CN108192909A - 包含可溶性细胞壁多糖的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明提供生物燃料制品、木制品或其它制品，例如纸制品、纺织制品或纱线制品。所述制品可以包含来自过表达编码一种酶的核酸分子的转基因植物的材料，所述酶使植物细胞壁比野生型植物细胞壁更具水溶性。

Description

包含可溶性细胞壁多糖的转基因植物

本申请是以下申请的分案申请：申请日：2008年3月26日；申请号：200880017574.2(PCT/IL2008/000419)；发明名称：同上。

发明领域

本发明一般涉及被遗传改造而显示出改变的结构、形态或表型的植物。一般来说，改变的结构、形态或表型与表达可溶性多糖的植物的细胞壁相关，所述可溶性多糖将在细胞壁合成的过程中插入，或修饰细胞壁聚合物，以变成更可溶的。具有这些特征的植物能使溶剂和酶更快速地穿透，或者更快速地分解细胞壁，产生产物，如生物燃料制品或木制品。这些制品可更加快速便宜地加工。

发明背景

在生物质至乙醇的加工中，最耗能的步骤是预处理。该过程通过水解反应将原料的大部分半纤维素部分转变为可溶性糖，主要是木糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖。小部分纤维素转变为葡萄糖。该转变使用稀硫酸和高温(例如190℃)完成。这些条件还溶解原料中的某些木质素，并暴露随后进行酶促水解的纤维素。从那一刻起，纤维素经历糖化和发酵，将纤维素转变为乙醇。使原料植物易受液体穿透或细胞壁分解将使该加工更便宜和更快速。

同样，制备木制品、纸制品、纤维制品或纺织制品的加工方法包括将溶剂和酶穿透入原料中。这些溶剂和酶的更快速穿透也将使这些加工更便宜快捷。本发明满足了该需要，并且还提供了其它优势。

发明概述

本发明提供生物燃料制品、木制品或其它制品，例如纸制品、纺织品或纱线制品。所述制品可以包含来自过表达编码一种酶的核酸分子的转基因植物的材料，所述酶催化多糖的合成，所述多糖是水溶性的和/或将在酸处理或碱处理时融化或溶解。或者，所述多糖可被转变为第二种多糖，所述第二种多糖是水溶性的和/或将在酸处理或碱处理时融化或溶解。

更具体地说，本发明涉及表达细胞壁调节性转基因或基因构建体的转基因植物，所述转基因或基因构建体导致转基因植物具有改变的结构或形态。细胞壁调节性转基因可以为编码一种酶的基因，所述酶催化水溶性聚合物的合成，尤其是在细胞壁中的合成，特别是在这样的水溶性聚合物插入到正常细胞壁中之处的合成。这类酶的实例是果聚糖蔗糖酶(levansucrase)。这类聚合物的实例是果聚糖。

或者，所述转基因为编码一种酶的基因，所述酶催化聚合物的合成，所述聚合物然后被转变为水溶性聚合物。这类酶的实例为几丁质合酶。这类聚合物的实例是几丁质，其可被转变为壳聚糖。这类酶的另一个实例是这样的一些酶：其可以将一个或多个N-乙酰葡糖胺单元(unit)掺入到纤维素聚合物中，由此产生几丁质-纤维素聚合物，该聚合物可被转变为壳聚糖-纤维素聚合物。另外，几丁质-纤维素聚合物在未转变的情况下为本发明的一个实例，因为其是不如纤维素聚合物高级的或晶体化的结构，并因此更具水溶性。

最后，本发明的转基因可以为某种酶，所述酶可使植物中的、更具体地优选细胞壁中的既有聚合物更具水溶性。这类酶的实例是纤维二糖脱氢酶(CDH)，其可以使纤维素聚合物比其天然形式更具水溶性。

另一方面，本发明提供过表达编码一种酶的核酸分子的转基因植物，所述酶催化多糖的合成，所述多糖处于细胞壁中，并在酸处理或碱处理时融化或溶解，前提是所述酶不是透明质酸合酶，且所述多糖不是透明质酸。

附图简述

图1显示了包含3种不同启动子的构建体，其于植物细胞壁发育的不同阶段表达Lsc基因，所述构建体制备用于转化桉树杂合体(Eucalyptus hybrid)(E.europhylla XE.grandis)。

图2显示了采用使用4CL和cel1启动子的两个不同构建体的转基因事件的频率。使用4CL启动子实现的转化百分率略高于cel1启动子。

图3显示了来自第三节间的组织的扫描电子显微镜检图，其表明了野生型和表达Lsc的转基因植物之间细胞壁结构的显著差异：A-C不同放大倍数的4CL-Lsc细胞；D-Fcel1-Lsc细胞；G-I野生型细胞。

图4显示了采用钙剂(calcoflour)染色的植物细胞的UV光学显微镜检术：所述细胞于酸-醇溶液和草酸铵中预温育24小时，以浸软组织。细胞壁与野生型相比是高度多孔的。植物在处理前于组织培养物中生长5周。

图5A显示了几丁质合酶(SEQ ID NO:1；完整cds；gi|18149184|dbj|AB071039.1|)的小球藻病毒CHS mRNA。

图5B显示了豆刺盘孢(colletotrichum lindemuthianum)几丁质脱乙酰酶基因(SEQ ID NO:2；部分cds；gi|49790329|gb|AY633657.1|))。

图6显示了绿草履虫小球藻病毒1的A98R透明质酸合酶(SEQ ID NO:3；gi|52221425:50903-52609)。

图7显示了土壤杆菌属ATCC 31749β1,3葡聚糖合酶催化亚基(crd)基因(SEQ IDNO:4；完整cds；gi|40556679|gb|AF057142.2|)。

图8显示了果聚糖蔗糖酶(SEQ ID NO:5；gi|433558|emb|X75079.1)的解淀粉欧文氏菌lsc基因。

图9显示了处于组成型启动子(超级启动子)和次级发育(4cl-l)启动子之下的嵌合透明质酸合酶(has)和处于组成型启动子(具有增强子的35S)之下的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)的构建体，其用于烟草植物转化。

图10显示了野生型和两个4cl-has独立谱系之间的糖化比较。图10A比较了在不同时间(小时)通过水解释放的还原糖(mg/g干重)。图10B比较了经受纤维素酶酶促水解和酸预处理的生物质的糖化效率(释放的总糖为由滤纸释放的糖的百分率)。

图11显示了在3种独立的lsc-转基因烟草植物中的HMW果聚糖累积的TLC分析。得自菊芋(Helianthus tuberosus)的高分子量(HMW)果聚糖用作阳性对照。于不同时间对样品进行酸水解。

图12显示了纤维二糖脱氢酶(CDH；SEQ ID NO:6))的DNA序列。

图13显示了GFAT的DNA序列(SEQ ID NO:7)和氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。

发明详述

本发明涉及含有来自转基因植物的材料的制品，所述转基因植物过表达编码一种酶的核酸分子，所述酶催化第一种多糖的合成，所述第一种多糖是水溶性的，和/或将在酸处理或碱处理时融化或溶解。或者，可通过例如化学方法或酶学方法将第一种多糖转变为第二种多糖，所述第二种多糖是水溶性的，和/或将在酸处理或碱处理时融化或溶解。本发明的制品的实例包括生物燃料，优选乙醇或丁醇、木制品、纸制品、纺织制品和纱线制品。

本发明的多糖可以在酸处理或碱处理时融化或溶解，其不同于基于在多糖单元彼此氢键键合时形成的随机结构的其它多糖。本发明多糖可以在细胞壁发育过程中被分泌或产生，并可以插入到纤维素纤维之间。然后，所述植物及其细胞壁可以更容易地吸收液体，例如溶剂或酶，并因此使本发明的制品(例如木制品或纸制品)的加工更便宜和更快速。而且，所述植物可以用含有碱或酸的溶液处理，导致细胞壁更易于进行制品加工，例如将植物加工为生物燃料，例如乙醇或丁醇。

这类多糖的实例包括透明质酸、果聚糖、凝乳聚糖(curdlan)和壳聚糖。相比之下，其它多糖形成晶体型结构。这类多糖的实例包括例如纤维素和几丁质。因此，本发明的植物比野生型植物更易于接受液体穿透。

按照本发明的具体实施方案，所述酶为透明质酸合酶，且所述多糖为透明质酸；所述酶为果聚糖合酶，优选地为果聚糖蔗糖酶，且所述多糖为果聚糖；所述酶为凝乳聚糖合酶，且所述多糖为凝乳聚糖；或者所述酶为几丁质脱乙酰酶，且所述第一种多糖为壳聚糖。更具体地说，所述酶包括SEQ ID NO:1-5或由其组成。

或者，如上所述，例如可通过化学方法将第一种多糖转变为第二种多糖，所述第二种多糖将在酸处理或碱处理时融化或溶解。例如，诸如几丁质合酶的酶的过表达可以引起几丁质形成。几丁质合酶可以合成几丁质。然而，几丁质是不溶于水的。所述酶几丁质脱乙酰酶可以将几丁质转变为在稀酸中可溶的壳聚糖。或者，可通过在强碱溶液如氢氧化钠(＞40％)中于高温(90-120℃)加热将几丁质转变为壳聚糖。

优选地，可以使用启动子过表达本发明的酶。在具体的实施方案中，所述启动子是组成型植物启动子。在更具体的实施方案中，所述植物启动子是CaMV 35S启动子。在另一个具体的实施方案中，所述启动子是组织特异性植物启动子。在更具体的实施方案中，所述植物启动子是伸长组织特异性cel1启动子。在另一个具体的实施方案中，所述植物启动子是发育特异性启动子，例如纤维特异性启动子或木质部特异性启动子。其它这类启动子的实例是4Cl和Cel1。

优选地，过表达和多糖合成发生在植物的细胞壁中。因此，还可以使用编码信号肽的序列过表达本发明的酶。参见例如美国专利号6,184,440。优选地，所述酶为果聚糖合酶，例如果聚糖蔗糖酶。

在另一个实施方案中，本发明提供过表达编码一种酶的核酸分子的转基因植物，所述酶催化多糖合成，所述多糖处于细胞壁中，并在酸处理或碱处理时融化或溶解。一方面，规定所述酶不是透明质酸合酶，且所述多糖不是透明质酸。另一方面，所述核酸分子或构建体还编码涉及细胞壁中的过表达的信号肽。因此，优选所述酶在细胞壁中过表达。如上所释，获得的转基因植物比野生型更易于接受液体穿透。

按照本发明的具体实施方案，所述酶是果聚糖合酶，优选地，为果聚糖蔗糖酶，且所述多糖为果聚糖，所述酶为凝乳聚糖合酶，且所述多糖为凝乳聚糖；或者所述酶为几丁质合酶连同几丁质脱乙酰酶，且所述第一种多糖为几丁质，所述第二种多糖为壳聚糖。

或者，本发明涉及修饰纤维素，以使其更具水溶性和/或更易于对其及其所在的植物进行加工。更具体地说，纤维素微纤维是不溶性的电缆样结构，通常由约36个氢键键合的链组成，所述链含有500-14,000个β-1,4-连接的葡萄糖分子。纤维素微纤维包含围绕着每个细胞的细胞壁的核心元件。许多植物约1/3的总质量为纤维素。Somerville C,Annu.Rev.Cell Dev.Biol,22:53-78(2006)。

β-l,4-葡聚糖链的伸展特性产生了其中链可以非常精确的方式彼此相互作用而形成刚性结构的情形。因此，从不会天然作为单链存在但由合成时开始作为许多链的晶体包装的纤维素叫做微纤维。所述链以精确得使微纤维纤维素大部分为晶体的方式经葡萄糖残基之间的链内和链间的氢键键合非常坚固地结合。

还在生物圈中发现了结构相关的多糖，例如几丁质和壳聚糖。上述的几丁质是β-1,4-连接的N-乙酰葡糖胺的均聚物。在自然界中其是纤维素之后的第二丰富的聚合物。几丁质存在于节肢动物外骨骼中、真菌细胞壁中和不同的无脊椎动物的多种组分中。几丁质因为大量的强链间氢键而难以加工。同样，在上文论述的壳聚糖部分或全部是脱乙酰的几丁质。

本发明还包括这样的酶：其导致一个或多个N-乙酰葡糖胺或葡糖胺单元掺入到纤维素中，并因此导致产生比天然存在于植物细胞壁中的微纤维纤维素更低晶体化且更具水溶性的聚合物。获得的纤维素-几丁质或纤维素-壳聚糖聚合物被掺入到细胞壁中，并使植物更易于加工。

这类酶的实例是谷氨酰胺:果糖6-磷酸氨基转移酶(GFAT，也称为谷氨酰胺合酶)，该酶将果糖-6-磷酸转变为谷氨酰胺-6-磷酸，谷氨酰胺-6-磷酸是UDP-N-乙酰葡糖胺代谢途径的中间体。因此，用GFAT转化植物导致植物过量产生N-乙酰葡糖胺。然后，在植物中天然存在的纤维素合酶可将葡糖胺和N-乙酰葡糖胺(尽管其是过量的)掺入到纤维素聚合物中，用于产生新的无定形葡萄糖:N-乙酰葡糖胺和葡萄糖:葡糖胺共聚物(本文又分别称为纤维素-几丁质和纤维素-壳聚糖)。

本发明的该方面的优势是将引入植物细胞壁的改变最小化，如上所述，植物细胞壁以纤维素纤维为主。因此，植物表型改变最小，同时仍使其更具水溶性，并因此更易于加工。

实际上，就溶解性和反应性而言，控制掺入纤维素中的葡糖胺或N-乙酰葡糖胺的水平提供了新的加工性选择。具有水溶性葡糖胺内容物的纤维素可以在稀酸中变成可溶性的，导致新的加工选择，同时保持纤维素样特性，相形之下，纤维素由于在大部分溶剂中的低溶解性而具有严格的加工限制。葡萄糖:N-乙酰葡糖胺共聚物摩尔比率的实例为0.5-1.0，优选为0.8:1.0。

更具体地说，谷氨酰胺:果糖6-磷酸氨基转移酶(GFAT，也称为葡糖胺合酶)将果糖-6-磷酸转变为UDP-N-乙酰葡糖胺代谢途径中的中间体葡糖胺-6-磷酸。业已描述了植物GFAT的胚乳特异性过表达，所述植物GFAT融合至质体信号肽，以将所述酶靶向至用于在转基因玉米中合成阳离子淀粉的质体。参见WO/2000/011192。可以检测来自转基因玉米胚乳的面粉中的UDP-葡糖胺的增加量。GFAT的表达还已经增加转基因植物中透明质酸的合成。WO/2007/039314。

迄今为止所研究的所有绿藻病毒(chloroviruses)都包含GFAT的功能基因，其产生几丁质合成所需的糖前体GlcNAc-6P(Landstein等人，1998)。几丁质生产型绿藻病毒CVK2编码gfat基因(登录号AB107976)，该基因编码596个氨基酸的蛋白(Swiss-ProtQ76DQ7)。这使得CVK2几丁质生产更有效和丰富。

壳聚糖经苛刻的热-化学程序由几丁质产生。温度和NaOH浓度急剧影响脱乙酰化速率。几丁质脱乙酰化的最佳条件描述于Chang等人,Carbohydrate Research 303:327-332(1997)。使用几丁质脱乙酰酶(CDA)制备壳聚糖聚合物和寡聚物提供了远没有那么苛刻的酶处理。CDA催化几丁质中的N-乙酰胺基键水解，以产生壳聚糖。已由几种真菌纯化和表征了几丁质脱乙酰酶，包括鲁氏毛霉(Mucor rouxii)(美国专利号5,525,502)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和豆刺盘孢(Colletotrichumlindemuthianum)的两种菌株(美国专利号6,057,144)。来自豆刺盘孢(C.lindemuthianum)和构巢曲霉(A.nidulans)的酶不仅具有较大的热稳定性，而且它们不受脱乙酰化反应的产物乙酸盐抑制。

豆刺盘孢UPS9含有806bp的ORF(登录号AY633657)，其编码带有信号肽(27个氨基酸)的前蛋白(248个氨基酸)和62bp的内含子。Shrestha等人,Protein Exp.Purif,38:196-204(2004)。

GFAT基因可以由CVK2病毒克隆，CDA基因可以由豆刺盘孢UPS9克隆。GFAT或GFAT与CDA一起在烟草和白杨植物中的过表达可以处于Cel1启动子(其显示在生长细胞中特异性表达)、4CL-1启动子(其显示在次级细胞壁中特异性表达)和35S启动子(其具有强组成型表达)之下。CDA可以融合cel1信号肽，以确保细胞壁中的脱乙酰化。

UDP-N-乙酰葡糖胺的过度生产允许通过纤维素合酶将亚基掺入到纤维素聚合物中，以生产纤维素:几丁质共聚物。如上所述当两种基因一起在转基因植物中过表达时，可以通过NaOH处理或在体内通过CDA基因将纤维素:几丁质共聚物修饰为纤维素:壳聚糖。

另一方面，本发明的转基因可以为这样的酶：其可以使植物中的、更特别优选在细胞壁中的既有聚合物更具水溶性。这类酶的实例是纤维二糖脱氢酶(CDH)，且既有聚合物的实例是纤维素。CDH可以使纤维素聚合物比其天然形式更具水溶性。

CDH展示了典型的脱氢酶的特性和可以单独研究的氧化和还原半反应。氧化半反应代表糖C1位的氧化。在该位置的半乙缩醛被转变为内酯，其自发地水解为羧酸—纤维素二糖酸。Henriksson等人，J Biotechnol 7893-113(2000)。

CDH可以通过纤维素酶增强纤维素降解。例如，已经表明，通过加入来自白腐真菌(P.chrysosporium)的CDH增加利用里氏木霉(T.reesei)纤维素酶的微晶纤维素水解。Bao和Renganathan,FEBS Lett.30277-80(1992)。补加CDH的样品水解的纤维素比没有加入CDH的那些多19％。作用随着所用CDH浓度的升高而降低。羟基残基产生需要CDH结合纤维素和催化H₂O₂和Fe²⁺这二者形成的能力提示，CDH破坏纤维素的微晶晶格，并因此增加真菌纤维素酶。

CDH可以增强纤维素降解的另一种方式是消除纤维二糖产物对纤维素酶的抑制。CDH的纤维二糖氧化产物纤维二糖内酯不抑制纤维素酶。Cameron和Aust,Arch.Biochem.Biophys.376115-121(1999)。纤维素的还原性末端可能能够与邻接纤维素链的非还原性末端再聚合或“快速反向”。使用微晶纤维素作为电子供体，CDH可以催化电子受体的还原，因此，CDH有可能氧化微晶纤维素的还原性末端，以防止再聚合。

CDH例如可得自担子菌类白腐真菌(P.chrysosporium)，其中在水解纤维素条件下该氧化还原酶占胞外蛋白的约0.5％。Raices等人,Biochem.Biophys.Acta 1576,15-22(2002)。白腐真菌包含2.4-kb ORF编码CDH(登录号x88897)。作为分泌性酶，CDH具有18个氨基酸的信号肽序列。成熟蛋白含有755个氨基酸，预测质量为80,115Da(SwissProtQ12661)。序列分析提示，血红素结构域位于N末端，而黄素结构域位于C末端。CDH类似于纤维素酶结合纤维素。

得自白腐真菌的CDH已用于纸浆和造纸工业中的漂白。木质素释放发生在漂白过程中。已发现CDH对木质素降解很重要，因为其还原因酚氧化酶对木质素降解产物的作用而形成的苯氧基残基和醌。美国专利号5,866,392。

含有本发明转基因植物材料的制品包括生物燃料，具体地说是乙醇或丁醇、木制品、纸制品、纺织制品和纱线制品。优选地，本发明的酶可以使用启动子过表达。这类启动子的实例是35S、4Cl或Cel1。优选地，过表达和多糖合成发生在植物细胞壁中。因此，本发明的酶还可以使用编码信号肽的序列过表达。参见例如美国专利号6,184,440。优选地，所述酶为果聚糖合酶，例如果聚糖蔗糖酶。

本发明还涉及制备以上公开的制品和转基因植物的方法。制备所述植物的方法包括过表达编码一种酶的核酸分子，所述酶催化多糖的合成，所述多糖处于细胞壁中，并在酸处理时融化或溶解，前提是所述酶不是透明质酸合酶，且所述多糖不是透明质酸。

关于以生物质至乙醇加工制备生物燃料制品如乙醇，最耗能的步骤是预处理。该加工通过水解反应将原料的大部分半纤维素部分转变为可溶性糖，主要是木糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖。小部分纤维素被转变为葡萄糖。该转变使用稀硫酸和高温(约190℃)完成。这些条件允许原料中的一些木质素变成可溶的，并“暴露”随后进行酶促水解的纤维素。从那一刻起，纤维素可以经受糖化和发酵，将纤维素转变为乙醇或丁醇。最后，可以比较产生的乙醇量与在相同的工业条件下由野生型植物材料产生的乙醇量。

关于制备木制品或纸制品，在纸浆制备中，第一步是消化，其除去一些木质素。下一步是漂白，其氧化余下的木质素。如果如本文所公开的，植物材料的细胞壁是多孔的，则将在消化阶段除去更多的木质素，因此在漂白步骤中将需要更少的化学品。

另外，约84％的木浆通过化学方法产生。第一类的化学制浆叫做牛皮纸/苏打法。该方法使用基于钠的碱溶液(白液)，其由氢氧化钠和硫酸钠组成，以消化木屑和产生纸浆。第二类化学制浆是硫酸法。在该方法中，亚硫酸和硫酸氢盐离子的酸溶液用于降解木质素。参见Smook,载于：Handbookfor pulp and paper technologists(1992),第2版,Wilde,Vancouver。本发明通过使细胞壁更易于接受液体吸附和分解，使任一种方法都更便宜和更快速。成功程度可以通过比较用本发明的植物和相应的野生型植物实施相同的加工来检测，例如比较处理的液体穿透程度或者产生木制品的速度或成本。

已过表达了本发明范围内的酶。参见例如Ebskamp等人，Nature Biotech,12:272-75(1994)；Sevenier等人，Nature Biotech,843-46(1998)；美国申请公开号20060168690和美国专利号5,908,975。然而，未表明这类酶在细胞壁中表达，且未表明产生的多糖存在于该处。而且，如上文所公开的，本发明设想制备包括来自转基因植物的材料的本发明制品。相比之下，任何教导本发明的酶的技术都没有教导或提示如此制备本发明制品的方法。

对转化植物或其子代筛选表达所需蛋白、多肽或酶的植物。而且，表现出所需的改变结构或形态的工程改造植物可用于植物育种或直接用于农业生产或工业应用。具有一种改变的酶、蛋白或多肽的植物可以与另外被工程改造为具有其它生长调节性酶、蛋白或多肽改变的改变植物杂交，以产生与亲代或祖代植物相比更进一步增强改变的结构形态特征的谱系。

核酸序列的特性是可变的，多种潜在的宿主植物细胞的遗传结构也是可变的。所述本发明的示例性实施方案可包括技术人员认为虽不是绝对必需但明显有利的众多特征。这些特征包括分离、合成或构建基因构建体的方法，将基因构建体导入到植物细胞中的操作，基因构建体的某些特征和与基因构建体相关的载体的某些特征。

此外，可以针对DNA或RNA分子编码本发明的基因构建体。按照本发明，优选通过基因组整合外源导入的核酸构建体，尤其是重组DNA构建体，实现所需的目标植物的稳定基因型变化。尽管如此，按照本发明，这样的基因型改变也可以通过导入游离体(DNA或RNA)而实现，所述游离体可以自主复制，并且是体和胚稳定的。在导入的核酸构建体含有RNA的情况下，可通过以逆转录产生的DNA中间体，由这样的构建体进行植物转化或基因表达。

可以使用本领域技术人员众所周知的方法产生本文描述的核酸构建体。技术人员可以参阅例如Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,New York的关于重组DNA方法的教导，所述重组DNA方法可用于分离、表征和操作构建体组分以及建立构建体自身。在某些情况下，当已知所需组分的核酸序列时，对所需组分进行合成可能是有利的，而不是由生物来源分离获得。在其它情况下，所需的组分可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增来有利地产生。

按照本发明，可通过用基因构建体转化植物细胞来工程改造能够表达本发明的酶的转基因植物，所述构建体包含编码这种酶的序列。在一个实施方案中，植物启动子与编码所需酶的序列有效结合。“有效结合的”或“有效连接的”在本文用于表示通过“结合的”或“有效连接的”启动子控制的转录产生功能性信使RNA，其翻译产生所述酶。

在本发明的优选实施方案中，结合的启动子是强的且非组织特异性或发育特异性的植物启动子(例如在许多或全部植物组织类型中强表达的启动子)。这类强“组成型”启动子的实例包括但不限于CaMV 35S启动子、T-DNA甘露碱合成酶启动子以及它们的多种衍生物。

在本发明的另一个实施方案中，可以用包含编码一种酶的序列的基因构建体有利地工程改造植物，所述酶有效结合组织特异性或发育特异性启动子，例如但不限于cel1启动子、CHS启动子、PATATIN启动子和4Cl启动子。例如，当需要在伸长组织和器官中表达时，可以使用诸如cel1启动子的启动子。

在本发明的又一个实施方案中，可以用基因构建体有利地转化植物，所述基因构建体包含编码一种酶的序列，所述酶有效连接修饰的启动子或人工启动子。通常，通过重组不同启动子的结构元件构建的这类启动子具有独特的表达模式和/或在天然启动子中不存在的水平。参见例如Salina等人,Plant Cell,4:1485-93(1992)，例如由顺式调节元件与启动子核心组合构建的人工启动子。

在本发明的再一个实施方案中，可以通过增加基因的拷贝数工程改造编码本发明的酶的基因的表达。一种用增加拷贝的所需基因生产植物细胞的方法是用核酸构建体转化，所述构建体包含多个拷贝的所述基因。或者，编码所需多肽的基因可以处于核酸构建体中，所述核酸构建体含有扩增选择标记(ASM)基因，例如谷氨酰胺合成酶(GS)基因或二氢叶酸还原酶基因。对用这样的构建体转化的细胞实施培养方案，所述方案选择具有增加的ASM基因拷贝数的细胞系。参见例如Donn等人,JMol.Appl.Genet.,2:549-62(1984)关于用于分离含有扩增的GS基因拷贝的植物细胞系的选择方案。因为所需基因与ASM基因紧密连锁，所以扩增ASM基因的细胞系应当也有可能扩展编码所需酶的基因。

在本发明的又一个实施方案中，可通过用编码调节基因的核酸构建体转化植物细胞来工程改造所述酶的表达，所述调节基因控制编码所需酶的内源基因或转基因的表达，其中修饰所导入的调节基因，以允许在所需组织和/或发育阶段强表达所述酶。

本发明的重组构建体可以包括用于增殖所述构建体的选择标记。例如，在细菌中增殖的构建体优选含有抗生素抗性基因，例如赋予对卡那霉素、四环素、链霉素或氯霉素的抗性的基因。适用于增殖所述构建体的载体包括质粒、粘粒、噬菌体或病毒，在此仅举几例。

另外，重组构建体可以包括植物可表达的选择标记基因或筛选标记基因，用于分离、鉴定或跟踪由这些构建体转化的植物细胞。选择标记包括但不限于赋予抗生素抗性(例如对卡那霉素或潮霉素的抗性)或除草剂抗性(例如对磺酰脲、草铵膦或草甘膦的抗性)的基因。筛选标记包括但不限于编码β-葡糖苷酸酶(Jefferson,Plant Molec Biol.Rep,5:387-405(1987))、荧光素酶(Ow等人,Science,234:856-59(1986))以及调节花青色素生产的B和Cl基因产物(Goff等人,EMBO J,9:2517-22(1990))的基因。

在利用土壤杆菌系统转化植物的本发明的实施方案(参见下文)中，重组DNA构建体至少另外含有侧接要转化入植物细胞中的DNA序列的右T-DNA边界序列。在优选的实施方案中，要转移的序列侧接右和左T-DNA边界序列。正确设计和构建基于这类T-DNA的转化载体，对于本领域技术人员来说，是众所周知的。

按照本发明，可通过用本文描述的核酸构建体转化植物细胞获得所需植物。在某些情况下，可能需要用几种不同的基因构建体来工程改造植物或植物细胞。这样的工程改造可以通过用全部所需的基因构建体同时转化植物或植物细胞完成。或者，可以序贯进行工程改造。即，如下完成遗传改造：用一种基因构建体转化，在选择和筛选后获得所需转化体，用第二种基因构建体转化所述转化体，诸如此类。在某些实施方案中，每种基因构建体可以连接至不同的选择标记基因或筛选标记基因，以利于鉴定含有多个基因插入序列的植物转化体。在其它实施方案中，可以通过针对每种基因的工程改造型亲代系的杂交，将几种不同的基因掺入一种植物中。

在本发明的一个实施方案中，使用土壤杆菌将基因构建体导入到植物中。这样的转化优选使用二元土壤杆菌T-DNA载体(Bevan,Nuc.Acid Res.,12:8711-21(1984))和共栽培方法(Horsch等人,Science,227:1229-31(1985))。一般而言，土壤杆菌转化系统用于工程改造双子叶植物(Bevan等人,1982,Ann.Rev.Genet 16:357-384；Rogers等人,1986,Methods Enzymol.118:627-641)。土壤杆菌转化系统还可以用于将DNA转化和转移至单子叶植物及植物细胞(参见Hernalsteen等人,EMBO J,3:3039-41(1984)；Hooykass-VanSlogteren等人,Nature,311:763-64(1984)；Grimsley等人,Nature,325:1677-79(1987)；Boulton等人,Plant Mol.Biol,12:31-40(1989)；和Gould等人,Plant Physiol,95:426-434(1991))。

在其它实施方案中，还可以使用不同替代方法将重组核酸构建体导入到植物和植物细胞。这些其它方法在所述靶为单子叶植物或植物细胞的情况下特别有用。替代的基因转移和转化方法包括但不限于以下：通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的裸DNA吸收进行的原生质体转化(参见Paszkowski等人,EMBO J,3:2717-22(1984),Potrykus等人,Molec.Gen.Genet.,199:169-77(1985)；Fromm等人,Proc.Nat.Acad.Sci USA,82:5824-28(1985)；和Shimamoto,Nature,338:274-76(1989)；和植物组织的电穿孔(D′Ηalluin等人,Plant Cell,4:1495-1505(1992))。其它的植物细胞转化方法包括微注射、碳化硅介导的DNA吸收(Kaeppler等人,Plant Cell Reporter,9:415-418(1990))和微粒子轰击(参见Klein等人,Proc.Nat.Acad.Sci USA,85:4305-09(1983)；和Gordon-Kamm等人,PlantCell,2:603-18(1990))。

按照本发明，可以使用本发明的核酸构建体和上述的多种转化方法，针对本文所述的所需生理学和农艺学特征，工程改造多种植物和植物细胞系统。在优选的实施方案中，用于工程改造的目标植物和植物细胞包括但不限于那些单子叶植物和双子叶植物，例如农作物，包括谷类作物(例如小麦、玉米、水稻、黍、大麦、大豆)、结果作物(例如番茄、苹果、梨、草莓、橙子)、饲料作物(例如苜蓿)、根类蔬菜作物(例如胡萝卜、马铃薯、糖甜菜、薯蓣)、叶类蔬菜作物(例如莴苣、菠菜)；开花植物(例如矮牵牛、玫瑰、菊花)、木本植物、针叶树和松树(例如松冷杉(pine fir)、火炬松、辐射松、云杉)；白杨、柳树、桉树、刺槐、油椰子、甘蔗、洋姜；多年生牧草(例如柳枝稷、芒属(miscanthus))；用于植物修复的植物(例如累积重金属的植物)；油类作物(例如向日葵、油菜籽)和用于实验目的的植物(例如拟南芥)。

作为另一个实例，可以由转基因植物制备DNA，设计DNA-特异性引物，然后进行PCR。在已进行PCR后，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，并用溴化乙锭、SYBRGreen溶液等染色，由此检测为条带的扩增产物。因此可以证实转化。或者，可以使用先前已用荧光染料等标记的引物经PCR检测扩增产物。此外，可以通过例如荧光反应或酶反应使扩增产物结合固相，例如微量滴定板，由此证实扩增产物。

如上所述，单子叶植物或双子叶植物可用于转化。单子叶植物的实例包括属于以下的那些：Graniineae，例如水稻、大麦、小麦、玉米、甘蔗、结缕草、高粱、谷子和粟；百合科，例如芦笋、百合、洋葱、韭菜和日本紫藤(Japanese dogtooth violet)；以及姜科，例如生姜(ginger)、蘘荷姜(Zingiber mioga)和姜黄。双子叶植物的实例包括但不限于属于以下的那些：十字花科，例如拟南芥、甘蓝、油菜籽、花椰菜、椰菜和萝卜；茄科，例如番茄、茄子、马铃薯和烟草；豆科，例如大豆、豌豆、菜豆和苜蓿；葫芦科，例如黄瓜、瓜和南瓜；伞形科，例如胡萝卜、芹菜和鸭儿芹；紫菀科，例如莴苣；锦葵科，例如棉花和秋葵；藜科，例如糖甜菜和菠菜；桃金娘科，例如桉树和丁香；以及杨柳科，例如白杨。

在本发明中，要转化的植物材料的实例包括：植物组织，例如根、茎、叶、种子、胚芽、胚珠、子房、根尖(在植物秧苗边缘的生长点)、花粉囊和花粉；这类植物组织的部分；未分化的愈伤组织；和培养的植物细胞，例如通过经酶处理除去细胞壁制备的原生质体。

本发明的转基因植物是指全株、植物器官(例如根、茎、叶、花瓣、种子或果实)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅栏组织或海绵组织)或培养的植物细胞。

当要转化培养的植物细胞时，可以经常规组织培养技术由获得的转化细胞再生器官或个体。通过由植物细胞再生植物的常用技术，本领域技术人员可容易地实施这类程序。例如，可以以以下方式由植物细胞再生植物。

当植物组织或原生质体用作要转化的植物材料时，首先在形成愈伤组织的培养基中培养它们，所述培养基已被灭菌，并加入例如无机元素、维生素、碳源、作为能源的糖或植物生长调节剂(植物激素，例如发育素或细胞分裂素)，并允许形成无限增殖(indeterminately proliferating)去分化愈伤组织(在后文该方法被称为“愈伤组织诱导”)。将由此形成的愈伤组织转移至含有植物生长调节剂如发育素的新培养基中，然后进一步增殖(即传代培养)。

在固体培养基如琼脂中进行愈伤组织诱导，并在例如液体培养基中进行传代培养。这使得两种培养均可以有效地大量实施。随后，在合适条件下，培养经前述传代培养增殖的愈伤组织，以诱导器官的再分化(此后称为“再分化的诱导”)，最终再生完整植株。可以恰当地通过确定培养基中的每种成分的类型和量，进行再分化诱导，所述成分例如植物生长调节剂(如发育素或细胞裂解素)，以及碳源、光、温度和其它条件。这样的再分化诱导导致形成不定胚芽、不定根、不定芽、不定枝条等，其导致生长为完整植株。或者，这类材料可以它们变成完整植株之前所属的状态储存(例如囊化的人工种子、干胚芽或冻干的细胞和组织)。

按照本发明，可通过将一种或多种公开的基因构建体工程改造入多种植物细胞类型(包括但不限于原生质体、组织培养细胞、组织和器官外植体、花粉、胚芽以及全株)获得所需植物。在本发明的实施方案中，在下述的方案和方法之后，对工程改造的植物材料选择和筛选转化体(已掺入或整合了导入的一个或多个基因构建体的那些)。然后可将分离的转化体再生为植株。或者，可将工程改造的植物材料再生为植株或小植株，之后对得到的植株或小植株进行标记基因性状的选择或筛选。在选择或筛选标记基因之前或之后由植物细胞、组织或器官再生植株的方法是本领域技术人员众所周知的。

可以通过选择或筛选工程改造的植物材料由转化DNA上存在的标记基因编码的性状，鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂的培养基上培养工程改造的植物材料进行选择，转化基因构建体赋予对所述抗生素或除草剂的抗性。此外，转化的植物和植物细胞还可以通过筛选可能存在于本发明的重组核酸构建体上的任何可见标记基因(例如β-葡糖苷酸酶、萤光素酶、B或C1基因)的活性来鉴定。这样的选择和筛选方法是本领域技术人员众所周知的。

还可以使用物理和生物化学方法鉴定含有本发明的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)检测和测定重组DNA插入序列的结构的DNA分析或PCR扩增；2)用于检测和检验基因构建体的RNA转录物的RNA印迹、实时定量RT-PCR、S1RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶-PCR扩增；3)检测酶或核酶活性的酶测定，其中这样的基因产物由所述基因构建体编码；4)蛋白凝胶电泳、蛋白质印迹技术、免疫沉淀或酶联免疫测定，其中所述基因构建体产物为蛋白。还可以使用其它的技术(例如原位杂交、酶染色和免疫染色)检测特定植物器官和组织中的重组构建体的存在情况和表达。进行所有这些测定的方法对本领域技术人员是众所周知的。

可以将本发明的基因导入到植物中，然后将其用作转基因植物的选择标记基因。本发明的标记基因可以单独导入或与要表达的其它靶基因组合导入。

可以将本发明的标记基因导入单子叶植物或双子叶植物中。其实例如上所列，并优选能够形成愈伤组织的植物。

可以将本发明的标记基因导入到例如以下组织、部分或细胞中：植物组织，例如根、茎、叶、种子、胚芽、胚珠、子房、根尖(在植物秧苗边缘的生长点)、花粉囊和花粉；这类植物组织的部分；未分化的愈伤组织；和培养的植物细胞，例如通过经酶处理除去细胞壁制备的原生质体。在本发明中，一般将标记基因导入到为了将这样的基因导入到植物中而由植物中取出的组织部分、愈伤组织或原生质体，并将导入的标记基因掺入植物组织的细胞中，具体地说是掺入其染色体中。

当将标记基因单独导入到植物中时，可以将标记基因连接至质粒，以制备重组载体。但是，当将标记基因连同靶基因一起导入到植物中时，标记基因和靶基因连接至相同的质粒，以制备重组载体。或者，可以由通过将靶基因连接至质粒获得的重组载体单独地制备通过将选择标记基因连接至质粒获得的重组载体。在单独制备重组载体时，将两种载体共转染入宿主中。在载体制备过程中，可以将启动子连接至靶基因或标记基因上游的位置，并可以将终止子连接至其下游的位置。启动子的实例包括花椰菜花叶病毒35S启动子、OCS-mas超级启动子、肌动蛋白启动子和遍在蛋白启动子。终止子的实例是胭脂碱合酶基因终止子。将载体导入到植物中的方法的实例包括前述方法和与其类似的方法。

可将表现出其它特性的基因连同本发明的标记基因一起掺入到载体中，以获得表现出这些特性的再分化植株，所述特性例如针对给定细菌的抗微生物特性、对给定药物的耐受、合成给定的有用材料的能力、对给定的植物激素的敏感性或与原始植物的特性不同的形态特性。

优选由其中已以前述方式导入标记基因的原生质体或植物组织形成愈伤组织，并进一步培养所形成的愈伤组织。愈伤组织诱导、传代培养和诱导再分化的方法如上所述。

可按照在植物组织培养中通常采用的前述技术使选定的植物生长。或者，可以将这样的材料以它们变成完全植株之前所属的状态(例如囊化的人工种子、干胚芽或冻干的细胞和组织)储存。

本发明还包含与SEQ ID NO：1-5具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％和99％以上的同源性的核酸序列。对于序列比较，通常一个序列用作参比序列，将测试序列与其比较。在使用序列比对算法时，将测试序列和参比序列输入计算机中，如有需要指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者可以指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列同一性百分率。

本文所用的“比较窗”包括参比选自20-600个、通常约50个至约200个、更通常约100个至约150个连续位置数中的任一个的区段，其中在最佳比对两个序列后，可以将序列与相同连续位置数的参比序列比较。用于比较的序列比对方法在本领域众所周知。用于比较序列的最佳比对可如下进行：例如可以通过Smith和Waterman,Adv.Appl.Math,2:482,1981的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch,J.Mol.Biol.,48:443(1970)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman,Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA,85:2444(1988)的相似性检索方法、通过这些算法的计算机实现(Wisconsin遗传软件包，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)或者通过手工比对和目测(参见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编辑，1995增补))。

有用算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进式成对比对产生一组相关序列的多个序列比对，以表明关系和序列同一性百分率。其还做出了树图或系统树图，所述图表明了用于产生比对的聚簇关系。PILEUP使用Feng和Doolittle,J.Mol.Evol,35:351-360(1987)的简化的渐进比对法。所用的方法类似于Higgins和Sharp,CABIOS,5:151-153(1989)描述的方法。所述程序可以比对至多300个序列，每个序列的最大长度为5,000个核苷酸或氨基酸。多个比对方法以两个最相似的序列的成对比对开始，产生两个比对序列的聚簇。然后将该聚簇与下一个最相关的序列或比对序列的聚簇进行比对。通过简单延伸两个单独序列的成对比对来比对两个序列聚簇。最后的比对通过一系列的渐进式成对比对来实现。所述程序如下运行：指定序列比较区域的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标，并指定程序参数。使用PILEUP，使用以下参数：默认空位权重(3.00)、默认空位长度权重(0.10)和加权的末端空位，比较参比序列和其它测试序列，以确定序列同一性关系百分率。PILEUP可以得自GCG序列分析软件包，例如7.0版(Devereaux等人,Nuc.Acids Res.,12:387-395(1984)。

适于确定序列同一性百分率和序列相似性的算法的另一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人,Nuc.Acids Res,25:3389-3402(1977)和Altschul等人,J.Mol.Biol.,215:403-410(1990)。进行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短字节来鉴定高得分序列对(HSP)，所述短字节在与数据库序列中相同长度的字节比对时匹配或满足一定的正值阈值得分T。T被称为邻近字节得分阈值(Altschul等，出处同上)。这些初始邻近字节命中结果用作启动搜索以寻找含有它们的更长HSP的种子。字节命中结果沿着每个序列以双向延伸，只要累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的赏分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用记分矩阵计算累积得分。在发生以下情况时停止每个方向上的字节命中结果延伸：累积比对得分从其最大获得值下降量X；由于一个或多个负记分残基比对的积累，使得累积得分达到0或以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)利用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝－4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3、期望值(E)10的默认值，BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:10915,1989)使用比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝－4，并比较两条链。

BLAST算法还进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见例如Karlin&Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci USA 90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性检测是最小和概率(P(N))，其提供两个核苷酸序列或氨基酸序列之间会偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参比核酸比较的最小和概率低于约0.2，更优选低于约0.01，最优选低于约0.001，则核酸被认为与参比序列相似。

两个核酸序列或多肽基本相同的指示是由第一种核酸编码的多肽与抗体(针对由下述的第二种核酸编码的多肽产生的)免疫交叉反应。因此，多肽通常与第二种多肽基本相同，例如两种肽的差异仅在于保守取代的情况下。两种核酸序列基本相同的另一个指示是两种分子或其互补物在如下所述的严格条件下彼此杂交。两种核酸序列基本相同的又一个指示是相同的引物可用于扩增所述序列。

本发明的基因还包括在严格条件下与由核苷酸序列组成的DNA(其与SEQ ID NO:1-5所示核苷酸序列组成的DNA互补)杂交的DNA。本发明还包括在严格条件下与由核苷酸序列组成的DNA(其与包含SEQ ID NO:1-5或由SEQ ID NO:1-5组成的DNA互补)杂交的DNA。

术语“严格条件”是指其中形成所谓的特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。在这样的条件下，例如，由高度同源的核酸组成的DNA(即由与示于SEQ ID NO:1-5的核苷酸序列表现出约65％以上、优选约75％以上、更优选约85％以上以及最优选约95％以上同源性的核苷酸序列组成的DNA)的互补链杂交，但具有的同源性低于前述水平的核酸的互补链不杂交。更具特异性的条件为：钠浓度为150mM-900mM、优选600mM-900mM，同时温度为60℃-68℃，而优选65℃。

本发明的酶还可以包括编码蛋白的一个以上的缺失、添加或取代，其不会消除编码蛋白的活性，这是本领域技术人员周知的。可通过经本领域已知的技术修饰前述蛋白编码基因实施氨基酸残基的缺失、添加和取代。可以经常规技术，如Kunkel法或空位双链法，或者与所述方法相似的技术，将突变导入到基因中。例如，使用诱变试剂盒，例如Mutant-K(Takara)或使用定点诱变的Mutant-G(Takara)或Takara LA PCR体外诱变系列试剂盒(Takara)，导入突变。

一旦确定了本发明基因的核苷酸序列，就可以通过化学合成、利用克隆的cDNA作为模板的PCR或者利用具有这样的核苷酸序列的DNA片段作为探针的杂交获得本发明的基因。此外，可以通过例如定点诱变合成编码前述基因的修饰DNA。

本发明还涉及通过以取代、添加或缺失改变cel1序列而制备的Cel1衍生物或类似物，其提供具有本文公开的酶活性的分子。因此，本发明的酶包括含有全部或部分由SEQ IDNO:1-5编码的氨基酸序列作为一级氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包括序列改变,其中功能等同的氨基酸残基取代序列中的残基，该取代后的多肽仍然具有功能活性。例如，序列中的一个或多个氨基酸残基可以被相似极性的另一个氨基酸取代，所述另一个氨基酸用作功能等同物，产生沉默改变。序列中的氨基酸的保守取代可以选自氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。这样的酶衍生物可通过化学肽合成制备，或通过重组产生编码酶的核酸制备，所述核酸已被突变。可以使用本领域已知用于诱变的任何技术，包括但不限于化学诱变、体外定点诱变、使用TAB.RTM接头(Pharmacia)和用含突变的引物进行的PCR。

此外，如有需要，可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加导入到酶、衍生物或类似物中。非经典的氨基酸一般包括但不限于普通氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸，例如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和氨基酸类似物。此外，所述氨基酸可以为D(右旋的)或L(左旋的)。

本发明还涉及分离的核酸分子，其包含启动子的核苷酸序列。本发明还包括(a)重组核酸载体，其包含任一种前述植物编码序列和/或其互补物(即反义序列)；(b)重组核酸表达载体，其含有与引导编码序列表达的调节元件有效连接的前述编码序列的任一种；和(c)含有任一种前述编码序列的遗传工程改造的宿主细胞，所述编码序列与引导编码序列在宿主细胞中表达的调节元件有效连接。本文使用的调节元件包括但不限于诱导型和非诱导型启动子、增强子、操作子和本领域技术人员已知驱动和调节表达的其它元件。这样的调节元件包括但不限于来源于植物细胞基因组的启动子(例如热激启动子；RUBISCO小亚基启动子；叶绿素a/b结合蛋白启动子)或来源于植物病毒的启动子(例如CaMV的355RNA启动子；烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白启动子、巨细胞病毒hCMV立即早期基因、SV40腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操作子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子以及酵母α-交配因子的启动子。

本发明包括包含核酸分子的重组核酸载体，所述核酸分子包含(a)SEQ ID NO:1-5；(b)SEQ ID NO:1-5的变体核苷酸序列，其是等位基因变体、种变体及其天然的或人工的功能变体；或(c)编码由SEQ ID NO:1-5编码的多肽的衍生物或类似物的核酸分子。

本发明还涉及含有上述重组核酸载体的宿主细胞。本发明进一步涉及含有编码分泌性信号肽的第一个核酸序列的重组核酸载体和编码本发明的酶的第二个核酸序列。

本发明还包括根据众多标准中的任一种的判断与由SEQ ID NO:1-5编码的酶功能等同的蛋白，所述标准包括但不限于本文公开的酶活性。这样的功能等同酶包括但不限于由上述核苷酸序列编码的氨基酸序列中的氨基酸残基的添加或取代，但其导致沉默突变，由此产生功能等同的基因产物。

可基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性实施氨基酸取代。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

尽管可以对DNA实施随机突变(使用本领域技术人员众所周知的随机诱变技术)并测试所获突变酶的活性，但可以对编码序列的定点诱变工程改造(使用本领域技术人员众所周知的定点诱变技术)，以产生具有增加的功能的突变植物细胞。

可以对编码序列实施其它突变，以产生更适于在选定宿主细胞中表达、放大等的酶。例如，半胱氨酸残基可被缺失或被另一个氨基酸取代，以便消除二硫键；可以改变或消除N-联糖基化位点，以实现例如同源产物的表达，所述同源产物更易于由已知高糖基化N-联位点的酵母宿主回收和纯化。

尽管可以化学合成所述多肽，但大的多肽自身可以有利地通过本领域众所周知的用于表达含酶基因序列和/或编码序列的核酸的重组DNA技术产生。这样的方法可用于构建含所述核苷酸序列和适宜的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。或者，可以使用例如合成仪化学合成能够编码cel1核苷酸序列的RNA。

本发明范围还包括在合成过程当中或之后被差异修饰的酶蛋白、衍生物和类似物，所述差异修饰方式例如生物素化、苄基化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、聚乙二醇化、通过已知的保护基/封闭基衍生化、蛋白水解、连接至抗体分子或其它细胞配体。可以通过已知技术实施众多化学修饰中的任一种，所述技术包括但不限于乙酰化、甲酰化、氧化、还原或在衣霉素存在下的代谢合成。这些修饰可用于增加本发明的酶的稳定性、生物利用度和/或作用。

上述的任一种酶、衍生物或类似物都可以额外具有共价连接至其氨基和/或羧基末端的非肽大分子载体基团。这样的大分子载体基团可以包括例如脂质-脂肪酸缀合物或碳水化合物。

可以使用多种宿主表达载体系统来表达本发明的核苷酸序列。可以使用本领域技术人员众所周知的方法构建含有编码序列和适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。

可以使用多种宿主表达载体系统以表达编码序列。这些包括但不限于微生物，例如用含有植物GluR编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用包含植物GluR编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫系统；用含有编码序列的重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统，或用含有编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者用重组病毒表达载体(例如腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统，包括被工程改造为含有多个拷贝的序列的细胞系，所述序列被稳定扩增(CHO/dhfr)，或者在双微染色体中被不稳定扩增(例如鼠细胞系)。

这些系统的表达元件的强度和特异性可变。根据所用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用众多合适的转录和翻译元件中的任一种，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，例如噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用的启动子诸如：杆状病毒多角体蛋白启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用来源于植物细胞基因组的启动子(例如cel1启动子、热激启动子；RUBISCO小亚基启动子；叶绿素a/b结合蛋白启动子)或来源于植物病毒的启动子(例如CaMV的35S RNA启动子；TMV的外壳蛋白启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)；在产生含有多个拷贝的cel1DNA的细胞系时，可以使用基于SV40-、BPV-和EBV-的载体和适宜的选择标记。

就其中使用植物表达载体的情况而言，可以通过众多启动子中的任一种驱动编码序列的表达。例如，可以使用病毒启动子，诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子或TMV的外壳蛋白启动子。或者，可以使用植物启动子，例如cel1启动子或其功能片段、RUBISCO的小亚基或热激启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B。可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等，将这些构建体导入到植物细胞中。关于这些技术的综述，参见例如Weissbach&Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,AcademicPress,NY,第8章,421-463页(1988)；及Grierson&Corey,Plant Molecular Biology,第2版，Blackie,London,7-9章(1988)。

为长期高得率生产重组蛋白，优选稳定的表达。例如，可以工程改造稳定表达所述酶的细胞系。可以用由合适的表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的酶DNA和选择标记转化宿主细胞，而不是使用含有病毒复制起点的表达载体。在导入外源DNA后，可允许工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换至选择培养基。在重组质粒中的选择标记赋予对选择的抗性，并允许细胞稳定地将质粒整合入其染色体中并生长，以形成转化灶，所述转化灶再可克隆和扩增入细胞系中。

可以使用许多选择系统，包括但不限于可分别在tk.sup.-、hgprt.sup.-或aprt.sup.-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因。另外，抗代谢物抗性可以用作以下的选择基础：dhfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性；和hygro，其赋予对潮霉素基因的抗性。已描述了其它的选择基因，即trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸DFMO的抗性。本发明还包括(a)DNA载体，其含有任一种前述的编码序列和/或其互补物(即反义序列)；(b)DNA表达载体，其含有任一种前述的编码序列，所述编码序列与引导编码序列表达的调节元件有效连接；和(c)基因工程改造的宿主细胞和/或植物，其含有任一种前述的编码序列，所述编码序列与引导编码序列在宿主细胞中表达的调节元件有效连接。本文使用的调节元件包括但不限于诱导型和非诱导型启动子、增强子、操作子和本领域技术人员已知驱动和调节表达的其它元件。

实施例

提供以下的实施例仅仅是为了阐述，无意以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

本实施例表明了植物中的几丁质和壳聚糖的合成及其作用。

几丁质为β-1,4-连接的N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)的均聚物，是自然界中在纤维素之后的第二丰富的聚合物。几丁质存在于节肢动物的外骨骼中、真菌的细胞壁中和不同的无脊椎动物的多种组分中(Kawasaki等人,Virology:302,123-31(2002))。

壳聚糖是部分或完全脱乙酰化的几丁质。其天然存在于某些微生物和真菌中。脱乙酰程度范围40％-98％。可溶性多糖带正电荷。壳聚糖的溶解性取决于pH和脱乙酰程度。其在稀酸溶液中是充分可溶的。壳聚糖在溶液中的粘度随着脱乙酰程度增加和温度降低而增加。Ilium L.,Pharm.Res.,15:1326-31(1998)。

绿藻病毒CVK2具有功能性几丁质合酶的基因(CHS；登录号AB071039；SEQ ID NO:1)，其编码516个氨基酸的蛋白(Swiss-Prot Q8V735)。CVK2CHS显示出与酵母和真菌的CHS3型酶的高度相似性。然而，其大小显著小于真菌的酶(1000-1300个氨基酸)，且序列相似性限于那些酶的羧基末端区，在该区域中存在保守催化位点(Nagahashi等人,J Biol.Chem.,270:13961-67(1995)；Kawasaki等人,2002,出处同上)。已表明在真菌酶中延伸的N-末端区涉及酶活性的加工和调节(Nagahashi等人,1995,出处同上)。CVK2CHS蛋白的较小尺寸可能反映了其较简单的调节和加工机制以及在细胞中的不同定位方法。新合成的几丁质被有效地穿过小球藻膜和细胞壁分泌至胞外基质，提示CVK2CHS蛋白可整合入所述膜和细胞壁中，在该处其通过加入UDP-GlcNAc合成几丁质分子，并将不溶性材料转运至细胞外间隙(Cabib,E.,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.59:59-101(1987))。所有的绿藻病毒连同迄今为止所研究的CVK2均包含GFAT的功能性基因，其产生几丁质合成所需的糖前体GlcNAc-6P(Landstein等人,Virology,250:388-96(1998))。该功能性基因使CVK2几丁质生产更有效和丰富。

几丁质脱乙酰化以生产壳聚糖的方法

经苛刻的热-化学方法由几丁质生产壳聚糖。温度和NaOH浓度显著影响脱乙酰化速率。几丁质脱乙酰化的最佳条件描述于Chang等人,Carbohydrate Research,303:327-32(1997)。利用几丁质脱乙酰酶制备壳聚糖聚合物和寡聚物可以克服大部分这些缺陷。几丁质脱乙酰酶(CDA；EC 3.5.1.41)催化几丁质中的N-乙酰氨基键水解，产生壳聚糖。已经由几种真菌纯化并表征了几丁质脱乙酰酶。已充分研究的酶是得自真菌鲁氏毛霉(Mucorrouxii)(美国专利号5,525,502)、蓝色犁头霉(Absidia coerulea)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)和豆刺盘孢(Colletotrichum lindemuthianum)的两种菌株(美国专利号6,057,144)的那些。来自豆刺盘孢(C.lindemuthianum)和构巢曲霉(A.nidulans)的酶在潜在的生物技术应用方面的一种令人感兴趣的特性在于，除了其热稳定性之外，它们还不受脱乙酰反应的产物乙酸盐抑制(Tsigos等人,Trends Biotechnol,18:305-12(2000))。豆刺盘孢(C.lindemuthianum)UPS9包含806bp的ORF(登录号AY633657；SEQ IDNO:2)，其编码带有信号肽(27个氨基酸)的前蛋白(248个氨基酸)和62bp的内含子(Shrestha等人,Protein Expr.Purif.,38:196-204(2004))。

克隆CVK2的CHS基因和豆刺盘孢(C.lindemuthianum)UPS9的CDA基因。单独的CHS基因或两个基因一起在Cel1启动子(在生长细胞中特异性表达)、4CL-1启动子(在次级细胞壁中特异性表达)和35S启动子(强组成型表达)下在烟草和白杨植物中过表达。

通过在研磨机中进行NaOH处理或当两种基因一起在转基因植物中过表达时由CDA基因在体内将几丁质修饰为壳聚糖。壳聚糖分子在酸处理过程中在研磨机中融化或溶解，并利于液体穿透和细胞壁分解。

实施例2

本实施例显示了植物中的透明质酸的合成及其作用。

透明质酸(HA)是长度可变的长链多糖，其含有葡糖醛酸和n-乙酰葡糖胺的重复二糖单元。该多糖一直被认为是胞外基质、尤其是脊椎动物的软结缔组织中的相对惰性的组分，其表现出令人感兴趣的粘弹性和构象特征。HA是高度亲水性的生物分子，在水溶液中表现为相当显著固有刚性的扩展型无规卷曲。基于其最近发现的调节炎症的作用，HA还作为许多不同疾病的潜在治疗剂而备受关注(DeAngelis,P.L,CellMol.Life Sci,56:670-82(1999))。

HA合酶(HAS)是内在膜蛋白，其使用活化的尿苷二磷酸(UDP)-糖核苷酸作为底物聚合HA分子。已由419-588个残基的大小范围的基因测序推断出某些HAS的氨基酸序列(DeAngelis等人,JBiol.Chem.,268:19181-84(1993))。尽管已针对HA在众多生物和病理过程中的重要性进行了大量研究，但负责其合成的酶直至最近仍难以捉摸。链球菌HA合酶(HAS)的克隆导致鉴定出3种哺乳动物酶，被称为HAS1、HAS2和HAS3(Recklies等人,Biochem.J.,354:17-24(2001))。最近，已发现小球藻病毒PBCV-1包含约1900bp ORF A98R(GenBank登录号U42580；SEQ ID NO:3)，其编码与已知的HAS具有相似性的568个残基的蛋白(DeAngelis等人,Science,278:1800-03(1997))。先前已描述了重组A98R蛋白在植物中的克隆和表达以及透明质酸的分离(美国申请公布号20060168690)。

A.构建体的制备：

制备包含不同启动子的构建体，用于转化烟草植物(Nicotiana tabacum)，所述构建体于不同的植物细胞壁发育阶段表达透明质酸合酶基因。参见图9。

B.稀酸预处理

将植株样品(200mg干燥的烟草茎)与1.8ml稀硫酸溶液(1％重量/体积)在玻璃Erlenmeyer中混合，并在高压蒸汽装置中于121℃加热1小时。固体预处理残基被酶促水解。

C.酶促水解

使用改进形式的NREL实验室分析方法9测定纤维素消化性。Brown L.和TorgetR.Enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass；LAP-009.NRELAnalytical Procedure.National Renewable Energy Laboratory,Golden,CO。用DDW洗涤酸预处理的样品，在玻璃纤维纸上过滤后烘箱干燥。如下对样品进行缓冲：加入1.5ml 1M柠檬酸(pH 4.8)、来自绿色木霉菌(trichoderme viride)的纤维素酶(1ml)和麝香草酚(15μl的50gl^-1溶液，在70％体积/体积乙醇中)，以达到15ml终体积。内容物在振荡温育器中于45℃和125rpm温育72小时。依据先前描述的Ghose法的检测，纤维素酶混合物具有40个滤纸单位/ml的活性。分析温育上清液的可溶性碳水化合物。按照Ghose利用DNS试剂分析总可溶性碳水化合物。Ghose,T.K.,Pure and Applied Chemistry 59:257-268(1984)。

D.结果

处于4cl-1启动子转基因系之下的2种独立透明质酸合酶的糖化效率和生物质释放的还原糖(mg/g干重)(has61和has63)大于对照植物。参见图10。在72小时温育后，糖化效率在has61和has63系中为71-76％，相比之下在对照中为49％。

实施例3

本实施例显示了植物中的凝乳聚糖的合成及其作用。

凝乳聚糖是葡萄糖的高分子量聚合物β-1,3-葡聚糖，其通过纯培养物发酵由细菌土壤杆菌生物变种1(Agrobacterium biobar 1)(在发现时被鉴别为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis var.myxogenes))或Agrobacterium radiobactor的非致病性和非致毒性菌株产生。凝乳聚糖由β-(1,3)-连接的葡萄糖残基组成，并具有在加热其水性混悬液时形成弹性凝胶的不常见特性(Mclntosh等人,Appl.Microbiol Biotechnol,68:163-73(2005))。已鉴定了3种形式的再生凝乳聚糖，并提出了它们之间的结构差异。Kasai N.和Harada T.,Fiber Diffraction Methods,ACS Symp.序列号141,Washington,DC.363-383(French A.D.和Gardner K.H.编辑(1980))。

凝乳聚糖以三螺旋、单螺旋或单链存在，这主要取决于水合程度、加热温度和溶剂条件(Zhang等人,Int.J.Biol.Macromol.,30:7-16(2002))。加热凝乳聚糖的水性混悬液至80℃以上，然后将其冷却，产生高凝固度(high-set)热不可逆的凝胶，而低凝固度(low-set)热可逆的凝胶在加热至55℃时产生。凝胶化包括杆样三螺旋通过非共价结合的聚集(扩展结合区)。三螺旋链于高温可能展开，得到单链，随着温度降低，单链退火，再形成三螺旋。在高凝固度凝胶中，涉及一个以上复合物的单链可互相连接成三螺旋。在低凝固度凝胶中，凝乳聚糖分子作为单螺旋链存在(Kasai和Harada 1980，出处同上)。在碱溶液中，凝乳聚糖三螺旋展开，并在中和或对水透析时，在不加热的情况下形成低凝固度凝胶。这样的已中和凝胶在加热至80℃以上时转变为不可逆的高凝固度凝胶。已有文件记载了低凝固度和高凝固度凝乳聚糖的流变学和热性能(Zhang等人，2002,出处同上)。

由DNA序列(1,965bp)推断的凝乳聚糖合酶(crdS；登录号AF057142；SEQ ID NO:4)产物(73kDa)与β-d-聚糖合酶共有同源性，所述β-d-聚糖合酶包括细菌和植物纤维素合酶，以及壳寡糖和透明质酸合酶，它们是糖基转移酶家族GT2的成员(Coutinho P.M.和Henrissat B.,Recent advances in carbohydrate bioengineering.The Royal Societyof Chemistry,(Cambridge Gilbert HJ,Davies G,Henrissat B,Svensson B编辑(1999))。在土壤杆菌中，CrdS是整合内在膜蛋白，具有7个跨膜(TM)螺旋、1个非跨膜两亲螺旋和N_out-Cⁱⁿ排列(Karnezis等人,Trends Glycosci Glycotechnol,12:211-27(2000)；Karnezis等人,Glycobiology,13:693-706(2003))。

crdS基因由土壤杆菌菌株ATCC31749克隆，并在Cel1启动子(在生长细胞中特异性表达)、4CL-1启动子(在次级细胞壁中特异性表达)和35S启动子(强组成型表达)之下在烟草和白杨植物中过表达crdS。

包含凝乳聚糖分子的转基因植物材料将在热处理过程中形成凝胶，将在研磨机中的酸处理过程中融化或溶解，并将利于液体穿透和细胞壁分解。

实施例4

本实施例显示了植物中的果聚糖的合成及其作用。

是果聚糖(寡果糖和聚果糖)而不是淀粉作为主要储存碳水化合物，在12-15％的高等植物中天然存在。淀粉和果聚糖之间的最明显差异是位置和溶解性。果聚糖位于液泡中，并且相比于不溶的质体淀粉是可溶的。

生产果聚糖的细菌可以存在于广泛的微生物中，包括存在于动物和人的口和肠道菌群中的植物病原体和细菌。其中可以发现生产果聚糖的菌株的细菌菌属的实例为杆菌(Bacillus)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、欧文氏菌(Erwinia)和放线菌(Actinomyces)(Hendry和Wallace,Science and Technology of Fructans,119-139页(CRC Press,Boca Raton,FL,M Suzuki,NJ Chatterton编辑，(1993))。一般而言，细菌产生的果聚糖分子主要由β-(2-6)-连接的果糖基残基组成，偶尔包含β-(2-l)-连接的支链。这样的果聚糖叫做聚果糖(levan)，并可以达到100,000个以上果糖单元的DP。细菌聚果糖由单一酶果聚糖蔗糖酶(LSC)在胞外产生，该酶直接由蔗糖产生聚果糖(Vijn&Smeekens,Vijn I.和Smeekens S.,Plant Physiol.,120:351-59(1999))。解淀粉欧文氏菌(E.amylovora)包含lsc基因(1248bp；SEQ ID NO.5)，其编码415个氨基酸的蛋白(登录号X75079)。

已表明用LSC转化的植物相比于野生型植物包含更高分子量的果聚糖。

A.聚果糖沉淀：

用研钵和研棒研磨500mg干物质，并用2ml 80％沸腾乙醇萃取粉末15分钟。在以10,000g离心10分钟后，用1ml水于80℃再萃取沉淀物3次，每次15分钟。合并萃取物，并以Speed-Vac浓缩器浓缩至50μl。

B.TLC分析：

在10cm×20cm垂直水槽玻璃展开室中通过溶剂蒸汽饱和进行TLC分析。在TLC分析之前，用0.02M乙酸钠预处理硅胶层。然后在烘箱中于50℃干燥平板5分钟。将10μl样品施加至平板底部。用乙醇-水(85:15，体积/体积)作为流动相于实验室温度展开各层。在层展开和流动相于热空气流中蒸发15分钟后，通过尿素-磷酸喷雾检测糖。Wise等人,Ann.Biochem.27:33-36(1955)。由菊芋(Helianthus tuberosus)纯化的果聚糖和果糖用作标准品。已检测了在lsc-转基因植物中的高分子量果聚糖。图11。

果聚糖蔗糖酶催化由蔗糖合成水溶性果聚糖聚合物。在细胞壁中表达果聚糖蔗糖酶产生含果聚糖聚合物的木材，所述聚合物插入到正常细胞壁中。在细胞壁中的可溶性果聚糖“袋”的产生能够使溶剂和酶快速穿透，由此有利于在工业过程中的更加快速便宜地加工木制品。我们报告了细菌果聚糖蔗糖酶在转基因桉树植物中于不同启动子下的表达。提供了对植物生长和细胞壁结构的作用。

制备含有不同启动子的构建体(其于不同的植物细胞壁发育阶段表达Lsc基因)，用于桉树杂合体(Eucalyptus hybrid)(E.Gurophylla X E.grandis)的转化。参见图1。如图2所示，使用4CL启动子相比于cel1启动子达到的转化百分率稍高一点。如在图3中所示，野生型和表达Lsc的转基因植物之间在细胞壁结构方面存在显著差异。如在图4中所示，转基因植物的细胞明显小于野生型植物的细胞。细胞壁相比于野生型是高度多孔的。

上述结果表明，4CL-Lsc转基因不引起植物生长的任何显著降低，但显著产生多孔的细胞壁表型。因此，对于遗传改善木材以利用于工业加工来说，添加Lsc基因是非常重要的。

预期在细胞壁中表达果聚糖蔗糖酶产生含果聚糖聚合物的木材，所述聚合物插入到正常细胞壁中。在细胞壁中产生的可溶性果聚糖“袋”能使溶剂和酶快速穿透，由此有利于在工业过程中更快速便宜地加工木制品。

本文提及的所有参考文献都整体通过引用结合到本文中。要认识到的是，以上的详述仅意在阐述本发明的某些优选实施方案。其绝对无意限制在实施方案中陈述的本发明的范围。

1.一种生物燃料制品、木制品、纸制品、纺织制品或纱线制品，所述制品包含来自过表达编码一种酶的核酸分子的转基因植物的材料，所述酶使所述植物比野生型更具水溶性。

2.实施方案1的制品，其中所述植物的细胞壁比野生型植物的细胞壁更具水溶性。

3.实施方案1的制品，其中所述酶催化第一种多糖的合成，所述第一种多糖在碱处理或酸处理时将融化或溶解。

4.实施方案1的制品，其中所述酶催化第一种多糖的合成，所述第一种多糖被转变为第二种多糖，所述第二种多糖在碱处理或酸处理时将融化或溶解。

5.实施方案1的制品，其中所述酶催化一个或多个单元的糖的合成，所述糖被掺入植物细胞壁中的纤维素中。

6.实施方案5的制品，其中所述酶为谷氨酰胺-果糖-6-磷酸氨基转移酶(GFAT)。

7.实施方案6的制品，其中所述酶与几丁质脱乙酰酶一起被过表达。

8.实施方案1的制品，其中所述酶使植物中的纤维素更具水溶性。

9.实施方案7的制品，其中所述酶为纤维二糖脱氢酶(CDH)。

10.实施方案1的制品，其中所述植物比野生型更易接受液体穿透。

11.实施方案3的制品，其中所述酶为透明质酸合酶，且所述第一种多糖为透明质酸。

12.实施方案3的制品，其中所述酶为果聚糖合酶，且所述第一种多糖为果聚糖。

13.实施方案12的制品，其中所述果聚糖合酶为果聚糖蔗糖酶。

14.实施方案3的制品，其中所述酶为凝乳聚糖合酶，且所述第一种多糖为凝乳聚糖。

15.实施方案3的制品，其中所述酶为几丁质脱乙酰酶，且第一种多糖为壳聚糖。

16.实施方案4的制品，其中所述酶为几丁质合酶，所述第一种多糖为几丁质，而所述第二种多糖为壳聚糖。

17.实施方案1的制品，其中所述制品为生物燃料。

18.实施方案17的制品，其中所述生物燃料为乙醇或丁醇。

19.实施方案1的制品，其中所述制品为木制品。

20.实施方案1的制品，其中所述制品为纸制品。

21.实施方案1的制品，其中使用启动子过表达所述酶。

22.实施方案21的制品，其中所述启动子为35S、4Cl或Cel1。

23.一种过表达编码一种酶的核酸分子的转基因植物，所述酶催化多糖合成，所述多糖处于细胞壁中，并在碱处理或酸处理时融化或溶解，前提是所述酶不是透明质酸合酶。

24.实施方案23的植物，其中所述植物比野生型更易接受液体穿透。

25.实施方案23的植物，其中所述酶催化聚合物的合成。

26.实施方案25的植物，其中所述聚合物被掺入到植物细胞壁中的纤维素中。

27.实施方案23的植物，其中所述酶为GFAT。

28.实施方案27的植物，其中所述酶与几丁质脱乙酰酶一起被过表达。

29.实施方案23的植物，其中所述酶使植物中的纤维素更具水溶性。

30.实施方案29的制品，其中所述酶为CDH。

31.实施方案25的植物，其中所述酶为果聚糖合酶，且所述多糖为果聚糖。

32.实施方案31的植物，其中所述果聚糖合酶为果聚糖蔗糖酶。

33.实施方案25的植物，其中所述酶为凝乳聚糖合酶，且所述多糖为凝乳聚糖。

34.实施方案25的植物，其中所述酶为几丁质脱乙酰酶，且所述多糖为壳聚糖。

35.一种纸制品，所述纸制品包含来自实施方案23的植物的材料。

36.一种木制品，所述木制品包含来自实施方案23的植物的材料。

37.一种生物燃料制品，所述生物燃料制品包含来自实施方案23的植物的材料。

38.实施方案37的生物燃料制品，其中所述制品为乙醇或丁醇。

39.一种过表达核酸分子或构建体的转基因植物，所述核酸分子或构建体编码a)一种酶，所述酶催化多糖合成，所述多糖位于细胞壁中，并在碱处理或酸处理时融化或溶解；和b)信号肽，所述信号肽将所述酶引导到植物的细胞壁中。

CPCH1663533D 序 列 表

<110> CBD Technologies Ltd.

Yissum Research Development Company of the Hebrew

University of Jerusalem

Shoseyov, Oded

Shani, Ziv

Abramson, Miron

Barimboim, Noga

Dekel, Mara

Lapidot, Sahul

<120> 包含可溶性细胞壁多糖的转基因植物

<130> 43042

<150> US 60/907,344

<151> 2007-03-29

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1707

<212> DNA

<213> 小球藻病毒(Chlorella virus)

<400> 1

ttgacttata aaagagaaca catatttgtt tcgttaaaat aaattaacgc gaaaacgaaa 60

aacacaatgc tgcctctcaa aatcaagagt agcatactgt atgcggttat cttggccatt 120

aactttggga ttgctttcgc tcgtcattat atttcatgag tattggtatg catttgcgcc 180

tattcttgta ctcggcgctg cgtcttctct gtggtatatt gcgtgggtgc ttatgcatcg 240

tgtatactta ggtttcaaag gaaaacccgt gctgaccgcc cccaaagaac ctatgatgtt 300

cctcgtcaca gcgtatcgcg agacgaagga agaacttgat agaaccgtgg agtccgttac 360

gatgcaaaaa atagaccccg aggttagcaa gactgttgtt gttattgttg atggtgagaa 420

ggaaactgca cacgaactac gaaagtataa ccagtatgat gaaactttcg tcatcaaaga 480

tgcatatgag gattggcata ataagccaaa ggatgttaca attttcaaga aaatacataa 540

tggtattgac gtcgtatatc tcataaaaag tgagaacgcg ggaaaacgtg atagcgttgt 600

gcttgcacga actcttgcat acggaaatct gttcgaacat agtgaaaaca gacatgctat 660

gaaaatttca ggcgaattag acctcatatg gtctcgtttg gtaccgaaag ttacccgtat 720

gattggtatt gacgccgaca ctgttttcca cgaggattgc tctcaagctc ttcttgaaga 780

aatgaattat cccggtgata ggccggttga cggtgttgtt ggttatattg atattgagat 840

ggggaaaggt aaatctccct atcaaaaggc ttggatttgg ttccaaggaa ttggttatat 900

aatcggccag catgtgatgc gcgtatacca gagcaggata accgaaaagg taagttgttt 960

gtcgggcgct tgttacggta tttacgtccc taccatgtgc gaacctgagt tgttgaaaga 1020

atttaatacg cctcctcccc caaacgccgg tttgtttctt agtattcttg gttatgcttc 1080

cgaagatcgt agatcagtcg tcctgtcact atgtcgtgat aggaacgtcc gttttagaca 1140

ggcacttgat agtcgtgcgg tcgcttatac agtgcctcca gataacttta cagtttttat 1200

ctcacagagg cgtcgttggt ctcttggcac tgtatgcaat aatctatggc tctttcttta 1260

tggaaagaat ttgtatattt ccgaacgtat tatagctctt gttcaagtta ttggttttct 1320

gttttcaccc ctttatctca tggttaacgt atatttgatt tatattctag tttctagatt 1380

cgatatcaaa ctgatttata tttctatccc aatgttcttg gtgtatctga ataacctttg 1440

catccctgtg tggtcccctt gcatgggttc tcttagaaat cgtctatcgt attatccaaa 1500

attgattatg gcattttttt attctccatg ggtttcagtc atcattcaag caaactccgt 1560

tatcaaaagt tttagtgttt cgtggggaaa aactgtggtt aaaacgactt ccgagacaac 1620

taaaattaca caaaccaata cacttgtctg aaacgtatcg ttgtaaatat caatcacaca 1680

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1707

<210> 2

<211> 809

<212> DNA

<213> Glomerella lindemuthiana

<400> 2

atgcacttct cgaccctttt tggcgccgcg gctactgctg ctctcgctgg cagcacgaac 60

gcaaggtacg tcgccggcgg ctccttgggc ccttgacaca gacaccccag actgacacaa 120

ctcacagccc tctcgcccgt cgccaggttc ccgtgggcac acccatcctc cagtgcaccc 180

agcctggtct ggttgccctg acctacgacg acggtccctt caccttcacc ccgcagctcc 240

tcgacatctt gaagcagaac gacgtcaggg cgaccttttt cgtcaacggc aacaactggg 300

ccaacatcga ggccggatcc aaccccgaca ccatccgccg catgcgcgcc gacggccacc 360

tcgtcggctc tcacacgtac gctcacccgg acctcaacac gctctcctcc gcggaccgca 420

tctcccagat gcggcacgtc gaggaggcta cccgccgcat cgacggcttc gcgcccaagt 480

acatgcgcgc gccctacctg tcgtgcgacg cgggctgcca gggcgacctc ggcggcctcg 540

gataccacat catcgacacc aacctcgaca ccaaggacta cgagaacaac aagcccgaga 600

ccacgcacct ctcggccgag aagttcaaca acgagctgag cgccgacgtc ggcgccaaca 660

gctacattgt cctctcgcac gacgtccacg agcagacggt cgtctccctc acgcagaagc 720

tgattgacac gctcaagagc aagggctacc gcgccgtcac cgtcggcgag tgcctcggcg 780

acgccccgga gaactggtac aaggcgtaa 809

<210> 3

<211> 1707

<212> DNA

<213> 绿草履虫小球藻病毒(Paramecium bursaria Chlorella virus)1

<400> 3

atgggtaaaa atataatcat aatggtttcg tggtacacca tcataacttc aaatctaatc 60

gcggttggag gagcctctct aatcttggct ccggcaatta ctgggtatgt tctacattgg 120

aatattgctc tctcgacaat ctggggagta tcagcttatg gtattttcgt ttttgggttt 180

ttccttgcac aagttttatt ttcagaactg aacaggaaac gtcttcgcaa gtggatttct 240

ctcagaccta agggttggaa tgatgttcgt ttggctgtga tcattgctgg atatcgcgag 300

gatccttata tgttccagaa gtgcctcgag tctgtacgtg actctgatta tggcaacgtt 360

gcccgtctga tttgtgtgat tgacggtgat gaggacgatg atatgaggat ggctgccgtt 420

tacaaggcga tctacaatga taatatcaag aagcccgagt ttgttctgtg tgagtcagac 480

gacaaggaag gtgaacgcat cgactctgat ttctctcgcg acatttgtgt cctccagcct 540

catcgtggaa aacgggagtg tctttatact gggtttcaac ttgcaaagat ggaccccagt 600

gtcaatgctg tcgttctgat tgacagcgat accgttctcg agaaggatgc tattctggaa 660

gttgtatacc cacttgcatg cgatcccgag atccaagccg ttgcaggtga gtgtaagatt 720

tggaacacag acactctttt gagtcttctc gtcgcttggc ggtactattc tgcgttttgt 780

gtggagagga gtgcccagtc ttttttcagg actgttcagt gcgttggggg gccactgggt 840

gcctacaaga ttgatatcat taaggagatt aaggacccct ggatttccca gcgctttctt 900

ggtcagaagt gtacttacgg tgacgaccgc cggctaacca acgagatctt gatgcgtggt 960

aaaaaggttg tgttcactcc atttgctgtt ggttggtctg acagtccgac caatgtgttt 1020

cggtacatcg ttcagcagac ccgctggagt aagtcgtggt gccgcgaaat ttggtacacc 1080

ctcttcgccg cgtggaagca cggtttgtct ggaatttggc tggcctttga atgtttgtat 1140

caaattacat acttcttcct cgtgatttac ctcttttctc gcctagccgt tgaggccgac 1200

cctcgcgccc agacagccac ggtgattgtg agcaccacgg ttgcattgat taagtgtggg 1260

tatttttcat tccgagccaa ggatattcgg gcgttttact ttgtgcttta tacatttgtt 1320

tactttttct gtatgattcc ggccaggatt actgcaatga tgacgctttg ggacattggc 1380

tggggtactc gcggtggaaa cgagaagcct tccgttggca cccgggtcgc tctgtgggca 1440

aagcaatatc tcattgcata tatgtggtgg gccgcggttg ttggcgctgg agtttacagc 1500

atcgtccata actggatgtt cgattggaat tctctttctt atcgttttgc tttggttggt 1560

atttgttctt acattgtttt tattgttatt gtgctggtgg tttatttcac cggcaaaatt 1620

acgacttgga atttcacgaa gcttcagaag gagctaatcg aggatcgcgt tctgtacgat 1680

gcaactacca atgctcagtc tgtgtga 1707

<210> 4

<211> 2085

<212> DNA

<213> 土壤杆菌ATCC 31749

<400> 4

attgggcgag ccctgcgggt tcactcctat acccgcaggg cagttcttca ttttcaaaaa 60

tgatgttcag atgcgcgccc ggaacccgac gcgcagccga ccaactgcga ggttagggcg 120

atgtatttca gtgctgaagg tgacgttcag tcggtgctct atgtgaacct gacgattgcg 180

attggggcga tcctgtttgc ccttctcgct gatcccagaa agatggtcga caggttggcc 240

ttcagcatca tcatgttgct atcgcttggt gtctatatcg tatggcgggc aacggatacc 300

ttgccgccgc cggaactctc cctcgaaacg ctctggtgct acacctattt caccttcgag 360

ctgatctcgg tgctttatgc catggggtcc atcctcatac ttcttcgccg aaccgactgg 420

tcagccgttg ccgatcaggg agaggcatat cttgcaggca acccgcatgc gccgctcgtc 480

gatgtgttta tctgcactta caacgagccg ctgaacgttc tcgaaaaatc catcatcgcc 540

gcgcaggcga tggattatcc tcgactgcgc gtcttcgtct gtgacgacac acgtcgcggg 600

gaggtaagaa cctattgcga agcggcaggc gtgaactacg tcacacgtcc cgacaacaag 660

cacgccaagg caggaaatct caacaatgcg ctgctccaca ccaatgcgct ggaagaggtt 720

tccgacttca tcatggtcct cgacgcggat tttgcccccc aggcaaactt cctgcggcgc 780

gtgacgggtc tcttttcgga cccgaaggtg gctgtcgtcc agacgcctca attctatttc 840

aacagtgatc caattcagca caatctcggt atagacaaga gcttcgtgga cgaccagcgg 900

gtcttcttcg acgatttcca gccggccaag gatgccgttg gttgcgcttt tcgcgtcggc 960

accagcttcg tcgtacgccg cgccgcggta aatggtattg gtggtttccc tacggatgcg 1020

cttaccgaag acatgctgct gacatatcgc ctgatggaaa ggggatatgt cacgcgctgg 1080

ctgaatgaga agtggagcgt tggattgtcg gcggaaggtg tacccgaata catcacccag 1140

cgcacccgct ggtgtctcgg cacgatccag atcgggcttc tgcggaccgg acctctctgg 1200

cgtggaaatt ttacgctgac gcagcggctg cactatctgc atggactttt ctgctggctg 1260

tcgaagccgc ttatcctgtg cctgctgctt gcgccgtcca tctattggct gacgggcgtg 1320

tcggcgctgc aggtcgatga gctgatgttc atgaagctcg gcctgtcatc tcttgcgctt 1380

ttctggacct attccacctg gatatccggc aagaggacgc ttcctctctt caccgaagtc 1440

acccacgccc tgaccgctgt acccattacc atcacgcttt ttcaggcaat ccgtaaaccg 1500

ttcgggcgcc cgttcaaagt caccgaaaag ggaggagacc gatcccaggt ccgtgtccac 1560

ctcccgacgg ggattttttt cgctttcgtg accctgtctt cggccgtctc catcgtgctg 1620

gctgtctatg gtctggatgc tccgtccgag ctgtcctcgc gggactgcct caatctgatc 1680

tggtccgccg tcgcgatggt tatcgcattc accagcttca tttgctgcat tgaattgccg 1740

cgtttcggca aggaggaaat gatcggagtg gattttcgcg ggcagttgcg gtccgcatcc 1800

tcaacgagac cggtgcgtat caccggcctc tcgacggaaa acatcacact ggctgcggtt 1860

ccgtcttcca gcgatgtaaa ggatgttttc gtaccggagg cggggtggat gcggatcagc 1920

cctgcggagc acgcgcagaa ctccggaaag ttcgatattc atccaagcga cgagcagcgc 1980

cggtccattt tgcgcctgtt gtttcgcaag gctcctgaaa atgtcgcgga acagggcgac 2040

ctgatgaaat ccatgcggat tcttctcgca cgggcattcg ggtga 2085

<210> 5

<211> 1406

<212> DNA

<213> 解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)

<400> 5

ctgcagcgat catggttatt tataagggat tgttatgtcc tgaaaaccac acaacagaac 60

cagagtgatt tcaaaaaata aaaagctatt aatatacaga ccttcagcaa gaaggtattc 120

gaaataacct gtgaggatat ttatgtcaga ttataattat aaaccaacgc tgtggactcg 180

tgccgatgca ttgaaagttc atgaggatga cccaaccaca actcaaccgg ttattgacat 240

tgcattcccg gtaatgagtg aagaagtctt tatttgggat accatgccat tgcgagactt 300

cgacggagag attatctctg taaatggttg gtgtattatt tttacgctaa cagcagatcg 360

caacactgat aatccgcaat tccaggatga aaatggcaat tatgatatta ctcgtgactg 420

ggaagacaga catggtcgtg cgcgtatttg ttattggtac tcacgcaccg gtaaagactg 480

gatttttggc ggtcgggtaa tggccgaagg tgtcgcaccg acgacgcgtg agtgggccgg 540

aaccccgatc cttttaaacg atcggggcga tattgacctg tattatacct gtgtcactcc 600

gggtgcaacc attgccaaag tgcgcggtaa aatcgtcact tccgatcaaa gtgtaagcct 660

ggaaggtttt cagcaggtta catcactttt ctctgctgac gggactattt accagacgga 720

agagcagaac gctttctgga acttccgtga cccaagccca ttcattgaca ggaatgatgg 780

caaattatat atgctgtttg aaggaaacgt ggcggggccg cgcggttcgc acgaaattac 840

ccaggctgag atgggtaatg tgccgccggg ttatgaagat gtgggtggcg caaaatatca 900

ggcaggctgt gttggtctgg ctgtggccaa agacctgtca ggcagtgagt ggcaaatcct 960

gcctccgctg atcaccgctg ttggcgtaaa cgatcagact gaacgccctc attttgtctt 1020

ccaggatggt aaatactatc tgttcaccat tagccataag tacacttttg ccgataacct 1080

gaccggccct gatggagtgt atggctttgt aagcgataaa cttaccggcc cttacacgcc 1140

gatgaatagc tccgggctgg tgctgggcaa cccgtcttca caacctttcc agacatattc 1200

acactatgtt atgcctaatg ggctggtcac ttcctttatt gacagtgttc cgtggaaagg 1260

taaggactat cgcattggcg gtactgaagc tccgaccgta aaaattctgt tgaaaggcga 1320

tcgctcattt attgttgata gcttcgatta tggatatatt ccggcaatga aagacattac 1380

tttaaaataa gtctgttgtc gatatc 1406

<210> 6

<211> 2319

<212> DNA

<213> 白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)

<400> 6

atgctaggtc gatcgttact tgcgcttctg ccttttgtag gcctcgcgtt ctcgcagagt 60

gcctcacagt ttaccgaccc taccacagga ttccagttca ctggtatcac cgaccctgtt 120

catgacgtga cctacggctt cgttttcccc cctctggcca cctccggagc gcaatccact 180

gagttcatcg gagaggttgt tgcccccatc gcatcaaaat ggattggtat tgccctcggt 240

ggcgccatga acaacgacct gctacttgtg gcttgggcca acggcaacca aattgtttcc 300

tccactcgct gggctactgg ctatgtacag ccgactgcat atacgggaac tgccactttg 360

acaacactcc ctgagacaac catcaactcc acgcactgga agtgggtctt caggtgtcag 420

ggctgcactg agtggaacaa tggcggcgga atcgacgtca ctagccaggg cgttctggcg 480

tgggcattct ccaacgtcgc cgtcgacgac ccctccgacc cgcagagtac cttcagcgag 540

cacaccgact tcggcttctt cggaattgac tactcgaccg acagcgccaa ctaccagaac 600

taccttaatg gcgactccgg caaccctacg accacgagca ccaagcccac aagcacgagc 660

agctcagtca cgactggacc cactgtttct gctacacctt acgattacat catcgtcggt 720

gctggtcctg gcggtatcat tgcagctgat cgtctgtcgg aggctggcaa gaaggttctc 780

cttctcgagc gcggtggccc tagcaccaag cagaccggtg gaacgtatgt cgctccatgg 840

gctactagca gtggtctaac gaagttcgat attcccggac tgttcgagtc cttgttcact 900

gattccaacc ccttctggtg gtgcaaagac atcacagtct tcgctggttg cctggtcggc 960

ggcggtactt cggtcaacgg agctctctac tggtacccta acgacggcga cttctcctcg 1020

agcgttggtt ggccaagcag ctggaccaac cacgccccgt acacgagcaa gctttcgtct 1080

cgtctcccca gtacggacca cccttcgact gatggccagc gctaccttga gcaatcattc 1140

aacgtcgtgt ctcaacttct caaaggccaa ggctacaacc aggccaccat caacgacaac 1200

cccaactaca aggaccacgt cttcggctac agcgcattcg atttccttaa cggcaagcgt 1260

gctggtccag tcgccaccta cctccagacg gcattggctc gccccaactt cactttcaag 1320

accaatgtca tggtctcgaa cgttgtccgc aacggctcgc agatcctcgg tgtccagacg 1380

aacgacccga cgctcggccc caacggtttc atccccgtga ccccgaaggg gcgtgtcatc 1440

ctctctgctg gtgcatttgg cacttcgcgc attctcttcc aaagcggtat tggccccacg 1500

gatatgattc agactgttca gagcaacccg accgccgccg ccgcgctccc gccgcagaac 1560

cagtggatca acctcccagt cggcatgaac gcacaggaca acccctcgat caacctggtc 1620

ttcacccacc ccagcatcga tgcctatgag aactgggctg acgtctggag caacccgcgc 1680

ccggctgacg ctgcacagta cctcgcgaac cagtccggtg tcttcgcagg tgcttctccc 1740

aaactcaact tctggcgcgc atactctggt tcggatggct ttacccgtta tgcccagggg 1800

acggtgcgcc cgggcgcagc ctccgtgaac tcctcgctgc cgtacaacgc gagccagatc 1860

ttcacgatca ccgtgtacct ctctacgggc atccagtcgc gtgggcgcat cggcatcgat 1920

gcagcgctcc gcggtacggt gctcacaccg ccgtggctcg tgaatccggt cgacaagacc 1980

gtgctcctgc aggcgctgca cgacgtcgtc tcgaacatag ggtcgattcc cggcctgacg 2040

atgatcacgc ccgacgtcac gcagacactc gaggagtacg tcgatgcgta cgaccccgcg 2100

acgatgaact cgaaccactg ggtctcgtcc acgacgatcg gctcatctcc ccagagcgcg 2160

gtagtcgatt cgaacgtcaa ggtctttggc acgaacaacc tgtttatcgt cgacgcaggt 2220

atcattcccc acctgcccac gggcaacccc cagggcacgc tcatgtctgc cgccgagcag 2280

gcggccgcga agatcctcgc gcttgcggga ggtccttga 2319

<210> 7

<211> 1791

<212> DNA

<213> 小球藻病毒(Chlorella virus)

<400> 7

atgtgtggca tctttggagc agtgtcaaac aataactcta tcgaggtgtc aataaagggt 60

attcaaaagc tagaatatcg cgggtatgat tcgtgcggta ttgcgtatgc agatggagac 120

ggtgtaatcg agcgtatacg ttcaattgat ggaattgaag atcttcgcaa gaaaacactt 180

gaagaatcct caccggttgc cattgctcac tctaggtgga gcaccaccgg aattccatcg 240

gtggtgaacg cacatcctca tatttctcgc ggaaccagtg ggtgtgagtc tcgtatcgcg 300

gtagtccaca atggtatcat tgaaaactat cagcagatcc gaaaatatct catcaatctc 360

ggttatacgt ttgatagtca aacggacaca gaggtcattg cacatttgat cgattctcag 420

tacaatggga atatcttgca caccgtccaa atggctgtca agcacctgaa gggctcttat 480

gcaattgcag ttatgtgtca taaagagtct ggtaaaatag tcgtggcgaa acagaagtca 540

cccctcgtac ttggaatcgg ctcagatggt gcttactaca ttgcttcgga cgtgctggcg 600

ctgccgacaa ataaagttgt ttatatttca gatggtttct ccgcagaact atctccaggg 660

agtatgacca tttacgatcc tgatggaaat gaagtggaat atgaagtaga ggacgttgaa 720

atggaacaaa ctagtatgtc tctcgataac tttgatcatt acatgattaa ggaaattaat 780

gagcaaccaa tcagtattct aaacactata aaaaataaag ggttctatgc agaaatattc 840

ggtgatttgg cgcatgaaat cttccaaaaa atagacaaca tcctgatact ggcttgtggt 900

acaagttatc acgccggtct tgtaggaaaa cagtggatag agaccatcgc gagaatcccc 960

gtggatgttc acatcgcgag cgaatacgaa cctacaattc cgagagcgaa cacattggta 1020

atcactattt cacagtcggg tgaaactgcg gacacgatag cggctttgca acgggcccag 1080

aacgcaggga tgatttatac gttgtgcatt tgcaactcgc caaagagcac tcttgtccgc 1140

gagagcgtta tgaagtacat aacgaaatgt gggtctgagg tgtcagtagc atcaacgaag 1200

gcgtttacct cacagctcgt agtactgtac atgctggcaa acgtattggc aaataaaacc 1260

gatgatttgc tgggagacct cccacaggca atagaacggg tgatttgttt gacaaatgac 1320

gaaatgaaac gatgggctga cgaaatttgc actgcgaaat ctgcgatctt cctgggaaga 1380

ggactaaacg caccagttgc ctttgaggga gcgctgaagc tcaaagaaat ctcttacatt 1440

catgcagagg gcttcctggg aggtgagttg aaacatggtc ccctcgcact ccttgatgac 1500

aagattcctg ttatcgtaac cgtagcagat catgcttatt tggaccatat caaagcaaat 1560

attgacgaag tgcttgcgag gaacgttacg gtatacgcca tagtagacca gtatgtgaac 1620

attgagcccc aggaacgcct tcacgtcgtc aaggttccgt ttgtatccaa agaattttct 1680

ccgataattc acactatccc gatgcaactg ctttcgtatt acgtggcaat taagcttggg 1740

aagaacgttg acaaaccaag gaatcttgca aaatccgtga ctacctttta a 1791

<210> 8

<211> 596

<212> PRT

<213> 小球藻病毒(Chlorella virus)

<400> 8

Met Cys Gly Ile Phe Gly Ala Val Ser Asn Asn Asn Ser Ile Glu Val

1 5 10 15

Ser Ile Lys Gly Ile Gln Lys Leu Glu Tyr Arg Gly Tyr Asp Ser Cys

20 25 30

Gly Ile Ala Tyr Ala Asp Gly Asp Gly Val Ile Glu Arg Ile Arg Ser

35 40 45

Ile Asp Gly Ile Glu Asp Leu Arg Lys Lys Thr Leu Glu Glu Ser Ser

50 55 60

Pro Val Ala Ile Ala His Ser Arg Trp Ser Thr Thr Gly Ile Pro Ser

65 70 75 80

Val Val Asn Ala His Pro His Ile Ser Arg Gly Thr Ser Gly Cys Glu

85 90 95

Ser Arg Ile Ala Val Val His Asn Gly Ile Ile Glu Asn Tyr Gln Gln

100 105 110

Ile Arg Lys Tyr Leu Ile Asn Leu Gly Tyr Thr Phe Asp Ser Gln Thr

115 120 125

Asp Thr Glu Val Ile Ala His Leu Ile Asp Ser Gln Tyr Asn Gly Asn

130 135 140

Ile Leu His Thr Val Gln Met Ala Val Lys His Leu Lys Gly Ser Tyr

145 150 155 160

Ala Ile Ala Val Met Cys His Lys Glu Ser Gly Lys Ile Val Val Ala

165 170 175

Lys Gln Lys Ser Pro Leu Val Leu Gly Ile Gly Ser Asp Gly Ala Tyr

180 185 190

Tyr Ile Ala Ser Asp Val Leu Ala Leu Pro Thr Asn Lys Val Val Tyr

195 200 205

Ile Ser Asp Gly Phe Ser Ala Glu Leu Ser Pro Gly Ser Met Thr Ile

210 215 220

Tyr Asp Pro Asp Gly Asn Glu Val Glu Tyr Glu Val Glu Asp Val Glu

225 230 235 240

Met Glu Gln Thr Ser Met Ser Leu Asp Asn Phe Asp His Tyr Met Ile

245 250 255

Lys Glu Ile Asn Glu Gln Pro Ile Ser Ile Leu Asn Thr Ile Lys Asn

260 265 270

Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Ile Phe Gly Asp Leu Ala His Glu Ile Phe

275 280 285

Gln Lys Ile Asp Asn Ile Leu Ile Leu Ala Cys Gly Thr Ser Tyr His

290 295 300

Ala Gly Leu Val Gly Lys Gln Trp Ile Glu Thr Ile Ala Arg Ile Pro

305 310 315 320

Val Asp Val His Ile Ala Ser Glu Tyr Glu Pro Thr Ile Pro Arg Ala

325 330 335

Asn Thr Leu Val Ile Thr Ile Ser Gln Ser Gly Glu Thr Ala Asp Thr

340 345 350

Ile Ala Ala Leu Gln Arg Ala Gln Asn Ala Gly Met Ile Tyr Thr Leu

355 360 365

Cys Ile Cys Asn Ser Pro Lys Ser Thr Leu Val Arg Glu Ser Val Met

370 375 380

Lys Tyr Ile Thr Lys Cys Gly Ser Glu Val Ser Val Ala Ser Thr Lys

385 390 395 400

Ala Phe Thr Ser Gln Leu Val Val Leu Tyr Met Leu Ala Asn Val Leu

405 410 415

Ala Asn Lys Thr Asp Asp Leu Leu Gly Asp Leu Pro Gln Ala Ile Glu

420 425 430

Arg Val Ile Cys Leu Thr Asn Asp Glu Met Lys Arg Trp Ala Asp Glu

435 440 445

Ile Cys Thr Ala Lys Ser Ala Ile Phe Leu Gly Arg Gly Leu Asn Ala

450 455 460

Pro Val Ala Phe Glu Gly Ala Leu Lys Leu Lys Glu Ile Ser Tyr Ile

465 470 475 480

His Ala Glu Gly Phe Leu Gly Gly Glu Leu Lys His Gly Pro Leu Ala

485 490 495

Leu Leu Asp Asp Lys Ile Pro Val Ile Val Thr Val Ala Asp His Ala

500 505 510

Tyr Leu Asp His Ile Lys Ala Asn Ile Asp Glu Val Leu Ala Arg Asn

515 520 525

Val Thr Val Tyr Ala Ile Val Asp Gln Tyr Val Asn Ile Glu Pro Gln

530 535 540

Glu Arg Leu His Val Val Lys Val Pro Phe Val Ser Lys Glu Phe Ser

545 550 555 560

Pro Ile Ile His Thr Ile Pro Met Gln Leu Leu Ser Tyr Tyr Val Ala

565 570 575

Ile Lys Leu Gly Lys Asn Val Asp Lys Pro Arg Asn Leu Ala Lys Ser

580 585 590

Val Thr Thr Phe

595

Claims (22)

1.一种表达编码纤维二糖脱氢酶(CDH)多肽的核酸序列的转基因植物，利用编码信号肽的核酸序列在所述植物的细胞壁中表达所述多肽。

2.权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物的细胞壁比野生型植物的细胞壁更具水溶性。

3.权利要求1的转基因植物，其中所述植物选自单子叶植物和双子叶植物、谷类作物、饲料作物、根茎蔬菜作物、木本植物、松柏植物、松树、杨树、柳树、桉树、金合欢植物、油棕榈、甘蔗、洋姜和多年生牧草。

4.权利要求3的转基因植物，其中所述根茎蔬菜作物选自胡萝卜、马铃薯、甜菜和薯蓣。

5.权利要求3的转基因植物，其中所述松树选自松冷杉、火炬松、辐射松和云杉。

6.权利要求3的转基因植物，其中所述多年生牧草为柳枝稷或芒草。

7.权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物细胞壁中的纤维素相对于野生型植物细胞壁中的纤维素更少结晶。

8.权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物细胞壁中的木质素含量相对于野生型植物细胞壁中的木质素含量更少。

9.权利要求1的转基因植物，其中所述转基因植物比野生型植物更容易加工为生物燃料制品、木制品、纸制品、纺织制品或纱线制品。

10.一种制备生物燃料制品、木制品、纸制品、纺织制品或纱线制品的方法，所述方法包括加工所述植物的纤维素或半纤维素部分为所述制品，其中所述植物在植物细胞壁中过表达编码纤维二糖脱氢酶(CDH)的核酸分子。

11.权利要求10的方法，其中所述制品为生物燃料制品。

12.权利要求11的方法，其中所述生物燃料制品为乙醇或甲醇。

13.根据权利要求10的方法获得的生物燃料制品、木制品、纸制品、纺织制品或纱线制品。

14.一种在植物细胞的细胞壁中表达纤维二糖脱氢酶(CDH)的方法，该方法包括在植物细胞的细胞壁中表达编码CDH的核酸分子，其中所述转基因植物细胞的细胞壁比野生型植物的细胞壁更具水溶性。

15.权利要求14的方法，其中所述转基因植物来自木本植物或树木。

16.权利要求14的方法，其中所述转基因植物细胞比野生型植物更容易加工为生物燃料制品、木制品、纸制品、纺织制品或纱线制品。

17.一种制备制品的方法，所述方法包括加工植物为所述制品，其中所述植物已用编码纤维二糖脱氢酶(CDH)的核酸分子转化，使得CDH在所述植物细胞壁中过表达。

18.权利要求17的方法，其中所述制品为生物燃料制品、木制品、纸制品、纺织制品或纱线制品。

19.权利要求18的方法，其中所述制品为生物燃料制品。

20.权利要求18的方法，其中所述制品为木制品。

21.权利要求18的方法，其中所述制品为纸制品。

22.权利要求18的方法，其中所述制品为纺织制品或纱线制品。