pré-tratada (PCS) (ou outro material celulósico pré-tratado) durante 3 a 7 dias a uma temperatura adequada tal como 40 ºC a 80 ºC, por exemplo, 40 ºC, 45 ºC, 50 ºC, 55 ºC, 60 ºC, 65 ºC, 70 ºC, 75 ºC ou 80 “C, e um pH adequado, tal como 4 a 9, por exemplo, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ou 9,0, em comparação com uma hidrólise de controle sem adição de proteína de enzima celulolítica. Condições típicas são reações de 1 ml, PCS lavada ou não lavada, sólidos insolúveis a 5% (peso seco), acetato de sódio 50 MM pH 5, MNSO4 1 mM, 50 ºC, 55 ºC, ou 60 ºC, 72 horas, análise de açúcares por cromatografia em coluna AMINEXO HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA).
[035] Enzimas hidrolíticas ou hidrolase/polipeptídeo com atividade de hidrolase: "Enzimas hidrolíticas" e polipeptídeo com atividade de hidrolase são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a qualquer proteína catalítica que use água para quebrar substratos. As enzimas hidrolíticas incluem celulases (EC 3.2.1.4), xilanases (EC 3.2.1.8), arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55 (alfa- L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora); EC 3.21.185 (beta-L- arabinofuranosidases de extremidade não redutora) celobio-hidrolase | (EC 3.2.1.150), celobio-hidrolase Il (E.C. 3.2.1.91), celobio-hidrolase (E.C. 3.2.1.176), beta-glicosidase (E.C.3.2.1.21), beta-xilosidases (EC 3.2.1.37).
[036] Xilanases/polipeptideo com atividade de xilanase: Os termos "xilanase" e polipeptídeo com atividade de xilanase são usados de forma intercambiável no presente documento e referem-se a uma 1,4-beta-D-xilano-xilo-hidrolase (E.C.
3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos. À atividade de xilanase pode ser determinada com AZCL-arabinoxilano a 0,2% como substrato em TRITONO X-100 a 0,01% e fosfato de sódio a 200 mM pH 6 a 37 ºC. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como a quantidade de atividade de xilanase que produz 1,0 umol de azurina por minuto a 37 ºC, pH 6 a partir de AZCL-arabinoxilano a 0,2% como substrato em fosfato de sódio 200 mM pH 6.
[037] Outras definições:
[038] No presente contexto, os termos são usados de modo a serem comuns para um versado na técnica. Alguns desses termos são elucidados abaixo:
[039] “Tempo de contato: Para uma ou mais enzimas reagirem com um substrato, a uma ou mais enzimas têm que estar em contato com o substrato. "Tempo de contato" refere-se ao período de tempo em que uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas está em contato com pelo menos uma fração de uma massa de substrato. As enzimas podem não estar em contato com toda a massa de substrato durante o tempo de contato, entretanto, misturar a uma ou mais enzimas com uma massa de substrato permite o potencial de hidrólise enzimaticamente catalisada de uma fração da massa de substrato durante o tempo de contato.
[040] Grão de milho: Uma variedade de grãos de milho é conhecida, incluindo, por exemplo, milho maduro, milho flint, milho-tunicado, milho ornamental, milho doce, milho ceroso e similares.
[041] Alguns grãos de milho tem uma cobertura externa denominada "Pericarpo" que protege o germe nos grãos. A mesma resiste à água e vapor d'água e é indesejável a insetos e microrganismos. A única área dos grãos não coberta pelo "Pericarpo" é a "Ponta", que é um ponto de ligação do grão à espiga.
[042] Grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho: Esse termo é usado para descrever os grãos de milho através do processo de moagem a úmido. Quando os grãos de milho são quebrados e processados, todas as partes fracionadas do grão de milho são consideradas como estando incluídas quando esse termo é usado. O termo inclui, por exemplo: grãos embebidos, grãos triturados, massa de grão de milho, uma primeira fração, uma segunda fração, uma ou mais frações da massa de grão de milho, etc.
[043] Massa de grão de milho: é, de preferência, usado para referência a uma massa que compreende fibra, glúten e amido, de preferência, atingida por estufagem e trituração dos grãos de milho e separação de uma massa que compreende fibra, glúten e amido dos germes. Conforme a massa de grão de milho se move através da lavagem de fibra, a mesma é separada em diversas frações, incluindo uma primeira fração (s) e uma segunda fração (f). Portanto, "frações de massa de grão de milho" e "uma ou mais frações de massa de grão de milho" referem-se, entre outros, à primeira (s) e à segunda frações (f).
[044] —cDNA: O termo “cDNA” significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA, processada, madura, obtida a partir de uma célula eucariótica ou procariótica. O cCDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial é um precursor de MRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mMRNA processado maduro.
[045] Sequência de codificação: O termo “sequência de codificação” significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo. As fronteiras da sequência de codificação são, geralmente, determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG ou TGA. À sequência de codificação pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético ou uma combinação dos mesmos.
[046] Sequências de controle: O termo “sequências de controle” designa sequências de ácidos nucleicos necessárias para a expressão de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa (isto é, do mesmo gene) ou estranha (isto é, de um gene diferente) ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas sem limitação, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo-sinal e terminador da transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada transcricional e tradução. As sequências de controle podem ser dotadas de ligantes para a finalidade de introdução de sítios de restrição específicos, facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação do polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo.
[047] Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida na produção de um polipeptídeo, incluindo, mas sem limitação, transcrição, modificação pós-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e segregação.
[048] Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” designa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo e está ligado de maneira funcional a sequências de controle que fornecem a sua expressão.
[049] Fragmento: O termo “fragmento” significa um polipeptídeo que tem um ou mais (por exemplo, vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo maduro, em que o fragmento tem atividade de protease.
[050] Germe: O "Germe" é a única parte viva do caroço de milho. O mesmo contém as informações genéticas essenciais, enzimas, vitaminas e minerais para o caroço crescer como uma planta de milho. No milho maduro amarelo, cerca de 25 por cento do germe é óleo de milho. O endosperma coberto ou circundado pelo germe compreende cerca de 82 por cento do peso seco do caroço e é a fonte de energia (amido) e proteína para a semente em germinação. Há dois tipos de endosperma, mole e duro. No endosperma duro, o amido é embalado firmemente junto. No endosperma macio, o amido é perdido.
[051] Polipeptídeo GH5: refere-se a um polipeptídeo com atividade enzimática, em que o polipeptídeo é classificado como o membro da família de glicosídeo hidrolase 5 no banco de dados de Carbohydrate-Active enZYmes (CAZymes) (http://www.cazy.org/).
[052] Polipeptídeo GH30: refere-se a um polipeptídeo com atividade enzimática, em que o polipeptídeo é classificado como o membro da família de glicosídeo hidrolase 30 no banco de dados de Carbohydrate-Active enZYmes (CAZymes) (http://www.cazy.org/).
[053] Glúten: Glúten é uma proteína constituída por duas proteínas menores, glutenina e gliadina. No presente documento, "glúten" refere-se à maior parte das proteínas encontradas em grãos de milho. Os produtos principais de glúten da moagem a úmido de milho são farinha de glúten de milho (aproximadamente 60% de proteína) e ração de glúten de milho (aproximadamente 20% de proteína).
[054] —Triturar ou trituração: O termo "trituração" refere-se a quebrar os grãos de milho em componentes menores.
[055] — Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução ou similares com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula de origem que não seja idêntica à célula de origem devido a mutações que ocorrem durante a replicação.
[056] Isolado: O termo “isolado” significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância de ocorrência não natural, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais, ou de todos os, constituintes de ocorrência natural, aos quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (por exemplo, produção recombinante em uma célula hospedeira; múltiplas cópias de um gene codificando a substância; e uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância).
[057] Tempo de incubação: O tempo em que a uma ou mais frações da massa de grão de milho está em contato com a enzima hidrolítica durante a lavagem de fibra, sem serem triadas.
[058] Emmuitas modalidades preferenciais, um método de acordo com a presente invenção utiliza um sistema que compreende um espaço (V), ou "incubador", dentro do qual o material é "deixado ser afetado" peças enzimas e, em tais situações, o tempo de incubação pode ser determinado por: volume do incubator [m3] * densidade de influxo ao incubador [8/1] ne” influxo de massa por unidade de tempo ao incubador [8]
[059] — Alternativamente, se o influxo ao incubador for expresso em termos de unidade de volume por tempo: tem volume de incubador [m?] i influxo de volume por unidade de tempo ao incubador [7]
[060] Polipeptídeo maduro: O termo “polipeptídeo maduro” significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós- traducionais, tal como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro são os aminoácidos 21 a 678 da SEQ ID NO: 2 com base no programa de computador SignalP (Nielsen et a/., 1997, Protein Engineering 10: 1 a 6), que prevê que os aminoácidos 1 a 20 da SEQ ID NO: 2 são um peptídeo-sinal. Sabe-se na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (isto é, com um aminoácido —C-terminal e/ou N-Hterminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo. Também se sabe na especialidade que diferentes células hospedeiras processam polipeptídeos diferentemente e, portanto, uma célula hospedeira que expressa um polinucleotídeo pode produzir um polipeptídeo maduro diferente (por exemplo, que tem um aminoácido de C-terminal e/ou N-terminal diferente) em comparação com outra célula hospedeira que expressa o mesmo polinucleotídeo.
[061] Sequência de codificação do polipeptíideo maduro: O termo "sequência de codificação de um polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro.
[062] Equipamento de moinho: "Equipamento de moinho" refere-se a todo equipamento usado em um moinho. O processo de moagem a úmido variará dependendo do equipamento de moinho disponível. Os exemplos de equipamento de moinho podem ser tanques de maceração, evaporador, prensa de parafuso, secador giratório, tela de drenagem, centrífuga, hidrociclone, etc. O tamanho e o número de cada equipamento de moinho/linha de moagem podem variar em moinhos diferentes, o que afetará o processo de moagem. Por exemplo, o número de unidades de tela de lavagem de fibra pode variar, assim como o tamanho de uma centrífuga.
[063] —“Construto de ácido nucleico: O termo “construto de ácido nucleico” significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de uma maneira que não existiria de outro modo na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.
[064] —Operacionalmente ligado: O termo “operacionalmente ligado” significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência de codificação de um polinucleotídeo, de modo que a sequência de controle direcione a expressão da sequência de codificação.
[065] “Tempo de retenção: O tempo em que uma ou mais enzimas hidrolíticas e grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho são deixados reagir durante o procedimento de lavagem de fibra.
[066] Em algumas modalidades, o tempo de retenção é o período de tempo em que a massa de grão de milho, recebida na primeira unidade de triagem (S1) e uma ou mais frações da mesma, é colocada em contato com uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas antes de deixar o sistema de lavagem de fibra novamente. Durante o tempo de retenção, a uma ou mais frações de massa de grão de milho são incubadas com uma ou mais enzimas hidrolíticas em um espaço (V), antes de deixar o sistema de lavagem de fibra, como parte de uma primeira fração (s1) da unidade de triagem mais a montante (S1) ou como parte de uma segunda fração (f4) da unidade de triagem mais a jusante (S4).
[067] O tempo de retenção pode ser, de preferência, estimado como a duração de tempo média que uma matéria sólida leva em um sistema de lavagem de fibra conforme definido em relação à presente invenção. O mesmo pode ser estimado pela seguinte relação:
volume do sistema: [m?] x densidade de influxo de massa [F9/ns] meo influxo de massa por unidade de tempo ao sistema [9/3]
[068] &—Alternativamente, se o influxo ao sistema for expresso em termos de unidade de volume por tempo: te= volume do sistema [m?] influxo de volume por unidade de tempo ao sistema [m/s]
[069] — O volume do sistema é tipicamente definido igual à soma dos volumes de todos os espaços vazios no sistema; entretanto, como a tubulação no sistema tipicamente se torna menor, pode ser preferencial desconsiderar o volume da tubulação.
[070] Triado: O termo "triado" ou "triagem" refere-se ao processo de separar massa de grão de milho em uma primeira fração s e uma segunda fração fe o movimento dessas frações de uma unidade de triagem para outra. Um período de não triagem é um período de não separação fornecido para incubação de massa de grão de milho ou frações da mesma com enzimas.
[071] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro “identidade de sequência”.
[072] Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidade de sequências entre duas sequências de aminoácidos é determinado com o uso do algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453) conforme implantado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et a/., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277), de preferência, versão 3.0.0 ou posterior. Foi usada a versão 6.1.0.
[073] Os parâmetros opcionais usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM6?2). O resultado de Needle identificado “identidade mais longa” (obtido usando a opção —nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento — Número Total de Intervalos no Alinhamento).
[074] Amido: O termo "amido" significa qualquer material compreendido por polissacarídeos complexos de
[075] plantas, composto de unidades de glicose que ocorrem amplamente em tecidos de planta na forma de grânulos de armazenamento, consistindo em amilose e amilopectina e representado como (CsH10Os)n, em que n é qualquer número.
[076] Maceração ou embebimento: O termo "maceração" significa embeber o grão de cultura com água e, opcionalmente, SO2.
[077] Descrição da invenção: Um primeiro aspecto da presente invenção fornece um método para melhorar o rendimento de amido e/ou rendimento glúten totais que podem ser obtidos a partir de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, em que o método compreende: Misturar por adição grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho com uma composição de enzimas que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas, em que pelo menos uma das ditas enzimas hidrolíticas é selecionada dentre o grupo que consiste em um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GH5 ou uma combinação dos mesmos.
[078] Parte do amido e/ou glúten nos grãos de milho ou frações de grãos de milho pode estar ligada à fração de fibra e nunca ser liberada durante o processo de moagem a úmido. Entretanto, a adição de enzimas hidrolíticas, que pode incluir qualquer proteína catalítica que pode usar água para quebrar substratos presentes em grãos de milho, pode liberar parte do amido e/ou glúten ligado e, assim, melhorar o rendimento de amido e/ou glúten no processo de moagem a úmido. Os presentes inventores concluíram surpreendentemente que os polipeptídeos GH5 e os polipeptídeos GH30 são particularmente eficazes para diminuir a quantidade de amido e glúten ligados na fração de fibra.
[079] —Emuma modalidade, o método da presente invenção leva a um aumento na quantidade de amido e/ou glúten liberado da fibra durante o processo, tal como durante o procedimento de lavagem de fibra.
[080] O procedimento específico e o equipamento usado no processo de moagem a úmido pode variar, mas os princípios principais do processo permanecem os mesmos (consultar a descrição sobre o processo de moagem a úmido).
[081] Em uma modalidade, o método da invenção compreende as etapas de: a) embeber os grãos de milho em água para produzir grãos embebidos; b) triturar os grãos embebidos para produzir grãos embebidos e triturados; c) separar germes dos grãos embebidos e triturados para produzir uma massa de grãos de milho que compreende fibra, amido e glúten; e d) submeter a massa de grãos de milho resultante a um procedimento de lavagem de fibra.
[082] Para obter máxima recuperação de amido e glúten, ao mesmo tempo que se mantém qualquer fibra no produto final a um mínimo absoluto, é necessário lavar o amido e glúten livres da fração de fibra durante o processamento. A fibra é coletada, transformado em uma pasta fluida e triada, tipicamente após embebimento, trituração e separação dos germes dos grãos de milho (consultar a descrição do processo de moagem a úmido), para recuperar qualquer amido ou glúten residual na massa de grão de milho. Esse processo é denominado no presente documento o procedimento de lavagem de fibra.
[083] Em uma modalidade, os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas, antes, durante ou após a etapa de submeter a massa de grãos de milho a um procedimento de lavagem de fibra.
[084] Em uma modalidade, os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas, antes da etapa de submeter a massa de grãos de milho a um procedimento de lavagem de fibra. De acordo com essa modalidade, os grãos de milho são, de preferência, misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas durante a maceração, durante a trituração e/ou durante a separação de germe.
[085] Em uma modalidade, os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas, após a etapa de submeter a massa de grãos de milho a um procedimento de lavagem de fibra.
[086] Emuma modalidade preferencial, os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas, durante a etapa de submeter a massa de grãos de milho a um procedimento de lavagem de fibra.
[087] Em uma modalidade, os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho é deixada reagir com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas por pelo menos 15 minutos, tal como pelo menos 20 minutos, pelo menos 25 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 35 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 55 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 70 minutos, pelo menos 80 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos 100 minutos, pelo menos 110 minutos ou pelo menos 120 minutos.
[088] O equipamento específico usado no procedimento de lavagem de fibra pode variar, mas o princípio mais importante do processo permanece o mesmo.
[089] Em uma modalidade, o dito procedimento de lavagem de fibra compreende o uso de um sistema de lavagem de fibra otimizado para a introdução de uma ou mais enzimas hidrolíticas, em que o sistema de lavagem de fibra compreende um espaço (V) configurado para fornecer um tempo de reação total no sistema de lavagem de fibra (tempo de retenção) de pelo menos 35 minutos, tal como pelo menos 40 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 70 minutos, pelo menos 80 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos
100 minutos, pelo menos 110 minutos ou pelo menos 120 minutos e menos do que 48 horas, tal como menos do que 40 horas, menos do que 36 horas, menos do que 30 horas, menos do que 24 horas, menos do que 20 horas, menos do que 12 horas, menos do que 10 horas, menos do que 8 horas, menos do que 6 horas, menos do que 5 horas, menos do que 4 horas, menos do que 3 horas. Em uma modalidade, o tempo de retenção total no sistema de lavagem de fibra está entre 35 minutos e 48 horas, tal como entre 35 minutos e 24 horas, 35 minutos e 12 horas, 35 minutos e 6 horas, 35 minutos e 5 horas, 35 minutos e 4 horas, 35 minutos e 3 horas, 35 minutos e 2 horas, 45 minutos e 48 horas, 45 minutos e 24 horas, 45 minutos e horas, 45 minutos e 6 horas, 45 minutos e 5 horas, 45 minutos e 4 horas, 45 minutos e 3 horas, 45 minutos e 2 horas, 1 a 48 horas, 1 a 24 horas, 1 a 12 horas, 1 a 6 horas, 1 a 5 horas, 1 a 4 horas, 1 a 3 horas, 1 a 2 horas.
[090] Em uma modalidade, o sistema de lavagem de fibra compreende:
[091] - uma pluralidade de unidades de triagem (S1...S4) que estão conectadas de modo fluido em uma configuração de lavagem de contracorrente; em que cada unidade de triagem é configurada para separar uma corrente de líquido e massa de grão de milho em duas frações: uma primeira fração (s) e uma segunda fração (f), em que a dita segunda fração (f) contém uma quantidade maior medida em % em peso do que a primeira fração (s);
[092] - um espaço (V) disposto no sistema e que está conectado de modo fluido para receber a dita primeira fração (s), em que a dita segunda fração (f), ou uma primeira e segunda frações mistas (s,f), de preferência, uma segunda fração (f), e configurado para fornecer um tempo de incubação para uma ou ambas as frações recebidas no espaço; e saída da assim incubada uma ou ambas as frações para uma unidade de triagem a jusante (S4),
[093] em que o sistema é configurado para
[094] - entrada de líquido e massa de grão de milho na unidade de triagem mais a montante (S1)
[095] - saída da primeira fração (s1) da unidade de triagem mais a montante (S1) como uma corrente de produto contendo amido,
[096] - entrada de água de processo, de preferência, disposta para entrada de água de processo em uma unidade de triagem mais a jusante (S4),
[097] - saída da segunda fração (f4) da unidade de triagem mais a jusante (S4) como uma massa de grão de milho lavada contendo uma quantidade menor de amido e glúten do que a massa de grão de milho original.
[098] - introdução de enzimas hidrolíticas no sistema.
[099] A Figura 1 ilustra esquematicamente uma modalidade de um sistema de lavagem de fibra conforme descrito acima. Conforme ilustrado na Figura 1, o sistema de lavagem de fibra compreende uma pluralidade de unidades de triagem S1, S2, S3, S4 que estão conectadas de modo fluido em uma configuração de lavagem contracorrente. "Conectado de modo fluido" significa tipicamente que as unidades de triagem estão conectadas com o uso de linhas de fluxo, tal como canos para transportar matéria entre as unidades de triagem. Cada uma das unidades de triagem S1 a S4 é configurada para separar uma corrente de líquido e massa de grão de milho em duas frações: uma primeira fração s (s1, s2, s3, s4) e uma segunda fração f (f1, f2, f3, f4). Conforme o versado na técnica entenderá, o número de primeiras frações produzidas no sistema de lavagem de fibra depende do número de unidades de triagem incluídas no sistema. O número de unidades de triagem no sistema é, de preferência, entre 2 a 8, e, em tais modalidades, o número de primeiras e segundas frações estará também entre 2 a 8. As unidades de triagem são tipicamente configuradas de modo que a matéria sólida seja separada em uma corrente separada, de modo que a segunda fração f contenha uma quantidade maior medida em % em peso de fibra do que a primeira fração s. Na Figura, a notação "s", de preferência, refere-se a uma corrente sem fibra (contendo amido) e a notação "f", de preferência, refere-se a uma corrente contendo fibra. O índice emfes refere-se à origem da corrente. Nota-se que, embora seja preferencial que as primeiras frações s não contenham qualquer fibra, isso pode ser, em uma configuração prática, difícil de atingir.
[0100] O fluxo no sistema tem uma direção a jusante e uma direção a montante: cada unidade de triagem; por exemplo, unidade de triagem S3, recebe uma corrente; por exemplo, f2, de uma unidade de triagem a montante, por exemplo, S2 e entrega uma corrente; por exemplo, s3, à unidade de triagem a montante; por exemplo, S2. Similarmente, a unidade de triagem S3 recebe uma corrente s4 de uma unidade de triagem a jusante S4 e entrega uma corrente f3 à unidade de triagem a jusante S4.
[0101] Conforme ilustrado na Figura 1, a água de processo, que é tipicamente água que é usada como água de lavagem no sistema, é fornecida à unidade de triagem mais a jusante S4, e a água de processo é tipicamente água não contendo fibra. À massa de grão de milho é tipicamente uma suspensão líquida (tipicamente uma suspensão em água), fornecida na unidade de triagem mais a montante S1. Isso é indicado na figura 1 pela seta identificada como "Da moagem". Assim, e pela conexão fluida entre as unidades de triagem, a massa de grão de milho e as frações f da mesma fluem a jusante no sistema e a água de processo se movo a montante no sistema. Assim, a configuração fluida no sistema pode ser vista conforme a massa de grão de milho é lavada na unidade de triagem mais a jusante S1 por um fluido contendo alta quantidade de amido e na unidade de triagem mais a jusante S4 lavada por um fluido contendo baixa quantidade de amido. Ademais, a massa de grão de milho na unidade de triagem mais a jusante S1 contém uma quantidade maior de amido do que a fração f da massa de grão de milho na unidade de triagem mais a montante S4.
[0102] Um objetivo de usar o sistema de lavagem de fibra descrito acima é fornecer um tempo de contato de pelo menos 35 minutos, tal como pelo menos 40 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 70 minutos, pelo menos 80 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos 100 minutos, pelo menos 110 minutos ou pelo menos 120 minutos, entre massa de grão de milho ou frações da mesma e enzimas no sistema, a fim de aumentar a eficiência da remoção do amido da fibra. O tempo de contato/tempo de retenção entre enzimas e massa de grão de milho ou frações da mesma no sistema de lavagem de fibra é também denominado como tempo de retenção. O tempo de contato/tempo de retenção entre enzimas e massa de grão de milho ou frações da mesma no espaço (V) é denominado como tempo de incubação.
[0103] Em uma modalidade, o tempo de incubação no dito espaço (V) configurado no sistema de lavagem de fibra é pelo menos 5 minutos, tal como pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 20 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 70 minutos, pelo menos 80 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos 100 minutos, pelo menos 110 minutos ou pelo menos 120 minutos e menos do que 48 horas, tal como menos do que 40 horas, menos do que 36 horas, menos do que 30 horas, menos do que 24 horas, menos do que 20 horas, menos do que 12 horas, menos do que 10 horas, menos do que 8 horas, menos do que 6 horas, menos do que 5 horas, menos do que 4 horas, menos do que 3 horas.
[0104] Em uma modalidade, o tempo de incubação no dito espaço (V) está entre 35 minutos e 48 horas, tal como entre 35 minutos e 24 horas, 35 minutos e horas, 35 minutos e 6 horas, 35 minutos e 5 horas, 35 minutos e 4 horas, 35 minutos e 3 horas, 35 minutos e 2 horas, 45 minutos e 48 horas, 45 minutos e 24 horas, 45 minutos e 12 horas, 45 minutos e 6 horas, 45 minutos e 5 horas, 45 minutos e 4 horas, 45 minutos e 3 horas, 45 minutos e 2 horas, 1 a 48 horas, 1 a 24 horas, 1 a 12 horas, 1 a 6 horas, 1 a 5 horas, 1 a 4 horas, 1 a 3 horas, 1 a 2 horas.
[0105] Em uma modalidade, a temperatura de incubação no dito espaço (V) está entre 25 e 95 ºC, tal como entre 25 e 90 ºC, 25 e 85 ºC, 25 e 80 ºC, 256 75ºC,25e70 ºC, 25 e 65 ºC, 25 e 60 ºC, 25 e 55 ºC, 25 e 53 ºC, 25 e 52 ºC, 30 e 90 ºC, 30 e 85 ºC, e 80 ºC, 30 e 75 ºC, 30 e 70 ºC, 30 e 65 ºC, 30 e 60 “C, 30 e 55 ºC, 30 e 53 ºC, 30 e 52ºC,35 e 90 “ºC, 35 e 85 ºC, 35 e 80 ºC, 35 e 75 ºC, 35 e 70 ºC, 35 e 65 ºC, 35 e 60
ºC, 35 e 55 ºC, 35 e 53 ºC, 35 e 52 ºC, 39 e 90 ºC, 39 e 85 ºC, 39 e 80 ºC, 39 e 75ºC, 39 e 70 ºC, 39 e 65 ºC, 39 e 60 ºC, 39 e 55 ºC, 39 e 53 ºC, 39 e 52ºC.
[0106] Mostrou ser vantajoso adicionar enzimas na posição que está mais a montante de uma unidade de triagem mais a jusante S1 e a jusante de uma unidade de triagem mais a montante S4; na modalidade da figura 1, a adição de enzimas é ilustrada como ocorrendo na posição fluida da unidade de triagem S3 (ilustrada pela seta na figura 1 identificada como "Enzimas".
[0107] Adicionando-se as enzimas em um ponto ideal no sistema de lavagem de fibra, o tempo de retenção pode ser prolongado, o que pode aumentar a eficiência da remoção ou separação de amido da fibra. A fim de fornecer um tempo de retenção mais longo que aquele fornecido por um moinho típico, um espaço V (não mostrado na figura 1) pode ser disposto no sistema e ser conectado de modo fluido para receber uma das ditas primeiras frações s, uma das ditas segundas frações f ou uma primeira e uma segunda frações mistas s, f, de preferência, apenas uma segunda fração f, e configurado para fornecer um tempo de incubação para uma ou ambas as frações recebidas no espaço; e saída da fração ou frações assim incubadas para uma unidade de triagem a jusante S4. Nota-se que, embora possa ser preferencial ter uma unidade incubadora separada disposta no sistema, as linhas de fluxo que conectam as unidades de triagem podem ser também usadas para fornecer o espaço.
[0108] De acordo com as modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 2 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente entre a primeira e a segunda unidades de triagem ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 2.
[0109] De acordo com as modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 3 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente na segunda unidade de triagem ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 3, com máxima preferência, na unidade de triagem 2, ou um espaço configurado entre a unidade de triagem 2 e 3.
[0110] De acordo com as modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 4 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente na segunda ou na terceira unidade de triagem ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 4, com máxima preferência, na unidade de triagem 2, ou um espaço configurado entre a unidade de triagem 2 e 3.
[0111] De acordo com as modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 5 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente na segunda, terceira ou quarta unidade de triagem, ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 5, com máxima preferência, na unidade de triagem 3 ou um espaço configurado entre a unidade de triagem 3 e 4.
[0112] De acordo com as modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 6 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente na segunda, terceira, quarta ou quinta unidade de triagem ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 6, com máxima preferência, na unidade de triagem 4, ou um espaço configurado entre a unidade de triagem 4 e 5.
[0113] De acordo com modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 7 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente na segunda, terceira quarta, quinta ou sexta unidade de triagem ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 7, com máxima preferência, na unidade de triagem 4, ou um espaço configurado entre a unidade de triagem 4 e 5.
[0114] De acordo com as modalidades em que o sistema de lavagem de fibra compreende 8 unidades de triagem, a dosagem ocorre preferencialmente na segunda, terceira, quarta, quinta, sexta ou sétima unidade de triagem, ou em um espaço configurado entre a unidade de triagem 1 e a unidade de triagem 8, com máxima preferência, na unidade de triagem 5 ou um espaço configurado entre a unidade de triagem 5e 6.
[0115] Assim, um sistema de acordo com as modalidades preferenciais da invenção é configurado para
[0116] - entrada de líquido e massa de grão de milho na unidade de triagem mais a montante S1, de preferência, compreendendo uma entrada para o sistema que alimenta a matéria à unidade de triagem mais a montante S1;
[0117] - saída da primeira fração s1 da unidade de triagem mais a montante S1 como uma corrente de produto contendo amido, de preferência, compreendendo uma saída da unidade de triagem mais a montante que alimenta uma corrente sem fibra fora do sistema;
[0118] - entrada de água de processo, de preferência, disposta para entrada de água de processo em uma unidade de triagem mais a jusante S4; a entrada de água de processo é, de preferência, uma entrada para a unidade de triagem mais a jusante S4;
[0119] - saída da segunda fração f4 da unidade de triagem mais a jusante S4 como uma massa de grão de milho lavada contendo uma quantidade menor de amido e glúten do que a massa de grão de milho original; de preferência, compreendendo uma saída da unidade de triagem mais a jusante.
[0120] O sistema é também configurado para introduzir enzimas hidrolíticas no sistema, que pode ser uma entrada disposta em uma posição preferencial para permitir o contato entre a massa de grão de milho ou frações da mesma e a uma ou mais enzimas hidrolíticas.
[0121] É feita referência à figura 2 que ilustra esquematicamente uma modalidade adicional de um sistema de acordo com a presente invenção. A mesma notação conforme usada na figura 1 é usada na figura 2. Conforme apresentado na figura 2, todas as unidades de triagem S1 a S4 compreendem um elemento de triagem (tela) indicado por uma linha pontilhada oblíqua dentro das unidades de triagem. Essa linha pontilhada oblíqua ilustra um dispositivo configurado para separar uma fração f contendo fibra e um fração que, de preferência, não contém qualquer fibra; isso poderia, por exemplo, ser fornecido por um filtro de banda ou um filtro em geral disposto dentro das partes de parede que definem um espaço vazio interno de uma unidade de triagem.
[0122] Na modalidade mostrada na figura 2, as várias frações a serem misturadas são ilustradas como sendo misturadas fora das unidades de triagem S1 a S4. Entretanto, as mesmas podem ser misturadas dentro das unidades de triagem.
[0123] Conforme também ilustrado na figura 2, o espaço V é um recipiente separado que é conectado de modo fluido à unidade de triagem S3 de modo que a unidade de triagem S3 receba fluido com fibra e enzimas após o fluido com fibra e enzimas ter tido um tempo de incubação no espaço V. Conforme esquematicamente ilustrado na figura 2, o espaço V pode ter placas defletoras para assegurar que o fluido não flua em uma linha reta da entrada para a saída do recipiente, que poderia, de outro modo, encurtar o fluxo para fornecer um tempo de incubação.
[0124] A figura 2 também ilustra que as enzimas são aplicadas às correntes f2 e s4 que entram no espaço V. Na modalidade mostrada, as enzimas são dosadas por uma bomba dosadora 10 ilustrada esquematicamente como uma bomba de pistão acionada por um virabrequim em que a quantidade de enzimas dosada é controlada pela rotação do virabrequim (válvulas de entrada e de saída de um sentido estão presentes no cilindro ou cabeçote do cilindro, mas não são ilustradas).
[0125] Assim, um sistema de acordo com a presente invenção é, de preferência, configurado para introduzir enzimas hidrolíticas na dita primeira fração (s), e/ou na dita segunda fração (f), e/ou em uma primeira e segunda frações mistas e/ou na corrente de água de processo abastecida ao sistema.
[0126] O número de unidades de triagem S pode ser selecionado de acordo com, por exemplo, a capacidade volumétrica para separação em duas correntes e/ou outros objetivos de projeto. Entretanto, um sistema de acordo com a presente invenção terá, em geral, uma unidade de triagem mais a montante, uma unidade de triagem mais a jusante e, de preferência, uma ou mais unidades de triagem intermediárias fluídicas dispostas entre as unidades de triagem mais a montante e mais a jusante. Ou seja, com referência às figuras | e 2, um sistema preferencial compreenderá uma unidade de triagem mais a montante S1 e uma unidade de triagem mais a jusante S4 e diversas unidades de triagem (por exemplo, 2) dispostas entre as mesmas, em que disposto entre refere-se a estar conectado de modo fluido conforme ilustrado nas figuras 1 e 2.
[0127] Em detalhes, a configuração de lavagem de contracorrente conectada de modo fluido, conforme revelado nas figuras 1 e 2, tipicamente compreendendo a pluralidade de unidades de triagem S1...S4 que estão dispostas de uma maneira que: (a) uma segunda fração f1 produzida por uma unidade de triagem a montante S1 seja misturada com uma primeira fração s3 produzida por uma unidade de triagem a jusante S3, e em que as ditas frações mistas são separadas por uma unidade de triagem S2, que é intermediária entre as ditas unidades de triagem a montante e a jusante S1, S3, em uma primeira fração s2 e uma segunda fração f2.
[0128] Embora essa revelação seja realizada em relação à unidade de triagem S3, a mesma descrição pode se aplicar a quaisquer unidades de triagem intermediárias, tal como a tela S2, ou outras unidades de triagem intermediárias, em que a unidade de triagem intermediária refere-se a uma unidade de triagem que está disposta a jusante da unidade de triagem mais a montante e a montante de uma unidade de triagem mais a jusante.
[0129] Conforme ilustrado na figura 2, é, em algumas modalidades, preferencial que a mistura de uma segunda fração f1 e uma primeira fração s3 ocorra antes de ser inserida em uma unidade de triagem intermediária S2. Tal mistura pode ser fornecida por entrada das duas frações em uma câmara de mistura que compreende meios de agitação que fornecem tipicamente uma agitação vigorosa do fluido ou a mistura pode ser fornecida por uma tubulação que tem uma entrada para cada corrente e uma saída para a corrente mista.
[0130] Como uma alternativa à mistura antes de ser inserida em uma unidade de triagem, a mistura de uma segunda fração f1 e uma primeira fração 3 pode ocorrer dentro de uma unidade de triagem intermediária S2. Isso pode ser, por exemplo, realizado pelo interior da unidade de triagem que está equipada com um meio de agitação que fornece tipicamente uma agitação vigorosa do fluido dentro da unidade de triagem.
[0131] Embora as modalidades reveladas nas figuras 1 e 2 sejam mostradas compreendendo mais de duas unidades de triagem, um sistema é considerado como estando completamente operacional com apenas duas unidades de triagem. Assim, é, de modo geral, preferencial que o sistema compreenda 2 a 8 unidades de triagem tipicamente dispostas conforme ilustrado na figura 1 ou 2.
[0132] Ademais, a dimensão do espaço (em m?) é, de preferência, configurada para fornecer um tempo de incubação de pelo menos pelo menos 5 minutos, tal como pelo menos 10 minutos, pelo menos 15 minutos, pelo menos 20 minutos pelo menos 25 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 35 minutos, pelo menos 40 minutos, pelo menos 45 minutos, pelo menos 50 minutos, pelo menos 55 minutos, pelo menos 60 minutos, pelo menos 70 minutos, pelo menos 80 minutos, pelo menos 90 minutos, pelo menos 100 minutos, pelo menos 110 minutos, pelo menos 120 minutos. O espaço (V) designado para incubação tem, de preferência, um volume de pelo menos 30 m?, pelo menos 40 m?, pelo menos 50 m?, pelo menos 60 m?, pelo menos 70, m?, pelo menos 80, m?, pelo menos 90, m?, pelo menos 100 m?, pelo menos 110 m?, pelo menos 120 m?, pelo menos 130 m?, pelo menos 140 m?, pelo menos 150 m?, pelo menos 160 mº, pelo menos 170 m?, pelo menos 180 m?, pelo menos 190 m?, pelo menos 200 mº, pelo menos 210 m?, pelo menos 220 m?, pelo menos 230 m?, pelo menos 240 m?, pelo menos 250 m?, pelo menos 260 m?, pelo menos 270 m?, pelo menos 280 m?, pelo menos 290 m?, pelo menos 300 m?, pelo menos 400 m? ou pelo menos 500 m?. O tempo de incubação pode também estar em mais do que um espaço V com um volume total ou combinado de pelo menos 100 m?, pelo menos 110 m?, pelo menos 120 m?, pelo menos 130 m?, pelo menos 140 m?, pelo menos 150 m?, pelo menos 160 m?, pelo menos 170 m?, pelo menos 180 m?, pelo menos 190 m?, pelo menos 200 m?, pelo menos 210 mº, pelo menos 220 m?, pelo menos 230 m?, pelo menos 240 m?, pelo menos 250 mº, pelo menos 260 m?, pelo menos 270 m?, pelo menos 280 m?, pelo menos 290 m?, pelo menos 300 mº?, pelo menos 400 m?, pelo menos 500 mº?.
[0133] Durante o tempo de incubação, é preferencial que o fluido recebido no espaço V não seja peneirado. Assim, o fluido que deixa o espaço V tem a mesma composição, por exemplo, de amido e fibra, que o fluido recebido no espaço V, embora o mesmo, de preferência, contenha uma proporção mais alta de amido que foi liberada das fibras.
[0134] Para assegurar o contato íntimo entre as enzimas e a fibra, pode ser preferencial configurar o espaço V para agitação de matéria contida no dito espaço V, tal como compreendendo um rotor ou hélice.
[0135] Conforme ilustrado na figura 2, é preferencial dispor o espaço V a jusante da unidade de triagem mais a montante S1 e a montante da dita unidade de triagem mais a jusante S4; em particular, a modalidade da figura 2 ilustra que o espaço V é disposto para alimentar fluido para a segunda unidade de triagem mais a jusante S3.
[0136] Conforme revelado no presente documento, o espaço pode ser fornecido de maneira diferente e, conforme ilustrado na figura 2, o espaço V pode ser, de preferência, fornecido como uma unidade incubadora separada. A unidade incubadora pode ser configurada por linhas de fluido adequadas para receber uma primeira fração s, uma segunda fração f ou uma combinação de uma primeira e uma segunda fração s,f, de preferência, apenas uma segunda fração f, e entregar o material assim incubado a uma unidade de triagem a montante S3.
[0137] É feita referência à figura 3 que ilustra esquematicamente uma unidade de triagem com um incubador/espaço embutido V. Conforme ilustrado, a unidade de triagem/incubador que compreende, na extremidade inferior, um elemento de triagem 14 e, acima do mesmo, um espaço V. Dentro do espaço, placas defletoras estão dispostas para evitar atalho no fluxo de fluido da extremidade superior (que recebe a modalidade revelada das frações f1 e s3 da figura 3) em direção ao elemento de triagem
14. Conforme também ilustrado, a corrente sem fibra s2 é triada para fora, fornecendo uma fração contendo fibra f2.
[0138] A enzima usada na liberação do amido da massa de grão de milho tipicamente tem um intervalo térmico dentro do qual a liberação de enzima é mais eficiente e pode ser, portanto, mais vantajosa para poder controlar a temperatura nas posições selecionadas no sistema, tal como no espaço V. Para isso, um sistema de acordo com a presente invenção pode compreender, de preferência, elementos térmicos para fornecer uma temperatura de incubação do fluido dentro do dito espaço (V), de preferência, na faixa de 35 a 70 ºC, tal como na faixa de 40 a 60 ºC, tal como na faixa de 39 a 53 ºC, tal como na faixa de 45 a 53 ºC, tal como na faixa de 39 a 48 ºC, tal como 47 ºC. Na modalidade em que o espaço é fornecido como uma unidade de incubação separada (como na figura 2), os elementos térmicos podem estar dispostos dentro da unidade de incubação e/ou em uma carcaça que define o invólucro da unidade de incubação.
[0139] Os elementos térmicos são, de preferência, elementos de aquecimento/resfriamento com capacidade de termostato que são adaptados para medir a temperatura e alterar o fluxo de calor para dentro/fora do espaço para controlar a temperatura do material contido no espaço para que fique dentro de uma faixa predefinida.
[0140] Em algumas modalidades preferenciais, os elementos de aquecimento com capacidade de termostato que compreendem elementos de aquecimento/resfriamento elétricos ou elementos de aquecimento/resfriamento líquidos e sensores de temperatura.
[0141] Conforme apresentado no presente documento, a unidade de triagem fornece uma separação de fluido em duas frações s e f e a unidade de triagem tipicamente tria de uma maneira mecânica, em que uma ou mais, tais como todas as unidades de triagem, compreendem um ou mais elementos de triagem que têm aberturas (conforme ilustrado, por exemplo, na figura 2 com linhas pontilhadas oblíquas) configuradas para permitir a passagem de matéria sólida abaixo de um tamanho predefinido. O tamanho predefinido pode ser definido de acordo com diversos critérios de projeto. Entretanto, é tipicamente preferencial que nenhuma fibra seja permitida passar através da abertura. Por outro lado, uma abertura pequena pode ter uma tendência a se tornar bloqueada e, em muitos casos, o tamanho real das aberturas é selecionado considerando-se o aspecto de bloqueio e o aspecto de triagem, o que pode resultar em que quantidades menores de fibras sejam permitidas passar através das mesmas.
[0142] Em algumas modalidades preferenciais, uma ou mais, tais como todas as, unidades de triagem compreendem pá de rotor e/ou peneiras configuradas para fornecer as ditas duas frações s, f. Como uma alternativa aos elementos de triagem constituídos pelas aberturas, uma ou mais, tais como todas as, unidades de triagem podem ser hidrociclones 16, conforme ilustrado esquematicamente na figura 4.
[0143] Conforme revelado acima, o sistema é configurado para introduzir enzimas hidrolíticas na dita primeira fração s e/ou na dita segunda fração f e/ou em uma primeira e segunda frações mistas e/ou na água de processo, por meio de um dispositivo de dosagem — consultar a figura 2.
[0144] Tal dispositivo de dosagem é tipicamente adaptado para fornecer uma quantidade de dosagem controlável de enzimas, de preferência, de acordo com uma razão específica predeterminada entre a quantidade de enzimas e alimentação de massa de grão de milho ao sistema. Para realizar o mesmo, o dispositivo de dosagem poderia ser uma bomba medidora, conforme ilustrado por uma bomba de pistão na figura 2.
[0145] Alternativamente, o dispositivo de dosagem pode ser um dispensador de fluxo por gravidade que tem uma válvula de efluxo controlável configurada para controlar a quantidade de enzima que flui através da válvula de fluxo.
[0146] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH5 da presente invenção tem atividade de xilanase.
[0147] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH30 da presente invenção tem atividade de xilanase.
[0148] Em uma modalidade, o polipeptídeo GH5 da presente invenção tem uma quantidade de atividade de xilanase que é suficiente para liberar uma quantidade de amido e glúten que é pelo menos 15% (p/p) de matéria seca de fibra, tal como pelo menos 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 21% ou pelo menos 22% (p/p) da matéria seca de fibra, em um procedimento que compreende as etapas de:
i. Fornecer uma amostra de fibra prensada a partir de uma usina de moagem a úmido de milho; li. Ressuspender a amostra em tampão (pH 4, Acetato de Na 0,02 M) para fornecer uma pasta fluida contendo 5% de sólidos secos.
li. Adicionar polipeptídeco GH5 à pasta fluida em quantidades que correspondem a 35 ug de proteína enzimática (EP) por g de substrato de sólidos secos, tal como 70 ug de proteína enzimática (EP) por g de substrato de sólidos secos, em combinação com enzimas celulolíticas em uma quantidade que corresponde a 280 ug de proteína enzimática (EP) por g de substrato de sólidos secos; iv. Incubação de amostra a uma temperatura de 40 ou 52 “*C em um incubador aquecido a ar com agitação constante por 120 minutos.
v. Resfriamento rápido de amostra em água gelada (5 ºC) antes do processamento vi. Transferência de pasta fluida para uma peneira de 150 mícrons e coleta de filtrado que passa através da mesma.
vii. Pressionamento de fibra de retenção na peneira e coleta de filtrado que passa através da mesma, combinando o filtrado coletado com o primeiro filtrado.
viii. Transferência de fibra prensada para um béquer contendo 200 ml de água e agitação da mistura.
ix. Transferência da pasta fluida para uma peneira de 150 mícrons e coleta de filtrado que passa através da mesma, combinando o filtrado coletado com o primeiro filtrado.
x. Pressionamento de fibra de retenção na peneira e coleta de filtrado que passa através da mesma, combinando o filtrado coletado com o primeiro filtrado.
xi. Repetição da etapa viii a x mais uma vez.
xii. Filtragem a vácuo de filtrado combinado através de um micro papel de filtro de vidro (Whatman) que retém os sólidos insolúveis que foram liberados da fibra que passou através da peneira de 150 mícrons.
xiii. Passagem de 200 ml de água sobre o papel de filtro para remover quaisquer solúveis residuais xiv. Secagem e ponderação dos sólidos insolúveis totais retidos no papel de filtro, relatados como amido e glúten liberados (p/p) de matéria seca de filtro.
[0149] Em uma modalidade, o polipeptideco GH5 da presente invenção compreende, ainda, uma ou mais das seguintes atividades: atividade de endo-B-1,4- glucanase/celulase (EC 3.2.14), atividade de endo-B-1,4-xilanase (EC 3.2.1.8), atividade de B-glicosidase (EC 3.2.1.21), atividade de B-manosidase (EC 3.2.1.25), atividade de B-glucosilceramidase (EC 3.2.1.45), atividade de glucano B-1,3-glicosidase
(EC 3.2.1.58), atividade de liqueninase (EC 3.2.1.73), atividade de exo-B-1,4- glucanase/celodextrinase (EC 3.2.1.74), atividade de glucano endo-1,6-B-glicosidase (EC 3.2.1.75), atividade de manana endo-B-1,4-manosidase (EC 3.2.1.78), atividade de celulose B-1,4-celobiosidase (EC 3.2.1.91), atividade de esteril B-glicosidase (EC
3.2.1.104), atividade de endoglicoceramidase (EC 3.2.1.123), atividade de quitosanase (EC 3.2.1.132), atividade de B-primeverosidase (EC 3.2.1.149), atividade de endo-B-1,4- glucanase específica para xiloglucano (EC 3.2.1.151), atividade de endo-B-1,6- galactanase (EC 3.2.1.164), atividade de hesperidina 6-O-a-L-ramnosil-B-glicosidase (EC 3.2.1.168), atividade de B-1,3-mananase (EC 3.2.1.-) e atividade de endo-B-1,4- xilanase específica para arabinoxilano (EC 3.21.) e arabinoxilano manana transglicosilase (EC 2.4.1.-).
[0150] Em uma modalidade, o polipeptideco GH30 da presente invenção compreende, ainda, uma ou mais dentre as seguintes atividades: atividade de endo-B- 1,4-xilanase (EC 3.2.1.8), atividade de B-glicosidase (EC 3.2.1.21), atividade de B- glicuronidase (EC 3.2.1.31), atividade de B-xilosidase (EC 3.2.1.37), atividade de B- fucosidase (EC 3.2.1.38), atividade de glucosilceramidase (EC 3.2.1.45), atividade de B-1,6-glucanase (EC 3.2.1.75), atividade de glucuronoarabinoxilano endo-B-1,4- xilanase (EC 3.2.1.136), atividade de endo-B-1,6-galactanase (EC:3.2.1.164) e atividade de B-xilosidase [extremidade redutora] (EC 3.2.1.-).
[0151] Em uma modalidade, o polipeptíideo GH5 da presente invenção é selecionado dentre um grupo que consiste em: (a) Um polipeptídeo maduro da sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 a 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; (b) Um polipeptídeo maduro, que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro em i), tal como pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.
(c) Uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros em i) e ii); de preferência, a subsequência tem atividade de xilanase
[0152] Em uma modalidade, o polipeptíideo GH30 da presente invenção é selecionado dentre um grupo que consiste em:
[0153] Um polipeptídeo maduro da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7;
1. ii) Um polipeptídeo maduro, que tem pelo menos 60% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro em i), tal como pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência.
(b) Uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros em i) e ii); de preferência, a subsequência tem atividade de xilanase
[0154] O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, tal como processamento N-terminal, truncamento C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc.
[0155] Em uma modalidade, o polipeptideco maduro da SEQ ID NO: 1 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 655. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 28 a 655 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 1 a 27 da SEQ ID NO: 1 que são um peptídeo de sinalização. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 36 a 655 da SEQ ID NO: 1, aminoácidos 28 a 35 da SEQ ID NO: 1 que são uma etiqueta his. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 37 a 655 da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 40 a 655 da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 45 a 655 da SEQ ID NO: 1.
[0156] Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 555 da SEQ ID NO:
2. Em uma modalidade, o polipeptideio maduro da SEQ I|D NO: 2 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 7 a 555 da SEQ ID NO: 2, aminoácidos 1 a 6 da SEQ ID NO: 2 que são uma etiqueta his. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 10 a 555 da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 15 a 555 da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 20 a 555 da SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 30 a 555 da SEQ ID NO: 2.
[0157] Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 3 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 585 da SEQ ID NO:
3. Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ |D NO: 3 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 28 a 585 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 1 a 27 da SEQ ID NO: 3 que são um peptídeo de sinalização. Em uma modalidade o polipeptidio maduro da SEQ I|D NO 3 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 36 a 585 da SEQ ID NO: 3, aminoácidos 28 a 35 da SEQ ID NO: 3 que são uma etiqueta his. Em uma modalidade, o polipeptíideo maduro da SEQ ID NO: 3 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 37 a 585 da SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 40 a 585 da SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 45 a 585 da SEQ ID NO: 3.
[0158] Em uma modalidade, o polipeptíideo maduro da SEQ ID NO: 4 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 391 da SEQ ID NO:
4. Em uma modalidade, o polipeptideco maduro da SEQ I|D NO: 4 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 5 a 391 da SEQ ID NO:
4. Em uma modalidade, o polipeptideio maduro da SEQ I|D NO: 4 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 10 a 391 da SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o polipeptideco maduro da SEQ ID NO: 4 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 15 a 391 da SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 4 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 20 a 391 da SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, o polipeptideco maduro da SEQ ID NO: 4 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 30 a 391 da SEQ ID NO: 4.
[0159] Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 5 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 417 da SEQ ID NO:
5. Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ |D NO: 5 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 27 a 417 da SEQ ID NO: 5, aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 5 que são um peptídeo de sinalização.
[0160] Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 6 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 417 da SEQ ID NO:
6. Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 6 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 27 a 417 da SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 6 que são um peptídeo de sinalização.
[0161] Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 7 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 417 da SEQ ID NO:
7. Em uma modalidade, o polipeptideco maduro da SEQ I|D NO: 7 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 27 a 417 da SEQ ID NO: 7, aminoácidos 1 a 26 da SEQ ID NO: 7 que são um peptídeo de sinalização.
[0162] Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 8 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 557. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 8 a 557 da SEQ ID NO: 8, aminoácidos 1 a 7 da SEQ ID NO: 8 que são uma etiqueta his. Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 8 compreende/consiste/consiste essencialmente pelo menos nos aminoácidos 28 a 557 da SEQID NO: 8.
[0163] Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 576 da SEQ ID NO:
10. Em uma modalidade, o polipeptideo maduro da SEQ ID NO: 10 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 24 a 576 da SEQ ID NO: 10, aminoácidos 1 a 23 da SEQ ID NO: 10 que são um peptídeo de sinalização.
[0164] Em uma modalidade, o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12 compreende/consiste/consiste essencialmente nos aminoácidos 1 a 565 da SEQ ID NO:
12.
[0165] No contexto da presente invenção, o termo "subsequência" significa um polipeptídeo em que um ou mais (por exemplo, diversos) resíduos de aminoácidos estão ausentes do terminal amino (N) e/ou do terminal carbóxi (C) de um polipeptídeo maduro; em que a subsequência tem atividade de xilanase. Em algumas modalidades, o número de resíduos de aminoácido que estão ausentes em uma "subsequência” é no máximo 20, tal como no máximo 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,7, 6, 5,4, 3, 20u no máximo 1 resíduo de aminoácido.
[0166] Em algumas modalidades, uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 150 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 600 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 650 aminoácidos de comprimento.
[0167] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 1 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 600 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 650 aminoácidos de comprimento.
[0168] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 2 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento.
[0169] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 3 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 560 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 570 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 580 aminoácidos de comprimento.
[0170] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 4 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 150 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 360 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 370 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 380 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 390 aminoácidos de comprimento.
[0171] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 5 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 150 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 360 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 370 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 380 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 390 aminoácidos de comprimento.
[0172] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 6 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 150 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 360 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 370 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 380 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 390 aminoácidos de comprimento.
[0173] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 7 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 150 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 360 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 370 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 380 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 390 aminoácidos de comprimento.
[0174] Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 8 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 600 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 650 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 600 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 650 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, uma subsequência da SEQ ID NO: 12 dos polipeptídeos maduros pode ter pelo menos 200 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 250 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 300 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 350 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 400 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 450 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 500 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 550 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 600 aminoácidos de comprimento ou pelo menos 650 aminoácidos de comprimento.
[0175] Em uma modalidade, a composição enzimática que compreende uma ou mais enzimas hidrolíticas compreende, ainda, uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo que consiste em celulases (EC 3.2.1.4), xilanases (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55 (alfa-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora) celobio-hidrolase | (EC 3.2.1.150), celobio-hidrolase II (E.C. 3.2.1.91), celobiosidase
(E.C. 3.2.1.176), beta-glicosidase (E.C. 3.2.1.21), beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) e proteases (E.C 3.4).
[0176] Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas hidrolíticas são expressas em um organismo com um fundo de celulase, tal como Trichoderma reesei. De acordo com essas modalidades, os polipeptídeos GH5 e/ou GH30 definidos de acordo com a invenção são expressos juntamente com celulases endógenas de Trichoderma.
[0177] Em uma modalidade, a composição enzimática que compreende uma ou mais enzimas hidrolíticas pode compreender celulases expressas em Trichoderma reesei e outras enzimas hidrolíticas que são adicionadas à composição enzimática em uma forma purificada ou semipurificada.
[0178] Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas hidrolíticas são purificadas. As enzimas purificadas podem ser usadas em uma composição enzimática conforme descrito em outras modalidades da presente invenção.
[0179] Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas hidrolíticas estão em uma composição líquida. A composição pode ser homogênea ou heterogênea.
[0180] Em uma modalidade, a uma ou mais enzimas hidrolíticas estão em uma composição sólida.
[0181] Em uma modalidade, a quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas misturadas por adição com uma ou mais frações da dita massa de grão de milho está entre 0,005 a 0,5 kg de proteína enzimática (EP)/tonelada métrica (MT) de grãos de milho que entram no processo de moagem a úmido, tal como entre 0,010 a 0,5 kg de EP/MT de grão de milho, tal como entre 0,05 a 0,5 kg/MT de grão de milho ou 0,075 a 0,5 kg/MT ou 0,1 a 0,5 kg/MT de grão de milho ou 0,005 a 0,4 kg/MT de grão de milho ou 0,01 a 0,4 kg/MT de grão de milho ou 0,05 a 0,4 kg/MT de grão de milho ou 0,075 a 0,4 kg/MT de grão de milho ou 0,1 a 0,4 kg/MT de grão de milho ou 0,005 a 0,3 kg/MT de grão de milho ou 0,01 a 0,3 kg/MT de grão de milho ou 0,05 a 0,3 kg/MT de grão de milho ou 0,075 a 0,3 kg/MT ou 0,1 a 0,3 kg/MT de grão de milho ou 0,005 a 0,2 Kkg/MT de grão de milho ou 0,010 a 0,2 kg/MT de grão de milho ou 0,05 a 0,2 kg/MT de grão de milho ou 0,075 a 0,2 kg/MT ou 0,1 a 0,2 kg/MT de grão de milho ou tal como 0,075 a 0,10 kg/MT de grão de milho ou 0,075 a 0,11 kg/MT de grão de milho.
[0182] O tratamento enzimático de grãos de milho ou uma fração de grãos de milho com uma composição enzimática hidrolítica, que compreende pelo menos um polipeptídeo GH5 ou pelo menos um polipeptídeo GH30 ou uma combinação de pelo menos um GHB5 e pelo menos um polipeptídeo GH30, fornece produtos de amido de milho, glúten de milho e fibra de milho, que diferem dos produtos produzidos por outros métodos conhecidos na técnica.
[0183] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende amido de milho, em que a dita composição é obtenível pelo método da invenção.
[0184] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende glúten de milho, em que a dita composição é obtenível pelo método da invenção.
[0185] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição que compreende fibra de milho, em que a dita composição é obtenível pelo método da invenção.
[01868] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição enzimática que compreende um polipeptídeo GH30 isolado conforme definido no presente documento.
[0187] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição enzimática que compreende um polipeptídeo GH5 isolado conforme definido no presente documento.
[0188] Em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição enzimática que compreende um polipeptídeo GH30 isolado conforme definido no presente documento e um polipeptídeo GH5 isolado conforme definido no presente documento.
[0189] Em uma modalidade, a composição enzimática de acordo com a invenção, em que pelo menos uma das ditas enzimas hidrolíticas é selecionada dentre o grupo que consiste em um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GH5 ou uma combinação dos mesmos, compreende, ainda, uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo que consiste em celulases (EC 3.2.1.4), xilanases (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55 (alfa-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora) celobio-hidrolase | (EC 3.2.1.150), celobio-hidrolase 11 (E.C. 3.2.1.91), celobio-hidrolase (E.C. 3.2.1.176), beta-glicosidase (E.C. 3.2.1.21), beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) ou proteases (E.C 3.4).
[0190] Nas modalidades preferenciais, a composição enzimática compreende celulase obtida a partir de uma cultura de Trichoderma reesei, tal como uma cultura de Trichoderma reesei ATCC 26921. As celulases adequadas estão disponíveis, por exemplo, junto à Novozymes A/S sob o nome comercial CelluclastO.
[0191] Outro aspecto da invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo GH30 em moagem a úmido de milho.
[0192] O polipeptídeo GH30 pode ser, em particular, um polipeptídeo conforme definido acima no presente documento. De preferência, a moagem a úmido de milho é realizada com o uso de um processo de moagem a úmido conforme definido acima.
[0193] Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um polipeptídeo GH5 em moagem a úmido de milho. O polipeptídeo GH5 pode ser, em particular, um polipeptídeo conforme definido acima no presente documento. De preferência, a moagem a úmido de milho é realizada com o uso de um processo de moagem a úmido conforme definido em qualquer parte acima.
[0194] Ainda outro aspecto da invenção fornece o uso de uma composição enzimática, conforme descrito acima, em moagem a úmido de milho, de preferência, em um processo de moagem a úmido de milho conforme definido acima.
[0195] De preferência, o polipeptídeo GH30, o polipeptídeo GH5 e/ou a composição enzimática, quando usados de acordo com a invenção, são usados para o propósito de aumentar o rendimento de amido e/ou o rendimento de glúten totais de grãos de milho em um processo de moagem a úmido.
[0196] Polipeptídeos Tendo Atividade de Xilanase (a) Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10.
(b) Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de xilanase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende os ou consiste nos aminoácidos 24 a 576 da SEQ ID NO: 10.
(c) Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados que têm uma identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12 de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, que têm atividade de xilanase. Em um aspecto, os polipeptídeos diferem em até 10 aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10, do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12.
(d) Um polipeptídeo da presente invenção preferencialmente compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou uma sua variante alélica; ou é um seu fragmento tendo atividade de xilanase. Em outro aspecto, o polipeptídeo compreende o ou consiste no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 12.
(e) Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo isolado que tem atividade de pectina liase codificado por um polinucleotídeo que tem uma identidade de sequências com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 ou a sequência de cDNA do mesmo de pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%.
(f) Em outra modalidade, a presente invenção se refere a variantes do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 que compreendem uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais (por exemplo, várias) posições. Em uma modalidade, o número de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos introduzidas no polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 é até 10, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. As mudanças de aminoácidos podem ter uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carboxila- terminais, tais como um resíduo de metionina amino-terminal; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.
(g) Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que geralmente não alteram a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova lorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/Val, Ala/Glu e Asp/Gly.
(h) Alternativamente, as mudanças de aminoácidos têm uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo e similares.
(1) Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura por alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244:
1.081 a 1.085). Na última técnica, são introduzidas mutações simples de alanina em todos os resíduos na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade para identificar resíduos de aminoácidos que são essenciais para a atividade da molécula. Consultar também, Hilton et a/., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4.699 a 4.708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons ou marcação por fotoafinidade, em conjunção com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Consultar, por exemplo, de Vos et a/., 1992, Science 255: 306 a 312; Smith et a/., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899 a 904; Wiodaver et a/., 1992, FEBS Lett. 309: 59 a 64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.
() Podem ser feitas e testadas substituições, deleções e/ou inserções únicas ou múltiplas de aminoácidos usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreamento relevante, tais como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53 a 57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2.152 a 2.156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição em fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10.832 a 10.837; patente nº U.S. 5.223.409; WO 92/06204), e mutagênese sítio- dirigida (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et a/., 1988, DNA 7: 127).
(Kk) Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de triagem automatizados, de elevada capacidade, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893 a 896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas a partir das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas com o uso de métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.
(1) O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.
(m) O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo de fusão clivável no qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando outro polipeptídeo a um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos, de modo que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do mesmo promotor (ou promotores) e terminador. Os polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et a/., 1993, EMBO J. 12: 2.575 a 2.583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776 a 779).
(n) Um polipeptídeo de fusão pode compreender, adicionalmente, um sítio de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de sítios de clivagem incluem, porém sem limitação, os sítios revelados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568 a 576; Svetina et a/., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3.488 a 3.493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al/., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et a/., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
[0197] Fontes de Polipeptídeos Com Atividade de Xilanase (a) Um polipeptídeo com atividade de xilanase da presente invenção pode ser obtido a partir de micro-organismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo “obtido a partir de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deverá significar que o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo a partir da fonte foi inserido. Em um aspecto, o polipeptídeo obtido a partir de uma dada fonte é secretado extracelularmente.
(b) O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo, tal como um polipeptídeo de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, ou Streptomyces que tem atividade de pectina liase, ou um polipeptídeo bacteriano Gram-negativo, tal como um polipeptídeo de Campylobacter, E. coli Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.
(c) Em um aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.
(d) Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
(e) Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.
(f) O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo fúngico. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo de levedura, tal como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia; ou um polipeptídeo fúngico filamentoso, tal como um polipeptídeo de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicilium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, — Rhizomucor, — Schizophyllum, — Scytalidium, —Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.
(g) Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.
(h) Em outro aspecto, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergilus — oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum,
Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
() Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção abrange tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.
() As cepas dessas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um certo número de coleções de cultura, tal como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
(k) O polipeptídeo pode ser identificado e obtido a partir de outras fontes incluindo microrganismos isolados a partir da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente a partir de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pode ser depois obtido por rastreamento semelhante de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez que um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tiver sido detectado com a sonda (ou sondas), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se técnicas que são conhecidas por aqueles de habilidade comum na especialidade (consultar, por exemplo, Sambrook et al/., 1989, supra).
[0198] Polinucleotídeos (a) A presente invenção se refere também a polinucleotídeos isolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção, como descrito no presente documento.
(b) As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento a partir de DNA genômico ou cDNA ou uma sua combinação. A clonagem dos polinucleotídeos a partir de DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, usando a bem conhecida reação em cadeia da polimerase
(PCR) ou rastreamento com anticorpos de bibliotecas de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com as mesmas características estruturais. Consultar, por exemplo, Innis et a/., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova lorque. Podem ser usados outros procedimentos de amplificação de ácidos nucleicos tais como reação em cadeia da ligase (LCR), transcrição ativada por ligação (LAT) e amplificação baseada em polinucleotídeos (NASBA).
(c) A modificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para sintetizar polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo se refere a formas do polipeptídeo não ocorrendo naturalmente. Esses polipeptídeos podem diferir, de algum modo manipulado, do polipeptídeo isolado de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem na atividade específica, termoestabilidade, pH ideal ou similares As variantes podem ser construídas com base no polinucleotídeo apresentado como a sequência de codificação do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 ou a sua sequência de cDNA, p.ex., uma sua subsequência, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeos que não resultam em uma mudança na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro pretendido para produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar origem a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituições de nucleotídeos, consultar, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95 a 107.
[0199] Construtos de Ácido Nucleico (a) A presente invenção se relaciona também com construtos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
(b) O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de maneiras para proporcionar a expressão do polipeptídeo. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando os métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.
(c) A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.
(d) Os exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos construtos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável em ácidos de Aspergillus niger, glucoamilase (g/aA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase | de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase |1l de Trichoderma reesei, endoglucanase | de Trichoderma reesei, endoglucanase || de Trichoderma reesei, endoglucanase Ill de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase | de Trichoderma reesei, xilanase || de Trichoderma reesei, xilanase Ill de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados e híbridos. Outros promotores são descritos na Patente nº US 6.011.147.
(e) A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. O terminador está operacionalmente ligado ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado na presente invenção.
(f) Os terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos a partir dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glicosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxisporum, beta-glicosidase de Trichoderma reesei, celobio-
hidrolase | de Trichoderma reesei, celobio-hidrolase || de Trichoderma reesei, endoglucanase | de Trichoderma reesei, endoglucanase |l de Trichoderma reesei, endoglucanase Ill de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase | de Trichoderma reesei, xilanase |l de Trichoderma reesei, xilanase Ill de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei e fator de alongamento da tradução de Trichoderma reesei.
(9) A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de MRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência de codificação de um gene que aumenta a expressão do gene.
(h) A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. O líder está operacionalmente ligado à terminação 5' do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquer condutor que seja funcional na célula hospedeira pode ser usado.
(i) Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da TAKA amilase de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.
() A sequência de controle pode ser também uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada à terminação 3' do polinucleotídeo e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mMRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira pode ser usada.
(k) As sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas a partir dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glicosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae e protease tipo tripsina de Fusarium oxisporum.
(1) A sequência de controle pode ser também uma região de codificação do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado à terminação N de um polipeptídeo e que direciona o polipeptídeo para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência de codificação do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência de codificação do peptídeo sinal naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da sequência de codificação que codifica o polipeptídeo. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência de codificação pode conter uma sequência de codificação do peptídeo sinal que é estranha à sequência de codificação. Uma sequência de codificação do peptídeo de sinalização estranha pode ser necessária quando a sequência de codificação não contém naturalmente uma sequência de codificação do peptídeo de sinalização. Alternativamente, uma sequência de codificação do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência de codificação do peptídeo sinal natural para intensificar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer sequência de codificação do peptídeo sinal que direcione o polipeptídeo expresso para a via secretora de uma célula hospedeira pode ser usada.
(m) As sequências de codificação do peptídeo de sinalização eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências de codificação do peptídeo de sinalização obtidas a partir dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.
(n) A sequência de controle pode ser também uma sequência de codificação do pró-peptídeo que codifica um pró-peptídeo posicionado na terminação N de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró- polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência de codificação de pró-peptídeo pode ser obtida a partir dos genes para protease alcalina de Bacillus subtilis (aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), lacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.
(o) Quando tanto o peptídeo sinal quanto as sequências de pró-peptídeo estão presentes, a sequência de pró-peptídeo é posicionada próxima ao terminal N de um polipeptídeo e a sequência de peptídeo sinal é posicionada próxima ao terminal N da sequência de pró-peptídeo.
(p) Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão do polipeptídeo em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sequências reguladoras são aquelas que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Em fungos filamentosos, pode ser usado o promotor de glicoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae e promotor de glicoamilase de Aspergillus oryzae, promotor de celobio-hidrolase | de Trichoderma reesei e promotor de celobio-hidrolase || de Trichoderma reesei. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem a amplificação do gene. Em sistemas eucariotas, essas sequências reguladoras incluem o gene de di-hidrofolato redutase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nesses casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora.
[0200] Vetores de Expressão (a) A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricionais e translacionais. As várias nucleotídeo e sequências de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em tais sítios. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expressado através da inserção do polinucleotídeo ou de um construto de ácido nucleico que compreende o polinucleotídeo em um vetor adequado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência de codificação é localizada no vetor de modo que a sequência de codificação seja ligada de modo operacional com as sequências de controle adequadas para a expressão.
(b) O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos de DNA recombinante e podem dar origem à expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.
(c) O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação — cromossômica, “por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o cromossomo (ou cromossomos) no qual foi integrado. Além do mais pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou um transpóson.
(d) O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam a seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.
(e) Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, porém sem limitação, adeA (fosforribosilaminoimidazol-
succinocarboxamida sintase), adeB (fosforribosil-aminoimidazol sintase), amdS (acetamidase), argB (ornitihta carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase) e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. São preferenciais para uso na célula de Aspergillus os genes amd'S e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus. Os genes adeA, adeB, amd'S, hph, e pyrG são preferenciais para uso em uma célula de Trichoderma.
(f) O marcador selecionável pode ser um sistema de marcador selecionável duplo conforme descrito no documento nº WO 2010/039889. Em um aspecto, o marcador selecionável duplo é um sistema de marcador selecionável duplo hph-tk.
(g) O vetor contém, preferencialmente, um elemento (ou elementos) que permite a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.
(h) Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionar a integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localização/localizações precisa/precisas no cromossomo (ou cromossomos). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter uma quantidade suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases e 800 a 10.000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência-alvo correspondente para potenciar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integrais podem ser qualquer sequência que seja homóloga à sequência-alvo no genoma da célula hospedeira. Para além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificadores ou codificadores. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
(i) Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediador da replicação autônoma que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” designa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.
() Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANS1 (Gems et a/., 1991, Gene 98: 61 a 67; Cullen et a/., 1987,
Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores que compreendem o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos revelados no documento nº WO 00/24883.
(k) Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de um polipeptídeo. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de, pelo menos, uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e, deste modo, cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.
(1) Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos por um versado na técnica (consultar, por exemplo, Sambrook et a/., 1989, supra).
[0201] Células Hospedeiras (a) A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, “compreendendo um polinucleotideco da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de um polipeptídeo da presente invenção. Um construto ou vetor que compreende um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de odo que o construto ou vetor seja mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante conforme anteriormente descrito. O termo “célula hospedeira” engloba qualquer descendência de uma célula de origem que não seja idêntica à célula de origem devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.
(b) A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. “Fungos”, como usado no presente documento, inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota e Zygomycota, bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8º edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).
(c) A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas das subdivisões Eumycota e Oomycota (como definidos por Hawksworth et a/., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico.
(d) A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.
(e) Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, = Neurospora crassa, Penicilium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
(f) As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 81: 1.470 a 1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para a transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al/., 1989, Gene 78: 147 a 156, e WO 96/00787.
[0202] Métodos de Produção (a) A presente invenção também se refere a métodos de produção de um polipeptídeo da presente invenção que compreendem (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante da presente invenção sob condições conducentes à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (b) recuperar o polipeptídeo.
(b) As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção do polipeptídeo com o uso de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser cultivadas por cultivo em frasco agitado ou fermentação em pequena escala ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, descontínuas, descontínuas alimentadas ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais em um meio adequado e sob condições permitindo que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado para o meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente a partir do meio. Se o polipeptídeo não for secretado pode ser recuperado a partir de lisados celulares.
(c) O polipeptídeo pode ser detectado usando métodos conhecidos na especialidade que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção incluem, mas sem limitação, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para se determinar a atividade do polipeptídeo.
(d) O polipeptídeo pode ser recuperado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado a partir do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação. Em um aspecto, um caldo de fermentação que compreende o polipeptídeo é recuperado.
(e) O polipeptídeo pode ser purificado por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (por exemplo, permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem e exclusão por tamanhos), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova lorque, 1989) para se obterem polipeptídeos substancialmente puros.
(f) Em um aspecto alternativo, o polipeptídeo não é recuperado, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando o polipeptídeo é usada como uma fonte do polipeptídeo.
[0203] Composições Enzimáticas (a) A presente invenção refere-se também a composições que compreendem um polipeptídeo da presente invenção.
(b) As composições podem compreender um polipeptídeo da presente invenção como o principal componente enzimático, por exemplo, uma composição monocomponente. Alternativamente, as composições podem compreender múltiplas atividades enzimáticas, tals como uma ou mais (por exemplo, várias) enzimas selecionadas dentre o grupo que consiste em hidrolase, isomerase, ligase, liase, oxidorreductase, ou transferase, por exemplo, uma alfa-galactosidase, alfa-glicosidase, aminopeptidase, amilase, beta-galactosidase, beta-glicosidase, beta-xilosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celobioidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, endoglucanase, esterase, glucoamilase, invertase, lacase, lipase, manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.
(c) As composições podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. As composições podem ser estabilizadas de acordo com métodos conhecidos na técnica.
MODALIDADES PREFERENCIAIS
[0204] A invenção é, ainda, descrita pelas seguintes modalidades numeradas: 1 Um método para melhorar o rendimento de amido e/ou rendimento de glúten de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, em que o método compreende misturar por adição grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho com uma composição de enzimas que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas, em que pelo menos uma das ditas enzimas hidrolíticas é selecionada dentre o grupo que consiste em um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GHB5 ou uma combinação dos mesmos.
2. O método, de acordo com a modalidade 1, em que a quantidade de amido e/ou glúten liberada da fibra durante o processo de moagem a úmido é aumentada.
3. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, que compreende as etapas de: a) embeber os grãos de milho em água para produzir grãos embebidos; b) triturar os grãos embebidos para produzir grãos embebidos e triturados; c) separar germes dos grãos embebidos e triturados para produzir uma massa de grãos de milho que compreende fibra, amido e glúten; e d) submeter a massa de grãos de milho resultante a um procedimento de lavagem de fibra.
4. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho serem misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas, antes, durante ou após a etapa d), de acordo com a modalidade 3.
5. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas durante a etapa d), de acordo com a modalidade 3,
6. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são permitidos reagir com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas por pelo menos 15 minutos.
7. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 3 a 6, em que o dito procedimento de lavagem de fibra compreende o uso de um sistema de lavagem de fibra otimizado para introdução de uma ou mais enzimas hidrolíticas e em que o sistema de lavagem de fibra compreende um espaço configurado para fornecer um tempo de retenção total no sistema de lavagem de fibra de pelo menos 35 minutos e menos de 48 horas.
8. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o tempo de incubação no dito espaço configurado no sistema de lavagem de fibra é pelo menos 5 minutos e menor que 48 horas.
9. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a temperatura de incubação está entre 25 ºC e 95 ºC.
10. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o dito polipeptídeo GH5 tem atividade de xilanase.
11. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o dito polipeptídeo GH30 tem atividade de xilanase.
12. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o dito polipeptídeo GH5 compreende, ainda, uma ou mais das seguintes atividades: atividade de endo-B-1,4-glucanase/celulase (EC 3.2.1.4) e/ou atividade de endo-B-1,4- xilanase (EC 3.2.1.8) e/ou atividade de B-glicosidase (EC 3.2.1.21) e/ou atividade de B- manosidase (EC 3.2.1.25) e/ou atividade de B-glucosilceramidase (EC 3.2.1.45) e/ou atividade de glucano B-1,3-glicosidase (EC 3.2.1.58) e/ou atividade de liqueninase (EC
3.2.1.73) e/ou atividade de exo-B-1,4-glucanase/celodextrinase (EC 3.2.1.74) e/ou atividade de glucano endo-1,6-B-glicosidase (EC 3.2.1.75) e/ou atividade de manana endo-B-1,4-manosidase (EC 3.2.1.78) e/ou atividade de celulose B-1,4-celobiosidase
(EC 3.2.1.91) e/ou atividade de esteril B-glicosidase (EC 3.2.1.104) ou atividade de endoglicoceramidase (EC 3.2.1.123) e/ou atividade de quitosanase (EC 3.2.1.132) e/ou atividade de B-primeverosidase (EC 3.2.1.149) e/ou atividade de endo-B-1,4-glucanase específica para xiloglucano (EC 3.2.1.151) e/ou atividade de endo-B-1,6-galactanase (EC 3.2.1.164) e/ou atividade de hesperidina 6-O-a-L-ramnosil-B-glicosidase (EC
3.2.1.168) e/ou atividade de B-1,3-mananase (EC 3.2.1.-) e/ou atividade de endo-B-1,4- xilanase específica para arabinoxilano (EC 3.2.1.-) e/ou arabinoxilano manana transglicosilase (EC 2.4.1.-).
13. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o dito polipeptídeo GH30 compreende, ainda, uma ou mais dentre as seguintes atividades: atividade de endo-B-1,4-xilanase (EC 3.2.1.8) e/ou atividade de B- glicosidase (EC 3.2.1.21) e/ou atividade de B-glicuronidase (EC 3.2.1.31) e/ou atividade de B-xilosidase (EC 3.2.1.37) e/ou atividade de B-fucosidase (EC 3.2.1.38) e/ou atividade de glucosilceramidase (EC 3.2.1.45) e/ou atividade de B-1,6-glucanase (EC
3.2.1.75) e/ou atividade de glucuronoarabinoxilano endo-fB-1,4-xilanase (EC 3.2.1.136) e/ou atividade de endo-B-1,6-galactanase (EC:3.2.1.164) e/ou atividade de B-xilosidase [extremidade redutora] (EC 3.2.1.-).
14. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo GH5 é selecionado dentre um grupo que consiste em:
[0205] Um polipeptídeo maduro da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1-3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12;
1. ii) Um polipeptídeo maduro, que tem pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeo maduro em i)
2. ii) Uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros emileii).
15. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o polipeptídeo GH30 é selecionado dentre um grupo que consiste em:
[0206] Um polipeptídeo maduro da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7; 1 ii) Um polipeptídeo maduro, que tem pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeo maduro em i)
2. ii) Uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros emileii).
16. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a dita composição enzimática que compreende uma ou mais enzimas hidrolíticas compreende, ainda, uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo que consiste em celulases (EC 3.2.1.4), xilanases (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55
(alfa-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora); EC 3.2.1.185 (beta-L- arabinofuranosidases de extremidade não redutora) celobio-hidrolase | (EC 3.2.1.150), celobio-hidrolase Il (E.C. 3.2.1.91), celobiosidase (E.C. 3.2.1.176), beta-glicosidase (E.C. 3.2.1.21), beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) ou proteases (E.C XXXX).
17. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a uma ou mais enzimas hidrolíticas são expressas em um organismo com um fundo de celulase, tal como Trichoderma reesei.
18. O método, de acordo com qualquer das modalidades anteriores, em que a uma ou mais enzimas hidrolíticas são purificadas.
19. O método, de acordo com qualquer das modalidades anteriores, em que a uma ou mais enzimas hidrolíticas está em uma composição líquida.
20. O método, de acordo com qualquer das modalidades anteriores, em que a uma ou mais enzimas hidrolíticas está em uma composição sólida.
21. O método, de acordo com qualquer das modalidades anteriores, em que a quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas misturada por adição com uma ou mais frações da dita massa de grão de milho está entre 0,005 a 0,5 kg de proteína enzimática/tonelada métrica de grãos de milho que entram no processo de moagem a úmido.
22. Uma composição que compreende fibra de milho, em que a dita composição é obtenível pelo método descrito em qualquer uma das modalidades 1 a 21.
23. Uso de um polipeptídeo GH30 e/ou um polipeptídeo GH5 em um método para melhorar o rendimento de e/ou o rendimento de glúten totais de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 21.
24. Um polipeptídeo isolado que tem atividade de xilanase selecionado dentre o grupo que consiste em: (b) um polipeptídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequências com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que tem pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11 ou a sua sequência de cDNA; (d) uma variante do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 que compreende uma substituição, deleção e/ou inserção em uma ou mais posições; e (e) um fragmento do polipeptídeo de (a), (b) ou (c) que tem atividade de pectina liase.
25. O polipeptídeo da modalidade 24 que tem pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12.
26. O polipeptídeo da modalidade 24 ou 25, que é codificado por um polinucleotídeo que se hibridiza sob condições de estringência médio-alta a condições de estringência muito alta com (i) a sequência de codificação de polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 11, (ii) a sua sequência de cDNA, ou (iii) o complemento de comprimento total de (i) ou (ii).
27. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 24 a 26, que é codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequências com a sequência de codificação do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12 ou sua sequência de cDNA.
28. O polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 24 a 27 que compreende ou consiste na SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO; 12; ou o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: O ou SEQ ID NO: 1.
29. Uma composição que compreende o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 24 a 28.
30. Um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo de qualquer uma das modalidades 24 a 28.
31. Um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende o polinucleotídeo da modalidade 30 ligado de maneira funcional a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
32. Uma célula hospedeira recombinante que compreende o polinucleotídeo da modalidade 30 operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que direcionam a produção do polipeptídeo.
33. Um método para produzir um polipeptídeo que tem atividade de xilanase que compreende as etapas de: a) cultivar a célula hospedeira da modalidade 32 sob condições apropriadas à produção do polipeptídeo; e, opcionalmente, (f) recuperar o polipeptídeo.
EXEMPLOS
[0207] Exemplo 1:
[0208] Nesse exemplo, a quantidade de amido e glúten separada da fibra, após incubação com e sem enzima, foi medida.
[0209] A amostra de fibra foi obtida a partir de uma usina de moagem a úmido após pressionamento de fibra com um teor de matéria seca total de 20%. A amostra foi ressuspensa em tampão (pH 4, Acetato de Na 0,02 M) a 100 g de pasta fluida contendo 5% de sólidos secos. A essa pasta fluida, enzima foi adicionada a uma taxa final de 350 ug por g de substrato de sólidos secos (DS). Consultar os detalhes da amostra na tabela
1.
Tabela 1
[0210] [0211] Te [0213] E [0214] | [0216] d D de mperatura nzimas H5º H30” Amostra [0212] (C | celulolíticas [0215] [0217] ( ) (vg de EP/g ug de EP/g pg de EP/g DS) DS) DS)
[0218] [0219] 40 [0220] 2 [0221] [0222] O [A “O NO So SS
[0223] [0224] 40 [0225] 2 [0226] [0227] 7 o o :
[0233] [0234] 52 [0235] 2 [0236] [0237] O 80 o
[0238] [0239] 52 [0240] 2 [0241] [0242] 7
NANA
[0243] [0244] 40 [0245] 2 [0246] [0247] 3 sc
[0248] [0249] 52 [0250] 3 [0251] [0252] O
CA
[0253] [0254] 40 [0255] 3 [0256] [0257] O sd A o Tabela 1: Temperatura e composição enzimática em cada amostra testada. *A composição de enzimas celulolíticas usadas é Celluclastê da Novozymes. “O polipeptídeo GH5 usado é o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 3. “O polipeptídeo GH30 usado é o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 4.
[0258] As amostras foram incubadas a uma temperatura de 52 ºC e 40 ºC (consultar a tabela 1) em um incubador aquecido a ar com agitação constante por 120 minutes. Após incubação, as amostras foram resfriadas rapidamente em água gelada
(5 ºC) antes do processamento. A pasta fluida foi transferida para uma peneira de 150 mícrons, enquanto era coletado o filtrado que passava através da mesma.
[0259] Afibra que era retida na peneira foi prensada com o uso de uma espátula para recuperar o máximo de filtrado possível. A fibra prensada foi, então, transferida para um béquer contendo 200 ml! de água e agitada. A pasta fluida foi passada através da peneira de 150 mícrons e o filtrado coletado foi combinado com a primeira. As etapas de pressionamento, lavagem e filtração acima foram repetidas mais uma vez, de modo que um filtrado final seja recuperado e combinado com os primeiros dois. O filtrado combinado foi, então, filtrado a vácuo, dessa vez através de um micro papel de filtro de vidro (Whatman) que retém os sólidos insolúveis que foram liberados da fibra e passado através da tela de 150 mícrons. Após passar 200 ml de água sobre o papel de filtro para remover qualquer traço de produtos solúveis, os sólidos insolúveis totais retidos no papel de filtro são secos e pesados. O peso seco é relatado como amido+glúten liberado como porcentagem (p/p) de matéria seca de fibra de substrato de partida. Os resultados são mostrados na tabela 2.
Tabela 2 [026 [0261] T [0262] Enzimas [0263] Amido+Glúte D de emperatura n Liberado (% (p/p) de Amostra matéria seca de fibra) 0ºC Enzimas celulolíticas 0ºC Enzimas celulolíticas 0ºC Enzimas 2ºC Enzimas celulolíticas 2ºC Enzimas celulolíticas 0ºC + Enzimas celulolíticas 2ºC celulolíticas 0ºC celulolíticas
[0296] O efeito de adição de enzima GH5 e/ou GH30 é evidente a partir do aumento em rendimentos de amido e glúten a 40 ºC e 52ºC.
[0297] Exemplo 2:
[0298] Enzimas:
[0299] GH30 xilanase A: GH30 xilanase derivada de Bacillus subtilis (SEQ ID NO:5)
[0300] GH30 Xilanase B: GH30 xilanase derivada de Bacillus subtilis (SEQ ID NO:6)
[0301] GH30 Xilanase C: GH30 xilanase derivada de Bacillus subtilis (SEQ ID NO:7)
[0302] Celluclast/Celluclast 1,51: Uma composição de celulase comercialmente disponível (Novozymes A/S, Dinamarca).
[0303] Um ensaio de 10 g de fibra foi realizado a pH 3,8, com incubação a 52 ºC por 1 hora e uma dosagem de 35 ug de proteína enzimática por grama de milho; com o uso de mesclas de enzimas contendo GH30 Xilanase A, GH30 Xilanase B ou GH30 Xilanase C, em combinação com Celluclast. As mesclas consistiram em 20% (p/p) de GH30 Xilanase A, GH30 Xilanase B ou GH30 Xilanase C, e os 80% restantes (p/p) de Celluclast. Para comparação, uma composição enzimática contendo apenas Celluclast foi incluída. Uma fibra de milho com 15,52% de amido residual e 12,00% de proteína residual em fibra foi usada como substrato no ensaio de fibra. A liberação de amido + glúten (substância seca) da fibra de milho na dosagem especificada foi medida; os resultados são fornecidos na tabela abaixo.
Tabela 3.
[0304] Tratamentos [0305] Dose [0307] Amido
[0306] (ug de + Glúten proteína enzimática/g de Recuperado milho)
[0311] Celluclast [0312] 35 [0313] 6,68% Jan > mm | SAO) SS SO
[0314] Celluclast+ [0315] 35 [0316] 8,66% E o]
[0317] Celluclast+ [0318] 35 [0319] 8,23% [amena | SS
[0320] Celluclast+ [0321] 35 [0322] 7,83%
[0323] A adição de GH30 Xilanase A, GH30 Xilanase B e GH30 Xilanase C em combinação com uma enzima celulase, tal como, Celluclast, pode aumentar significativamente o rendimento de amido + glúten em um processo de moagem a úmido de milho.
[0324] Exemplo 3: Tratamento de fibra por moagem a úmido em laboratório com GH5 Xilanase
[0325] Enzimas:
[0326] GHS5 Xilanase: GH5 21 xilanase derivada de Cryseobacterium sp., que tem a sequência de aminoácidos da proteína madura da SEQ ID NO: 8 (SEQ ID NO: 26 do documento nº WO 2016/005522).
[0327] Coquetel de enzimas D: consiste principalmente em celobio-hidrolases (CBH | e Il), de um doador exógeno, e endoglucanases (EG1 e 2) do hospedeiro Trichoderma nativo.
[0328] Coquetel de enzimas T: consiste principalmente (-80%) em celobio- hidrolases e endoglucanases do hospedeiro Trichoderma nativo e os -20% restantes de proteína total consistindo em xilanase GH10 de um doador exógeno.
[0329] Frontia Fiberwashe é um produto comercial, que consiste em um coquetel de xilanases e celulases. (Novozymes A/S, Dinamarca).
[0330] O ensaio de fibra de 10 g geralmente inclui incubar amostras de fibra úmidas obtidas a partir da moagem a úmido da planta, na presença de enzimas, em condições relevantes ao processo (pH 3,5 a 4, temperatura em torno de 52 ºC) e ao longo de um período de tempo dentre 1 a 4 horas. Após a incubação, a fibra é transferida e prensada sobre uma tela (tipicamente de 75 mícrons ou menor), em que os filtrados consistindo principalmente no amido e glúten separados são, então, coletados. Várias lavagens são feitas através da tela, e as lavagens são coletadas juntamente com o filtrado inicial. Os filtrados coletados são, então, passados através de um filtro de funil (filtro de vidro com abertura de 0,45 mícron) para separar adicionalmente os sólidos insolúveis (principalmente amido e glúten) do resto dos filtrados (principalmente sólidos dissolvidos). Esses sólidos insolúveis recuperados são lavados e, então, secos em forno até secar. A massa seca insolúvel é pesada e, então, analisada quanto ao teor de amido, com o uso de uma modificação de método de Ewers (hidrólise ácida e medição de glicose por cromatografia líquida).
[0331] Um ensaio de 10 g de fibra é realizado a pH 4, incubando-se a fibra a 50 ºC por 2 horas com tratamentos enzimáticos diferentes, conforme descrito a seguir.
O controle é a incubação de fibra sem qualquer enzima adicionada. Frontia FiberwashO é um produto comercial usado para essa aplicação industrial, que consiste em um coquetel de xilanases e celulases. GH5 é dosado em combinação com dois coquetéis de enzima diferentes, ambos os quais são derivados de fermentações de Trichoderma reesei. GH5 foi dosado a 20% da proteína enzimática total adicionada, com os 80% restantes consistindo no fundo de coquetel de enzima. À quantidade total de proteínas enzimáticas adicionadas em todos os tratamentos foi 500 microgramas por grama de fibra seca. Coquetel de enzimas D: consiste principalmente em celobio-hidrolases (CBH | e 11), de um doador exógeno, e endoglucanases (EG1 e 2) do hospedeiro Trichoderma nativo. O coquetel de enzimas T consiste principalmente (-80%) em celobio-hidrolases e endoglucanases do hospedeiro Trichoderma nativo e os -20% restantes de proteína total consistindo em xilanase GH10 de um doador exógeno. Os resultados são relatados na Tabela abaixo: Tabela 4
[0332] Tratamento [0333] Sólidos [0335] Ami com Mescla de Enzimas insolúveis recuperados do recuperado
[0334] (%em peso de [0336] (% fibra seca de partida) em peso de fibra seca de partida)
[0337] Controle (sem [0338] 3,60% (0,01) [0339] 2,48
[0340] Frontia [0341] 10,61% [0342] 7,81 FiberwashO (0,51%) Y% (0,22%)
[0343] GHS5+ [0344] 13,16% [0345] 9,25 | coquetel D (0,38%) | % (20,51%)
[0346] GH5+ [0347] 12,72% [0348] 8,77 (+ um desvio padrão, n=3)
[0349] EXEMPLO 4
[0350] Descrição de Método de Ensaio de 15 ml de Lavagem de Fibra
[0351] O ensaio de fibra fina de 15 ml, de modo geral, inclui incubar amostras de fibra fina úmidas obtidas de uma usina de moagem a úmido de milho na presença de enzimas, em condições relevantes para o processo (pH 4,0, temperatura aproximadamente 40 ºC) com mistura abundante em um Incubador de Hibridização Combi D-24 por uma hora. Após incubação, a fibra é filtrada a vácuo através de uma unidade de filtro de topo de tubo Millipore steriflip. A fibra é ressuspensa até um volume de 30 ml com água destilada, submetida a vórtice completamente e filtrada a vácuo uma segunda vez. O filtrado coletado consiste no amido e glúten extraídos. O filtrado é centrifugado em um Avanti J-E a 5.000 rpm por 7 minutos para peletizar o amido. O sobrenadante é lentamente removido com o uso de uma pipeta serológica de 50 ml de modo a não perturbar o pélete de amido e glúten. Esse procedimento de lavagem e centrifugação é repetido mais duas vezes para remover oligômeros solubilizados.
[0352] Após a lavagem, um volume total de 5 ml permanece, incluindo pélete de amido. A água em excesso é removida com o uso de um Evaporador de Solvente EZ-2 Elite (método: aquoso, máximo 65 ºC, 3 horas, 3.000 rpm, 120 mbar). Após o mesmo, o pélete (contendo amido e glúten) é ressuspenso em 500 ul de ácido clorídrico 1,6 M e aquecida a 90 ºC por 45 minutos, 1.000 rpm. Essa incubação quebra o grânulo de amido em monômeros de açúcar. Após hidrólise ácida, a reação é bruscamente arrefecida com o uso de 625 ul de hidróxido de sódio 1,4 M e resfriada até a temperatura ambiente. A quantidade de açúcares redutores é, então, determinada por meio da adição de 345 ul de reagente ácido dinitrossalicíclico (DNS). As amostras são incubadas por 10 minutos a 95 ºC, 300 rpm. Os açúcares redutores disponíveis reagem com o DNS, causando um aumento nos espectros vermelho- alaranjados (Miller, Analytical Chemistry 1959). As amostras são, então, centrifugadas a 5.000 rpm, 30 segundos para coletar condensado e resfriadas até a temperatura ambiente. 800 ul de cada amostra são transferidos para uma placa de 96 poços profundos e diluídos em água destilada com o uso de uma pipeta de múltiplos canais. 200 ul são, então, transferidos com o uso de uma pipeta de múltiplos canais para uma placa de 96 poços Nunc F. A absorbância a 560 nanômetros (nm) é lida com o uso de um Tecan Infinite M1000
[0353] Melhora de GH5 em relação a Frontia FiberwashO
[0354] O ensaio de 15 ml de fibra fina é realizado a pH 4, incubando-se por uma hora a 40 ºC com diferentes tratamentos enzimáticos. O controle é incubação de fibra sem enzima. Frontia FiberwashO é uma enzima comercial usada para liberar amido das fibras em um processo de moagem a úmido. A mescla de GH5 consiste em um complexo de celulose de Trichoderema reesei completo (80%) e a GH5 xilanase que tem a sequência de aminoácidos da proteína madura da SEQ ID NO:8 (20%). Todas as mesclas de enzimas foram adicionadas com um total de 500 microgramas de proteína enzimática por grama de sólidos de fibra secos (ug/gDS). Todos os tratamentos foram executados em triplicata. A absorbância foi lida a 560 nm e convertida em glicose (g/I) com o uso de um padrão de glicose. A glicose calculada foi, então, normalizada com o uso de sólidos secos de fibra e relatada como amido liberado da fibra. Os valores de absorbância e a liberação de amido da fibra são relatados na Tabela 5. Tabela 5: Resultados do ensaio de fibra de 15 ml
[0355] Mescla [0356] Absorção [0357] Liberação
[0359] 0,171 [0360] 1,82
[0358] Controle (0,047) (0,009)
[0361] Frontia [0362] 0,379 [0363] 5,83 FiberwashO (0,117) (0,022)
[0364] Mescla [0365] 0,576 [0366] 9,69 de GH5 (0,200) (0,40)
[0367] (t desvio padrão, n=3)
[0368] Exemplo 5 - diversidade de GH5
[0369] O ensaio de 15 ml de fibra fina é realizado a pH 4, incubando-se por uma hora a 40 ºC com diferentes tratamentos enzimáticos na Tabela 6. O controle é incubação de fibra sem enzima. Todas as mesclas de enzimas continham os 400 ug/gDS de T. reesei (Controle). Os GH5s auxiliares foram adicionados aos tratamentos adequados a 25 ug/gDS conforme indicado na Tabela 6. A absorbância foi lida a 560 nm e convertida em glicose (g/I) com o uso de um padrão de glicose. À glicose calculada foi, então, normalizada com o uso de sólidos secos de fibra e relatada como amido liberado da fibra. Os valores de absorbância e a liberação de amido da fibra são relatados na Tabela 7. Tabela 7: Diversidade de GH5 testada
[0370] Mescla de [0371] Subfamí [0372] Sequên
[0373] Chrysobacterium [0374] GH5 21 [0375] SEQID sp — 10696* NO: 8
[0376] Sphingobacteriu [0377] GH5 21 [0378] SEQID m sp-64162i NO: 9
[0379] Bacillus [0380] GH5 35 [0381] SEQID hemicellulosilyticus JCM 9152 NO: 10 *Inclui etiqueta n-his. Todas as enzimas do tipo selvagem têm etiqueta n-his, que mostrou reduzir a atividade enzimática.
Tabela 8: Resultados de diversidade de GH5
[0384] Liberaç
[0382] Mescla de [0383] Absorç ão de Amido da Fibra Tratamento ão Média (560 nm) (%)
[0386] 0,331 [0387] 5,99
[0385] Controle (0,097) (0,023)
[0388] Chrysobacterium [0389] 0,368 [0390] 6,90 sp — 10696* (0,022) (0,025)
[0391] Sphingobacterium [0392] 0,408 [0393] 7,70 sp-64162i (0,024) (0,006)
[0394] Bacillus [0395] 0,365 [0396] 6,82 hemicellulosilyticus JCM 9152 (0,013) (0,007) (+ desvio padrão, n=3)

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para melhorar o rendimento de amido e/ou rendimento de glúten de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, em que o método é caracterizado pelo fato de que compreende misturar por adição grãos de milho ou uma fração dos grãos de milho com uma composição de enzimas que compreende uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas, em que pelo menos uma das ditas enzimas hidrolíticas é selecionada dentre o grupo que consiste em um polipeptídeo GH30, um polipeptídeo GHB5 ou uma combinação dos mesmos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de amido e/ou glúten liberada da fibra durante o processo de moagem a úmido é aumentada.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) embeber os grãos de milho em água para produzir grãos embebidos; b) triturar os grãos embebidos para produzir grãos embebidos e triturados; c) separar germes dos grãos embebidos e triturados para produzir uma massa de grãos de milho que compreende fibra, amido e glúten; e d) submeter a massa de grãos de milho resultante a um procedimento de lavagem de fibra.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas, antes, durante ou após a etapa d), de acordo com a reivindicação 3.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho são misturados por adição com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas durante a etapa d), de acordo com a reivindicação 3.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que se permite que os ditos grãos de milho ou uma fração dos ditos grãos de milho reajam com a dita uma ou mais enzimas hidrolíticas por pelo menos minutos.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito procedimento de lavagem de fibra compreende o uso de um sistema de lavagem de fibra otimizado para introdução de uma ou mais enzimas hidrolíticas e em que o sistema de lavagem de fibra compreende um espaço configurado para fornecer um tempo de retenção total no sistema de lavagem de fibra de pelo menos minutos e menos de 48 horas.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o tempo de incubação no dito espaço configurado no sistema de lavagem de fibra é de pelo menos 5 minutos e menor que 48 horas.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a temperatura de incubação está entre 25 ºC e 95 ºC.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo GH5 tem atividade de xilanase.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo GH30 tem atividade de xilanase.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo GH5 compreende, ainda, uma ou mais das seguintes atividades: atividade de endo-B-1,4-glucanase/celulase (EC 3.2.1.4) e/ou atividade de endo-B-1,4-xilanase (EC 3.2.1.8) e/ou atividade de B-glicosidase (EC 3.2.1.21) e/ou atividade de B-manosidase (EC 3.2.1.25) e/ou atividade de B-glucosilceramidase (EC
3.2.1.45) e/ou atividade de glucano B-1,3-glicosidase (EC 3.2.1.58) e/ou atividade de liqueninase (EC 3.2.1.73) e/ou atividade de exo-B-1,4-glucanase/celodextrinase (EC
3.2.1.74) e/ou atividade de glucano endo-1,6-B-glicosidase (EC 3.2.1.75) e/ou atividade de manana endo-B-1,4-manosidase (EC 3.2.1.78) e/ou atividade de celulose B-1,4- celobiosidase (EC 3.2.1.91) e/ou atividade de esteril B-glicosidase (EC 3.2.1.104) ou atividade de endoglicoceramidase (EC 3.2.1.123) e/ou atividade de quitosanase (EC
3.2.1.132) e/ou atividade de B-primeverosidase (EC 3.2.1.149) e/ou atividade de endo-B- 1,4-glucanase específica para xiloglucano (EC 3.2.1.151) e/ou atividade de endo-B-1,6- galactanase (EC 3.2.1.164) e/ou atividade de hesperidina 6-O-a-L-ramnosil-B-glicosidase (EC 3.2.1.168) e/ou atividade de B-1,3-mananase (EC 3.2.1.-) e/ou atividade de endo-f- 1,4-xilanase específica para arabinoxilano (EC 3.2.1.-) e/ou arabinoxilano manana transglicosilase (EC 2.4.1.-).
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o dito polipeptídeo GH30 compreende, ainda, uma ou mais dentre as seguintes atividades: atividade de endo-B-1,4-xilanase (EC 3.2.1.8) e/ou atividade de B-glicosidase (EC 3.2.1.21) e/ou atividade de B-glicuronidase (EC 3.2.1.31) e/ou atividade de B-xilosidase (EC 3.2.1.37) e/ou atividade de B-fucosidase (EC 3.2.1.38) e/ou atividade de glucosilceramidase (EC 3.2.1.45) e/ou atividade de B-1,6-glucanase (EC
3.2.1.75) e/ou atividade de glucuronoarabinoxilano endo-B-1,4-xilanase (EC 3.2.1.136) e/ou atividade de endo-B-1,6-galactanase (EC:3.2.1.164) e/ou atividade de B-xilosidase [extremidade redutora] (EC 3.2.1.-).
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo GH5 é selecionado dentre um grupo que consiste em: i) Um polipeptideco maduro da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 a 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 ou SEQ ID NO: 12; ii) Um polipeptídeo maduro, que tem pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeo maduro em i) ii); Uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros em ii) e ii).
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o polipeptíideo GH30 é selecionado dentre um grupo que consiste em: i) Um polipeptideco maduro da sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:7; ii) Um polipeptídeo maduro, que tem pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeo maduro em i) ii), Uma subsequência de qualquer um dos polipeptídeos maduros em i) e ii).
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a dita composição enzimática que compreende uma ou mais enzimas hidrolíticas compreende, ainda, uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo que consiste em celulases (EC 3.214), xilanases (EC 3.2.1.8) arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55 (alfa-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora); EC 3.2.1.185 (beta-L-arabinofuranosidases de extremidade não redutora) celobio-hidrolase | (EC 3.2.1.150), celobio-hidrolase II (E.C. 3.2.1.91), celobiosidase (E.C.
3.2.1.176), beta-glicosidase (E.C. 3.2.1.21), beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) ou proteases (E.C XXXX).
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas hidrolíticas são expressas em um organismo com um fundo de celulase, tal como Trichoderma reesei.
18. Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas hidrolíticas são purificadas.
19. Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas hidrolíticas estão em uma composição líquida.
20. Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais enzimas hidrolíticas estão em uma composição sólida.
21. Método, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a quantidade eficaz de uma ou mais enzimas hidrolíticas misturadas por adição com uma ou mais frações da dita massa de grão de milho está entre 0,005 e 0,5 kg de proteína enzimática/tonelada métrica de grãos de milho que entram no processo de moagem a úmido.
22. Composição que compreende fibra de milho, em que a dita composição é caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
23. Uso de um polipeptídeo GH30 e/ou um polipeptídeo GH5 caracterizado pelo fato de que é em um método para melhorar o rendimento de amido e/ou o rendimento de glúten totais de grãos de milho em um processo de moagem a úmido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21.
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