CN103667085A

CN103667085A - 一种内切葡聚糖酶生产菌株

Info

Publication number: CN103667085A
Application number: CN201310653617.9A
Authority: CN
Inventors: 李佩佩; 许丽红; 王华明; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-12-04
Also published as: CN103667085B

Abstract

本发明构建了一种黑曲霉工程菌，能高效表达来源于草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达900U/mL；本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适温度为45℃，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工技术领域。

Description

一种内切葡聚糖酶生产菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种内切葡聚糖酶生产菌株。

背景技术

纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖、葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素被它降解后可转化为人类急需的能源、食物、化工原料，对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。

纤维素广泛存在于自然界的生物体中，细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的是木霉属、曲霉属和青霉属。

纤维素酶成本高以及酶活力低已经成为制约纤维素酶广泛应用的两大瓶颈，因此构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种内切葡聚糖酶生产菌株。本发明通过将草酸青霉（Penicillium oxalicum）的内切葡聚糖酶基因转化入黑曲霉中，获得高效生产内切葡聚糖酶的黑曲霉工程菌株，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面涉及一种黑曲霉工程菌，其携带有能表达内切葡聚糖酶的重组质粒。

所述重组质粒含有草酸青霉的内切葡聚糖酶基因。

所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

所述内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

本发明的另一方面涉及上述黑曲霉工程菌在生产内切葡聚糖酶中的应用。

本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达来源于草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，摇瓶发酵酶活可达900U/mL；本发明获得的重组内切葡聚糖酶的最适作用pH为4.0，最适温度为45℃，在pH5.0-7.0范围内酶活损失不高于5%，可广泛应用于纺织加工技术领域，具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于推广应用。

附图说明

图1 为黑曲霉EG-1发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中泳道1为对照组，泳道2为黑曲霉EG-1发酵上清液，箭头所指处即为重组表达的内切葡聚糖酶。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。

除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 内切葡聚糖酶基因的克隆

1.1 草酸青霉总DNA的提取

将草酸青霉（Penicillium oxalicum）过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。利用OMEGA公司的E.Z.N.A. Fungal RNA Kit制备草酸青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。

基因克隆

以1.1中提取的草酸青霉基因组总DNA为模板，设计引物进行PCR扩增。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃，7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

将回收的扩增产物分别连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-EG2，送至北京华大基因研究中心进行测序分析，获得的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，用blast分析表明扩增片段为草酸青霉的内切葡聚糖酶基因，其编码氨基酸序列为为SEQ ID NO:1，为一新的等位基因。

实施例2 黑曲霉工程菌的构建

2.1 表达载体构建

将1.2中得到的PCR产物进行Xba I单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行Xba I单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5α；然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pGAMD-EG1。

原生质体制备

接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3cm的菌落置于约100mL CMA（2%麦芽提取物、2%葡萄糖，0.1%细菌蛋白胨）的液体培养基中，30℃，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20 mL裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.8M MgSO₄溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10 mL 1.2M山梨醇悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量山梨醇悬浮分装（200 μL/管，10⁸个/mL）。

转化与验证

取10μg pGAMD-EG1 DNA加入到200μL原生质体中，接着加入50μL 25%PEG轻轻混匀，室温静置20 min；然后加2mL 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 mL左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.059%乙酰胺，0.152%KH₂PO4，0.34%CsCl，0.052%KCl，1%葡萄糖, 21.85%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板（0.059%乙酰胺, 0.152%KH₂PO4，0.34%CsCl，0.052%KCl，1%葡萄糖，1%琼脂粉），30℃黑暗培养数天至转化子长出。验证阳性转化子。将获得的一株工程菌命名为黑曲霉EG-1（Aspergillus niger EG-1）。

实施例3 发酵与酶活测定

3.1摇瓶表达

将黑曲霉工程菌EG-1接种于50mL 黑曲霉发酵培养基 (1.2％NaNO3，0.05％KCl，0.15% KH₂PO₄，0.205% MgSO₄·7H₂O，0.35％NaH₂PO₄·H₂O，7%柠檬酸钠，4.5%胰蛋白大豆肉汤，微量元素1mL，4.1%葡萄糖），30℃培养4-5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析。结果如图1所示，在50kDa处有一蛋白条带，即为重组表达的内切葡聚糖酶，重组蛋白大小与预测的一致。

实施例4 酶学性质分析

4.1最适作用pH值

用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定，在温度45℃条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用pH4.0。

最适作用温度

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.0的条件下测定酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组表达内切葡聚糖酶的最适作用温度为45℃。

实施例4 内切葡聚糖酶在针织面料、梭织面料的除毛染色方面的应用

处理原料：针织面料、梭织面料；

酶的用量：0.1-3.0g/L；

处理条件：35-55℃，处理时间为30-150分钟，pH范围为4.0-9.5；

适用的浴比范围：1:5-1:30；

设备类型：溢流染色机，卷染机，水洗机等；

本发明获得的重组内切葡聚糖酶具有除毛干净，对织物强力损失小的特点，有利于推广应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种内切葡聚糖酶生产菌株

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 477

<212> PRT

<213> endoglucanase enzyme sequence

<400> 1

Met Ser Phe Thr Arg Arg Pro Phe Pro Glu Ala Ala Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Leu Ala Gln Ala Gln Gln Gln Val Val Ala Lys Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Ser Pro Lys Thr Tyr Lys Cys Ser Lys Ser Gly Gly Cys Val Val Gln

35 40 45

Asp Thr Ser Val Val Phe Glu Trp Lys Ser Leu Trp Ile His Thr Ala

50 55 60

Asn Gly Tyr Asp Ser Cys Thr Thr Ser Phe Glu Val Asp Pro Thr Leu

65 70 75 80

Cys Pro Asp Val Thr Thr Trp Ser Lys Asn Cys Val Ile Glu Pro Ala

85 90 95

Asn Tyr Thr Ser Phe Gly Glu Ala Thr Ser Gly Asp Ser Leu Thr Leu

100 105 110

His Gln Tyr Val Lys Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Asn Ala Ser Pro Arg

115 120 125

Val Tyr Leu Leu Gly Pro Asp Gly Asp Tyr Val Leu Met Lys Leu Leu

130 135 140

Gly Gln Glu Leu Thr Phe Asp Val Asp Leu Ser Thr Leu Pro Cys Gly

145 150 155 160

Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Leu Ser Glu Met Ser Gly Ser Gly Gly Arg

165 170 175

Asn Ala Asn Asn Lys Gly Gly Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Tyr Cys Asp

180 185 190

Val Lys Cys Pro Leu Glu Thr Trp Lys Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly

195 200 205

Gly Gln Ala Tyr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Leu Glu Gly Asn Ser

210 215 220

Ala Ala Asn Ser Tyr Thr Pro His Pro Cys Ser Ser Asp Asp Cys Asp

225 230 235 240

Lys Gly Gly Cys Gly Phe Asn Pro Tyr Ala Gln Gly Lys Thr Asn Tyr

245 250 255

Trp Ala Pro Gly Gly Thr Val Asp Thr Ser Lys Pro Phe Thr Ile Asn

260 265 270

Thr Gln Phe Ile Thr Asn Asp Gly Thr Thr Thr Gly Ile Arg Thr Glu

275 280 285

Ile Arg Arg Lys Tyr Ile Gln Asn Gly Asn Val Ile Ala Asn Ala Lys

290 295 300

Ser Ser Ala Gly Val Asp Ser Ile Lys Val Ala Trp Ser Glu Ser Val

305 310 315 320

Glu Gly Ala Ala Ala Thr Phe Gly Gly Leu Thr Ser Met Gly Lys Ala

325 330 335

Pro Gly Arg Gly Ile Val Leu Ile Phe Ser Ile Arg Asn Glu Val Arg

340 345 350

Gly Asn Met Lys Ser Leu Asp Arg Gly Ser Asn Gly Pro Cys Ser Ser

355 360 365

Arg Glu Gly Asn Pro Thr Lys Ile Ile Ala Gln Asn Pro Asp Thr His

370 375 380

Val Val Phe Ser Lys Met Arg Trp Gly Asp Ile Gly Ser Thr Phe Asn

385 390 395 400

Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Cys Thr Thr Pro Ser Lys Ala

405 410 415

Thr Thr Thr Val Ala Thr Thr Lys Ala Thr Ser Thr Thr Thr Lys Ile

420 425 430

Ser Thr Thr Thr Thr Ala Gly Gly Ala Thr Gln Thr Gln Trp Gly Gln

435 440 445

Cys Gly Gly Gln Gly Lys Pro Gly Pro Thr Ala Cys Val Ser Gly Thr

450 455 460

Thr Cys Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

465 470 475

<210> 2

<211> 1434

<212> DNA

<213> endoglucanase gene sequence

<400> 2

atgtctttca caaggagacc gtttcccgag gcggcattgg ccctcttgcc tctcgcccag

60

gcccagcagc aagtggttgc gaaacttgaa aacccgtccc cgaaaacata caagtgctcc

120

aagtccggag gctgtgttgt tcaggacacg tcggttgtgt tcgaatggaa atccctctgg

180

attcacaccg ccaacggcta cgactcgtgc accacctcgt ttgaagtgga cccaaccttg

240

tgccctgatg ttacgacgtg gtccaagaac tgtgtcattg aacctgctaa ctacacctct

300

tttggagagg ccaccagtgg tgactcgctc actttgcacc agtacgtgaa aaccgacgga

360

acctacaaca atgcgtctcc ccgtgtctac ctcctcggtc ccgacggcga ctacgtcctc

420

atgaaactgc tgggccagga gctcaccttt gatgtcgacc tttccaccct gccgtgtggt

480

gagaacggtg cactctatct atccgagatg agtgggagcg gtggacgcaa tgccaacaac

540

aagggcggtg ccgcgtacgg ttcaggatac tgtgacgtta agtgccccct cgaaacctgg

600

aaaaatggca cccttgtgcc cggtggccag gcttactgct gtaacgaaat ggatatcctg

660

gagggtaact ccgcagccaa ctcttacaca cctcaccctt gcagctccga tgactgtgac

720

aagggtggat gcggcttcaa cccctatgcg cagggtaaga ccaactactg ggcgcccggc

780

ggtaccgtgg acacctccaa gcccttcacc atcaacactc agttcatcac caacgatggt

840

acaaccaccg gtattcgcac cgagatccgc cggaaataca tccagaatgg caatgttatt

900

gccaacgcca agtcttccgc gggagttgac tccatcaagg tggcgtggtc cgaaagcgtg

960

gaaggcgccg ccgccacttt cggtggactg acctccatgg gcaaggctcc cggccgcggt

1020

attgtgctga tcttcagtat caggaacgaa gttaggggca acatgaaatc cttggacagg

1080

ggtagcaacg gtccttgcag cagcagggag ggcaacccta ccaaaatcat tgctcagaac

1140

cccgacactc acgttgtctt ctctaaaatg cgctggggtg acattggttc cactttcaac

1200

gcccccggtg gctctggatc gagctcgtgt accaccccca gcaaggccac caccaccgtc

1260

gctacgacca aggcgacctc caccaccacc aagatttcca ccaccaccac cgccggtggc

1320

gcgactcaga cccaatgggg ccagtgtgga ggccagggca agcccggacc tacagcctgc

1380

gtgtccggaa ctacctgcaa ggcgcagaag ctttactact ctcagtgcct gtga

1434

Claims

1.一种宿主细胞，其携带有能表达内切葡聚糖酶的重组质粒。

2.如权利要求1所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为黑曲霉（Aspergillus niger）。

3.如权利要求1所述宿主细胞，其特征在于，所述内切葡聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1。

4.如权利要求1所述宿主细胞，其特征在于，所述内切葡聚糖酶的编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。

5.权利要求1所述宿主细胞在生产内切葡聚糖酶中的应用。