WO2017159733A1 - 有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法 - Google Patents

有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法 Download PDF

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WO2017159733A1
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cells
cell
hole
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萬壽　優
順子 渡邉
近藤　孝志
誠一 松本
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株式会社村田製作所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/02—Separating microorganisms from the culture medium; Concentration of biomass
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D29/00—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor
    • B01D29/01—Filters with filtering elements stationary during filtration, e.g. pressure or suction filters, not covered by groups B01D24/00 - B01D27/00; Filtering elements therefor with flat filtering elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
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    • B01D39/14—Other self-supporting filtering material ; Other filtering material
    • B01D39/20—Other self-supporting filtering material ; Other filtering material of inorganic material, e.g. asbestos paper, metallic filtering material of non-woven wires
    • B01D39/2027—Metallic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/491—Blood by separating the blood components
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D2201/00—Details relating to filtering apparatus
    • B01D2201/60—Shape of non-cylindrical filtering elements

Definitions

  • the present invention relates to a filter for filtering nucleated cells and a filtration method using the same.
  • Patent Document 1 discloses a method of concentrating mononuclear cells and platelets from a liquid containing red blood cells, nucleated cells, and platelets using a cell trapping filter material.
  • the cell capture filter material of Patent Document 1 captures nucleated cells and platelets and allows unnecessary cells such as red blood cells to pass through.
  • Patent Document 1 still has room for improvement in terms of improving the recovery rate of nucleated cells.
  • An object of the present invention is to provide a filter for filtering nucleated cells capable of improving the recovery rate of nucleated cells and a filtration method using the same.
  • the filter of one embodiment of the present invention includes A filter for filtering nucleated cells,
  • the main component is at least one of metal and metal oxide,
  • a plurality of through holes are formed,
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole is smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell, and the inscribed circle of the through hole is a circle in contact with all sides that define the opening of the through hole.
  • the filtration method of one embodiment of the present invention includes: A method for filtering nucleated cells, comprising: The main component is at least one of a metal and a metal oxide, and a plurality of through holes are formed.
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole is smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell, and
  • An inscribed circle is a circle that is in contact with all sides that define the opening of the through-hole, providing a filter; Passing the liquid containing the nucleated cells through the filter; including.
  • the present invention it is possible to provide a filter for filtering nucleated cells capable of improving the recovery rate of nucleated cells and a filtration method using the same.
  • Patent Document 1 mononuclear cells are separated from blood by capturing nucleated cells and platelets using a cell capture filter material composed of a nonwoven fabric and passing unnecessary cells such as erythrocytes. Yes.
  • the recovery rate of mononuclear cells is about 74%, and there is still room for improvement in terms of improving the recovery rate of cells to be captured.
  • the present inventors conducted filtration on a liquid containing nucleated cells using a filter containing at least one of a metal and a metal oxide as a main component. The inventors have found that the recovery rate of nuclear cells can be improved, and have reached the present invention.
  • the filter of one embodiment of the present invention includes A filter for filtering nucleated cells,
  • the main component is at least one of metal and metal oxide,
  • a plurality of through holes are formed,
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole is smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell, and the inscribed circle of the through hole is a circle in contact with all sides that define the opening of the through hole.
  • Such a configuration can improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell may be 0.64 or less.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell may be 0.06 or more.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell may be 0.07 or more.
  • Such a configuration can shorten the filtration time and further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the filter may have a smooth main surface on the side in contact with the liquid containing the nucleated cells.
  • nucleated cells captured on the main surface of the filter part can be easily recovered.
  • At least one of the metal and the metal oxide has a dipping potential of 0.03 V or higher based on a reference electrode composed of silver chloride immersed in a saturated potassium chloride solution in phosphate buffered saline. It may be.
  • Such a configuration can prevent the metal or metal oxide that is a component of the filter from eluting into the liquid containing nucleated cells.
  • At least one of the metal and the metal oxide contains at least one selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, nickel, palladium, alloys thereof, and oxides thereof. It may be.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the filtration method of one embodiment of the present invention includes: A method for filtering nucleated cells, comprising: The main component is at least one of a metal and a metal oxide, and a plurality of through holes are formed.
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole is smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell, and
  • An inscribed circle is a circle that is in contact with all sides that define the opening of the through-hole, providing a filter; Passing the liquid containing the nucleated cells through the filter; including.
  • Such a configuration can improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell may be 0.64 or less.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell may be 0.06 or more.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell may be 0.07 or more.
  • Such a configuration can shorten the filtration time and further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the filter may have a smooth main surface on the side in contact with the liquid containing the nucleated cells.
  • nucleated cells captured on the main surface of the filter can be easily recovered.
  • At least one of the metal and the metal oxide has an immersion potential of 0.03 V based on a reference electrode composed of silver chloride immersed in a saturated potassium chloride solution in phosphate buffered saline. You may be noble.
  • Such a configuration can prevent the metal or metal oxide that is a component of the filter from eluting into the liquid containing nucleated cells.
  • At least one of the metal and the metal oxide contains at least one selected from the group consisting of gold, silver, copper, platinum, nickel, palladium, alloys thereof, and oxides thereof. You may do it.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the step of passing the liquid containing the nucleated cells through the filter may include a step of separating live cells and dead cells.
  • the variation coefficient of the size of the plurality of through holes of the filter may be 0.17 or less.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the shape of the through hole of the filter may be a regular polygon.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the shape of the through hole of the filter may be a square.
  • Such a configuration can further improve the recovery rate of nucleated cells.
  • the kit of one embodiment of the present invention includes: A kit for carrying out the filtration method, comprising a filter for filtering nucleated cells,
  • the filter is mainly composed of at least one of metal and metal oxide,
  • a plurality of through holes are formed, The diameter of the inscribed circle of the through hole is smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell, and the inscribed circle of the through hole is a circle in contact with all sides that define the opening of the through hole.
  • Such a configuration can improve the recovery rate of nucleated cells.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a filter 10 according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an enlarged perspective view of a part of the filter 10 according to the first embodiment of the present invention.
  • the X, Y, and Z directions in FIGS. 1 and 2 indicate the vertical direction, the horizontal direction, and the thickness direction of the filter 10, respectively.
  • the filter 10 includes a filter portion 11 and a frame portion 15 provided on the outer periphery of the filter portion 11.
  • the filter 10 has a first main surface PS1 and a second main surface PS2 that face each other.
  • the filter part 11 includes a filter base part 14 in which a plurality of through holes 12 penetrating the first main surface PS1 and the second main surface PS2 are formed.
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is designed to be smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell.
  • the filter 10 filters the nucleated cells by allowing a liquid (cell suspension) containing the nucleated cells to pass through the filter unit 11.
  • nucleated cells are cells in which the nucleolus and cytoplasm are separated by the nuclear membrane.
  • the material constituting the filter base portion 14 forming the base portion of the filter 10 is mainly composed of metal and / or metal oxide.
  • the filter base 14 may be, for example, gold, silver, copper, platinum, nickel, palladium, alloys thereof, and oxides thereof.
  • the outermost layer of the filter 10 may be composed of a metal and / or metal oxide that is difficult to elute into the cell suspension.
  • the outermost layer of the filter 10 is covered with a metal whose immersion potential of the reference electrode standard made of silver chloride soaked in a saturated potassium chloride solution in phosphate buffered saline is nobler than 0.03V.
  • the outermost layer of the filter 10 may be made of a hydrophilic material. For example, when an aqueous cell suspension is treated, the treatment time can be shortened, so that stress on the cells can be reduced.
  • the outer shape of the filter 10 is, for example, a circle, a rectangle, or an ellipse.
  • the outer shape of the filter 10 is substantially circular.
  • the fluid can be made to flow uniformly over the main surface of the filter 10 (for example, the first main surface PS1 of the filter unit 11).
  • substantially circular means that the ratio of the length of the major axis to the length of the minor axis is 1.0 or more and 1.2 or less.
  • the filter part 11 is a plate-like structure in which a plurality of through holes 12 are formed.
  • the shape of the filter unit 11 is, for example, a circle, a rectangle, or an ellipse. In Embodiment 1, the shape of the filter part 11 is substantially circular. By making the shape of the filter part 11 substantially circular, the fluid can flow uniformly with respect to the first main surface PS1 of the filter part 11.
  • FIG. 3 is a schematic view of a part of the filter unit 11 as viewed from the thickness direction (Z direction).
  • the plurality of through holes 12 are periodically arranged on the first main surface PS ⁇ b> 1 and the second main surface PS ⁇ b> 2 of the filter unit 11. Specifically, the plurality of through holes 12 are provided at regular intervals in a matrix in the filter unit 11.
  • the through hole 12 has a square shape when viewed from the first main surface PS1 side of the filter unit 11, that is, the Z direction.
  • the shape of the through-hole 12 as viewed from the Z direction is not limited to a square, and may be a shape such as a triangle, a rhombus, or a regular polygon.
  • the shape (cross-sectional shape) of the through-hole 12 projected on a plane perpendicular to the first main surface PS1 of the filter unit 11 is a rectangle.
  • the cross-sectional shape of the through hole 12 is a rectangle in which the length of one side in the radial direction of the filter 10 is longer than the length of one side in the thickness direction of the filter 10.
  • the cross-sectional shape of the through-hole 12 is not limited to a rectangle, and may be, for example, a tapered shape such as a parallelogram or a trapezoid, a symmetric shape, or an asymmetric shape. .
  • the plurality of through holes 12 have two arrangement directions parallel to each side of the square when viewed from the first main surface PS1 side (Z direction) of the filter unit 11, that is, the X direction in FIG. They are provided at equal intervals in the Y direction.
  • the aperture ratio can be increased, and the passage resistance of the fluid to the filter 10 can be reduced.
  • the processing time can be shortened and the stress on the cells can be reduced.
  • the filter can be easily observed.
  • the arrangement of the plurality of through holes 12 is not limited to a square lattice arrangement, and may be a quasi-periodic arrangement or a periodic arrangement, for example.
  • the periodic array as long as it is a square array, a rectangular array in which the intervals in the two array directions are not equal may be used, or a triangular lattice array or a regular triangular lattice array may be used.
  • the through-hole 12 should just be provided with two or more by the filter part 11, and arrangement
  • the interval between the through holes 12 is appropriately designed according to the type (size, form, nature, elasticity) or amount of cells to be separated.
  • the interval between the through holes 12 is, as shown in FIG. 3, the through holes 12 adjacent to the center of any through hole 12 when the through holes 12 are viewed from the first main surface PS1 side of the filter portion 11. It means the distance b from the center.
  • the interval b between the through holes 12 is, for example, larger than 1 side d of the through hole 12 and 10 times or less, preferably 3 times less than the side d of the through hole 12.
  • the aperture ratio of the filter unit 11 is 10% or more, and preferably the aperture ratio is 25% or more.
  • the aperture ratio is calculated by (area occupied by the through hole 12) / (projected area of the first main surface PS1 when it is assumed that the through hole 12 is not vacant).
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is designed to be smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell.
  • the “inscribed circle of the through hole 12” means a circle having the largest diameter among circles drawn in the through hole 12 when viewed from the first main surface PS1 side of the filter portion 11, that is, the through hole 12. Is the circle with the largest diameter among the circles in contact with the inner wall of the filter part 11 constituting.
  • the “inscribed circle of the through hole 12” means a circle that contacts all sides that define the opening of the through hole 12 when viewed from the first main surface PS1 side of the filter unit 11.
  • nucleus size of a nucleated cell means that a nucleated cell is placed in a liquid and observed with a microscope, and any two points on the periphery of the nucleus of the nucleated cell are connected. If the longest of the lines is the length of the nucleus of the nucleated cell, it means the average value of the lengths of the nucleated cells.
  • the dimension of the through hole 12 is preferably such that the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole to the size of the nucleus of the nucleated cell is 0.64 or less.
  • the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 to the size of the nucleus of the nucleated cell is preferably 0.06 or more. More preferably, the ratio of the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 to the size of the nucleus of the nucleated cell is 0.07 or more.
  • the dimensions of the plurality of through holes 12 are designed to be substantially the same.
  • the standard deviation in the size of the plurality of through holes 12 is small.
  • the variation coefficient is preferably 40% or less.
  • the thickness of the filter part 11 is preferably greater than 0.1 times the size of the through hole 12 (one side d) and not more than 100 times. More preferably, the thickness of the filter portion 11 is greater than 0.5 times the size of the through hole 12 (one side d) and not more than 10 times.
  • the arithmetic average roughness of the surface (first main surface PS1) of the filter unit 11 is preferably smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell. With such a configuration, the adhesion of cells to the surface (first main surface PS1) of the filter unit 11 is reduced, and the cell recovery rate can be increased.
  • the measurement of arithmetic average roughness is carried out using the stylus type surface shape measuring machine DEKTAK150 (registered trademark) manufactured by ULVAC, Inc., and the average value of five measured values on the surface of the filter unit 11 Arithmetic mean roughness.
  • the first main surface PS1 with which the liquid containing nucleated cells comes into contact may be formed smoothly.
  • the first main surface PS1 of the filter unit 11 may be formed with a uniform plane without unevenness.
  • the openings of the plurality of through holes 12 on the first main surface PS1 of the filter portion 11 are formed on the same plane.
  • substrate part 14 which is a part in which the through-hole 12 is not formed among the filter parts 11 is connected, and is formed integrally.
  • the through hole 12 of the filter unit 11 communicates through a wall surface in which an opening on the first main surface PS1 side and an opening on the second main surface PS2 side are continuous.
  • the through hole 12 is provided so that the opening on the first main surface PS1 side can be projected onto the opening on the second main surface PS2 side. That is, when the filter unit 11 is viewed from the first main surface PS1 side, the through hole 12 is provided such that the opening on the first main surface PS1 side overlaps the opening on the second main surface PS2 side.
  • the through hole 12 is provided such that the inner wall thereof is perpendicular to the first main surface PS1 and the second main surface PS2.
  • the frame portion 15 is provided on the outer periphery of the filter portion 11, and is a portion where the number of through holes 12 per unit area is smaller than that of the filter portion 11.
  • the number of through holes 12 in the frame portion 15 is 1% or less of the number of through holes 12 in the filter portion 11.
  • the thickness of the frame portion 15 may be greater than the thickness of the filter portion 11. With such a configuration, the mechanical strength of the filter 10 can be increased.
  • the frame part 15 may function as a connection part that connects the filter 10 and the apparatus.
  • the frame portion 15 may display filter information (such as dimensions of the through hole 12).
  • the frame portion 15 is formed in a ring shape when viewed from the first main surface PS1 side of the filter portion 11.
  • the center of the frame portion 15 coincides with the center of the filter portion 11 when the filter 10 is viewed from the first main surface PS1 side. That is, the frame portion 15 is formed concentrically with the filter.
  • the filter 10 may be used by being fixed to a jig from the viewpoint of ease of handling and ease of joining with the system.
  • the jig can be made of, for example, a material that can be gamma sterilized.
  • the jig is, for example, polyethylene, polyethylene terephthalate, polyurethane, polystyrene, silicone rubber, ABS resin, polyamide, polyamideimide, polysulfone, natural rubber, latex, urethane rubber, silicone rubber, ethylene vinyl acetate, polyesters, epoxies, You may form with the material containing phenols, a silica, an alumina, gold
  • the filter 10 is prepared.
  • a filter 10 is prepared in which the size of the through hole 12 is selected according to the size of the nucleus of the nucleated cell.
  • a filter 10 having a through hole 12 smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell to be filtered is prepared.
  • the size of the through holes 12 smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell is confirmed by confirming the size of the nucleus of the plurality of nucleated cells using a micrometer or a hemocytometer.
  • a filter 10 having a size may be selected.
  • the filter 10 having a through-hole 12 size smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell can be obtained by photographing a plurality of nucleated cells and measuring the size of the nucleus of the plurality of nucleated cells. You may choose. The selection of the filter 10 is not limited to these.
  • the filter 10 is attached to the apparatus. Specifically, the filter 10 is attached to the apparatus by sandwiching the frame portion 15 of the filter 10.
  • cell suspension is a fluid containing nucleated cells.
  • the fluid containing nucleated cells is a liquid.
  • the liquid include a culture solution containing amino acid, protein, serum, etc., phosphate buffered saline, or water.
  • the cell suspension may contain non-living substances such as resin particles, a part of tissue such as bone pieces or meat pieces, dead cells, and the like.
  • the nucleated cells are separated from the liquid by passing the liquid containing the nucleated cells through the filter unit 11.
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 of the filter unit 11 is designed to be smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell. For this reason, the nucleated cells are captured on the first main surface PS1 of the filter unit 11 without passing through the through hole 12.
  • the cell suspension As a method for allowing the cell suspension to pass through the filter 10, for example, there is a method for allowing the cell suspension to pass through the first main surface PS1 of the filter unit 11 from substantially vertically above using gravity. In addition to this, the cell suspension is brought into contact with the first main surface PS1 of the filter unit 11 and then the cell suspension is pressurized (passed), or the first main surface PS1 of the filter unit 11 There is a method in which the cell suspension is brought into contact with the cell suspension and sucked from the second main surface PS2 to pass through the cell suspension (suction). In the step of allowing the liquid containing nucleated cells to pass through the filter unit 11, it is preferable that the cells are not stressed as much as possible.
  • the pressure when applying pressure, it is preferable to set the pressure so that the nucleated cells do not deform. More preferably, the liquid is passed through the filter unit 11 by its own weight without applying pressure. Alternatively, it is preferable to shorten the processing time by increasing the aperture ratio of the filter unit 11 and reduce the time during which the nucleated cells are stressed.
  • the cell suspension may be passed through the filter 10 with the nucleated cells floating in the liquid. Since the nucleated cells suspended in the liquid have a substantially spherical shape, the recovery rate of the nucleated cells to be captured can be improved. That is, it is possible to improve the dimensional accuracy of nucleated cells to be captured.
  • the filter 10 by passing the filter 10 a plurality of times, the dimensional accuracy of the nucleated cells to be captured can be increased.
  • filtration may be performed using a filtration container.
  • the filtration container is, for example, a cylindrical container having an outer diameter of 14 mm, an inner diameter of 6 mm, and a height of 55 mm, and the filter 10 can be attached to the bottom.
  • a filtration container is not limited to this, You may use containers of various shapes and dimensions.
  • a Cu power feeding film is formed on the upper surface of the silicon substrate.
  • This power supply film serves as a power supply when forming a filter base portion 14 of the filter 10 described later.
  • an intermediate layer such as Ti may be formed for the purpose of securing the adhesion between the silicon substrate and the power feeding film.
  • the conditions for forming the Cu power supply film are as follows.
  • Sputtering gas Argon gas Vacuum degree of sputtering apparatus: 5.0 ⁇ 10 ⁇ 4 Pa
  • Applied power DC500W
  • Sputtering time Cu film formation / 27 minutes Ti film formation / 3 minutes 5 seconds
  • a resist image is formed on the power supply film formed on the upper surface of the silicon substrate.
  • a resist film having a predetermined thickness is formed on the power supply film formed on the upper surface of the silicon substrate using a spin coater or the like.
  • the resist is exposed through a photomask on which a predetermined pattern is formed and developed to form a resist image.
  • the conditions for applying the resist film are as follows. Resist agent: Novolac resin + organic solvent Spin coater rotation speed: 1130 rpm Resist film thickness: 2 ⁇ m After applying the resist agent on the upper surface of the silicon substrate with a spin coater, the solvent is volatilized at 130 ° C. in a nitrogen atmosphere and then cooled to form a resist film.
  • the resist agent is exposed by irradiating a light beam having an energy density of 2500 J / m 2 including a wavelength of 365 nm for 0.25 seconds.
  • a filter base portion 14 is formed in the opening of the resist image. Using the previously formed power supply film as a power supply, the filter base portion 14 made of a nickel plating film is formed by electrolytic plating.
  • the conditions for forming the filter base portion 14 are as follows. Pretreatment: The surface of the power supply film is activated by being immersed in dilute sulfuric acid for 60 seconds.
  • Plating speed 0.5 ⁇ m / min Plating: Electroplating is performed while rocking.
  • a support base may be provided on the filter 10 as necessary. By doing in this way, it can prevent that the filter 10 is damaged during filtration.
  • the support substrate is produced by the following steps.
  • the support base material corresponds to a member indicated by reference numeral “13” in FIG.
  • a photosensitive resist is again applied to the upper surface of the silicon substrate on which the base of the filter 10 is formed to form a resist film, and then the resist is exposed through a photomask and developed to form a resist image. At this time, exposure and development processing are performed so that the resist image crosses a plurality of substrates of the filter 10. A portion where the resist image straddles the base of the filter 10 becomes an opening of the filter 10 after the filter 10 is completed. That is, the number of substrates of the filter 10 that the resist image straddles is appropriately determined according to the aperture ratio required for the filter 10.
  • a filter base portion 14 is formed in the opening of the resist image.
  • a support base material made of a nickel plating film is formed by electrolytic plating. Note that the width of the support substrate is appropriately determined according to the strength required for the filter 10.
  • the resist is peeled off by dissolving the resist film by applying ultrasonic waves to the supporting substrate in an acetone solution for 15 minutes.
  • the removal of the power feeding film is performed by immersing it in an aqueous solution prepared by mixing 60% hydrogen peroxide solution, acetic acid and pure water at a mixing ratio of 1: 1: 20 in an environment of 25 ° C. for 48 hours.
  • the filter 10 according to Embodiment 1 can provide the following effects.
  • the filter 10 contains at least one of metal and metal oxide as a main component.
  • the filter 10 includes a filter portion 11 in which a plurality of through holes 12 are formed. With such a configuration, the through-hole 12 of the filter unit 11 is not easily deformed, and the nucleated cells to be captured can be captured and the recovery rate of the nucleated cells can be improved.
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is designed to be smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell. With such a configuration, the recovery rate of nucleated cells can be further improved.
  • 1st main surface PS1 of the filter part 11 is formed smoothly. With such a configuration, since the nucleated cells captured by the first main surface PS1 can be easily separated from the filter unit 11, the collection becomes easy.
  • nucleated cells such as an ellipse other than a perfect circle.
  • the diameter of the inscribed circle of the through-hole 12 is formed smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell, and the inscribed circle of the through-hole 12 defines all the openings defining the through-hole 12.
  • a circle that touches the side With such a configuration, it is possible to reliably capture nuclei of various shapes other than the perfect circle nuclei and improve the recovery rate.
  • the nucleated cells that are the capture target can be reliably captured by allowing the liquid containing the nucleated cells to pass through the filter 10, thereby improving the recovery rate. it can.
  • Nucleated cells vary in size depending on the type, culture conditions, passage number, etc. For example, even in the same cell, the size of the nucleus varies depending on the culture conditions such as the temperature, time, or environment of the culture. For this reason, even if it is the same nucleated cell, the size of the nucleus varies, and when the filter 10 is prepared without paying attention to the size of the nucleus, the nucleated cell may pass through the through-hole 12. There is. In the filtration method using the filter 10, the filter 10 in which the size of the through hole 12 is selected according to the size of the nucleus of the nucleated cell is prepared.
  • the filter 10 having the through hole 12 smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell to be filtered is selected, and the filter 10 used for the filtration is prepared. For this reason, in the filtration method using the filter 10, nucleated cells can be reliably captured on the filter 10, and the recovery rate can be improved.
  • the present invention is not limited to this.
  • the dimensions of the through holes 12 may be different from each other.
  • the maximum dimension of the through hole 12 only needs to be designed to be smaller than the size of the nucleus of the nucleated cell.
  • the method for manufacturing the filter 10 has been described as an example including the step of forming the backing layer base portion, but is not limited thereto.
  • the method for manufacturing the filter 10 may not include the step of forming the backing layer base portion.
  • the filter 10 may be used to separate live cells and dead cells from a liquid containing live cells and dead cells.
  • the live cells may be captured on the first main surface PS1 of the filter unit 11 by the filter 10 and the dead cells may be allowed to pass through.
  • the dead cell may be captured on the first main surface PS1 of the filter unit 11 by the filter 10, and the live cell may be allowed to pass through.
  • the filter 10 and the filtration method were demonstrated, it is not limited to this.
  • it may be used as a kit for carrying out the filtration method including the filter 10 for filtering nucleated cells.
  • Example 1-8 and Comparative Example 1 have an outer diameter of 7.8 mm and a filter portion 11 with a diameter of 6 mm.
  • the filter base 14 is nickel (Ni), and the filter base 14 in Example 8 is gold (Au).
  • the filter portion 11 is provided with square through holes 12 in a square lattice arrangement as viewed from the first main surface PS1 side. Since the shape of the through hole 12 is square, as shown in Table 1, the length of one side d of the through hole 12 and the diameter of the inscribed circle have the same dimensions.
  • FIG. 4 shows a schematic configuration of the filter 10 to which the support base material 13 is attached.
  • the support base material 13 is provided on the second main surface PS2 side of the filter 10.
  • the support base 13 is provided with a plurality of square openings 12a.
  • the thickness of the support base 13 is 14 ⁇ m, the one side of the opening 13a, that is, the crossing interval A is 260 ⁇ m, and the crossing width B is 14 ⁇ m.
  • a part of the culture solution from a 100 mm dish was transferred to a 15 mL centrifuge tube by pipetting. Next, the centrifuge tube containing the culture solution was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes, and then the supernatant was removed. Phosphate buffered saline was then added to produce a cell suspension. Incidentally, by adjusting the amount of phosphate buffered saline so that the cell concentration of the cell suspension at 10 5 cells / mL.
  • the size of the cell suspension and 15 ⁇ L of the fluorescent reagent DAPI are mixed in a microtube to stain the cells, and the stained cell suspension (cell stain) is incubated at 37 ° C. for 20 minutes in the dark. did. Thereafter, 10 ⁇ L of the cell staining solution was dropped on the slide glass, the cover glass was overlaid, and the fluorescence was observed with a fluorescence microscope through a bandpass filter centered at 455 nm using an excitation light source having a wavelength of 345 nm. When the size of the nuclei that developed blue-violet color was measured, the size of the HL-60 nuclei was 7.0 ⁇ m in diameter. In the examples, the size of HL-60 nuclei is an average value calculated by measuring the size of 100 HL-60 nuclei.
  • the cell concentration was 5 ⁇ 10 5 cells / mL
  • the average size of active cells was 13.4 ⁇ m
  • the survival rate was 90%.
  • the cell suspension and 0.4% trypan blue solution are mixed at a volume ratio of 1: 1 to stain the cell membrane blue, and 10 ⁇ L of the cell suspension and trypan blue solution mixture is added.
  • the cells were observed by dropping them onto a cell counting slide (Countess (registered trademark) Cell Counting Chamber Slide manufactured by Thermo Fisher). In cell counting, the number of cells (concentration), the average cell size, and the survival rate were determined by image analysis using the stained cell membrane as a marker.
  • a cell counting slide (Countess (registered trademark) Cell Counting Chamber Slide manufactured by Thermo Fisher). In cell counting, the number of cells (concentration), the average cell size, and the survival rate were determined by image analysis using the stained cell membrane as a marker.
  • HL-60 cell suspension was prepared by further mixing RPMI1620 medium in an arbitrary ratio to the culture solution in a 100 mm dish. Concentration of active cells (HL-60) ... 3.06 ⁇ 10 5 cells / mL Liquid volume: 1 mL
  • the viability decreased to 81%. This means that the activity decreases when the cells are left at room temperature for a long time.
  • Example 1-8 the recovery rate of cells (HL-60) was 100%. On the other hand, in Comparative Example 1, the cell recovery rate was 67.6%. In Comparative Example 1, since the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is 7.2 ⁇ m, the size of the nucleus of the cell (HL-60) is larger than 7.0 ⁇ m. For this reason, it is considered that the cells have passed through the through hole 12. On the other hand, in Example 1-8, the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is 0.4 ⁇ m or more and 4.5 ⁇ m or less, which is smaller than the size of the cell nucleus. For this reason, it is considered that in Example 1-8, more cells could be captured by the first main surface PS1 of the filter unit 11 than in Comparative Example 1.
  • the “recovery rate” means the ratio of the number of cells with active activity to the cells captured on the first main surface PS1 of the filter, and is expressed as (number of cells with active activity ⁇ passage). The number of active cells contained in the liquid) / (number of cells with active activity) was calculated.
  • the concentration of active cells HL-60 was different. There is no effect on the results of the evaluation.
  • the number of active cells contained in the flow-through solution was determined by dispersing 10 cells in the flow-through solution by pipetting and then removing 10 samples of 10 ⁇ L of the flow-through solution using a micropipette. The number of cells in the sample was measured with a counter, Countess (registered trademark) II FL).
  • the diameter of the inscribed circle of the through-hole 12 is smaller than the size of the cell nucleus, more cells can be captured and the recovery rate can be improved. This is because the cytoplasm surrounding the cell nucleus is easily deformed, and the cell nucleus is not easily deformed.
  • the cytoplasm is deformed even if the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is smaller than the size of the cell.
  • the cell may pass through the filter 10.
  • the diameter of the inscribed circle of the through-hole 12 is designed to be smaller than the cell nucleus as in Example 1-8, the cell nucleus is less likely to be deformed. Easy to capture.
  • the filter 10 is made of metal contributes to the improvement of the cell recovery rate.
  • the filter 10 made of metal the amount of deformation of the through hole 12 itself of the filter 10 is smaller than that of a resin filter such as a membrane. For this reason, the filter 10 makes it easier to capture cells.
  • the ratio of the diameter (X) of the inscribed circle of the through-hole 12 to the size (Y) of the cell nucleus is 0.64 or less in order to improve the cell recovery rate. Is preferred.
  • the ratio of the diameter (X) of the inscribed circle of the through-hole 12 to the size (Y) of the cell nucleus is preferably 0.06 or more.
  • the filtration time in Example 1 is longer than that in Example 2-7. Therefore, the filtration time can be shortened by setting the ratio of the diameter (X) of the inscribed circle of the through-hole 12 to the size (Y) of the cell nucleus to 0.07 or more.
  • the area of the portion where the through hole 12 is provided in the filter portion 11 of Example 1-8 is 0.28 cm 2 .
  • the processing capacity (the number of input cells / the area of the part where the through holes are provided) is 1.1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • the processing capability is 0.37 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 .
  • the processing capability is higher than that of the filter of Patent Document 1.
  • Example 1-7 a nickel metal filter is used for filtering the cells (HL-60). In Example 1-7, the filtration can be completed without impairing the cell activity. It was. In Example 8, a metal filter made of Au is used for filtering the cells (HL-60). In Example 8, as in Example 1-7, the cell activity is not impaired. The filtration could be completed.
  • Measured immersion potential which is an index of metal ionization tendency, for nickel and Au.
  • immersion potential of a reference electrode standard composed of silver chloride soaked in a saturated potassium chloride solution in phosphate buffered saline was measured for 3 minutes
  • the nickel immersion potential transitioned in a noble range from 0.03 V
  • the immersion potential of Au changed in a noble range from 0.3V. That is, it can be said that filtration is possible without impairing the activity of the cell as long as it is a metal and / or metal oxide that exhibits a noble immersion potential of at least 0.03 V when measured under the same conditions.
  • Example 1-8 while HL-60 was captured on the first main surface PS1 of the filter unit 11, phosphate buffered saline could be passed.
  • the ease of liquid passage depends on the aperture ratio of the filter, but the lowest aperture ratio among the examples is 23.3% in Examples 1 and 2 (see Table 1). In other words, it can be said that the liquid can be passed if the aperture ratio of the metal filter of the present invention is at least 23.3%.
  • the variation of the through holes 12 formed in the metal filter is small. In the case where the filtration time is short (for example, less than 100 seconds), the largest variation coefficient among the examples is 0.17 in Example 3. That is, it can be said that the coefficient of variation is preferably 0.17 or less.
  • Example 9-16 has an outer diameter of 7.8 mm and a filter portion 11 with a diameter of 6 mm.
  • the filter base 14 is nickel, and in Example 16, the filter base 14 is Au.
  • the filter portion 11 is provided with square through holes 12 in a square lattice arrangement as viewed from the first main surface PS1 side. Since the shape of the through hole 12 is a square, as shown in Table 3, the length of one side d of the through hole 12 and the diameter of the inscribed circle have the same dimensions.
  • the medium was removed from the 100 mm dish by suction.
  • 2 mL of phosphate buffered saline was added to Hela cells on a 100 mm dish, and the cell culture surface (cell surface) of the Hela cells was washed by pipetting.
  • 1 mL of phosphate buffered saline was added, and the cell culture surface of the Hela cells was washed again by pipetting, and the PBS was removed by suction. Thereafter, 0.8 mL of a 0.25% trypsin / 0.02% EDTA solution was added to the washed Hela cells, and allowed to stand in a CO 2 incubator for 5 minutes.
  • the cell suspension was transferred from the 100 mm dish to a 15 mL centrifuge tube by pipetting. Further, the 100 mm dish was washed with 1 mL of the medium, and a part of the cell suspension was transferred to a centrifuge tube. Centrifugation was performed at 1,000 rpm for 5 minutes using a centrifuge, and the supernatant was removed. Thereafter, the cells were dispersed by pipetting with 1 mL of the medium.
  • the size of Hela cell nuclei was measured by magnifying a part of the cell suspension at a magnification of 40 times.
  • the size of the Hela cell nucleus was 10.0 ⁇ m in diameter.
  • the size of the nuclei of Hela cells is an average value calculated by measuring the size of the nuclei of 100 Hela cells.
  • the cells were observed by dropping them onto a cell counting slide (Countess (registered trademark) Cell Counting Chamber Slide manufactured by Thermo Fisher). In cell counting, the number of cells (concentration), the average cell size, and the survival rate were determined by image analysis using the stained cell membrane as a marker.
  • a cell counting slide (Countess (registered trademark) Cell Counting Chamber Slide manufactured by Thermo Fisher). In cell counting, the number of cells (concentration), the average cell size, and the survival rate were determined by image analysis using the stained cell membrane as a marker.
  • the cell suspension containing the cultured Hela cells was diluted with RPMI1620 medium to prepare a Hela cell suspension.
  • NIH3T3 (hereinafter referred to as NIH3T3 (ras)) suspension into which the ras gene has been introduced
  • NIH3T3 (ras) NIH3T3
  • Mouse embryonic fibroblast adherent cells NIH3T3 (ras) into which the ras gene had been introduced were cultured for 3 days in a medium (containing 4.5 g / L glucose and L-glutamic acid).
  • the medium was removed from the 100 mm dish by suction.
  • 2 mL of phosphate buffered saline was added to NIH3T3 (ras) remaining on the 100 mm dish, and the cell culture surface (cell surface) was washed by pipetting.
  • 1 mL of phosphate buffered saline was added, the cell culture surface was washed again by pipetting, and the PBS was removed by suction.
  • 0.8 mL of 0.25% trypsin / 0.02% EDTA solution was added, and the mixture was allowed to stand in a CO 2 incubator for 3 minutes.
  • a part of the cell suspension was transferred from the 100 mm dish to a 15 mL centrifuge tube by pipetting. Further, the 100 mm dish was washed with 1 mL of the medium, and a part of the cell suspension was transferred to a centrifuge tube. Centrifugation was performed at 1,000 rpm for 5 minutes using a centrifuge, and the supernatant was removed. Thereafter, the cells were dispersed by pipetting with 1 mL of the medium.
  • the size of the NIH3T3 (ras) nucleus was measured by magnifying a part of the cell suspension at a magnification of 40 times.
  • the nucleus size of NIH3T3 (ras) was 11.5 ⁇ m in diameter.
  • the NIH3T3 (ras) nucleus size is an average value calculated by measuring the size of 100 NIH3T3 (ras) nuclei.
  • 10 ⁇ L of this cell suspension is removed using a micropipette, and the cell concentration, viability, and average cell size are measured with a cell counter (Thermo Fisher automatic cell counter, Countess (registered trademark) II FL). The value was measured. As a result, the cell concentration was 4 ⁇ 10 6 cells / mL, the average size of active cells (NIH3T3 (ras)) was 15.4 ⁇ m, and the survival rate was 89%. Specifically, the cell suspension and 0.4% trypan blue solution are mixed at a volume ratio of 1: 1 to stain the cell membrane blue, and 10 ⁇ L of the cell suspension and trypan blue solution mixture is added.
  • a cell counter Thermo Fisher automatic cell counter, Countess (registered trademark) II FL. The value was measured. As a result, the cell concentration was 4 ⁇ 10 6 cells / mL, the average size of active cells (NIH3T3 (ras)) was 15.4 ⁇ m, and the survival
  • the cell morphology is observed by dropping onto a cell counting slide (Thermo Fisher's Countess® Cell Counting Chamber Slide). In cell counting, the number of cells (concentration), the average cell size, and the survival rate were determined by image analysis using the stained cell membrane as a marker.
  • the cultured cell suspension containing NIH3T3 (ras) was diluted with the DMEM medium (containing 4.5 g / L glucose and L-glutamic acid) to prepare a NIH3T3 (ras) cell suspension.
  • DMEM medium containing 4.5 g / L glucose and L-glutamic acid
  • the size of the nucleus of Hela cells and the size of the nucleus of NIH3T3 (ras) were also measured using a fluorescence microscope. Specifically, the size of Hela cell nuclei and the size of NIH3T3 (ras) nuclei were measured by magnifying a part of these cell suspensions at a magnification of 40 times using a fluorescence microscope. As a result of measurement using a fluorescence microscope, the size of the Hela nucleus was 10.0 ⁇ m in diameter, and the size of the NIH3T3 (ras) nucleus was 11.5 ⁇ m.
  • the cell suspension and 0.4% trypan blue solution are mixed at a volume ratio of 1: 1 to stain the cell membrane blue, and 10 ⁇ L of the cell suspension and trypan blue solution mixture is added.
  • the cells were observed by dropping them onto a cell counting slide (Countess (registered trademark) Cell Counting Chamber Slide manufactured by Thermo Fisher). In cell counting, the number of cells (concentration), the average cell size, and the survival rate were determined by image analysis using the stained cell membrane as a marker.
  • Hela cell suspension was prepared by further mixing phosphate buffered saline in an arbitrary ratio to the cell suspension containing Hela cells.
  • NIH3T3 (ras) cell suspension was prepared by further mixing phosphate buffered saline in an arbitrary ratio to the cell suspension containing NIH3T3 (ras). Concentration of active cells (NIH3T3 (ras)) ... 2.97 ⁇ 10 5 cells / mL Liquid volume: 1 mL
  • Example 9-16 the recovery rate was 100% for both Hela and NIH3T3 (ras).
  • the diameter of the inscribed circle of the through hole 12 is 0.4 ⁇ m or more and 7.2 ⁇ m or less, which is smaller than the size of the cell nucleus in Hela and NIH3T3 (ras). Therefore, also in Example 9-16, it is considered that more cells could be captured by the first main surface PS1 of the filter unit 11 as in Example 1-8.
  • Example 9 has a longer filtration time than Examples 10-16. That is, as in Example 1-8, the ratio of the diameter (X) of the inscribed circle of the through-hole 12 to the size (Y) of the cell nucleus can be reduced to 0.07 or more to shorten the filtration time. Can do.
  • the area of the portion where the through hole 12 is provided in the filter portion 11 of Example 9-16 is 0.28 cm 2 .
  • the processing capacity (the number of input cells / the area of the part where the through holes are provided) is 1.1 ⁇ 10 6 cells / cm 2 .
  • the processing capability is 0.37 ⁇ 10 6 pieces / cm 2 .
  • the processing capability is higher than that of the filter of Patent Document 1.
  • Example 9-15 a nickel metal filter was used, and in Example 16, a Au metal filter was used, and filtration was completed without impairing cell activity as in Example 1-8. We were able to.
  • the filter 10 can capture nucleated cells to be collected even when a very low concentration cell suspension with several nucleated cells / mL is filtered into the cell suspension. .
  • the filter of the present invention can improve the recovery rate of nucleated cells, it is useful for use in separating nucleated cells from a cell suspension.

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Abstract

有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターを用いた濾過方法を提供する。本発明の濾過方法は、有核細胞の濾過方法であって、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である、フィルターを準備するステップ、前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、を含む。

Description

有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法
　本発明は、有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法に関する。
　特許文献１には、赤血球と有核細胞と血小板とを含んでなる液体から、細胞捕捉フィルター材を用いて単核細胞と血小板とを濃縮する方法が開示されている。特許文献１の細胞捕捉フィルター材は、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させている。
特開２００９－２８４８６０号公報
　しかしながら、特許文献１の細胞捕捉フィルター材では、有核細胞の回収率の向上といった点で、未だ改善の余地がある。
　本発明は、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することを目的とする。
　本発明の一態様のフィルターは、
　有核細胞の濾過用フィルターであって、
　金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
　複数の貫通孔が形成されており、
　前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である。
　本発明の一態様の濾過方法は、
　有核細胞の濾過方法であって、
　金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である、フィルターを準備するステップ、
　前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
　本発明によれば、有核細胞の回収率を向上させることができる有核細胞の濾過用フィルターおよびそれを用いた濾過方法を提供することができる。
本発明に係る実施の形態１のフィルターの概略構成図である。 本発明に係る実施の形態１のフィルターの一部の拡大斜視図である。 図２のフィルターの一部を厚み方向から見た概略図である。 本発明に係る実施の形態１のフィルターに支持基材を設けた概略図である。
（本発明に至った経緯）
　特許文献１では、不織布で構成される細胞捕捉フィルター材を用いて、有核細胞と血小板とを捕捉し、赤血球のような不要な細胞を通過させることによって、血液から単核細胞を分離している。しかしながら、特許文献１の細胞捕捉フィルターでは、単核細胞の回収率が７４％程度であり、捕捉対象である細胞の回収率の向上といった点で未だ改善の余地がある。
　本発明者らは、鋭意研究したところ、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とするフィルターを用いて、有核細胞を含む液体に対して濾過を行うことによって、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができることを見出し、本発明に至った。
　本発明の一態様のフィルターは、
　有核細胞の濾過用フィルターであって、
　金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
　複数の貫通孔が形成されており、
　前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である。
　このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
　前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．６４以下であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０６以上であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記フィルターにおいて、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０７以上であってもよい。
　このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記フィルターにおいて、前記有核細胞を含む液体が接触する側に平滑な主面を有していてもよい。
　このような構成により、フィルター部の主面で捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
　前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴であってもよい。
　このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。
　前記フィルターにおいて、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有していてもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　本発明の一態様の濾過方法は、
　有核細胞の濾過方法であって、
　金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である、フィルターを準備するステップ、
　前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
を含む。
　このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．６４以下であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０６以上であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０７以上であってもよい。
　このような構成により、濾過時間を短縮すると共に、有核細胞の回収率をより更に向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記フィルターは、前記有核細胞を含む液体が接触する側に平滑な主面を有していてもよい。
　このような構成により、フィルターの主面で捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
　前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴であってもよい。
　このような構成により、フィルターの成分である金属又は金属酸化物が有核細胞を含む液体中に溶出することを防止することができる。
　前記濾過方法において、前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有していてもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含んでもよい。
　このような構成により、生細胞と死細胞とを分離することができる。
　前記濾過方法において、前記フィルターの前記複数の貫通孔の大きさの変動係数は、０．１７以下であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記フィルターの前記貫通孔の形状は、正多角形であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　前記濾過方法において、前記フィルターの前記貫通孔の形状は、正方形であってもよい。
　このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　本発明の一態様のキットは、
　有核細胞の濾過用フィルターを含む、前記濾過方法を実施するためのキットであって、
　前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
　複数の貫通孔が形成されており、
　前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である。
　このような構成により、有核細胞の回収率を向上させることができる。
　以下、本発明に係る実施の形態１について、添付の図面を参照しながら説明する。また、各図においては、説明を容易なものとするため、各要素を誇張して示している。
（実施の形態１）
［フィルターの構成］
　図１は、本発明に係る実施の形態１のフィルター１０の概略構成図である。図２は、本発明に係る実施の形態１におけるフィルター１０の一部の拡大斜視図である。図１及び図２中のＸ、Ｙ、Ｚ方向は、それぞれフィルター１０の縦方向、横方向、厚み方向を示している。図１に示すように、フィルター１０は、フィルター部１１と、フィルター部１１の外周に設けられた枠部１５とを備える。図２に示すように、フィルター１０は、互いに対向する第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを有している。フィルター部１１は、第１主面ＰＳ１と第２主面ＰＳ２とを貫通する複数の貫通孔１２が形成されたフィルター基体部１４を備える。貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。
　フィルター１０は、有核細胞を含む液体（細胞懸濁液）をフィルター部１１に通過させることによって、有核細胞を濾過するものである。
　本明細書において、「有核細胞」とは、核小体と細胞質とが核膜によって隔てられている細胞である。
＜材質＞
　フィルター１０の基体部分を形成するフィルター基体部１４を構成する材料は、金属及び／又は金属酸化物を主成分としている。フィルター基体部１４は、例えば、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物であってもよい。
　フィルター１０の最表層は、細胞懸濁液へ溶出しにくい金属及び／又は金属酸化物で構成されていてもよい。例えば、フィルター１０の最表層が、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である金属で覆われている場合、フィルター１０を構成する材料が、細胞懸濁液へ溶出することを抑制することができる。これにより、細胞へのストレスを低減することができる。あるいは、フィルター１０の最表層は、親水性の材料で構成されていてもよい。例えば、水系の細胞懸濁液を処理する場合に、処理時間を短縮することができるため、細胞へのストレスを低減することができる。
＜外形＞
　フィルター１０の外形は、例えば、円形、長方形、又は楕円形である。実施の形態１では、フィルター１０の外形は、略円形である。フィルター１０の外形を略円形にすることによって、フィルター１０の主面（例えば、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１）に対して流体を均一に流すことができる。なお、本明細書において、「略円形」とは、短径の長さに対する長径の長さの比が１．０以上１．２以下であることをいう。
＜フィルター部＞
　フィルター部１１は、複数の貫通孔１２が形成された板状構造体である。フィルター部１１の形状は、例えば、円形、長方形、楕円形である。実施の形態１では、フィルター部１１の形状は、略円形である。フィルター部１１の形状を略円形にすることによって、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して流体を均一に流すことができる。
　図３は、フィルター部１１の一部を厚み方向（Ｚ方向）から見た概略図である。図３に示すように、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２上に周期的に配置されている。具体的には、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１においてマトリクス状に等間隔で設けられている。
　実施の形態１では、貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側、即ちＺ方向から見て、正方形の形状を有する。なお、貫通孔１２は、Ｚ方向から見た形状が正方形に限定されず、例えば三角形、菱形、正多角形などの形状であってもよい。
　実施の形態１では、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して垂直な面に投影した貫通孔１２の形状（断面形状）は、長方形である。具体的には、貫通孔１２の断面形状は、フィルター１０の半径方向の一辺の長さがフィルター１０の厚み方向の一辺の長さより長い長方形である。なお、貫通孔１２の断面形状は、長方形に限定されず、例えば、平行四辺形又は台形等のテーパー形状であってもよいし、対称形状であってもよいし、非対称形状であってもよい。
　実施の形態１では、複数の貫通孔１２は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側（Ｚ方向）から見て正方形の各辺と平行な２つの配列方向、即ち図３中のＸ方向とＹ方向に等しい間隔で設けられている。このように、複数の貫通孔１２を正方格子配列で設けることによって、開口率を高めることが可能であり、フィルター１０に対する流体の通過抵抗を低減することができる。このような構成により、処理時間を短くし、細胞へのストレスを低減することができる。また、複数の貫通孔１２の配列の対称性が向上するため、フィルターの観察が容易になる。
　なお、複数の貫通孔１２の配列は、正方格子配列に限定されず、例えば、準周期配列、又は周期配列であってもよい。周期配列の例としては、方形配列であれば、２つの配列方向の間隔が等しくない長方形配列でもよく、三角格子配列又は正三角格子配列などであってもよい。なお、貫通孔１２は、フィルター部１１に複数設けられていればよく、配列は限定されない。
　貫通孔１２の間隔は、分離する細胞の種類（大きさ、形態、性質、弾性）又は量に応じて適宜設計されるものである。ここで、貫通孔１２の間隔とは、図３に示すように、貫通孔１２をフィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、任意の貫通孔１２の中心と隣接する貫通孔１２の中心との距離ｂを意味する。周期配列の構造体の場合、貫通孔１２の間隔ｂは、例えば、貫通孔１２の一辺ｄの１倍より大きく１０倍以下であり、好ましくは貫通孔１２の一辺ｄの３倍以下である。あるいは、例えば、フィルター部１１の開口率は、１０％以上であり、好ましくは開口率は、２５％以上である。このような構成により、フィルター部１１に対する流体の通過抵抗を低減することができる。そのため、処理時間を短くすることができ、細胞へのストレスを低減することができる。なお、開口率とは、（貫通孔１２が占める面積）／（貫通孔１２が空いていないと仮定したときの第１主面ＰＳ１の投影面積）で計算される。
　貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。本明細書では、「貫通孔１２の内接円」とは、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、貫通孔１２内に描ける円のうち直径が最も大きい円、即ち貫通孔１２を構成するフィルター部１１の内壁に接する円のうち直径が最も大きい円を意味する。言い換えると、「貫通孔１２の内接円」とは、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、貫通孔１２の開口を画定するすべての辺に接する円を意味する。また、本明細書では、「有核細胞の核の大きさ」とは、有核細胞を液中に配置して顕微鏡で観察し、有核細胞の核の外周の任意の２つの点を結んだ線のうち、最長なものを有核細胞の核の長さとした場合、複数個の有核細胞の核の長さの平均値を意味する。
　貫通孔１２の寸法は、前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合が、０．６４以下であることが好ましい。また、有核細胞の核の大きさに対する貫通孔１２の内接円の直径の割合は、０．０６以上であることが好ましい。より好ましくは、有核細胞の核の大きさに対する貫通孔１２の内接円の直径の割合が、０．０７以上である。
　複数の貫通孔１２の寸法は、略同一に設計されている。同じ形状の複数の貫通孔１２を周期配列した構成である場合、複数の貫通孔１２の大きさにおける標準偏差は小さい方が好ましい。具体的には、貫通孔１２の一辺ｄの測長を行い、１００個の貫通孔１２の一辺ｄの平均値と標準偏差とから変動係数を求めた場合、変動係数は４０％以下が好ましい。
　フィルター部１１の厚みは、貫通孔１２の大きさ（一辺ｄ）の０．１倍より大きく１００倍以下が好ましい。より好ましくは、フィルター部１１の厚みは、貫通孔１２の大きさ（一辺ｄ）の０．５倍より大きく１０倍以下である。このような構成により、流体に対するフィルター１０の抵抗を低減することができ、処理時間を短くすることができる。その結果、細胞へのストレスを低減することができる。
　フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）の算術平均粗さは、有核細胞の核の大きさよりも小さいことが好ましい。このような構成により、フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）への細胞の付着が低減され、細胞の回収率を高くすることができる。なお、算術平均粗さの測定は、株式会社アルバック製の触針式表面形状測定機ＤＥＫＴＡＫ１５０（登録商標）を用い、フィルター部１１の表面のうち５個所の測定値の平均値をフィルター部１１の算術平均粗さとした。
　フィルター部１１において、有核細胞を含む液体が接触する第１主面ＰＳ１は、平滑に形成されていてもよい。具体的には、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１は、凹凸がなく均一な平面で形成されていてもよい。言い換えると、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上の複数の貫通孔１２の開口が同一平面上に形成されている。また、フィルター部１１のうち貫通孔１２が形成されていない部分であるフィルター基体部１４は、繋がっており、一体に形成されている。このような構成により、フィルター部１１の表面（第１主面ＰＳ１）への細胞の付着が低減され、捕捉した有核細胞を容易に回収することができる。
　フィルター部１１の貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口と第２主面ＰＳ２側の開口とが連続した壁面を通じて連通している。具体的には、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口に投影可能に設けられている。即ち、フィルター部１１を第１主面ＰＳ１側から見た場合に、貫通孔１２は、第１主面ＰＳ１側の開口が第２主面ＰＳ２側の開口と重なるように設けられている。実施の形態１において、貫通孔１２は、その内壁が第１主面ＰＳ１及び第２主面ＰＳ２に対して垂直となるように設けられている。
＜枠部＞
　枠部１５は、フィルター部１１の外周に設けられており、フィルター部１１に比べて単位面積当たりの貫通孔１２の数が少ない部分である。枠部１５における貫通孔１２の数は、フィルター部１１における貫通孔１２の数の１％以下である。枠部１５の厚みは、フィルター部１１の厚みよりも厚くてもよい。このような構成により、フィルター１０の機械強度を高めることができる。
　フィルター１０を装置に接続して使用する場合、枠部１５は、フィルター１０と装置とを接続する接続部として機能してもよい。また、枠部１５には、フィルターの情報（貫通孔１２の寸法など）を表示してもよい。
　枠部１５は、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１側から見て、リング状に形成されている。フィルター１０を第１主面ＰＳ１側から見て、枠部１５の中心は、フィルター部１１の中心と一致する。即ち、枠部１５は、フィルターと同心円上に形成されている。
　フィルター１０は、取り扱いやすさ及びシステムとの接合のしやすさの観点から、治具に固定されて使用されてもよい。治具は、例えば、ガンマ滅菌可能な材料で構成することができる。治具は、例えば、ポリエチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタン、ポリスチレン、シリコンゴム、ＡＢＳ樹脂、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリスルフォン、天然ゴム、ラテックス、ウレタンゴム、シリコンゴム、エチレン酢酸ビニル、ポリエステル類、エポキシ類、フェノール類、シリカ、アルミナ、金、白金、ニッケル、ステンレス、チタン、などを含む材料で形成されていてもよい。このような材料で治具を構成することにより、細胞へのストレスを低減することができる。
［濾過方法］
　フィルター１０を用いた濾過方法について説明する。
　まず、フィルター１０を準備する。この工程では、有核細胞の核の大きさに応じて貫通孔１２のサイズを選択したフィルター１０を準備する。具体的には、濾過対象となる有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２を有するフィルター１０を準備する。
　例えば、フィルター１０を準備する工程では、複数個の有核細胞の核の大きさをミクロメーター又は血球計算盤などを用いて確認することによって、有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２のサイズを有するフィルター１０を選択してもよい。あるいは、複数個の有核細胞を写真撮影し、複数個の有核細胞の核の大きさを測長することによって、有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２のサイズを有するフィルター１０を選択してもよい。なお、フィルター１０の選択は、これらに限定されない。
　フィルター１０は、装置に取り付けられる。具体的には、フィルター１０の枠部１５を挟持することによって、フィルター１０が装置に取り付けられる。
　次に、細胞懸濁液をフィルター１０に通過させる。本明細書において、「細胞懸濁液」とは、有核細胞を含む流体である。多くの場合、有核細胞を含む流体は、液体である。液体としては、例えば、アミノ酸、タンパク質、血清、などを含んだ培養溶液、リン酸緩衝生理食塩水、又は水である。細胞懸濁液には、細胞と流体の他に、樹脂製粒子などの非生物由来物質、骨片又は肉片などの組織の一部、死細胞などを含んでいてもよい。
　このように、有核細胞を含む液体をフィルター部１１に通過させることによって、液体から有核細胞を分離する。実施の形態１では、フィルター部１１の貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさよりも小さく設計されている。このため、有核細胞は、貫通孔１２を通過せずに、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に捕捉される。
　細胞懸濁液をフィルター１０に通過させる方法としては、例えば、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に対して略鉛直上方から重力を利用して細胞懸濁液を通過させる方法がある。この他に、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた上で細胞懸濁液に圧力を加えて通過させる方法（押圧）、又はフィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させて、第２主面ＰＳ２から吸引して細胞懸濁液を通過させる方法（吸引）などがある。なお、有核細胞を含む液体をフィルター部１１に通過させる工程においては、細胞にストレスをなるべく与えないことが好ましい。例えば、圧力を加える場合、有核細胞が変形しない程度の圧力とすることが好ましい。より好ましくは、圧力を加えずに、液体の自重により、液体をフィルター部１１に通過させることである。あるいは、フィルター部１１の開口率を高めることによって処理時間を短縮し、有核細胞にストレスがかかっている時間を少なくすることが好ましい。
　また、液体中に有核細胞が浮遊した状態で細胞懸濁液をフィルター１０に通過させてもよい。液体中に浮遊した有核細胞は、ほぼ球形状となるため、捕捉対象である有核細胞の回収率を向上させることができる。即ち、捕捉したい有核細胞の寸法精度を向上させることができる。
　また、フィルター１０に複数回通過させることによって、捕捉対象である有核細胞の寸法精度を高めることができる。
　フィルター１０を用いた濾過方法において、例えば、濾過用容器を用いて、濾過を行ってもよい。濾過用容器は、例えば、外形１４ｍｍ、内径６ｍｍ、高さ５５ｍｍの円筒形状の容器であり、底部にフィルター１０を取り付けることができる。なお、濾過容器は、これに限定されず、様々な形状及び寸法の容器を使用してもよい。
［フィルターの製造方法］
　フィルター１０の代表的な製造方法について説明する。フィルター１０は、以下の工程により製造される。
＜給電膜の形成＞
　スパッタ装置を用いて、シリコン基板の上面にＣｕの給電膜を形成する。この給電膜は、後述するフィルター１０のフィルター基体部１４を形成するときの給電源となる。このとき、シリコン基板と給電膜との接着性確保を目的としてＴｉ等の中間層を形成してもよい。
　Ｃｕの給電膜を形成する条件は、以下の通りである。
　スパッタリングガス：アルゴンガス
　スパッタリング装置の真空度：５．０×１０－４Ｐａ
　印加電力：ＤＣ５００Ｗ
　スパッタ時間：Ｃｕ膜形成時／２７分
　　　　　　　　Ｔｉ膜形成時／３分５秒
＜レジスト像の形成＞
　シリコン基板の上面に形成された給電膜上にレジスト像を形成する。
　スピンコーター等を用いて、シリコン基板の上面に形成された給電膜上に所定の膜厚のレジスト膜を形成する。次に、所定のパターンが形成されたフォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。
　レジスト膜塗布の条件は、以下の通りである。
　レジスト剤：ノボラック系樹脂＋有機溶剤
　スピンコーターの回転数：１１３０ｒｐｍ
　レジスト膜厚：２μｍ
　スピンコーターにて上記レジスト剤をシリコン基板上面に塗布した後に窒素雰囲気下で１３０℃にて溶剤を揮発させた後に冷却することで、レジスト膜を形成する。
　波長３６５ｎｍを含んだエネルギー密度２５００Ｊ／ｍ２の光線を０．２５秒間照射して、レジスト剤を露光する。
　露光部分をアルカリ性溶液に接触させて現像処理する。
＜フィルター基体部の形成＞
　レジスト像の開口部にフィルター基体部１４を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなるフィルター基体部１４を形成する。
　フィルター基体部１４の形成の条件は、以下の通りである。
　前処理：希硫酸に６０秒浸漬させることで給電膜の表面を活性化する。
　めっき液：スルファミン酸ニッケルめっき液　液温５５℃　ｐＨ＝４．０
　めっき速度：０．５μｍ／ｍｉｎ
　めっき：揺動させながら、電解めっきを行う。
＜レジストの溶解及び剥離＞
　フィルター基体部１４にアセトン溶液中で１５分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させて、レジストを剥離する。
＜支持基材の形成＞
　フィルター１０を用いて濾過を行うに際し、必要に応じてフィルター１０に支持基材を設けてもよい。このようにすることで、濾過中にフィルター１０が破損することを防止できる。支持基材は以下の工程により作製される。なお、支持基材は、後述する図４において、符号「１３」で示される部材に相当する。
　フィルター１０の基体が形成されたシリコン基板の上面に再度、感光性レジストを塗布してレジスト膜を形成した後に、フォトマスクを介してレジストを露光し、現像処理することによりレジスト像を形成する。このとき、レジスト像がフィルター１０の基体を複数またぐように露光、現像処理を行う。なお、レジスト像がフィルター１０の基体をまたいでいる部分は、フィルター１０の完成後に、フィルター１０の開口部となる。つまり、レジスト像がまたぐフィルター１０の基体の数は、フィルター１０に求められる開口率に応じて適宜決定される。
　レジスト像の開口部にフィルター基体部１４を形成する。先に形成した給電膜を給電源として、電解めっき法を用いて、ニッケルめっき膜からなる支持基材を形成する。なお、支持基材の幅は、フィルター１０に求められる強度に応じて適宜決定される。
　支持基材にアセトン溶液中で１５分間超音波をかけることによって、レジスト膜を溶解させることで、レジストを剥離する。
＜給電膜の除去＞
　給電膜を除去し、シリコン基板から、フィルター基体部１４及び支持基材を分離することで有核細胞の濾過用のフィルター１０が完成する。
　給電膜の除去は、６０％の過酸化水素水と酢酸と純水を１：１：２０の混合比で作製した水溶液に、２５℃の環境下で４８時間浸漬することによって行う。
［効果］
　実施の形態１に係るフィルター１０によれば、以下の効果を奏することができる。
　フィルター１０は、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分としている。また、フィルター１０は、複数の貫通孔１２が形成されたフィルター部１１を備えている。このような構成により、フィルター部１１の貫通孔１２が変形しにくく、捕捉対象である有核細胞を捕捉し、有核細胞の回収率を向上させることができる。
　貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さくなるように設計されている。このような構成により、有核細胞の回収率を更に向上させることができる。
　フィルター部１１の第１主面ＰＳ１は、平滑に形成されている。このような構成により、第１主面ＰＳ１で捕捉した有核細胞を容易にフィルター部１１から分離させることができるため、回収が簡単になる。
　有核細胞の核の形状は、真円以外に楕円形等の様々な形状が存在する。フィルター１０では、貫通孔１２の内接円の直径は、有核細胞の核の大きさより小さく形成されており、且つ、貫通孔１２の内接円は、貫通孔１２の開口を画定するすべての辺に接する円である。このような構成により、真円形状の核以外の様々な形状の核についても確実に捕捉することができ、回収率を向上させることができる。
　また、フィルター１０を用いた濾過方法では、有核細胞を含む液体をフィルター１０に通過させることによって、捕捉対象である有核細胞を確実に捕捉することができるため、回収率を向上させることができる。
　有核細胞は、種類、培養条件、継代数等によって、核の大きさが変動する。例えば、同じ細胞であっても、培養した温度、時間又は環境などの培養条件によって、核の大きさが異なってくる。このため、同じ有核細胞であっても核の大きさは様々であり、核の大きさに着目せずに、フィルター１０を準備した場合、有核細胞が貫通孔１２を通過してしまうことがある。フィルター１０を用いた濾過方法では、有核細胞の核の大きさに応じて貫通孔１２のサイズを選択したフィルター１０を準備している。即ち、フィルター１０を用いた濾過方法では、濾過対象の有核細胞の核の大きさより小さい貫通孔１２を有するフィルター１０を選択し、濾過に使用するフィルター１０を準備している。このため、フィルター１０を用いた濾過方法では有核細胞をフィルター１０上に確実に捕捉することができ、回収率を向上させることができる。
　なお、実施の形態１では、貫通孔１２の寸法が略同一である例について説明したが、これに限定されない。例えば、貫通孔１２の寸法は、それぞれ異なっていてもよい。この場合、貫通孔１２の最大寸法は、有核細胞の核の大きさより小さく設計されていればよい。
　実施の形態１では、フィルター１０の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含む例を説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター１０の製造方法は、裏打ち層基体部を形成する工程を含んでいなくてもよい。
　実施の形態１では、有核細胞を含む液体をフィルター１０に通過させることによって、有核細胞を濾過する例について説明したが、これに限定されない。例えば、フィルター１０を用いて、生細胞と死細胞とを含む液体から、生細胞と死細胞とを分離してもよい。
　生細胞と死細胞とを分離する方法としては、例えば、フィルター１０によってフィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に生細胞を捕捉し、死細胞を通過させてもよい。また、フィルター１０によって、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上に死細胞を捕捉し、生細胞を通過させてもよい。
　実施の形態１では、フィルター１０と濾過方法について説明したが、これに限定されない。例えば、有核細胞の濾過用のフィルター１０を含む、濾過方法を実施するためのキットとして使用されてもよい。
　実施の形態１に係るフィルター１０の性能評価を、実施例１－８及び比較例１を用いて行った。
（１）実施例１－８と比較例１のフィルターについて
　実施の形態１に係るフィルター１０について、表１に示す仕様で作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実施例１－８及び比較例１は、外形の直径７．８ｍｍ、フィルター部１１の直径６ｍｍである。実施例１－７において、フィルター基体部１４はニッケル（Ｎｉ）であり、実施例８におけるフィルター基体部１４は金（Ａｕ）である。フィルター部１１には、第１主面ＰＳ１側から見て、正方形の貫通孔１２を正方格子配列で設けた。なお、貫通孔１２の形状が正方形であるため、表１に示すように、貫通孔１２の一辺ｄの長さと内接円の直径とは、同じ寸法になっている。
　図４は、支持基材１３が取り付けられたフィルター１０の概略構成を示す。図４に示すように、実施例１－６では、フィルター１０の第２主面ＰＳ２側に支持基材１３が設けられている。支持基材１３には、正方形状の複数の開口部１２ａが設けられている。支持基材１３の厚みは、１４μｍであり、開口部１３ａの一辺、即ち桟の間隔Ａは、２６０μｍであり、桟の幅Ｂは、１４μｍである。
　これらの実施例１－８及び比較例１のフィルターをそれぞれ濾過装置に設置し、細胞懸濁液を濾過することによって、実施例１－８及び比較例１のフィルターの性能評価を行った。
（２）細胞懸濁液について
　１００ｍｍディッシュを用いて、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ１６２０培地（Ｌ－グルタミン含有）で、白血病細胞株である浮遊細胞ＨＬ－６０を５日間培養した。
　１００ｍｍディッシュから培養液の一部を、ピペッティングにより１５ｍＬの遠沈管に移した。次に、培養液が入った遠沈管に対して、回転数１０００ｒｐｍで、３分間の遠心分離を行った後、上清を除去した。次いで、リン酸緩衝生理食塩水を添加し、細胞懸濁液を生成した。なお、細胞懸濁液の細胞濃度が１０５個／ｍＬになるようにリン酸緩衝生理食塩水の添加量を調整した。
　３０μＬの細胞懸濁液と、１５μＬの蛍光試薬ＤＡＰＩと、をマイクロチューブにて混合して細胞を染色し、染色した細胞懸濁液（細胞染色液）を遮光下にて３７℃で２０分間インキュベートした。その後、スライドガラスの上に細胞染色液１０μＬを滴下し、カバーガラスを重ね、波長３４５ｎｍの励起光源を使用し、４５５ｎｍを中心とするバンドパスフィルターを通して、蛍光顕微鏡により蛍光観察を行った。青紫色に発色した核のサイズを測定したところ、ＨＬ－６０の核の大きさは直径で７．０μｍであった。なお、実施例において、ＨＬ－６０の核の大きさは、１００個のＨＬ－６０の核の大きさを測定することによって算出された平均値である。
　１００ｍｍディッシュ中の培養液の一部に対して、ピペッティングにより細胞を分散させた後、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　ＩＩ　ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は５×１０５個／ｍＬ、活性のある細胞（ＨＬ－６０）の大きさの平均値は１３．４μｍ、生存率は９０％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
　１００ｍｍディッシュ中の培養液に対して、さらにＲＰＭＩ１６２０培地を任意の比率で混合することにより、以下のＨＬ－６０細胞懸濁液を作製した。
　活性のある細胞（ＨＬ－６０）の濃度・・・３．０６×１０５個／ｍＬ
　液量・・・１ｍＬ　
　なお、室温下のクリーンベンチ内に４時間放置した１００ｍｍディッシュ中の培養液について、上述の方法で細胞の生存率を測定した結果、生存率が８１％に低下した。このことは、細胞を室温で、長時間放置することによって活性が低下することを意味している。
（３）濾過方法について
　濾過装置に取り付けられた実施例１－８及び比較例１のフィルターにおいて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた状態で、第２主面ＰＳ２側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、２ｋＰａの圧力で吸引を行った。
（４）評価結果について
　表２に評価結果について示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例１－８においては、細胞（ＨＬ－６０）の回収率が１００％であった。これに対し、比較例１では、細胞の回収率が６７．６％であった。比較例１では、貫通孔１２の内接円の直径が７．２μｍであるため、細胞（ＨＬ－６０）の核の大きさ７．０μｍよりも大きい。このため、細胞が貫通孔１２を通過してしまったと考えられる。一方、実施例１－８においては、貫通孔１２の内接円の直径は、０．４μｍ以上４．５μｍ以下であり、細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例１－８では、比較例１と比べて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１で細胞を多く捕捉することができたと考えられる。なお、本明細書において、「回収率」とは、フィルターの第１主面ＰＳ１上に捕捉した細胞に対する投入した活性のある細胞数の割合を意味し、（投入した活性のある細胞数－通過液に含まれる活性細胞の数）／（投入した活性のある細胞数）で計算した。なお、表２において、実施例１－７及び比較例１の評価と、実施例８の評価とは、異なる日に行ったため、活性のある細胞（ＨＬ－６０）の濃度が異なっているが、評価の結果に影響はない。
　なお、通過液に含まれる活性細胞の数は、ピペッティングにより通過液中の細胞を分散させた後にマイクロピペットを使用して１０μＬの通過液を１０検体取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　ＩＩ　ＦＬ）にて、上記検体中の細胞の数を計測した。
　このように、貫通孔１２の内接円の直径を、細胞核の大きさよりも小さく設計することで、より多くの細胞を捕捉することができ、回収率を向上させることができる。この理由としては、細胞核を取り囲む細胞質は変形しやすく、細胞核は変形しにくい点にある。
　比較例１のように、貫通孔１２の内接円の直径が細胞核の大きさよりも大きい場合、たとえ貫通孔１２の内接円の直径が細胞の大きさよりも小さくても、細胞質が変形することで細胞がフィルター１０を通過してしまうことがある。
　一方、実施例１－８のように、貫通孔１２の内接円の直径を細胞核より小さく設計している場合、細胞核は変形しにくいため、比較例１と比べて、細胞をフィルター１０上で捕捉しやすい。
　また、フィルター１０が金属製である点も細胞の回収率の向上に寄与している。金属から成るフィルター１０を使用することで、フィルター１０の貫通孔１２自体の変形量は、メンブレンなどの樹脂性のフィルターと比べて少なくなる。このため、フィルター１０では、更に細胞を捕捉しやすくなっている。
　表２に示すように、細胞の回収率を向上させるために、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．６４以下であることが好ましい。また、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．０６以上であることが好ましい。
　また、表２に示すように、実施例１は、実施例２－７と比べて濾過時間が長くなっている。このことから、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．０７以上にすることによって濾過時間を短縮することができる。
　また、実施例１－８のフィルター部１１において貫通孔１２が設けられている部分の面積は、０．２８ｃｍ２である。処理能力（投入した細胞数／貫通孔が設けられている部分の面積）は、１．１×１０６個／ｃｍ２となる。一方、特許文献１のフィルターでは、処理能力は０．３７×１０６個／ｃｍ２である。このように、実施例１－８では、特許文献１のフィルターと比べて、処理能力が高い。
　また、有核細胞を濾過するに際し、細胞懸濁液への不純物混入、すなわちフィルター１０を構成する金属が細胞懸濁液へ溶出することを抑制することが好ましいことは言うまでもない。
　実施例１－７では、細胞（ＨＬ－６０）を濾過するに際し、ニッケル製の金属フィルターを使用しており、実施例１－７では、細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。また、実施例８では、細胞（ＨＬ－６０）を濾過するに際し、Ａｕ製の金属フィルターを使用しており、実施例８においても、実施例１－７と同様に、細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。
　ニッケルとＡｕについて、金属のイオン化傾向の指標である浸漬電位の測定を実施した。リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位を３分間測定したところ、ニッケルの浸漬電位は０．０３Ｖより貴の範囲で推移し、Ａｕの浸漬電位は、０．３Ｖより貴の範囲で推移した。つまり、同条件で測定したときに、少なくとも０．０３Ｖより貴の浸漬電位を示す金属及び／又は金属酸化物であれば、細胞の活性を損なわずに濾過が可能であると言える。
　また、実施例１－８では、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１上にＨＬ－６０を捕捉する一方で、リン酸緩衝生理食塩水を通過させることができた。液体の通過しやすさは、フィルターの開口率に依存するが、実施例のうち開口率が最も低いのは実施例１及び２における２３．３%である（表１参照）。つまり、本発明の金属製のフィルターの開口率が少なくとも２３．３%であれば、液体を通過させることが可能ということが言える。また、液体の通過させやすさの観点では、金属製フィルターに形成された貫通孔１２のばらつきが小さい方が好ましい。濾過処理時間が短い場合（例えば、１００秒未満）で、実施例のうち変動係数が最も大きいのは、実施例３における０．１７である。つまり、変動係数は、０．１７以下であることが好ましいといえる。
（５）実施例９－１６のフィルターについて
　実施の形態１に係るフィルター１０について、表３に示す仕様で作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　実施例９－１６は、外形の直径７．８ｍｍ、フィルター部１１の直径６ｍｍである。実施例９－１５において、フィルター基体部１４はニッケルであり、実施例１６において、フィルター基体部１４はＡｕである。フィルター部１１には、第１主面ＰＳ１側から見て、正方形の貫通孔１２を正方格子配列で設けた。なお、貫通孔１２の形状が正方形であるため、表３に示すように、貫通孔１２の一辺ｄの長さと内接円の直径とは、同じ寸法になっている。
（６）細胞懸濁液について
　以下の２種類の細胞懸濁液を作製した。
（ｉ）Ｈｅｌａ懸濁液
　１００ｍｍディッシュを用いて、１０ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＲＰＭＩ１６２０培地（Ｌ－グルタミン含有）で、ヒト子宮頚癌由来ヒト細胞株である接着細胞Ｈｅｌａを５日間培養した。
　培養後、１００ｍｍディッシュから培地を吸引除去した。次に、１００ｍｍディッシュ上のＨｅｌａ細胞にリン酸緩衝生理食塩水を２ｍＬ加え、ピペッティングによりＨｅｌａ細胞の細胞培養面（細胞の表面）を洗浄した。更に、リン酸緩衝生理食塩水を１ｍＬ加え、ピペッティングによりＨｅｌａ細胞の細胞培養面の洗浄を再度行い、ＰＢＳ吸引除去した。その後、洗浄したＨｅｌａ細胞に０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ液を０．８ｍＬ加え、ＣＯ２インキュベータ内で５分静置した。顕微鏡でＨｅｌａ細胞が１００ｍｍディッシュから剥離したことを確認後、１００ｍｍディッシュからピペッティングにより１５ｍＬの遠沈管に細胞懸濁液の一部を移した。更に、培地１ｍＬで１００ｍｍディッシュを洗い、細胞懸濁液の一部を遠沈管に移した。遠心分離機を用いて１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。その後、培地１ｍＬでピペッティングし、細胞を分散させた。
　対物ミクロメーター付き顕微鏡を用いて、倍率４０倍で細胞懸濁液の一部を拡大観察することによって、Ｈｅｌａ細胞の核の大きさを測定した。Ｈｅｌａ細胞の核の大きさは、直径１０．０μｍであった。なお、実施例において、Ｈｅｌａ細胞の核の大きさは、１００個のＨｅｌａ細胞の核の大きさを測定することによって算出された平均値である。
　この細胞懸濁液を、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　ＩＩ　ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は７×１０６個／ｍＬ、活性のある細胞（Ｈｅｌａ）の大きさの平均値は１７．１μｍ、生存率は９５％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
　培養したＨｅｌａ細胞を含む細胞懸濁液を、ＲＰＭＩ１６２０培地で希釈してＨｅｌａ細胞懸濁液を作製した。
（ｉｉ）ｒａｓ遺伝子が導入されたＮＩＨ３Ｔ３（以下、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）と表記することがある）懸濁液　１００ｍｍディッシュを用いて、５ｖｏｌ％のウシ胎児血清と１ｖｏｌ％のペニシリン―ストレプトマイシンとを含むＤＭＥＭ培地（４．５ｇ/Ｌ　グルコース　Ｌ－グルタミン酸含有）で、ｒａｓ遺伝子導入したマウス胎児線維芽株接着細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）を３日間培養した。
　培養後、１００ｍｍディッシュから培地を吸引除去した。次に、１００ｍｍディッシュ上に残ったＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）にリン酸緩衝生理食塩水を２ｍＬ加え、ピペッティングにより細胞培養面（細胞の表面）を洗浄した。更に、リン酸緩衝生理食塩水を１ｍＬ加え、ピペッティングにより細胞培養面の洗浄を再度行い、ＰＢＳ吸引除去した。０．２５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ液を０．８ｍＬ加えＣＯ２インキュベータ内で３分静置した。顕微鏡で細胞が１００ｍｍディッシュから剥離したことを確認後、１００ｍｍディッシュからピペッティングにより細胞懸濁液の一部を１５ｍＬの遠沈管に移した。更に、培地１ｍＬで１００ｍｍディッシュを洗い、細胞懸濁液の一部を遠沈管に移した。遠心分離機を用いて１，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。その後、培地１ｍＬでピペッティングし、細胞を分散させた。
　対物ミクロメーター付き顕微鏡を用いて、倍率４０倍で細胞懸濁液の一部を拡大観察することによって、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさを測定した。ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさは、直径で１１．５μｍであった。なお、実施例において、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさは、１００個のＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさを測定することによって算出された平均値である。
　この細胞懸濁液に対して、マイクロピペットを使用して１０μＬ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　ＩＩ　ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度は４×１０６個／ｍＬ、活性のある細胞（ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ））の大きさの平均値は１５．４μｍ、生存率は８９％であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察する。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
　培養したＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）を含む細胞懸濁液を、当該ＤＭＥＭ培地（４．５ｇ/Ｌ　グルコース　Ｌ－グルタミン酸含有）で希釈してＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）細胞懸濁液を作製した。
　また、Ｈｅｌａ細胞の核の大きさとＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさについて、蛍光顕微鏡を用いても測定した。具体的には、蛍光顕微鏡を用いて、倍率４０倍でこれらの細胞懸濁液の一部を拡大観察することによってＨｅｌａ細胞の核の大きさとＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさとを測定した。蛍光顕微鏡を用いて測定したところ、Ｈｅｌａの核の大きさは、直径で１０．０μｍであり、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）の核の大きさは１１．５μｍであった。
　また、これらの細胞懸濁液に対して、マイクロピペットを使用して１０μＬそれぞれ取り出し、細胞数計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製自動セルカウンター、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　ＩＩ　ＦＬ）で細胞濃度、生存率、細胞の大きさの平均値を測定した。その結果、細胞濃度はＨｅｌａが３．１７×１０５個／ｍＬ、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）が２．９７×１０５個／ｍＬ、活性のある細胞の大きさの平均値は、Ｈｅｌａが１７．１μｍ、ＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)が１５．４μｍ、生存率はＨｅｌａが９８%、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）が８９%であった。具体的には、細胞懸濁液と０．４％のトリパンブルー溶液を１：１の体積割合で混合して細胞膜を青色に染色し、細胞懸濁液とトリパンブルー溶液との混合液１０μＬを細胞計数スライド（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ製Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｃｈａｍｂｅｒ　Ｓｌｉｄｅ）に滴下して、細胞の形態を観察した。細胞計数では、染色された細胞膜をマーカーとする画像解析によって、細胞の個数（濃度）、細胞の大きさの平均値、生存率をそれぞれ求めた。
　Ｈｅｌａ細胞を含む細胞懸濁液に対して、さらにリン酸緩衝生理食塩水を任意の比率で混合することにより、以下のＨｅｌａ細胞懸濁液を作製した。
　活性のある細胞（Ｈｅｌａ）の濃度・・・３．１７×１０５個／ｍＬ
　液量・・・１ｍＬ
　ＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)を含む細胞懸濁液に対して、さらにリン酸緩衝生理食塩水を任意の比率で混合することにより、以下のＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)細胞懸濁液を作製した。
　活性のある細胞（ＮＩＨ３Ｔ３(ｒａｓ)）の濃度・・・２．９７×１０５個／ｍＬ
　液量・・・１ｍＬ
（７）濾過方法について
　濾過装置に取り付けられた実施例９－１６のフィルターにおいて、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１に細胞懸濁液を接触させた状態で、第２主面ＰＳ２側から細胞懸濁液を吸引することによって、細胞懸濁液の濾過を行った。操作条件としては、２ｋＰａの圧力で吸引を行った。
（８）評価結果について
　表４及び５に評価結果について示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表４及び表５に示すように、実施例９－１６においては、Ｈｅｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）ともに回収率が１００％であった。実施例９－１６においては、貫通孔１２の内接円の直径は、０．４μｍ以上７．２μｍ以下であり、Ｈｅｌａ及びＮＩＨ３Ｔ３（ｒａｓ）における細胞の核の大きさよりも小さい。このため、実施例９－１６においても、実施例１－８と同様に、フィルター部１１の第１主面ＰＳ１で細胞をより多く捕捉することができたと考えられる。
　また、表４及び５に示すように、実施例９は、実施例１０－１６と比べて濾過時間が長くなっている。つまり実施例１－８と同様に、細胞の核の大きさ（Ｙ）に対する貫通孔１２の内接円の直径（Ｘ）の割合は、０．０７以上にすることによって濾過時間を短縮することができる。
　また、実施例９－１６のフィルター部１１において貫通孔１２が設けられている部分の面積は、０．２８ｃｍ２である。処理能力（投入した細胞数／貫通孔が設けられている部分の面積）は、１．１×１０６個／ｃｍ２となる。一方、特許文献１のフィルターでは、処理能力は０．３７×１０６個／ｃｍ２である。このように、実施例１－８では、特許文献１のフィルターと比べて、処理能力が高い。
　また、実施例９－１５では、ニッケル製の金属フィルターを使用し、実施例１６では、Ａｕ製の金属フィルターを使用し、実施例１－８と同様に細胞の活性を損なわずに濾過を完了することができた。
　なお、実施例においては、細胞懸濁液中に有核細胞が１０５個／ｍＬ以上存在する比較的高い濃度の細胞懸濁液を濾過して有核細胞を捕捉する例について説明したが、フィルター１０は、細胞懸濁液中に有核細胞が数個／ｍＬ程度の極めて低濃度の細胞懸濁液を濾過した場合であっても、回収対象である有核細胞を捕捉することができる。
　本発明は、添付図面を参照しながら好ましい実施形態に関連して充分に記載されているが、この技術の熟練した人々にとっては種々の変形や修正は明白である。そのような変形や修正は、添付した特許請求の範囲による本発明の範囲から外れない限りにおいて、その中に含まれると理解されるべきである。
　本発明のフィルターは、有核細胞の回収率を向上させることができるため、細胞懸濁液から有核細胞を分離する用途に有用である。
　１０　フィルター
　１１　フィルター部
　１２　貫通孔
　１３　支持基材
　１３ａ　開口部
　１４　フィルター基体部
　１５　枠部
　ＰＳ１　第１主面
　ＰＳ２　第２主面

Claims (11)

  1. 　有核細胞の濾過方法であって、
    　金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、複数の貫通孔が形成されており、前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である、フィルターを準備するステップ、
    　前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップ、
    を含む、濾過方法。
  2. 　前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．６４以下である、請求項１に記載の濾過方法。
  3. 　前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０６以上である、請求項１又は２に記載の濾過方法。
  4. 　前記有核細胞の核の大きさに対する前記貫通孔の内接円の直径の割合は、０．０７以上である、請求項１～３のいずれか一項に記載の濾過方法。
  5. 　前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、リン酸緩衝生理食塩水中での、飽和塩化カリウム溶液に浸された塩化銀からなる参照電極基準の浸漬電位が０．０３Ｖより貴である、請求項１～４のいずれか一項に記載の濾過方法。
  6. 　前記金属及び前記金属酸化物の少なくともいずれかは、金、銀、銅、白金、ニッケル、パラジウム、これらの合金及びこれらの酸化物からなる群から選択された少なくとも１つを含有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の濾過方法。
  7. 　前記有核細胞を含む液体を前記フィルターに通過させるステップは、生細胞と死細胞とを分離するステップを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の濾過方法。
  8. 　前記フィルターの前記複数の貫通孔の大きさの変動係数は、０．１７以下である、請求項１～７のいずれか一項に記載の濾過方法。
  9. 　前記フィルターの前記貫通孔の形状は、正多角形である、請求項１～８のいずれか一項に記載の濾過方法。
  10. 　前記フィルターの前記貫通孔の形状は、正方形である、請求項９に記載の濾過方法。
  11. 　有核細胞の濾過用フィルターを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
    　前記フィルターは、金属及び金属酸化物の少なくともいずれかを主成分とし、
    　複数の貫通孔が形成されており、
    　前記貫通孔の内接円の直径は、前記有核細胞の核の大きさより小さく、前記貫通孔の内接円は、前記貫通孔の開口を画定するすべての辺に接する円である、キット。
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