CN111705076A - 通过下调xat基因提高植物糖化效率的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法及其应用，属于生物质能源领域。本发明通过使植物的XAT基因功能缺失或下调，来提高植物的糖化效率。通过本发明的方法使得阿拉伯糖含量降低，减少了半纤维素分支度，减弱了其与木质素和纤维素交联的紧密，进一步导致突变体材料的糖化效率提高，降低了材料处理成本。因此，本发明从根本上改变了材料的生物质特性，使糖化效率有了根本上的提高，可以节约能源，降低劳动强度。通过本发明的方法获得材料可以应用在生物质转化、纸浆和造纸工业中。

Description

通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法及其应用
技术领域
本发明属于生物质能源领域，具体涉及利用生物技术下调植物体内木聚糖阿拉伯糖基转移酶(Xylan Arabinosyl-transferases，XAT)的活性，XAT下调后的植物具有更高的糖化效率，本发明涉及XAT下调植物在各种应用如生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用；特别涉及一种通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法及其应用。
背景技术
生物质能源结合了化石能源和新能源的优势，是储量极大、可再生的能源之一。由于其来自于植物或农林产业废弃物，同样具有环境友好的特性。当今世界的主要使用的仍为传统能源，储存有限、不可再生和环境危害严重，亟待提高和推广生物能源。如何高效合理地开发生物质能对经济和社会的可持续发展有着重要意义，也已成为大势所趋的热点。
木质纤维素作为重要的生物质能源，是生产生物乙醇的主要原料。木质纤维素中的纤维素和半纤维素经水解糖化成简单糖类，最后被发酵成乙醇，糖化效率是影响生物质产量的重要因素，木质纤维素的组成与交联方式直接影响糖化效率。禾本科植物的半纤维素主要是以木聚糖(Xylan)为主链，阿拉伯糖(Arabinose)、葡萄糖醛酸(Glucuronic acid)为侧链的葡萄糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖(Glucuronoarabinoxylan，GAX)和阿拉伯糖基木聚糖(AX)。木聚糖在植物次生壁中通过阿拉伯糖侧链与纤维素、木质素的部分结构交联来提高植物的韧性、抗逆性等，但木聚糖侧链的存在也对木质纤维素的工业应用带来了很大的影响。木聚糖在纤维素周周形成的交联网络结构阻止纤维素分解酶进入，不仅如此，侧链分支的程度也影响了糖化效率。木聚糖侧链合成的途径中，尿苷二磷酸阿拉伯糖(UDP-arabinose，UDP-Ara)会被木聚糖阿拉伯糖基转移酶(XAT)转移到木聚糖(Xylan)骨架上形成半纤维素的主要结构，对XAT的调节会直接影响木聚糖主链上阿拉伯糖侧链的分支程度，进而影响阿拉伯糖通过阿魏酸酯键与木质素的连接，并影响半纤维素和纤维素的交联，最终改变植物的糖化效率。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种通过CRISPR/Cas9下调XAT基因提高植物糖化效率的方法。
本发明通过改变植物木聚糖侧链含量和分支程度，从而使植物糖化效率提高。基于发明人的工作经验和当前生物质材料改良的需求，发明人认为下调阿拉伯糖合成的关键酶XAT可直接导致阿拉伯糖含量的降低，从而改变木质纤维素的组成与结构。通过对水稻基因组中所有XAT的分析可知，水稻基因组中共有2个XAT已被确认功能(XAT2、XAT3)，通过TMHMM在线预测可知OsXATs均具有跨膜区，定位于高尔基体。发明人利用CRISPR/CAS9基因编辑技术，对水稻中的两个XAT分别设计了多个靶点并对靶点所在的基因进行敲除。最终得到了两基因突变的植株XAT2XAT3，在测序鉴定可靠性之后，发明人的研究工作正是针对这突变体开展的。
在相同生长环境下，XAT2XAT3突变体表现出和用作对照的正常的水稻植株相同的生长表型，对突变体的农艺性状进行统计分析发现，XAT2XAT3突变体株高、叶形、穗数和正常水稻无异。对突变体的茎秆切片皆表现出没有变化的细胞壁。对突变体细胞壁中的阿拉伯糖进行单糖分析发现，突变体中的阿拉伯糖含量显著减少，而葡萄糖和木糖没有明显变化，这也是影响糖化效率的显著原因之一。对突变体材料进行糖化效率分析，表现出比野生型材料更高的糖化效率。以上实验结果表明，高尔基体定位的XAT突变能使植物木聚糖侧链-阿拉伯糖含量降低从而导致糖化效率提高。
本发明的另一目的在于提供上述方法获得的XAT下调植物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法，通过使植物的XAT基因功能缺失或下调，来提高植物的糖化效率。
所述的XAT基因功能下调优选为通过基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调植物体内的XAT活性，达到提高糖化效率的目的。
所述的植物优选为水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杨树(Populus)、桉树(Eucalyptus)、松树(Pinus)或麻疯树(Jatropha carcas L.)等；更优选为水稻。但同时可以衍生到其它植物，通过基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调该植物体内的XAT活性，达到提高糖化效率的目的。
对水稻中的XAT蛋白进行生物信息学分析。通过序列同源性比对分析发现，OsXAT2、OsXAT3氨基酸序列相似度为：55.12％。用TMHMM软件对XAT蛋白进行跨膜区分析发现，OsXATs均具有跨膜区，定位于高尔基体。
对突变体XAT2XAT3进行表型分析。突变体生长均正常，只穗粒数性状表现出弱势，对突变体的基部茎段进行切片分析发现，所有突变体木质部导管正常。
优选的，所述的XAT基因为OsXAT2、OsXAT3中的至少一种；
对突变体XAT2XAT3的细胞壁成分进行分析。收集突变体的茎段材料，对突变体材料进行了单糖组成分析(
Figure BDA0002550753240000031
J,Harholt J,Scheller HV,Orfila C(2004)Rhamnogalacturonan I in Solanum tuberosum tubers contains complexarabinogalactan structures.Phytochemistry 65:1429-1438)，结果表明，XAT2XAT3突变体的阿拉伯糖含量降低了32.85％。
对突变体XAT2XAT3的木聚糖结构进行分析。用0.5M KOH法提取突变体材料的半纤维素(Zhao X,Ouyang K,Gan S,Zeng W,Song L,Zhao S,Li J,Doblin MS,Bacic A,ChenXY,Marchant A,Deng X,Wu AM(2014)Biochemical and molecular changes associatedwith heteroxylan biosynthesis in Neolamarckia cadamba(Rubiaceae)duringxylogenesis.Front Plant Sci 5:602)。采用2D-HSQC和1H-NMR以及FT-IR进行半纤维素的结构分析。结果表明在OsXATs突变体中，葡萄糖醛酸(GlcA)的甲基化程度有不明显的降低，而乙酰化程度降低。上述结果表明，突变体阿拉伯糖下降十分明显，木聚糖侧链的甲基化程度和乙酰化程度降低，半纤维素的结构发生了较大变化。
对突变体XAT2XAT3的糖化效率进行分析。阿拉伯糖通过阿魏酸交联于木质素，阻碍纤维素分解酶的进入影响糖化效率，得到的突变体木聚糖侧链的结构发生了很大变化，因此突变体糖化效率也会发生较大变化。在对突变体进行纤维素混合酶酶解后，测定得到的单糖含量以计算糖化效率，突变体的糖化效率皆有很大提高。
另外，在拟南芥，杨树，桉树，松树，麻疯树等植物中也存在着高尔基体定位的XAT，它们的多突变体也有可预期的糖化效率提高的结果。
一种XAT下调植物，通过上述制备方法制得得到。
所述的XAT下调植物在生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
生物质能源的利用效率很大程度上取决于原材料的好坏，提高原材料的可利用成分，降低原材料的处理成本皆可以提高生物质能源的利用效率，本发明的落脚点就在于这两个方面，得到的突变体材料阿拉伯糖含量降低，相应地增加了S型木质素和G型木质素的比例，即减少了半纤维素分支度，减弱了其与木质素和纤维素交联的紧密，进一步导致突变体材料的糖化效率提高，降低了材料处理成本。现有方法大部分集中在改变材料的预处理方法上，对糖化效率的提高程度有限，本发明从根本上改变了材料的生物质特性，使糖化效率有了根本上的提高，可以节约能源，降低劳动强度。
附图说明
图1是水稻中2个OsXAT(OsXAT2和OsXAT3)蛋白的氨基酸序列比对图。
图2是水稻中2个OsXAT(OsXAT2和OsXAT3)蛋白跨膜区的预测图。
图3是pYLCRISPR/Cas9-MH的图谱示意图。
图4是水稻突变体的检测结果图；其中，(a)：序列突变位点示意图；左为Wildtype(WT)，中间为XAT2XAT3突变体1，右为XAT2XAT3突变体2。(b)：染色体突变所在位置；Wildtype是指水稻中花11号。
图5是水稻突变体以及水稻茎段切片图；其中，WT、wildtype是指水稻中花11号，xat2xat3是指XAT2XAT3突变体1。
图6是实时荧光定量PCR的鉴定结果图。
图7是糖化效率分析图，其中，xat2xat3是指XAT2XAT3突变体1。
图8是木聚糖侧链甲基化和乙酰化分析的核磁图；其中，(a)：突变体半纤维素2D-HSQC；(b)：突变体半纤维素H-NMR；(c)：半纤维素侧链修饰局部放大；WT是指水稻中花11号；xat2xat3是指XAT2XAT3突变体1。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
对水稻中的2个XAT蛋白进行生物信息学分析。用DNAMAN软件对OsXAT的氨基酸序列进行同源性分析，发现OsXAT2(LOC_Os02g22480.1)和OsXAT3(LOC_Os03g37010.3)氨基酸序列相似度为：55.12％，(图1)。进而，对2个OsXAT蛋白进行跨膜区预测(TMHMM，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，OsXAT2和OsXAT3均具有跨膜区，定位于高尔基体(图2)。
实施例2
OsXAT突变体的获得。合成相应的靶点引物，如表1所示。
表1 CRISPR/CAS9靶点引物
Primer Codes Primer sequence F(5′→3′) Primer sequence R(5′→3′)
OsXAT2 gccGTGGTGGGATGTGCAGGTGG aaac CCACCTGCACATCCCACCA
OsXAT3 gccGAGCGGCCGAAGCTGGTCCG aaac CGGACCAGCT TCGGCCGCT
注：表里序列中的小写字母代表接头的粘性末端，大写字母是基因组的靶序列。
用于基因敲除的靶基因序列从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)数据库中获得。在基因编辑之前，根据XATs(XAT2，LOC_Os02g22480.1；XAT3，LOC_Os03g37010.3)的序列在http://skl.scau.edu.cn/工具网站上设计并选择最佳靶点和引物(表1)。
首先，构建single guide RNA(gRNA)与敲除靶点序列的表达盒连接pUC18载体。基于pUC18骨架(氨苄青霉素抗性)，每个基因的表达盒单独构建。水稻来源的4个smallnuclear RNA启动子(OsU3，OsU6a～c)，其中，OsU3用于构建敲除OsXAT2的靶点序列的表达盒，OsU6a用于构建敲除OsXAT3的靶点序列的表达盒。
pUC18骨架利用BsaⅠ酶切位点，产生粘性末端，以此使得启动子、靶点序列、gRNA相互顺序连接，形成表达盒。
此载体质粒在E.coli DH10B繁殖。连接反应体系为：
配制10μL BsaI-连接反应液：加入ATP至终浓度1.0mM，加入约10ng pUC18-U3-gRNA或pUC18-U6a-gRNA质粒(预先配好10ng/μL保存)，1.0μL靶点序列(最终浓度0.1μM)，～5U BsaI，～35U T4DNA ligase。用变温循环仪(或PCR仪)循环反应5循环：37℃5min，20℃5min。
其中，pUC18-U3-gRNA是将U3-gRNA表达盒用BsaI酶切插入至pUC18中得到的；pUC18-U6a-gRNA是将U6a-gRNA表达盒用BsaI酶切插入至pUC18中得到的。
接着，通过BsaⅠ酶切位点将表达盒从载体上切下，拥有不同敲除靶点序列的表达盒在此过程一一连接，形成串联的表达盒。此过程通过具有特异引物的PCR实现，xat2xat3突变体的突变通过两种特异引物(单独表达盒所在的载体骨架相同)实现表达盒之间的连接：
1F：5′-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；
1R：5′-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′；
2F：5′-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3′；
2R：5′-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3′；
此连接反应体系为：
2μL连接产物为模板，15μL PCR，使用1F/R、2F/R各0.2μM，高保真PCR酶KOD-Plus。18～25循环，95℃10s，60℃15s，68℃30s。
最终载体使用为潮霉素抗性的pYLCRISPR/Cas9-MH(M＝monocot；H＝HPT，抗潮霉素基因)，图谱如图3所示。
仍通过BsaⅠ酶切位点，使得最终载体形成粘性末端，此与上一步中的表达盒串的互补粘性末端连接配对。
此连接反应体系为：
分装的pYLCRISPR/Cas9-MH(约40～60ng)管中，加入10～15ng的上步酶切PCR产物，在10μL连接反应(加35～70U连接酶)，16℃连接2～3h。
获得转化载体质粒后，送武汉伯远公司做中花11粳稻遗传转化，获得突变体植株。
利用鉴定引物(表2)鉴定获得的突变体的可靠性。
表2鉴定引物
Primer Codes Primer sequence 5′→3′
OsXAT2-F CTCTTTCGTTCCACAAACATGG
OsXAT2-R CCTCCAAGAGTACAGGCTTG
OsXAT3-F ATCTCATTCCACCAGCGCG
OsXAT3-R GCCTCCAGAAGAATAGGCCTG
鉴定结果可知，所有突变体都达到了完全突变OsXAT(图4)。
实施例3
水稻茎段切片制作与观察。选取生长成熟植株主茎，在土壤表层以上3cm取1cm茎段，用3％(w/v)的琼脂糖包埋茎段，在Leica VT1000S震动切片机上切片，厚度40μm，甲苯氨蓝染色1～2min，置于载玻片上于光学显微镜下观察拍照。XAT2XAT3突变体的木质部导管形态正常(图5)。
实施例4
实时荧光定量PCR。分别提取成熟水稻根(Root)、主茎的上中下段(Upper Stem、Middle Stem、lower Stem)、叶鞘(Leaf Sheath)、叶(Leave)、穗(Spike)中的总RNA。Q-PCR引物的设计利用oligo7与primer6软件协同设计，至少跨过一个内含子防止基因组DNA污染。
设计多个内参引物进行对比，选出误差较小的内参引物做数据分析。反应体系中的cDNA根据需要稀释10倍，SYBR PremixEXTaqTM购自TAKARA公司。实验所需仪器为罗氏LightCyler480。OsXATs基因表达量见图6。由于核苷酸糖的转运合成是植物基础的生化过程，因此在目标组织中都发现了不同表达程度的XAT。OsXAT2基因在每个组织中的表达量都很低，但是在叶中有不错的表达量，说明XAT2不主要参与成熟水稻中的Ara(阿拉伯糖)的转运，叶中的高表达量可能是因为叶中的半纤维素的需求更多，但XAT2和XAT3有着明显表达部位差异的原因还不清楚。OsXAT3虽然总表达量表现良好，但在不同的组织中表达的特异性十分强烈，例如穗中OsXAT3表达量极低，但在下部茎秆和叶鞘中的表达量十分惊人。
表3实时荧光定量PCR引物
序列(5′-3′)
ActinF AGGCCAATCGTGAGAAGATGACCCA
ActinR GTGTGGCTGACACCATCACCAGAG
18S rRNAF ATGATAACTCGACGGATCGC
18S rRNAR CTTGGATGTGGTAGCCGTTT
GAP-DHF GGGCTGCTAGCTTCAACATC
GAP-DHR TTGATTGCAGCCTTGATCTG
Tubulin F TACCGTGCCCTTACTGTTCC
Tubulin R CGGTGGAATGTCACAGACAC
OsXAT2-F CTCTTTCGTTCCACAAACATGG
OsXAT2-R CCTCCAAGAGTACAGGCTTG
OsXAT3-F ATCTCATTCCACCAGCGCG
OsXAT3-R GCCTCCAGAAGAATAGGCCTG
实施例5
细胞壁单糖成分分析。收集茎段材料进行粉碎，多步酸解法得到的清液在高效阴离子交换色谱仪Dionex ICS 3000上进行单糖测定，色谱柱为CarboPac PA20阴离子交换柱(3×150mm；Dionex)。分析结果如表4所示，xat2xat3突变体的阿拉伯糖含量降低了32.85％。
表4细胞壁单糖成分分析
野生型WT XAT2XAT3
Arabinose(阿拉伯糖)％，Ara％ 4.1465±0.07 2.7842±0.09
Glucose(葡萄糖)％，Glu％ 50.0660±1.83 45.1588±2.97
Xylose(木糖)％，Xyl％ 17.9881±1.05 18.2568±1.10
实施例6
木聚糖侧链甲基化和乙酰化分析，如图8所示。对提取到的木聚糖用endo-β-xylanase M6(Megazyme)酶解，酶解产物冻干后用20mg混合0.5mL D2O制样，使用600Hz NMR(Bruker)获得核磁数据。根据2D-HSQC结果，阿拉伯糖的5个1H/13C信号峰所在位置分别对应在109.14/5.15ppm、86.04/4.01ppm、80.27/3.92ppm、78.91/3.66ppm、61.15/3.58ppm，而很明显的五个信号强度的峰(101.77/4.30ppm、75.60/3.63ppm、74.09/3.36ppm、72.81/3.15ppm、63.43/3.95ppm)代表着木糖的大量存在。结果表明，在木糖的信号强度类似的情况下，突变体阿拉伯糖的信号强度有明显减少。除此之外，在4.56-4.62ppm、4.69ppm和5.11-5.17ppm表现出来木糖被乙酰基修饰的信号，分别是3-O-acetylated Xyl(H1)、2-O-acetylated Xyl(H1、H2)和3-O-acetylated Xyl(H3)，wt中的2-O-acetylated Xyl(H1、H2)的峰(4.69ppm)比突变体更明显，并且3-O-acetylated Xyl(H1)的信号(4.56-4.62ppm)也比突变体更明显。以上说明突变体半纤维素的乙酰化和甲基化程度发生了改变。
实施例7
糖化分析。收集茎段材料，在破壁机中粉碎，在0.1M H-Ac buffer中加入4mg纤维素复合酶(β-glucanase(β-葡聚糖酶)3.7×104U，cellulase(纤维素酶)3.4×102U，xylanase(木聚糖酶)6.5×104U；Imperial Jade Bio-technology Co.,Ltd)，50℃处理48h，上清过0.22μm滤膜后用HPLC(Agilent，Shodex sugar SP-0810column，refractiveindex detector)测定。测定结果见图7，xat2xat3突变体的糖化效率为55.68％，较WT(48.26％)，提高了7.42％；可见，突变体的糖化效率皆得到了较大提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法及其应用
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 583
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OsXAT2氨基酸序列：XAT2_LOC_Os02g22480.1
<400> 1
Met Lys Pro Val Glu Arg Ala Lys Leu Val Arg Ser Leu Arg Gln Glu
1 5 10 15
Ser Arg Arg Leu Arg Leu Leu Val Leu Val Ile Gly Phe Phe Leu Val
20 25 30
Thr Leu Thr Phe Val Val Ile Ser Lys Pro Asp Ala Leu Leu Phe Asn
35 40 45
Leu Asn Gly Arg Leu Ser Val Asp His Ala Pro Arg Ser Leu Leu Ile
50 55 60
Arg Gln Arg Ile His Ala Asp Ser Arg Arg Ser Ala Asp Thr Phe Pro
65 70 75 80
Ala Ala Glu Asp Pro Lys Val Val Asp Glu Asp Glu Gly Ala Glu Asp
85 90 95
Ala Thr Ala Lys Gly Thr Ser Glu Glu Glu Lys Arg Leu Leu Ser Ser
100 105 110
Glu Pro Glu Gln Gly Lys Asn Glu Glu Ala Ala Thr Ala Ser Glu Val
115 120 125
Leu Gly Gly Gly Gly Glu Glu Asp Asn Lys Asn Gly Glu Glu Glu Gly
130 135 140
His Thr Gln His Ser Lys Val Thr Leu Pro Thr Val Ser Asn Tyr Thr
145 150 155 160
Ile Arg Asp Ala Glu Asp Thr Asp Asn Gly Lys Gln Glu Asp Gly Lys
165 170 175
Pro Asn Glu Lys Tyr Glu Phe Glu Met Asp Ala Asp Lys Gly Asp Asn
180 185 190
Val Glu Pro Glu Thr Asp Asn Glu Glu Trp Asn Lys Lys Pro Leu Cys
195 200 205
Asp Phe Ser Asn Phe Arg Ala Asn Val Cys Glu Met Arg Gly Asn Ile
210 215 220
Arg Ile His Pro Asn Ala Ser Ser Val Met Tyr Met Glu Pro Ala Ser
225 230 235 240
Ser Lys Arg Glu Glu Ile Trp Lys Val Lys Pro Tyr Pro Arg Lys Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Cys Leu Gly His Ile Thr Glu Ile Thr Val Lys Ser Ser
260 265 270
Lys Val Ala Pro Glu Cys Ser Lys Tyr His Asn Val Pro Ala Val Val
275 280 285
Phe Ala Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Asn Leu Phe His Asp Phe Thr Asp
290 295 300
Val Leu Val Pro Leu Phe Thr Thr Ala Ser Glu Phe Asn Gly Glu Val
305 310 315 320
Gln Phe Leu Ile Thr Asp Met Ala Ile Trp Trp Thr Arg Lys Tyr Lys
325 330 335
Val Val Phe Asp Lys Leu Ser Lys Tyr Pro Leu Ile Asp Phe Asn Asn
340 345 350
Asp Asp Gln Val His Cys Phe Lys His Ala Ile Val Gly Leu His Ala
355 360 365
Tyr Met Glu Phe Thr Ile Asp Ser Ser Lys Ala Pro His Asn Tyr Ser
370 375 380
Met Val Asp Phe Asn Arg Phe Met Arg Arg Thr Tyr Ser Leu Pro Arg
385 390 395 400
Asp Phe Val Thr Ala Leu Gly Glu Ile Pro Lys Ala Lys Pro Arg Leu
405 410 415
Leu Ile Ile Ser Arg Gln Arg Thr Arg Met Phe Leu Asn Leu Asn Glu
420 425 430
Ile Val Ala Met Ala Glu Glu Ile Gly Tyr Glu Val Val Val Glu Glu
435 440 445
Ala Asn Val Ser Ser Asp Leu Ser His Phe Gly Lys Val Val Asn Ser
450 455 460
Val Asp Val Met Met Gly Val His Gly Ala Gly Leu Thr Asn Cys Val
465 470 475 480
Phe Leu Pro Gln Asn Ala Thr Leu Ile Gln Ile Val Pro Trp Gly Gly
485 490 495
Leu Asp Trp Ile Ser Arg Ile Asp Phe Gly Asn Pro Ala Glu Gln Met
500 505 510
Gly Leu Arg Tyr Lys Gln Tyr Ser Ile Gly Val His Glu Ser Ser Leu
515 520 525
Thr Asp Gln Tyr Pro Leu Asp His Glu Ile Phe Thr Asn Pro Leu Ser
530 535 540
Phe His Lys His Gly Phe Glu Phe Ile Arg Gln Thr Phe Met Asp Lys
545 550 555 560
Gln Asn Val Lys Leu Asp Cys Asn Arg Phe Lys Pro Val Leu Leu Glu
565 570 575
Val Leu Asp Gln Leu Asn Gln
580
<210> 2
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> OsXAT3氨基酸序列：XAT3_LOC_Os03g37010.3
<400> 2
Met Lys Ala Gly Glu Arg Pro Lys Leu Val Arg Gly Val Arg Gln Glu
1 5 10 15
Ser Arg Arg Phe Arg Leu Leu Val Ile Val Val Gly Phe Phe Leu Val
20 25 30
Ser Leu Thr Phe Val Phe Val Ser Lys Pro Asp Ala Ile Leu Phe Ser
35 40 45
Leu Asn Gly Lys Leu Pro Val Glu Gln Ala Pro Thr Ser Ile Leu Ile
50 55 60
Gln Gln Lys Val Asn Glu Pro Ser Gly Glu Ser Arg Lys Thr Ser Thr
65 70 75 80
Asp Ala Leu Arg Gly Asp Pro Lys Val Val Asp Asp Glu Ala Asp Ala
85 90 95
Lys Pro Lys Gly Gln Leu Ile Asn Phe Leu Phe Phe Ser Pro Ser Gln
100 105 110
Phe Tyr Leu Thr Asp Thr Asn Gly Val Arg Ser Phe Leu Leu Leu Leu
115 120 125
Leu Pro Ser Leu Pro Tyr Leu Leu Leu Gly Leu Leu Ile Ala Arg Val
130 135 140
Val Arg Pro Arg Leu Ile Ser Thr Gly Thr Gly Gly Gly Ser Glu Glu
145 150 155 160
Glu Glu Gly Arg Val Leu Ser Glu Pro Asp Pro Thr Ser Gly Met Met
165 170 175
Glu Pro Thr His Asn Lys Asp Gly Asn Gly His Lys Ser His Gln Glu
180 185 190
Thr Leu Gly Gly Gly Gly Asp Gly Glu Ser Lys Gly Asn Asp Glu Glu
195 200 205
Gly Glu His Ala Glu Gln Lys His Lys Val Thr Leu Pro Thr Val Ser
210 215 220
Asn Tyr Thr Ile His Asp Ala Ala Glu Asp Thr Glu Asn Ala Lys Gln
225 230 235 240
Glu Gly Met Asn Asn Val Gln Gln Gly Ser Lys Pro Leu Cys Asp Phe
245 250 255
Ser Asn Phe Arg Ala Asn Val Cys Glu Met Arg Gly Asp Val Arg Ile
260 265 270
His Pro Thr Ala Thr Ser Val Leu Phe Met Glu Pro Glu Gly Ser Gln
275 280 285
Arg Asp Glu Val Trp Lys Ile Lys Pro Tyr Pro Arg Lys Gly Asp Glu
290 295 300
Phe Cys Leu Ser His Ile Thr Glu Val Thr Val Lys Ser Ser Lys Val
305 310 315 320
Ala Pro Glu Cys Thr Lys Tyr His Asp Val Pro Ala Val Ile Phe Ser
325 330 335
Leu Thr Gly Tyr Thr Gly Asn Leu Phe His Asp Phe Thr Asp Val Leu
340 345 350
Val Pro Leu Phe Thr Thr Ala Ser Glu Phe Asn Gly Glu Val Gln Phe
355 360 365
Leu Ile Thr Asp Met Ala Leu Trp Trp Thr Ile Lys Tyr Gln Thr Val
370 375 380
Leu Gln Lys Leu Ser Lys Tyr Pro Val Ile Asp Phe Ser Lys Asp Asp
385 390 395 400
Gln Val His Cys Phe Lys His Ala Ile Val Gly Leu His Ala Tyr Met
405 410 415
Glu Phe Thr Ile Asp Ser Thr Lys Ala Pro His Asn Tyr Ser Met Ala
420 425 430
Asp Phe Asn Arg Phe Met Arg Gly Ala Tyr Ser Leu Gly Arg Asp Ser
435 440 445
Val Thr Val Leu Gly Glu Tyr Pro Lys Ile Lys Pro Arg Leu Leu Ile
450 455 460
Ile Lys Arg His Arg Thr Arg Met Phe Leu Asn Leu Asp Glu Ile Ile
465 470 475 480
Ser Met Ala Glu Glu Leu Gly Phe Glu Val Val Ile Asp Glu Ala Asn
485 490 495
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500 505 510
Val Met Met Gly Val His Gly Ala Gly Leu Thr Asn Cys Val Phe Leu
515 520 525
Pro Gln His Ala Thr Leu Ile Gln Ile Val Pro Trp Gly Gly Leu Asp
530 535 540
Trp Ile Ser Arg Thr Asp Phe Gly Asn Pro Ala Glu Leu Met Gly Leu
545 550 555 560
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565 570 575
Gln Tyr Pro Arg Asp His Glu Ile Phe Lys Asn Pro Ile Ser Phe His
580 585 590
Gln Arg Gly Phe Asp Phe Ile Arg Gln Thr Phe Met Asp Lys Gln Asn
595 600 605
Val Lys Leu Asp Cys Lys Arg Phe Arg Pro Ile Leu Leu Glu Ala Leu
610 615 620
Asp Asn Leu Asn Pro
625
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gccgtggtgg gatgtgcagg tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacccacct gcacatccca cca 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccgagcggc cgaagctggt ccg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaccggacc agcttcggcc gct 23
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttcagaggtc tctctcgact agtggaatcg gcagcaaagg 40
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcgtgggtc tcgaccgacg cgtccatcca ctccaagctc 40
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctctttcgtt ccacaaacat gg 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
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<212> DNA
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<400> 19
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<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
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taccgtgccc ttactgttcc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cggtggaatg tcacagacac 20

Claims (6)

1.一种通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法，其特征在于：通过使植物的XAT基因功能缺失或下调，来提高植物的糖化效率。
2.根据权利要求1所述的通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的XAT基因功能下调为通过基因组编辑技术来下调植物体内的XAT活性，达到提高糖化效率的目的。
3.根据权利要求1或2所述的通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的植物为水稻、拟南芥、杨树、桉树、松树或麻疯树。
4.根据权利要求1或2所述的通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的植物为水稻。
5.根据权利要求4所述的通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的XAT基因为OsXAT2、OsXAT3中的至少一种。
6.通过权利要求1～5任一项所述的通过下调XAT基因提高植物糖化效率的方法获得的XAT下调植物在生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用。
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