CN108384793A - 一种冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用。本发明所述阿魏酸酯酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的阿魏酸酯酶，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述阿魏酸酯酶基因可用于体外生成阿魏酸。经检测，去淀粉麦麸混悬液中阿魏酸的释放率为75.3％，远高于其它阿魏酸酯酶基因，为阿魏酸生产提供了新的酶源。

Description

一种冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用。

背景技术

阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是肉桂酸的衍生物之一，普遍存在于植物细胞中，与多糖、蛋白质、木质素通过酯健结合成为细胞壁的骨架，使整个细胞壁变得坚硬。阿魏酸是公认的天然抗氧化剂，也是近年来国际认知的防癌物质，具有抑制血小板聚集，抗动脉粥样硬化等多种药理作用，此外，阿魏酸具有强大的长波紫外线吸收功能。目前在食品，医药，化妆品工业中广泛应用。

阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterases，FAEs)又称肉桂酸酯酶，它是一种羧酸酯酶，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿魏酸游离出来的酶。用阿魏酸酯酶处理植物性原料，一方面可以促进半纤维素、木质素与纤维素的分离，另一方面可以释放出阿魏酸。阿魏酸酯酶在食品，造纸，饲料，生物合成等方面具有广泛的应用价值。

目前已在多种微生物中发现了阿魏酸酯酶，包括细菌、真菌和酵母等。不同微生物所分泌产生的阿魏酸酯酶具有各自不同的特性，它们在编码序列、氨基酸结构、物理化学性质和及催化特性上都有所不同。目前对于阿魏酸酯酶的研究，主要集中在对原始菌株培养条件的优化以增加酶活或产酶量，也有部分研究者通过基因工程技术来提高阿魏酸酯酶的酶活，但酶活仍普遍偏低。

因此，发现新的高效阿魏酸酯酶基因并实现高效表达，对阿魏酸的工业化生产具有重要意义。

发明内容

本发明主要目的是，提供一种阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明目的之一，提供一种阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

进一步，所述阿魏酸酯酶基因来源于冠突曲霉(Aspergillus cristatus)3.6088(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.6088)，基因全长为849bp。

本发明目的之二，提供一种所述阿魏酸酯酶基因编码的阿魏酸酯酶，所述阿魏酸酯酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明目的之三，提供一种含有上述的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体为将上述冠突曲霉阿魏酸酯酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。

本发明目的之四，提供一种含有所述的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。

进一步，所述重组菌是将所述的重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。

进一步，所述重组菌的构建方法，具体如下：

(1)设计引物fae-F和fae-R，序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；

以冠突曲霉3.6088cDNA为模板，扩增得到序列如SEQ ID No.1所示的阿魏酸酯酶基因；

(2)根据SEQ ID No.1所示序列设计引物fae-A-F和fae-A-R，序列分别如SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6所示，以冠突曲霉3.6088cDNA为模板，扩增得到含所述阿魏酸酯酶的人工合成DNA序列；

(3)以EcoRI/XbaI双酶切含所述阿魏酸酯酶的人工合成DNA序列，回收含目的基因的DNA片段，与以EcoRI/XbaI双酶切的pGAPZα-A表达载体进行连接构建重组表达载体pGAPZα-A-fae；

(4)将所述重组表达载体pGAPZα-A-fae转化毕赤酵母SMD1168H，即得。

本发明目的之五，提供一种所述阿魏酸酯酶基因和/或阿魏酸酯酶在阿魏酸制备中的应用。

本发明目的之六，提供一种阿魏酸体外生产的方法，将所述重组菌接种于YPD培养基中，28℃培养5天，发酵液上清通过镍亲和层析柱纯化，得到重组阿魏酸酯酶；取上述重组阿魏酸酯酶1mg，纤维素酶1mg,与200ml去淀粉麦麸混悬液混合，40℃酶解6小时，煮沸5min灭酶活，反应液上清即为阿魏酸粗提液；

所述麸皮混悬液成分：去淀粉麦麸10g、50mmol/L Tris·HCl(pH5.0)200ml；

上述纤维素酶为1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，购于国药集团化学试剂有限公司，其作用为减少纤维素对阿魏酸酯酶与底物结合的空间阻碍，促进阿魏酸酯酶的酶解作用。

目前，已发现大量产阿魏酸酯酶的微生物，原核生物有：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvent)、纤维弧菌(Cellvibrio japonicus)、粪堆梭菌(Clostridium stercorarium)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophillus)、居瘤胃解纤维素菌(Cellulosilyticum ruminicola)、嗜热甲烷八叠球菌(Myceliophthorathermophila)、泉生热袍菌(Thermoanaerobactertengcongensis)等。真核生物有：绳状青霉(Penicillium funiculosum)、扩展青霉(Penicillium expansum)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)、巴西青霉(Penicillium brasilianum)、黑曲霉(Aspergillusniger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黄柄曲霉(Aspergillus flavipes)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、塔宾曲霉(Aspergillustubingensis)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、嗜热侧孢霉(Sporotrichumthermophile)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)、变绿红菇(Russula virescens)、杏鲍菇(Pleurotuseryngii)等。本发明技术人员从冠突曲霉3.6088发现高活性表达阿魏酸酯酶的目的基因，进一步，本发明技术人员意外发现该阿魏酸酯酶基因可以在毕赤酵母中实现异源表达，并且经发酵培养后，该基因分泌表达的阿魏酸酯酶用于酶解去淀粉麦麸，去淀粉麦麸中阿魏酸的释放率远高于其它阿魏酸酯酶编码基因。

本发明的有益效果：

本发明将冠突曲霉3.6088阿魏酸酯酶基因经克隆到pGAPZα-A表达载体上，转化毕赤酵母SMD1168H，接种于YPD培养基中，上清液经镍亲和层析柱纯化，与适量纤维素酶合用可高效催化麦麸分解生成阿魏酸，经检测，反应液中阿魏酸的释放率为75.3％，远高于其它阿魏酸酯酶基因，为阿魏酸生产提供了新的酶源。

附图说明

图1是本发明所述冠突曲霉重组阿魏酸酯酶的SDS-PAGE电泳图；

图2.A是去淀粉麦麸混悬液上清的高效液相色谱图；B是去淀粉麦麸经本发明所述冠突曲霉重组阿魏酸酯酶酶解，释放阿魏酸的高效液相色谱图

具体实施方式

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法。

实施例1：冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的PCR扩增

将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种编号为3.6088的冠突曲霉培养液5mL，用RNA提取试剂盒进行总RNA提取，提取步骤参照Takara公司的RNA提取试剂盒说明书。以提取的总RNA为模板用反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA，反转录步骤参照Takara公司的反转录试剂盒说明书。

从GenBank中检索同属不同菌株阿魏酸酯酶基因的核苷酸序列，设计一对引物fae-F和fae-R。引物序列如下：

fae-F：5’-ATGAAACTCTTGACTGCAACA-3’SEQ ID NO.3；

fae-R：5’-CTACCAGGAACAGGCTCC-3’SEQ ID NO.4；

以cDNA为模板进行扩增，采用上述引物进行扩增。总体积为50μL，超纯水18μL，10×LAtaq buffer(含MgCl₂)5μL，dNTP(各2.5mmol/L)4μL，引物(20μmol/L)各1μL，基因组DNA25ng，TaKaRa LATaq酶2.5U。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，反应30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸6.5分钟)，30个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，用Omega凝胶回收试剂盒进行PCR片段切胶回收，测序大小为849bp。所得产物即为冠突曲霉阿魏酸酯酶基因片段，测得序列如SEQ IDNo.1。

该段核苷酸序列全长849bp，是一个完整的ORF，编码282个氨基酸。该849bp的ORF即为冠突曲霉阿魏酸酯酶基因，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

实施例2：冠突曲霉阿魏酸酯酶基因在毕赤酵母SMD1168H中的表达和纯化

根据SEQ ID No.1所示序列设计引物fae-A-F和fae-A-R，分别引入能插入pGAPZα-A质粒(购自美国Invitrogen公司)的EcoRI、XbaI酶切位点(下划线所示)，序列如下

fae-A-F：5’-GCGGAATTCATGAAACTCTTGACTGCAACA-3’SEQ ID NO.5；

fae-A-R：5’-GCGTCTAGAAACTACCAGGAACAGGCTCC-3’SEQ ID NO.6；

以反转录的冠突曲霉cDNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例1。PCR产物回收后加EcoRI、XbaI(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化，采用同样酶切方法处理pGAPZα-A质粒载体。将制备好的酶基因片段与pGAPZα-A载体按一定比例混合，采用T4连接酶(NEB，USA)于16℃连接18小时，然后采用CaCl₂转化法转化宿主菌大肠杆菌Top10，转化菌液涂布zeocin(25μg/mL)抗性低盐LB平板，37℃过夜培养。挑取生长良好的单菌落至低盐LB液体培养基中37℃培养10小时，提取质粒，通过酶切法和PCR法验证阳性转化子，得到重组质粒pGAPZα-A-fae。

将上述重组质粒pGAPZα-A-fae用AvrII内切酶(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化。然后将线性化的pGAPZα-A-fae采用电转化方法转化宿主毕赤酵母SMD1168H，转化菌液涂布zeocin(100μg/mL)抗性YPD平板，30℃培养3天。挑取生长良好的单菌落至YPD液体培养基中30℃培养3天，提取基因组，通过PCR法验证阳性转化子，得到重组毕赤酵母SMD1168H-fae。

将上述在zeocin抗性YPD平板中生长良好的毕赤酵母重组菌接种于200mL YPD培养液，28℃培养5天。发酵液离心收集上清，上清液用0.22μm滤膜过滤后用镍亲和层析柱(GE，USA)进行重组阿魏酸酯酶的纯化。纯化中使用的溶液如下：

Binding Buffer：Tris·HCl 20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，浓HCl调pH7.9；

Washing Buffer：咪唑20mmol/L，Tris·HCl 20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，浓HCl调pH7.9；

Eluting Buffer：咪唑200mmol/L，Tris·HCl 20mmol/L，NaCl 0.5mol/L，浓HCl调pH7.9。

上述纯化过程中的收集峰用SDS-PAGE电泳进行检测，电泳采用垂直板式不连续系统电泳方式，电泳分离胶浓度为10％，浓缩胶4％，电泳结果显示酶蛋白单亚基分子量约为31±3kDa(如附图1)。

上述低盐LB培养液成分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。

上述YPD培养液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃灭菌30分钟。其中葡萄糖单独配制灭菌，115℃灭菌30分钟，取出后与其他成分混合。

实施例3：重组冠突曲霉阿魏酸酯酶体外催化生成阿魏酸

将实施例2中获得的重组冠突曲霉阿魏酸酯酶洗脱液加入到10kD超滤管中，6000rpm离心至未滤过溶液体积为原体积的1/10时，加入滤过体积的50mmol/L Tris·HCl(pH7.0)缓冲液。重复上述步骤2次以去除洗脱液中的咪唑和NaCl，并最终收集浓缩的阿魏酸酯酶溶液。通过SDS-PAGE电泳和Bradford法测定所得阿魏酸酯酶溶液中阿魏酸酯酶的浓度。

取去淀粉麦麸10g与200ml 50mmol/LTris·HCl(pH5.0)缓冲液混合，搅拌均匀，制备麦麸混悬液。取上述重组阿魏酸酯酶1mg，纤维素酶1mg，与上述去淀粉麦麸混悬液混合，搅拌均匀，40℃反应6h。反应结束后，反应液离心，取上清液用HPLC检测阿魏酸含量(如附图2),色谱柱为TC-C18(Agilent，USA)，流动相乙腈-水-冰乙酸(17:82:1)，流速1.0mL/min，柱温30℃，检测波长320nm。经阿魏酸含量测定及计算，阿魏酸释放率为75.3％。阿魏酸的释放率为酶解去淀粉麦麸释放的阿魏酸占碱提等量去淀粉麦麸释放阿魏酸的百分比。

对比例1

以NCBI中记载的Aspergillus niger feruloylesterase Agene,complete cds作为对比，该基因的Sequence ID:KR296927.1，序列长度为903bp。利用全基因合成的方法合成该DNA片段，按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达和纯化；按实施例3的方法在体外催化生成阿魏酸。经检测，去淀粉麦麸中阿魏酸的释放率为42.5％。

对比例2

以NCBI中记载的Aspergillus oryzae FaeA(faeA)mRNA,complete cds作为对比，该基因的Sequence ID:KJ512992.1，序列长度为846bp。利用全基因合成的方法合成该DNA片段，按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达和纯化；按实施例3的方法在体外催化生成阿魏酸。经检测，去淀粉麦麸中阿魏酸的释放率为41.0％。

对比例3

以NCBI中记载的Aspergillus usamii type A feruloyl esterase(faeA)gene,complete cds作为对比，该基因的Sequence ID：KF805148.1，序列长度为1279bp。利用全基因合成的方法合成该DNA片段，按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达和纯化；按实施例3的方法在体外催化生成阿魏酸。经检测，去淀粉麦麸中阿魏酸的释放率为36.9％。

对比例4

以NCBI中记载的Aspergillus flavus strain CBE332.1feruloyl esterase A(FaeA)mRNA,complete cds作为对比，该基因的Sequence ID：KC748203.1，序列长度为846bp。利用全基因合成的方法合成该DNA片段，按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达和纯化；按实施例3的方法在体外催化生成阿魏酸。经检测，去淀粉麦麸中阿魏酸的释放率为49.1％。

由对比例1-4可以看出，本发明的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因所编码的阿魏酸酯酶具有非常高的催化活性，用于体外催化去淀粉麦麸分解生成阿魏酸，可以显著提高阿魏酸的释放率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学；山东省药学科学院

<120> 一种冠突曲霉阿魏酸酯酶基因及其工程菌和应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaaactct tgactgcaac acgtattctg attctggcga ccgcgggcgt gcgtcagggc 60

ctggcggcga gcacccaggg cattagcgaa gatgtgtata gccgtctggt gaaaatggcg 120

accattagcc aggcggcgta tgcggatctg tgcaacattc cggcgaccat taacaccgtg 180

ggcaaaattt ataacgcgga tatggatatt aacggctggg tgctgcgtga tgatagccat 240

caggaaatta ttaccgtgtt tcgtggcacc ggcagcgata aaaacattca gctggatacc 300

aactataccc aggcgccgtt tgataccctg ccgcagtgca gcagctgcgc ggtgcatggc 360

ggctattatc tgggctggat tagcattaaa gatcaggtgg aaagcctggt gaaacagcag 420

gcgagccagt atccgcagta tggcctgacc gtgaccggcc atagcctggg cgcgagcatg 480

gcggcgatta ccgcggcgca gctgagcgcg acctatgata acgtgagcct gtataccttt 540

ggcgaaccgc gtaccggcaa ccaggcgtat gcgctgtatg tgaacgaagc gtttaaagcg 600

cagagcccgg ataccaccac ctattatcgt gtgacccatg cgaacgatgg cattccgaac 660

gtgccgccga cctggcaggg ctatgtgagc agcggcattg aatattggag cgtggaaccg 720

catagcgcgc agaacaccta tgtgtgcacc ggcggcgaag tgcagtgctg cgaagcgcag 780

ggcggccagg gcgtgaacga tgcgcatgtg acctattttg gcatgaccag cggagcctgt 840

tcctggtag 849

<210> 2

<211> 282

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Leu Leu Thr Ala Thr Arg Ile Leu Ile Leu Ala Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val Arg Gln Gly Leu Ala Ala Ser Thr Gln Gly Ile Ser Glu Asp Val

20 25 30

Tyr Ser Arg Leu Val Lys Met Ala Thr Ile Ser Gln Ala Ala Tyr Ala

35 40 45

Asp Leu Cys Asn Ile Pro Ala Thr Ile Asn Thr Val Gly Lys Ile Tyr

50 55 60

Asn Ala Asp Met Asp Ile Asn Gly Trp Val Leu Arg Asp Asp Ser His

65 70 75 80

Gln Glu Ile Ile Thr Val Phe Arg Gly Thr Gly Ser Asp Lys Asn Ile

85 90 95

Gln Leu Asp Thr Asn Tyr Thr Gln Ala Pro Phe Asp Thr Leu Pro Gln

100 105 110

Cys Ser Ser Cys Ala Val His Gly Gly Tyr Tyr Leu Gly Trp Ile Ser

115 120 125

Ile Lys Asp Gln Val Glu Ser Leu Val Lys Gln Gln Ala Ser Gln Tyr

130 135 140

Pro Gln Tyr Gly Leu Thr Val Thr Gly His Ser Leu Gly Ala Ser Met

145 150 155 160

Ala Ala Ile Thr Ala Ala Gln Leu Ser Ala Thr Tyr Asp Asn Val Ser

165 170 175

Leu Tyr Thr Phe Gly Glu Pro Arg Thr Gly Asn Gln Ala Tyr Ala Leu

180 185 190

Tyr Val Asn Glu Ala Phe Lys Ala Gln Ser Pro Asp Thr Thr Thr Tyr

195 200 205

Tyr Arg Val Thr His Ala Asn Asp Gly Ile Pro Asn Val Pro Pro Thr

210 215 220

Trp Gln Gly Tyr Val Ser Ser Gly Ile Glu Tyr Trp Ser Val Glu Pro

225 230 235 240

His Ser Ala Gln Asn Thr Tyr Val Cys Thr Gly Gly Glu Val Gln Cys

245 250 255

Cys Glu Ala Gln Gly Gly Gln Gly Val Asn Asp Ala His Val Thr Tyr

260 265 270

Phe Gly Met Thr Ser Gly Ala Cys Ser Trp

275 280

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgaaactct tgactgcaac a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctaccaggaa caggctcc 18

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcggaattca tgaaactctt gactgcaaca 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgtctagaa actaccagga acaggctcc 29

Claims (10)

1.一种阿魏酸酯酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述阿魏酸酯酶基因，其特征在于，所述阿魏酸酯酶基因源于冠突曲霉3.6088。

3.如权利要求1所述阿魏酸酯酶基因编码的阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求1所述的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将权利要求1的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。

6.含有权利要求1所述的冠突曲霉阿魏酸酯酶基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.如权利要求6所述重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。

8.如权利要求7所述重组菌，其特征在于，所述重组菌的构建方法，具体如下：

(1)设计引物fae-F和fae-R，序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示；以冠突曲霉3.6088 cDNA为模板，扩增得到序列如SEQ ID No.1所示的阿魏酸酯酶基因；

(2)根据SEQ ID No.1所示序列设计引物fae-A-F和fae-A-R，序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，以冠突曲霉3.6088 cDNA为模板，扩增得到含所述阿魏酸酯酶的人工合成DNA序列；

(3)以EcoRI/XbaI双酶切含所述阿魏酸酯酶的人工合成DNA序列，回收含目的基因的DNA片段，与以EcoRI/XbaI双酶切的pGAPZα-A表达载体进行连接构建重组表达载体pGAPZα-A-fae；

(4)将所述重组表达载体pGAPZα-A-fae转化毕赤酵母SMD1168H，即得。

9.如权利要求1或2所述阿魏酸酯酶基因和/或阿魏酸酯酶在阿魏酸制备中的应用。

10.一种阿魏酸体外生产的方法，其特征在于，将如权利要求7所述重组菌接种于YPD培养基中，28℃培养5天，发酵液上清通过镍亲和层析柱纯化，得到重组阿魏酸酯酶；取上述重组阿魏酸酯酶1mg，纤维素酶1mg与200ml去淀粉麦麸混悬液混合，40℃酶解6小时，煮沸5min灭酶活，反应液上清即为阿魏酸粗提液；

所述麸皮混悬液成分：去淀粉麦麸10g、50mmol/L Tris·HCl(pH5.0)200ml；

所述纤维素酶为1,4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶。