CN102776131B

CN102776131B - TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用

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Publication number: CN102776131B
Application number: CN201210247669.1A
Authority: CN
Inventors: 董志扬; 陈秀珍; 陈飞
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-07-17
Filing date: 2012-07-17
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-07-17
Also published as: CN102776131A

Abstract

本发明公开了一种TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。本发明提供了一种构建工程菌的方法，包括如下步骤：抑制木霉中TrMAK基因的表达，得到工程菌；所述TrMAK基因编码如下（a）或（b）所述的TrMAK蛋白：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护所述TrMAK蛋白在调节木霉中的纤维素酶合成中的应用。本发明发现，敲除TrMAK基因后，木霉生产纤维素酶的能力显著增加。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于解决能源危机和环境危机具有潜在影响。

Description

TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用

技术领域

本发明涉及一种TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。

背景技术

随着全球能源和环境危机的日益恶化，寻找新的可再生能源已成为当前社会关注的热点问题，纤维素生物质作为植物吸收太阳能并通过光合作用形成的产物，是地球上最为丰富的、最可行的可再生新能源物质。但如何将生物质转化成现代工业可利用的能源物质却存在诸多问题，其中最关键问题就是实现天然生物质的高效降解。纤维素酶是自然界中存在最广泛、最有效的生物质降解酶，在木质纤维素资源转化过程起着关键性作用，其产量、活性的高低直接关系着新的生物质能源的开发、利用。

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)是主要的纤维素酶生产菌株，全球大约90%以上纤维素酶产品是通过木霉发酵生成的。五十年来，人们通过优化培养条件、基因突变和菌株诱变等方法使里氏木霉生产纤维素酶的能力获得大幅提高。但是，生产纤维素酶成本高、产量低仍是制约生物质能源不能规模化的瓶颈。通过传统方法进一步提高纤维素酶产量已经非常困难。

发明内容

本发明的目的是提供一种TrMAK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。

本发明提供了一种构建工程菌的方法，包括如下步骤：抑制木霉中TrMAK基因的表达，得到工程菌；所述TrMAK基因编码如下（a）或（b）所述的TrMAK蛋白：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列1衍生的蛋白质。

所述TrMAK基因为如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）序列表的序列2所示的DNA分子；

2）序列表的序列3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

所述“抑制木霉中TrMAK基因的表达”的实现方法如下：通过同源重组敲除木霉中的所述TrMAK基因。

所述“通过同源重组敲除木霉中的所述TrMAK基因”的实现方法如下：将含有DNA片段甲的重组质粒导入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrMAK基因的上游同源臂和所述TrMAK基因的下游同源臂。

所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还具有筛选标记基因。所述筛选标记基因具体可为pyr4基因；所述pyr4基因为编码序列表的序列5所示的pyr4蛋白的基因。所述pyr4基因具体可如序列表的序列4自5’末端第1380至2525位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可依次包括所述上游同源臂、所述pyr4基因的表达盒和所述下游同源臂。所述上游同源臂具体可如序列表的序列4自5’末端第7至1006位核苷酸所示。所述下游同源臂具体可如序列表的序列4自5’末端第2937至3936位核苷酸所示。所述pyr4基因的表达盒具体可如序列表的序列4自5’末端第1013至2930位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可为序列表的序列4自5’末端第7至3936位核苷酸所示的双链DNA分子。

所述含有DNA片段甲的重组质粒具体可为将所述DNA片段甲导入质粒pBluescript SK(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

所述木霉可为里氏木霉，具体可为TU6△tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。

以上任一所述方法得到的工程菌均属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：发酵所述工程菌，得到纤维素酶。所述发酵的具体条件为，将所述工程菌接种于发酵培养基，28℃，200rpm震荡培养48-144小时。

本发明还保护抑制所述TrMAK基因表达的物质在促进木霉生产纤维素酶中的应用。所述抑制所述TrMAK基因表达的物质为含有以上任一所述DNA片段甲的重组质粒。所述抑制所述TrMAK基因表达的物质具体可为将所述DNA片段甲导入质粒pBluescript SK(+)的多克隆位点得到的重组质粒。

本发明还保护所述TrMAK蛋白在调节木霉中的纤维素酶合成中的应用。

本发明发现，敲除TrMAK基因后，木霉生产纤维素酶的能力显著增加。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于解决能源危机和环境危机具有潜在影响。

附图说明

图1为实施例1中的PCR鉴定电泳图。

图2为实施例3中粗酶液SDS-PAGE分析电泳图。

图3为实施例3中粗酶液的纤维素酶酶活。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

里氏木霉（Trichoderma reesei)QM9414菌株：美国模式培养物集存库（简称ATCC，网址www.atcc.org/），ATCC编号为26921。

里氏木霉（Trichoderma reesei)TU6菌株是由QM9414菌株衍生的，pyr4基因功能丧失的、尿嘧啶营养缺陷菌株，ATCC编号为MYA-256。

微晶纤维素（Avicel^RPH-101）：购自fluka公司,产品目录号11365。

质粒pBluescript SK(+)：购自Stratagene公司,产品目录号212205。

里氏木霉（Trichoderma reesei)TU6△tku70菌株是由TU6菌株衍生的，敲除介导非同源重组的tku70基因得到的菌株，公众可从中国科学院微生物研究所获得；提及TU6△tku70菌株（又称T.reesi KU70）的文献：Zhang Guangtao,Lukas Hartl,AndreSchuster,Stefan Polak,Monika Schmoll,Tianhong Wang,Verena Seidl,BernhardSeiboth.Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocreajecorina.Journal of biotechnology,2009,139(2):146-151.。

土豆培养基（PDA固体培养基）：将20g去皮马铃薯切碎，加入90mL水，煮沸30min，双层纱布过滤并收集滤液，加入2g葡萄糖和1.8g琼脂粉，用水定容至100mL。

MM液体培养基（pH为5.2+0.1）：（NH₄）₂SO₄ 0.5g/100mL、KH₂PO₄ 1.5g/100mL、MgSO₄0.06g/100mL、CaCl₂ 0.06g/100mL、FeSO₄·7H₂O 0.0005g/100mL、MnSO₄·H₂O0.00016g/100mL、ZnSO₄·7H₂O 0.00014g/100mL、CoCl₂ 0.0002g/100mL，其余为水。

MM固体培养基：在MM液体培养基的基础上，每升添加20g琼脂粉。

LB培养基（自然pH値）：1g/100mL蛋白胨、1g/100mL氯化钠、0.5g/100mL酵母提取物，其余为水。

DNS试剂：50g 3,5-二硝基水杨酸溶于4L水中，不断搅拌，缓缓加入80g氢氧化钠，使之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次加入，并小心加热，溶液最高温度不超过45℃，冷却至室温后定容至5L,如果溶液不澄清，用Whatman1号滤纸过滤，然后棕色瓶室温贮藏。

TrMAK蛋白（又称trmak蛋白）如序列表的序列1所示，由763个氨基酸残基组成,理论分子量83.67kDa,等电点（PI）9.588。TrMAK蛋白的编码基因（又称TrMAK基因或trmak基因）的开放阅读框如序列表的序列2所示，其全长cDNA如序列表的序列3所示。

实施例1、重组菌甲的制备

一、重组质粒的构建

1、trmak基因上游同源臂（Ptrmak，约1kb）的获得

以TU6△tku70菌株的基因组DNA为模板，用upF和upR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

upF：5’-CCCAAGCTTAAGAAGGAAAAAAACAAGACGGAAG-3’（下划线标注HindIII酶切识别序列）；

upR：5’-CGGAATTCGCTGCCGGCCGGTAGAGTTCACGAC-3’（下划线标注EcoRI酶切识别序列）。

PCR扩增采用的Taq酶为高保真fastpfu（购自全是金公司）。

PCR扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性30s、60℃退火40s、72℃延1min，30个循环；72℃扩展延伸3min。

2、trmak基因下游同源臂（Ttrmak，约1kb）的获得

以TU6△tku70菌株的基因组DNA为模板，用downF和downR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

downF：5’-CGGGATCCAGGAGAGGGAGAAGAACGACCTTAA-3’（下划线标注BamHI酶切识别序列）；

downR：5’-ATAAGAATGCGGCCGCCACCACTGCACCAAACCTCCAACTC-3’（下划线标注NotI酶切识别序列）。

PCR扩增采用的Taq酶为高保真fastpfu（购自全是金公司）。

PCR扩增程序同步骤1。

3、pyr4基因表达盒(约2kb)的获得

以QM9414菌株的基因组DNA为模板，用Fpyr4和Rpyr4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

Fpyr4:5’-CGGAATTCCTCACCCCCAAAGTCGCAATATCG-3’（下划线标注EcoRI酶切识别序列）；

Rpyr4:5’-CGGGATCCCAACTGCATCCAAACCATCCTACC-3’（下划线标注BamHI酶切识别序列）。

PCR扩增采用的Taq酶为高保真fastpfu（购自全是金公司）。

PCR扩增程序同步骤1。

4、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。

5、用限制性内切酶BamHI和NotI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

6、用限制性内切酶EcoRI和BamHI双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。

7、用限制性内切酶HindⅢ和NotI双酶切质粒pBluescript SK(+)，回收载体骨架（约2961bp）。

8、将步骤4的酶切产物、步骤6的酶切产物、步骤5的酶切产物和步骤7的酶切产物连接，得到重组质粒pSK-Ptrmak-pyr4-Ttrmak（trmak基因敲除载体）。根据测序结果，对重组质粒pSK-Ptrmak-pyr4-Ttrmak进行结构描述如下：在质粒pBluescript SK(+)的HindIII和NotI酶切位点之间插入了序列表的序列4自5’末端第7至3936位核苷酸所示的双链DNA分子。

序列表的序列4中，自5’末端第1至6位核苷酸为HindIII酶切识别序列，第7至1006位核苷酸为trmak基因上游同源臂，第1007至1012位核苷酸为EcoRI酶切识别序列，第1013至2930位核苷酸为pyr4基因表达盒（其中，第1013至1379位核苷酸为启动子、第1380至2525位核苷酸为pyr4基因、第2526至2930位核苷酸为终止子），第2931至2936位核苷酸为BamHI酶切识别序列，第2937至3936位核苷酸为trmak基因下游同源臂，第3937至3944位核苷酸为NotI酶切识别序列。

二、重组菌甲的获得

1、Tu6△tku70菌株原生质体制备

（1）取Tu6△tku70菌株的孢子，用适量无菌水洗涤孢子并制成孢子悬液，用200目筛子过滤除去残余的菌丝，将过滤后的孢子悬液接种至装有100mL MM液体培养基的500mL三角瓶中，28℃培养至菌丝伸展（13h-14h）。

（2）将步骤（1）得到的培养体系经200目筛子过滤，收集菌体，用无菌水洗涤2-3次，然后用1.2M MgSO₄水溶液洗涤一次。

（3）将步骤（2）得到的菌体加入装有15mL裂解液的三角瓶中（裂解液是含有150mg的裂解酶和15mg纤维素酶的1.2M MgSO₄水溶液），30℃、80rpm振荡反应1.5h，显微镜下观察原生质体产生的情况，反应1h后每隔10min取样观察一次。

（4）步骤（3）中，当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0.6M山梨醇水溶液终止反应，经200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。

（5）将步骤（4）的原生质体沉淀用1.0M山梨醇水溶液重悬，室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀。

（6）将步骤（5）的原生质体沉淀用1.0M山梨醇水溶液重悬，室温3000rpm离心10min，收集原生质体沉淀并悬浮于200μL 1.0M山梨醇水溶液中，血球板计数器观察并计数（10⁸个原生质体/mL）。

2、重组菌甲的获得

50%PEG4000溶液：含有50g/100g PEG4000、50mM CaCl₂的10mM Tris-HCL(pH8.0)缓冲液。

（1）将重组质粒pSK-Ptrmak-pyr4-Ttrmak加入步骤一制备的原生质体中，轻轻混匀，再加入50μL 50%PEG4000溶液，再次混匀，冰上放置30min。

（2）在步骤（1）的培养体系中加入1mL50%PEG4000溶液，混匀，室温放置20min。

（3）在步骤（2）的培养体系中加入1mL 1.0M山梨醇水溶液，混匀后分四次且每次与一支4ml融化的MM固体培养基（58℃以下）混和，立即铺于含1.0M山梨醇的MM固体培养基平板上，30℃培养4-7d。

（4）待转化子长出后，将其转移至PDA平板上，28℃培养3-5天（有孢子生成），用无菌水将平板上的孢子洗下来制备成孢子悬液，做梯度稀释后，将其涂布在含0.1%（体积比）Triton-X100的MM固体培养基平板上分单孢，待菌丝长出后，抽提基因组DNA进行PCR鉴定。

PCR鉴定所用的引物如下：

pyrmF：5’-TCATAGAATGCAGCTGTATTTAGGC-3’；

dodoR：5’-AACTCTGAGTTAGCTGTTAAACTGG-3’。

pyrmF对应pyr4表达盒中的序列，dodoR对应Tu6△tku70菌株基因组DNA中trmak基因下游同源臂外侧，可以扩增得到约1500bp片段的菌株为重组菌甲。

鉴定结果见图1，其中M为1kb DNA ladder marker，1和2为重组菌甲，3为Tu6△tku70菌株。

实施例2、重组菌乙的获得

将质粒pBluescript SK(+)代替重组质粒pSK-Ptrmak-pyr4-Ttrmak进行实施例1的步骤二的操作，得到重组菌乙。

实施例3、重组菌的发酵和粗酶液的纤维素酶活性鉴定

将实施例1获得的重组菌甲、实施例2获得的重组菌乙或出发菌（TU6△tku70菌株）分别进行如下步骤：

一、重组菌的发酵

1、将菌株转至PDA固体培养基平板上产孢，然后用无菌水洗涤孢子并用无菌水制成高浓度的孢子悬液4×10⁷-5×10⁷个孢子/mL。

2、将0.5mL孢子悬液接种于250mL三角瓶中的50mL含2g/100mL葡萄糖的MM液体培养基中，28℃，200rpm预培养48h，四层纱布过滤并收集菌体。

3、称取1.8克菌体（湿重）于50mL发酵培养基中，28℃，200rpm震荡培养，分别于振荡培养48小时、72小时、96小时、120小时和144小时后取样。

发酵培养基（pH5.2±0.1）：含1g/100mL微晶纤维素的MM液体培养基。

4、将步骤3取得的样本12000r/min离心5min，收集上清液。

将重组菌甲振荡培养48小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液_48小时。将重组菌甲振荡培养72小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液_72小时。将重组菌甲振荡培养96小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液_96小时。将重组菌甲振荡培养120小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液_120小时。将重组菌甲振荡培养144小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液_144小时。

将重组菌乙振荡培养48小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液_48小时。将重组菌乙振荡培养72小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液_72小时。将重组菌乙振荡培养96小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液_96小时。将重组菌乙振荡培养120小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液_120小时。将重组菌乙振荡培养144小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液_144小时。

将出发菌振荡培养48小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液_48小 _时。将出发菌振荡培养72小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液_72小时。将出发菌振荡培养96小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液_96小时。将出发菌振荡培养120小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液_120小时。将出发菌振荡培养144小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液_144小时。

二、SDS-PAGE分析

将步骤一得到的各个粗酶液进行SDS-PAGE分析，结果见图2。图2中，1至3代表出发菌，3至6代表重组菌甲，48小时、72小时和120小时都代表发酵时间。因为粗酶液为发酵液上清，根据现有技术和文献记载，对于木霉来说，先以纤维素为底物进行发酵培养的条件下，分泌到胞外的蛋白基本上都是纤维素降解相关的酶，由图2中可以观察到，各个蛋白的表达量均随发酵时间上升。

三、粗酶液的纤维素酶活性鉴定

将步骤一得到的各个粗酶液参照IUPAC标准方法进行纤维素酶活性测定，具体方法如下：

（1）取100μl步骤一得到的上清液，加入10mL含0.05g/100mL苯甲酸钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05M、pH4.8）中，得到稀释至101倍的酶液。

（2）将Whatman1号滤纸制成6cm长、1cm宽的形状（50mg左右），折成4折，呈M型。

（3）分组处理

实验组：将步骤（2）的滤纸条置于试管底部，加入含0.05g/100mL苯甲酸钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05M、pH4.8）1.5mL，50℃水浴60分钟；然后加入0.5mL步骤（1）得到的酶液，混合均匀，使管内溶液浸没滤纸，50℃水浴1小时，迅速冷却；向试管中加入3mL DNS试剂，混合均匀，在沸水中煮10min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25mL。

对照组：将步骤（2）的滤纸条置于试管底部，加入含0.05g/100mL苯甲酸钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.05M、pH4.8）1.5mL，50℃水浴60分钟，使管内溶液浸没滤纸，50℃水浴1小时，迅速冷却；向试管中加入3mL DNS试剂，然后加入0.5mL步骤（1）得到的酶液，混合均匀，在沸水中煮10min，迅速冷却，用蒸馏水定容至25mL。

以对照组试管为参比，测定540nm的吸光度（A_540nm）。

在50℃、pH4.8的条件下，每分钟水解滤纸底物，产生1umol还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个国际单位滤纸酶活（1FPU）。

采用葡萄糖作为标准品，制作A_540nm和葡萄糖浓度的标准曲线，标准曲线方程如下：Y=0.6692X-0.0082，Y代表葡萄糖浓度（umol/mL），X代表A_540nm数值；R²=0.9988。

每毫升粗酶液酶活检测结果见图3。重组菌甲得到的粗酶液的纤维素酶活力显著高于出发菌得到的粗酶液。重组菌乙得到的粗酶液的纤维素酶活力与出发菌得到的粗酶液一致。结果表明，敲除TrMAK基因后，可以使木霉生产纤维素酶的能力显著增加。

Claims

1.一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤：发酵工程菌，得到纤维素酶；

所述工程菌的构建方法包括如下步骤：抑制木霉中TrMAK基因的表达，得到所述工程菌；所述TrMAK基因编码由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述TrMAK基因为如下1)或2)所述的DNA分子：

1)序列表的序列2所示的DNA分子；

2)序列表的序列3所示的DNA分子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述“抑制木霉中TrMAK基因的表达”的实现方法如下：通过同源重组敲除木霉中的所述TrMAK基因。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述“通过同源重组敲除木霉中的所述TrMAK基因”的实现方法如下：将含有DNA片段甲的重组质粒导入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrMAK基因的上游同源臂和所述TrMAK基因的下游同源臂。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还具有筛选标记基因。

6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述木霉为里氏木霉。