CN105112439A - 一种提高植物糖化效率的方法及其应用 - Google Patents
一种提高植物糖化效率的方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105112439A CN105112439A CN201510486749.6A CN201510486749A CN105112439A CN 105112439 A CN105112439 A CN 105112439A CN 201510486749 A CN201510486749 A CN 201510486749A CN 105112439 A CN105112439 A CN 105112439A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plant
- saccharification efficiency
- mutant
- uxs
- xylan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开一种提高植物糖化效率的方法及其应用，属于生物质能源领域。本发明通过使植物的UXS基因功能突变或下调，来提高植物的糖化效率。通过本发明的方法使得木糖含量降低，相应地增加了纤维素相对含量，木糖含量的降低又导致突变体材料的糖化效率提高，降低了材料处理成本。因此，本发明从根本上改变了材料的生物质特性，使糖化效率有了根本上的提高，可以节约能源，降低劳动强度。通过本发明的方法获得材料可以应用在生物质转化、纸浆和造纸工业中。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源领域，具体涉及利用生物技术下调植物体内尿苷二酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UDP-Glucuronicaciddecarboxylase，UXS)的活性，UXS下调后的植物具有更高的糖化效率，本发明涉及UXS下调植物在各种应用如生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用；特别涉及一种提高植物糖化效率的方法及其应用。
背景技术
生物质能为世界第4大能源，仅次于石油、煤炭与天然气。由于其来自于植物的光合作用，可在固态、液态和气态中转化，可谓取之不尽用之不竭，是可再生能源并具有环境友好的特性。当今世界的主要使用的仍为传统能源，储存有限、不可再生和环境危害严重，重重压力下全球注意力逐步在转移至可再生能源。如何高效合理地开发生物质能对经济和社会的可持续发展有着重要意义，也已成为大势所趋的热点。
木质纤维素作为重要的生物质能源，是生产生物乙醇的主要原料。木质纤维素中的纤维素和半纤维素经水解糖化成简单糖类，最后被发酵成乙醇，糖化效率是影响生物质产量的重要因素，木质纤维素的组成与交联方式直接影响糖化效率。被子植物次生壁的半纤维素主要为木聚糖(Xylan)，木聚糖的含量与组成直接影响植物的抗逆能力、工业应用价值等。木聚糖在植物次生壁中通过与纤维素、木质素交联来提高植物的韧性、抗逆能力等，但木聚糖的存在也对木质纤维素的工业应用带来了很大的影响，木聚糖在纤维素周周形成的交联网络结构阻止纤维素分解酶进入，影响糖化效率。木聚糖合成的底物尿苷二磷酸木糖(UDP-Xylose，UDP-Xyl)主要由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶(UXS)不可逆催化尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)脱羧而来，对UXS的调节会直接影响木聚糖在植物体内的含量，进而影响木聚糖与纤维素、木质素的交联，最终改变植物的糖化效率。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种提高植物糖化效率的方法。
本发明通过改变植物木聚糖含量，从而使植物糖化效率提高。基于发明人的工作经验和当前生物质材料改良的需求，发明人认为下调木聚糖合成的底物UDP-Xyl可直接导致木聚糖含量的降低，从而改变木质纤维素的组成与结构。通过对拟南芥基因组中所有UXS的分析可知，拟南芥基因组中共有6个UXS，通过TMHMM在线预测可知UXS1，UXS2，UXS4具有跨膜区，可能定位于高尔基体，UXS3，UXS5，UXS6无跨膜区，可能定位于胞质，通过注射烟草叶片异源表达融合了YFP的UXS蛋白并在激光共聚焦显微镜下观察证实以上定位结果。进而发明人从ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)订购到了这6个UXS的突变株，这6个突变株没有表现出任何不良表型，进而对它们进行了两组杂交，最终得到了定位于高尔基体的三个基因都突变的突变株uxs1uxs2uxs4，定位于胞质的三个基因都突变的突变株uxs3uxs5uxs6，发明人的研究工作正是针对这两个突变体开展的。
在相同生长环境下，两个突变体表现出不同的生长表型，uxs1uxs2uxs4突变体生长正常，只表现出莲座叶面积变小，uxs3uxs5uxs6突变体生长矮小，叶片深绿，果荚结种量低，伴有不育。对两个突变体的基部茎段进行切片分析发现，uxs1uxs2uxs4突变体木质部导管正常，uxs3uxs5uxs6突变体木质部导管坍塌，在电镜下进行观察，二者皆表现出变薄的木纤维细胞壁。提取两个突变体的木聚糖进行分子量分析发现，二者的木聚糖分子量皆有减小，经酶解处理后进行MALDI-TOFMS分析发现，二者甲基化葡萄糖醛酸的含量皆有提高。对突变体进行单糖测定，uxs1uxs2uxs4突变体的木糖含量变化不明显，uxs3uxs5uxs6突变体的木糖含量明显降低。对突变体材料进行糖化效率分析，二者皆表现出比野生型材料更高的糖化效率。以上实验结果表明，胞质定位与高尔基体定位的UXS突变皆会给植物带来较大的影响，皆能使植物木聚糖含量降低从而导致糖化效率提高。
本发明的另一目的在于提供上述方法获得的UXS下调植物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高植物糖化效率的方法，通过使植物的UXS基因功能突变或下调，来提高植物的糖化效率。
所述的UXS基因功能突变优选为高尔基定位的UXS基因功能突变和胞质定位的UXS基因功能突变中的至少一种。
所述的UXS基因功能下调优选为通过RNA干涉技术(RNAi)或者基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调植物体内的UXS活性，达到提高糖化效率的目的。
所述的植物优选为拟南芥(Arabidopsisthaliana)、杨树(Populus)、桉树(Eucalyptus)、水稻(Oryzasativa)、松树(Pinus)或麻疯树(JatrophacarcasL.)等；更优选为拟南芥。但同时可以衍生到其它植物，通过RNA干涉技术(RNAi)或者基因组编辑技术(CRISPRI-CAS9)来下调该植物体内的UXS活性，达到提高糖化效率的目的。
对拟南芥中的6个UXS蛋白进行生物信息学分析。通过序列同源性比对分析发现，AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6氨基酸序列相似度为：91.97％；AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4氨基酸序列相似度为：75.94％；而6个UXS家族成员氨基酸序列相似度则为63.92％。用TMHMM软件对6个UXS蛋白进行跨膜区分析发现，AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4具有跨膜区，定位于高尔基体，AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6三个蛋白无跨膜区，可能定位于胞质。
对6个AtUXS蛋白进行亚细胞定位。分别将6个AtUXS蛋白的CDS序列克隆入载体pEarlyGate101，得到C端融合有YFP荧光蛋白的AtUXS，转化土壤农杆菌C58，通过注射烟草，在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白在烟草叶片表皮细胞的定位，AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4可与高尔基体定位MarkerCD3-968共定位，表明这三个UXS定位于高尔基体，AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6弥散在细胞质中，表现出定位于细胞质的特点。
获得定位于高尔基体的三个UXS都突变的突变体uxs1uxs2uxs4，定位于胞质的三个UXS都突变的突变体uxs3uxs5uxs6。订购到6个UXS单突变体后，进行两两杂交，得到双基因突变纯合体，进一步对双基突变纯合体进行杂交得到三基因突变纯合体。
对突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6进行表型分析。uxs1uxs2uxs4突变体生长正常，只表现出莲座叶面积变小，uxs3uxs5uxs6突变体生长矮小，叶片深绿，果荚结种量低，伴有不育。对两个突变体的基部茎段进行切片分析发现，uxs1uxs2uxs4突变体木质部导管正常，uxs3uxs5uxs6突变体木质部导管坍塌，在电镜下进行观察，二者皆表现出变薄的木纤维细胞壁。
对突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6进行化学免疫分析。对生长7d的种子苗进行化学免疫(抗体：LM10，CCRC-M1，CCRC-M99，CCRC-M14，JIM5，JIM7)，uxs3uxs5uxs6突变体的LM10荧光最弱但CCRC-M1荧光最强，表明此突变体木聚糖含量最低，JIM7在突变体和野生型之间没有很大差别，表明它们的甲基化同聚半乳糖醛酸含量没有受到影响，但uxs1uxs2uxs4突变体的JIM5荧光最强，表明此突变体中增加了非甲基化的同聚半乳糖醛酸。进一步对突变体基部茎切片进行LM10化学免疫，两个突变体在木质部和束间纤维处的荧光都弱于野生型。
对突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6的细胞壁成分进行分析。收集突变体的茎段材料，对突变体材料进行了单糖组成分析(J,HarholtJ,SchellerHV,OrfilaC(2004)RhamnogalacturonanIinSolanumtuberosumtuberscontainscomplexarabinogalactanstructures.Phytochemistry65:1429-1438)，结果表明，uxs3uxs5uxs6突变体的木糖含量降低了21％，uxs1uxs2uxs4突变体的木糖含量没有受到影响。
对突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6的木聚糖结构进行分析。用KOH法提取突变体材料的半纤维素木聚糖(ZhaoX,OuyangK,GanS,ZengW,SongL,ZhaoS,LiJ,DoblinMS,BacicA,ChenXY,MarchantA,DengX,WuAM(2014)BiochemicalandmolecularchangesassociatedwithheteroxylanbiosynthesisinNeolamarckiacadamba(Rubiaceae)duringxylogenesis.FrontPlantSci5:602)，并用凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography，GPC)测定分子量，1NKOH提取到的uxs3uxs5uxs6木聚糖重均分子量和数均分子量(24.3kDa，9.7kDa)皆小于野生型材料(90.2kDa，22.7kDa)，uxs1uxs2uxs4的木聚糖分子量则介于二者之间(64.4kDa，9.8kDa)，2NKOH提取到的木聚糖分子量则有不同，两个突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6的重均分子量(73.0kDa，38.5kDa)皆明显小于野生型材料(107.6kDa)，而数均分子量变化不明显。在大部分木聚糖相关的突变体中，葡萄糖醛酸(GlcA)的甲基化程度都会提高，即甲基化葡萄糖醛酸(MeGlcA)含量升高(BrownDM,GoubetF,WongVW,GoodacreR,StephensE,DupreeP,TurnerSR(2007)Comparisonoffivexylansynthesismutantsrevealsnewinsightintothemechanismsofxylansynthesis.PlantJ52:1154-1168；MJ,ZhongR,ZhouGK,RichardsonEA,O'NeillMA,DarvillAG,YorkWS,YeZH(2007)Arabidopsisirregularxylem8andirregularxylem9:implicationsforthecomplexityofglucuronoxylanbiosynthesis.PlantCell19:549-563；WuAM,RihoueyC,SevenoM,HornbladE,SinghSK,MatsunagaT,IshiiT,LerougeP,MarchantA(2009)TheArabidopsisIRX10andIRX10-LIKEglycosyltransferasesarecriticalforglucuronoxylanbiosynthesisduringsecondarycellwallformation.PlantJ57:718-731)，为探明UXS突变体是否对MeGlcA的含量有影响，对提取到的木聚糖酶解并按照(ZhongR,PenaMJ,ZhouGK,NairnCJ,Wood-JonesA,RichardsonEA,MorrisonWH,3rd,DarvillAG,YorkWS,YeZH(2005)Arabidopsisfragilefiber8,whichencodesaputativeglucuronyltransferase,isessentialfornormalsecondarywallsynthesis.PlantCell17:3390-3408)的方法进行MALDI-TOFMS，结果表明，两个突变体的MeGlcA的含量(uxs1uxs2uxs4：87.9％；uxs3uxs5uxs6：96.1％)皆高于野生型(79.1％)。上述结果表明，两个突变体木聚糖的分子量变小，GlcA甲基化程度升高，木聚糖的结构发生了较大变化。
对突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6的糖化效率进行分析。木聚糖交联于纤维素和木质素，阻碍纤维素分解酶的进入影响糖化效率，得到的突变体木聚糖结构发生了很大变化，因此突变体糖化效率也会发生较大变化。在对突变体进行纤维素混合酶酶解后，测定得到的单糖含量以计算糖化效率，两个突变体的糖化效率皆有很大提高。
另外，在杨树，桉树，水稻，松树，麻疯树等植物中也存在着高尔基体定位和胞质定位的UXS，它们的多突变体也有可预期的糖化效率提高的结果。
一种UXS下调植物，通过上述制备方法制得得到。
所述的UXS下调植物在生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
生物质能源的利用效率很大程度上取决于原材料的好坏，提高原材料的可利用成分，降低原材料的处理成本皆可以提高生物质能源利用效率，本发明的落脚点就在于这两个方面，得到的突变体材料木糖含量降低，相应地增加了纤维素相对含量，木糖含量的降低又导致突变体材料的糖化效率提高，降低了材料处理成本。现有方法大部分集中在改变材料的预处理方法上，对糖化效率的提高程度有限，本发明从根本上改变了材料的生物质特性，使糖化效率有了根本上的提高，可以节约能源，降低劳动强度。
附图说明
图1是拟南芥中6个AtUXS蛋白的序列比对图。
图2是拟南芥中6个AtUXS蛋白的跨膜区预测图。
图3是拟南芥中6个AtUXS蛋白的亚细胞定位图；其中，A为AtUXS1；B为AtUXS2；C为AtUXS3；D为AtUXS4；E为AtUXS5；F为AtUXS6。
图4是拟南芥T-DNALine突变体的检测和多突变体图；其中，A为6个AtUXS的突变体图；B为半定量PCR鉴定结果图；C，D为三突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6及野生型(WT)的图。
图5是拟南芥茎段切片图。
图6是拟南芥化学免疫结果图。
图7是葡萄糖醛酸甲基化分析图。
图8是糖化效率分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。
实施例1
对拟南芥中的6个UXS蛋白进行生物信息学分析。用DNAMAN软件对AtUXS的氨基酸序列(SEQIDNO:2、4、6、8、10、12)进行同源性分析，发现AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6氨基酸序列相似度为：91.97％；AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4氨基酸序列相似度为：75.94％，两组之间相似度则比较小(图1)。进而，对6个AtUXS蛋白进行跨膜区预测(TMHMM，http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4具有跨膜区，定位于高尔基体，AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6三个蛋白无跨膜区，可能定位于胞质(图2)。
实施例2
利用烟草注射的方法对6个AtUXS进行亚细胞定位。分别用如表1所示引物扩增6个ATUXS的cDNA序列(SEQIDNO:1、3、5、7、9、11)。
表1扩增6个ATUXS的cDNA序列的引物
| 名称 | 序列(5′→3′) |
| ATUXS1attB1 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAAGCAGCTTCACAAGCAAATGAG |
| ATUXS1attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGAGACCTTTACCTTCGTCTTC |
| ATUXS2attB1 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGAGCGAGCTGATCAATCGG |
| ATUXS2attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCAGCTGAAGTTGTCTTGGTGGTG |
| ATUXS3attB1 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGACATTTAATGCGTACTCAGG |
| ATUXS3attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTTTCTTGGGACGTTAAGCCTTAG |
| ATUXS4attB1 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCTGAGCTGACAAACCG |
| ATUXS4attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTCTGTTGATGATGAAGTGGTG |
| ATUXS5attB1 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCTAGTGATAAACAAAC |
| ATUXS5attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTTCTTGTGGACTCCGAGCCTTAG |
| ATUXS6attB1 | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGGCGTCTAATTCTTCTAACGG |
| ATUXS6attB2 | GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTTCTTCGGAACACCAAGCCTTAG |
利用Gateway技术将6个AtUXS构建至植物表达载体pEarlyGate101(ABRC，ArabidopsisBiologicalResourceCenter)，由于去除了终止密码子，AtUXS可以和YFP融合表达。将构建好的载体转化土壤农杆菌C58(AgrobactreiumtumefaciensC58)(购自上海鼎国生物技术有限公司)，采用烟草注射的方式进行亚细胞定位。AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6三个蛋白直接注射烟草叶片，AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4三个蛋白与高尔基体MarkerCD3-968(购于ABRC,ArabidopsisBiologicalResourceCenter,StockNumber:CD3-968)共注射。在暗处放置2d后于激光共聚焦显微镜下观察，YFP激发波长488nm，发射波长507nm，CD3-968激发波长587nm，发射波长610nm。AtUXS1、AtUXS2和AtUXS4可与高尔基体定位MarkerCD3-968共定位，表明这三个UXS定位于高尔基体，AtUXS3、AtUXS5和AtUXS6弥散在细胞质中，表现出定位于细胞质的特点(图3)。
实施例3
AtUXS突变的T-DNALine的获得。从ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)订购到6个AtUXS的突变体：uxs1(N555603，Salk_055603，sixthintron)，uxs2(N503691，Salk_003691，firstexon)，uxs3(N907654，WiscDsLoxHs080_09，fifthexon)，uxs4(N609630，Salk_109630，fifthintron)，uxs5(N850623，WiscDsLox293-296invD4，eighthintron)anduxs6(N678548，salk_058602，secondintron)(图4A)。在SALK(SalkInstituteGenomicAnalysisLaboratory，http://signal.salk.edu)网站合成相应的T-DNALine鉴定引物，如表2所示。
表2T-DNALine鉴定引物
| Primer Codes | Primer sequence 5′→3′ |
| N555603F | CTGAATTGCTCTATCCAACGG |
| N555603R | TCACAATGCTTGAACTTGCAG |
| N503691F | CAAGAAAACATGCACGTGTTG |
| N503691R | CTTACTCGGATCCTTTCTCCG |
| N907654F | TGATAGGGCCAGTATCATTGC |
| N907654R | GCTTCATTGGTTCTCACTTGG |
| N609630F | GGTCCTTTAATCGTACGGCTC |
| N609630R | ACCAAGGTTAAATGGACCGAC |
| N850623F | TCGCCATTGTTTACCTCACTC |
| N850623R | ATTTTCTCAGGCTCTCGCTTC |
| N678548F | GGCTTAGTTAACAAATTTTGTGGG |
| N678548R | TGCTCCAACTCGCTTAGCTAG |
| LBα1 | TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG |
| WiscDsLoxHs080_09F | TGATCCATGTAGATTTCCCGGACATGAAG |
| WiscDsLox293-296invD4 | TATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGC |
利用三引物鉴定法得到6个T-DNALine的突变纯合株。得到突变纯合体后，用表3所示引物进行半定量PCR以确定AtUXS是否还有表达。
表3半定量PCR的引物
| Primer Codes | Primer sequence 5′→3′ |
| uxs1F | CTGAATTGCTCTATCCAACGG |
| uxs1R | CCCAGGTTTAGCTCCTTCATC |
| uxs2F | ACGAGACGGATCAACCAACC |
| uxs2R | ACGATCCACGAGATGCGATC |
| uxs3F | TGATAGGGCCAGTATCATTGC |
| uxs3R | GCTTCATTGGTTCTCACTTGG |
| uxs4F | ACTTCGTTGCCCAGGCATTA |
| uxs4R | GTCGCCAAAGACACGTTGAC |
| uxs5F | ATCGATGATGGCCGTGTTGT |
| uxs5R | CACCTTTGGTTCCCATCCCA |
| uxs6F | GACGACAAAGCCACCACCTA |
| uxs6R | AGCGGGACATGCTAAATGGT |
| 18s rRNA-F | TCAACTTTCGATGGTAGGATAGTG |
| 18s rRNA-R | CCGTGTCAGGATTGGGTAATTT |
鉴定结果可知，除uxs1和uxs5还有微量表达外，其余突变体都达到了完全不表达(图4B)。
对uxs3、uxs5和uxs6两两杂交，对uxs1、uxs2和uxs4两两杂交，最终得到两个三突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6(图4C，D)。uxs1uxs2uxs4突变体生长正常，只表现出莲座叶面积变小，uxs3uxs5uxs6突变体生长矮小，叶片深绿，果荚结种量低，伴有不育。
实施例4
拟南芥茎段切片制作与观察。选取生长6～7周的植株主茎，在土壤表层以上3cm取1cm茎段，用3％(w/v)的琼脂糖包埋茎段，在LeicaVT1000S震动切片机上切片，厚度40μm，甲苯氨蓝染色1～2min，置于载玻片上于光学显微镜下观察拍照。uxs1uxs2uxs4突变体的木质部导管形态正常(图5B)，而uxs3uxs5uxs6突变体的形态不规则，坍塌比例高(图5C)。进而对茎段进行透射电镜观察，在茎部相同位置切取1mm×1mm×2mm大小的样品，转入4％(v/v)的戊二醛溶液中，抽真空；倒掉固定液，用0.1M(pH7.2)的磷酸缓冲液漂洗3次；用1％(w/v)饿酸固定2h，用0.1M(pH7.2)的磷酸缓冲液漂洗3次；用乙醇梯度处理样品10min(30％，50％，70％，80％，90％，95％)，再用100％的乙醇处理15min，重复1次；用丙酮处理样品15min，重复一次；Spurr包埋剂(购自Leica公司)与丙酮的混合液(1/3，V/V)处理样品3h，Spurr包埋剂与丙酮的混合液(1/1，V/V)处理样品3h，Spurr包埋剂与丙酮的混合液(3/1，V/V)处理样品12h，纯Spurr包埋剂处理样品12h，再换一次树脂，更换离心管；渗透处理过的样品用磨具包埋起来，45℃聚合24h，60℃聚合24h得到包埋好的样品，干燥保存；超薄切片机切片，醋酸双氧铀与柠檬酸铅溶液双重染色，晾干后于透射电子显微镜下观察。两个突变体的束间纤维细胞壁厚度明显比野生型小，野生型拟南芥为3.49μm，uxs1uxs2uxs4为2.48μm，uxs3uxs5uxs6为1.60μm(图5D～I)(图5中的ve表示导管，if代表示束间纤维)。
实施例5
对实施例4中用于光学显微镜观察的切片进行化学免疫观察。在培养皿中铺2层滤纸，用去离子水浸湿，其上放置一层Parafilm膜，将切片置于Parafilm膜上。然后按照如下步骤进行化学免疫染色：用0.1M磷酸盐缓冲液(PhosphateBufferSolution，PBS；1L:0.218gKH2PO4，1.463gK2HPO4，29.22gNaCl，pH7.2)洗涤切片5～10min；用新鲜的3％(w/v)脱脂牛乳浸泡切片1h，期间不断吹打脱脂牛乳；去除脱脂牛乳，并用PBS缓冲液洗涤切片5min；一抗孵育：用稀释20倍的大鼠抗木聚糖抗体LM10(Plantprobes)孵育切片1h，用PBS缓冲液洗涤切片10次以洗净未结合的一抗；二抗孵育：用稀释50倍的FITC-羊抗大鼠抗体(Zomanbio，Cat.Z1319)孵育1h，用PBS缓冲液洗涤切片10次以洗净未结合的二抗，将切片固定于载玻片上。对生长7d的种子苗也进行化学免疫(抗体：LM10，CCRC-M1，CCRC-M99，CCRC-M14，JIM5，JIM7；Plantprobes)，操作过程如上。将制备好的样品置于激光共聚焦显微镜(ZeissLSM710，495nm)下观察拍照。uxs3uxs5uxs6突变体的LM10荧光最弱但CCRC-M1荧光最强，表明此突变体木聚糖含量最低，JIM7在突变体和野生型(WT)之间没有很大差别，表明它们的甲基化同聚半乳糖醛酸含量没有受到影响，但uxs1uxs2uxs4突变体的JIM5荧光最强，表明此突变体中增加了非甲基化的同聚半乳糖醛酸(图6A)。对突变体基部茎切片进行LM10化学免疫，两个突变体在木质部和束间纤维处的荧光都弱于野生型(图6B，其中，ve表示导管，xy表示木质部，if表示束间纤维)。
实施例6
细胞壁单糖成分分析。收集茎段材料进行粉碎，于95％中4℃放置24h，得到的沉淀用2N三氟乙酸在120℃下水解1h，在高效阴离子交换色谱仪DionexICS3000上进行单糖测定，色谱柱为CarboPacPA20阴离子交换柱(3×150mm；Dionex)。分析结果如表4所示，uxs3uxs5uxs6突变体的木糖含量降低了21％，uxs1uxs2uxs4突变体的木糖含量没有受到影响。
表4细胞壁单糖成分分析
| 野生型 | uxs1uxs2uxs4 | uxs3uxs5uxs6 | |
| Fucose(果糖) | 0.97±0 | 0.62±0.01 | 0.79±0.03 |
| Rhamnose(鼠李糖) | 4.05±0.02 | 4.07±0.03 | 5.93±0.21 |
| Arabinose(阿拉伯糖) | 3.83±0.03 | 3.45±0.02 | 7.86±0.26 |
| Galactose(半乳糖) | 9.84±0.05 | 9.51±0.10 | 12.67±0.30 |
| Glucose(葡萄糖) | 20.48±0.03 | 19.12±0.11 | 21.89±0.64 |
| Xylose(木糖) | 55.8±0.05 | 58.34±0.20 | 44.21±0.48 |
| GalA(半乳糖醛酸) | 4.45±0.11 | 4.18±0.06 | 6.32±0.31 |
| GlcA(葡萄糖醛酸) | 0.57±0.04 | 0.7±0.06 | 0.33±0.05 |
实施例7
凝胶渗透色谱(GelPermeationChromatography，GPC)测定木聚糖分子量。收集茎段材料进行粉碎，于95％中4℃放置24h，得到的沉淀分别用1NKOH和2NKOH在50℃浸3h，所得滤液用冰乙酸调节pH至5.5，再以3倍体积的95％(v/v)乙醇沉淀，沉淀经离心后冷冻干燥，得到半纤维素木聚糖。用0.005M磷酸钠(pH7.5，含0.02NNaCl)缓冲液溶解木聚糖(1.0mgmL-1)，用GPC-MALLS方法测定木聚糖分子量。使用的检测器为DAWNHELEOS-IIlaserphotometer(WyattTechnologyCo.，USA)和OptilabrEXdifferentialrefractiveindexdetector(WyattTechnologyCo.，USA)，配备有PLaquagel-OH50column(300×7.7mm，PolymerLboratoriesLtd.USA，45℃)，游动相为0.005M磷酸钠(pH7.5，含0.02NNaCL)缓冲液，等度洗脱，流速为0.5mLmin-1。测定结果如表5所示。
表5木聚糖分子量
其中，Mw表示重均分子量，Mn表示数均分子量，Mw/Mn表示分子量分散度。
1NKOH提取到的uxs3uxs5uxs6木聚糖重均分子量和数均分子量(24.3kDa，9.7kDa)皆小于野生型材料(90.2kDa，22.7kDa)，uxs1uxs2uxs4的木聚糖分子量则介于二者之间(64.4kDa，9.8kDa)，2NKOH提取到的木聚糖分子量则有不同，两个突变体uxs1uxs2uxs4和uxs3uxs5uxs6的重均分子量(73.0kDa，38.5kDa)皆明显小于野生型材料(107.6kDa)，而数均分子量变化不明显。
实施例8
葡萄糖醛酸甲基化分析。对提取到的木聚糖用endo-β-xylanaseM6(Megazyme)酶解，酶解产物与饱和2,5-dihydroxybenzoicacid(DHB)(溶于50％乙腈)混合制样，使用MALDI-TOFMS(Bruker，9kV，8×10-7torr，200lasershots)分析，m/z峰745，759，767，781和797分别代表GlcA-Xyl4-Na，MeGlcA-Xyl4-Na，Gal-GlcA-Xyl3-Na，GlcA-Xyl4-2Na，MeGlcA-Xyl4-2NaandGal-GlcA-Xyl3-2Na，在分析时，用(MeGlcA-Xyl4-Na+MeGlcA-Xyl4-2Na)/总GlcA-Xyl4的峰面积比代表甲基化程度(图7)。结果表明，两个突变体的甲基化葡萄糖醛酸(MeGlcA)含量(uxs1uxs2uxs4：87.9％；uxs3uxs5uxs6：96.1％)皆高于野生型(79.1％)。
实施例9
糖化分析。收集茎段材料，在球磨机(PM100，German)中粉碎，取50mg于2mL水中30℃震荡30min，然后120℃处理1h，加入4mg纤维素复合酶(β-glucanase(β-葡聚糖酶)3.7×104U，cellulase(纤维素酶)3.4×102U，xylanase(木聚糖酶)6.5×104U；ImperialJadeBio-technologyCo.,Ltd)，50℃处理24h，上清过0.22μm滤膜后用HPLC(Agilent，ShodexsugarSP-0810column，refractiveindexdetector)测定。测定结果见图8，两个突变体的糖化效率皆得到了较大提高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种提高植物糖化效率的方法，其特征在于通过使植物的UXS基因功能突变或下调，来提高植物的糖化效率。
2.根据权利要求1所述的提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的UXS基因功能突变为高尔基定位的UXS基因功能突变和胞质定位的UXS基因功能突变中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的UXS基因功能下调为通过RNA干涉技术或者基因组编辑技术来下调植物体内的UXS活性，达到提高糖化效率的目的。
4.权利要求1～3任一项所述的提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的植物为拟南芥、杨树、桉树、水稻、松树或麻疯树。
5.权利要求1～3任一项所述的提高植物糖化效率的方法，其特征在于：
所述的植物为拟南芥。
6.通过权利要求1～5任一项所述的提高植物糖化效率的方法获得的UXS下调植物在生物质转化、纸浆和造纸工业中的应用，其特征在于：所述的UXS下调植物通过权利要求1～5任一项所述的提高植物糖化效率的方法获得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510486749.6A CN105112439B (zh) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | 一种提高植物糖化效率的方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510486749.6A CN105112439B (zh) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | 一种提高植物糖化效率的方法及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105112439A true CN105112439A (zh) | 2015-12-02 |
| CN105112439B CN105112439B (zh) | 2018-12-07 |
Family
ID=54660551
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510486749.6A Active CN105112439B (zh) | 2015-08-07 | 2015-08-07 | 一种提高植物糖化效率的方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105112439B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106442529A (zh) * | 2016-09-26 | 2017-02-22 | 华南农业大学 | 一种新鲜烟叶切片及其制作方法与应用 |
| CN107418970A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-12-01 | 华南农业大学 | 通过下调uxt基因提高植物糖化效率的方法及其应用 |
| CN111705076A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-25 | 华南农业大学 | 通过下调xat基因提高植物糖化效率的方法及其应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103952473A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-30 | 华南农业大学 | 一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测 |
| CN104293891A (zh) * | 2013-07-16 | 2015-01-21 | 北京林业大学 | 筛选杨树生长及材性性状的PtUXS1 SNP位点、筛选方法、试剂盒及应用 |
-
2015
- 2015-08-07 CN CN201510486749.6A patent/CN105112439B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104293891A (zh) * | 2013-07-16 | 2015-01-21 | 北京林业大学 | 筛选杨树生长及材性性状的PtUXS1 SNP位点、筛选方法、试剂盒及应用 |
| CN103952473A (zh) * | 2014-03-27 | 2014-07-30 | 华南农业大学 | 一个尿苷二磷酸葡萄糖醛酸脱羧酶基因的功能检测 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| APRIL D. HARPER 等: "Biosynthesis of UDP-Xylose.Cloning and Characterization of a Novel Arabidopsis Gene Family，UXS，Encoding Soluble and Putative Membrane-Bound UDP-Glucuronic Acid Decarboxylase Isoforms", 《PLANT PHYSIOLOGY》 * |
| QINGZHANG DU 等: "The UDP-Glucuronate Decarboxylase Gene Family in Populus: Structure, Expression, and Association Genetics", 《PLOS ONE》 * |
| 吴蔼民 等: "葡萄糖醛酸木聚糖生物合成研究进展", 《华南农业大学学报》 * |
| 潘玉欣 等: "棉花ＵＸＳ 基因生物信息学分析与原核表达", 《河北农业大学学报》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106442529A (zh) * | 2016-09-26 | 2017-02-22 | 华南农业大学 | 一种新鲜烟叶切片及其制作方法与应用 |
| CN107418970A (zh) * | 2017-08-09 | 2017-12-01 | 华南农业大学 | 通过下调uxt基因提高植物糖化效率的方法及其应用 |
| CN107418970B (zh) * | 2017-08-09 | 2020-09-01 | 华南农业大学 | 通过下调uxt基因提高植物糖化效率的方法及其应用 |
| CN111705076A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-09-25 | 华南农业大学 | 通过下调xat基因提高植物糖化效率的方法及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105112439B (zh) | 2018-12-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Biswal et al. | Sugar release and growth of biofuel crops are improved by downregulation of pectin biosynthesis | |
| Huang et al. | Overproduction of native endo-β-1, 4-glucanases leads to largely enhanced biomass saccharification and bioethanol production by specific modification of cellulose features in transgenic rice | |
| Fan et al. | AtCesA8-driven OsSUS3 expression leads to largely enhanced biomass saccharification and lodging resistance by distinctively altering lignocellulose features in rice | |
| DK2041294T3 (en) | CONSTRUCTION OF HIGH EFFECTIVE CELLULASE COMPOSITIONS FOR ENZYMATIC HYDROLYSIS OF CELLULOSE | |
| Xie et al. | Global identification of multiple OsGH9 family members and their involvement in cellulose crystallinity modification in rice | |
| Chung et al. | Deletion of a gene cluster encoding pectin degrading enzymes in Caldicellulosiruptor bescii reveals an important role for pectin in plant biomass recalcitrance | |
| Zhang et al. | Identification of quantitative trait loci affecting hemicellulose characteristics based on cell wall composition in a wild and cultivated rice species | |
| Lee et al. | Biological conversion assay using Clostridium phytofermentans to estimate plant feedstock quality | |
| CN105112439A (zh) | 一种提高植物糖化效率的方法及其应用 | |
| CN106699854A (zh) | 功能蛋白pox04420及其编码基因与应用 | |
| Dash et al. | Breeding rice for sustainable bioenergy production | |
| CN104388406B (zh) | 一种内切木葡聚糖酶及其应用 | |
| Xiao et al. | Expression of the Trichoderma reesei expansin-like protein, swollenin, in poplar results in biomass with improved sugar release by enzymatic hydrolysis | |
| Belmokhtar et al. | Saccharification performances of miscanthus at the pilot and miniaturized assay scales: Genotype and year variabilities according to the biomass composition | |
| Cook et al. | Combination of pretreatment with white rot fungi and modification of primary and secondary cell walls improves saccharification | |
| Wang et al. | Improved lignocellulose saccharification of a Miscanthus reddish stem mutant induced by heavy‐ion irradiation | |
| Wang et al. | Upgrading pectin methylation for consistently enhanced biomass enzymatic saccharification and cadmium phytoremediation in rice Ospmes site-mutants | |
| CN108192909A (zh) | 包含可溶性细胞壁多糖的转基因植物 | |
| AU2011239486B2 (en) | Plants with altered cell wall biosynthesis and methods of use | |
| CN107418970B (zh) | 通过下调uxt基因提高植物糖化效率的方法及其应用 | |
| Donohoe et al. | Towards an understanding of enhanced biomass digestibility by in planta expression of a family 5 glycoside hydrolase | |
| Grabber et al. | Incorporation of flavonoid derivatives or pentagalloyl glucose into lignin enhances cell wall saccharification following mild alkaline or acidic pretreatments | |
| CN104212731B (zh) | 一种降低木质素含量的代谢途径改造方法及应用 | |
| Liszka et al. | Structural differences of cell walls in earlywood and latewood of Pinus sylvestris and their contribution to biomass recalcitrance | |
| CN111748575B (zh) | 通过下调uxe基因提高植物糖化效率的方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |