CN104471372A

CN104471372A - 被测定物的测定方法

Info

Publication number: CN104471372A
Application number: CN201380037589.6A
Authority: CN
Inventors: 神波诚治; 近藤孝志; 白井伸明; 冈田俊树; 长谷川慎
Original assignee: Murata Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Murata Manufacturing Co Ltd
Priority date: 2012-07-25
Filing date: 2013-07-22
Publication date: 2015-03-25
Also published as: JPWO2014017430A1; US20150129769A1; WO2014017430A1

Abstract

本发明是一种测定方法，其特征在于，所述测定方法是测定检体中的被测定物的有无或量的方法，其包括如下工序：过滤工序，将具有在垂直于主面的方向上贯通的多个空隙部的空隙配置结构体用作物理过滤器，从所述检体中过滤所述被测定物，将所述被测定物保持于所述空隙配置结构体；测定工序，对保持了所述被测定物的所述空隙配置结构体照射电磁波，检测因所述空隙配置结构体而被散射的电磁波的特性。

Description

被测定物的测定方法

技术领域

本发明涉及被测定物的测定方法。更详细而言，涉及将被测定物保持于具有空隙部的空隙配置结构体，对该空隙配置结构体照射电磁波，检测因空隙配置结构体而被散射的电磁波的特性，由此测定被测定物的有无或量的测定方法。

背景技术

一直以来，为了分析物质的特性，采用如下测定方法：在空隙配置结构体保持被测定物，对保持了该被测定物的空隙配置结构体照射电磁波，对其透射光谱等进行解析从而检测被测定物的有无或量。具体来说，可以举出例如对附着于金属网过滤器的蛋白质等被测定物照射太赫兹波而对透射光谱进行解析的手法。

作为采用这样的电磁波的透射光谱的解析手法的现有技术，专利文献1中公开了如下的测定方法：从相对于与空隙配置结构体的主面垂直的方向倾斜的方向，向具有保持了被测定物的空隙区域的空隙配置结构体(具体为网状的导体板)照射电磁波，测定透过空隙配置结构体的电磁波，测定值的频率特性所产生的跌落(ディップ)波形的位置由于被测定物的存在而发生移动，从而基于此检测被测定物的特性。

以往，采用所述测定方法测定检体中所含的被测定物的情况下，通常，首先从检体中提取出被测定物后，在将提取出的被测定物保持在空隙配置结构体的状态下进行利用电磁波的测定。因此，在测定之前需要另外的被测定物的提取工序，存在用于测定的操作工序增加的问题。

另外，例如，在使用膜过滤器等从液体、气体等检体中过滤提取被测定物的情况下，需要通过转印等将提取出的被测定物转载至空隙配置结构体的工序，由于难以将提取出的被测定物全部移动至空隙配置结构体，因此有时测定结果有较大偏差。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008－185552号公报

发明内容

发明要解决的课题

本发明鉴于上述问题，其目的在于，提供能够解决需要从检体提取被测定物的情况下的操作工序的增加、测定结果的偏差的问题，并以简便的工序高精度地测定检体中所含的被测定物的被测定物的测定方法。

用于解决课题的手段

本发明为一种测定方法，其特征在于，所述测定方法是测定检体中的被测定物的有无或量的方法，并包括如下工序：

过滤工序，将具有在垂直于主面的方向上贯通的多个空隙部的空隙配置结构体用作过滤器，从所述检体中过滤所述被测定物，将所述被测定物保持于所述空隙配置结构体；

测定工序，对保持了所述被测定物的所述空隙配置结构体照射电磁波，检测因所述空隙配置结构体而被散射的电磁波的特性。

所述空隙配置结构体的空隙部的大小优选为所述被测定物不能通过、或难以通过的大小。

所述空隙配置结构体的表面优选按照被测定物容易吸附的方式进行修饰。

所述检体优选为液体或气体。

所述被测定物优选为液体中的微生物，或者，气体中的无机物、有机物、或其复合物。

发明效果

在本发明中，空隙配置结构体兼任提取过滤器和测定器件，因此能够以简便的工序高精度地测定检体中所含的被测定物。

附图说明

图1是用于说明本发明所使用的空隙配置结构体的结构的示意图。

图2是用于说明本发明中的测定工序的一例的概要的示意图。

图3是用于说明实施例1的操作方法的示意图。(a)为俯视图，(b)为剖视图。

图4是表示实施例1中，被空隙配置结构体提取出的酵母的SEM照片的图。

图5是表示在实施例1中，提取出检体1～3后的空隙配置结构体的透过率特性的图。

图6是表示在实施例1中，空隙配置结构体上的酵母数与空隙配置结构体的透过率峰的关系的图表。

具体实施方式

本发明中，测定检体中的被测定物的有无或量是指，对作为液体或气体等检体中所含的被测定物的化合物进行定量，可以举出例如：测定溶液中等的微量的被测定物的含量的情形；进行被测定物的鉴定的情形等。检体优选为液体或气体。另外，所述被测定物优选为液体中的微生物，或者，气体中的无机物、有机物、或其复合物。

本发明的测定方法的特征在于，包括如下工序：

(1)过滤工序，将具有在垂直于主面的方向上贯通的多个空隙部的空隙配置结构体用作过滤器，从检体中过滤被测定物，将被测定物保持于空隙配置结构体；

(2)测定工序，对保持了被测定物的空隙配置结构体照射电磁波，检测因空隙配置结构体而被散射的电磁波的特性。

(空隙配置结构体)

本发明所使用的空隙配置结构体具有在垂直于其主面的方向上贯通的多个空隙部。例如，多个该空隙部在空隙配置结构体的主面上的至少一个方向上周期性地配置。但是，对于空隙部而言，可以是空隙部全部周期性地配置，也可以是在不破坏本发明的效果的范围内，一部分空隙部周期性地配置，而其他空隙部非周期性地配置。

空隙配置结构体优选为准周期结构体或周期结构体。准周期结构体是指，虽然不具有平移对称性但排列保持秩序性的结构体。作为准周期结构体，例如可以举出作为一维准周期结构体的斐波纳契结构、作为二维准周期结构体的彭罗斯结构。周期结构体是指，具有以平移对称性代表的各种空间对称性的结构体，根据其对称的维度而分类为一维周期结构体、二维周期结构体、三维周期结构体。一维周期结构体可以举出例如线栅结构、一维衍射光栅等。二维周期结构体可以举出例如网过滤器、二维衍射光栅等。在这些周期结构体之中，适宜使用二维周期结构体。

作为二维周期结构体，可以举出例如图1所示那样的呈矩阵状以固定间隔配置有空隙部的板状结构体(栅格状结构体)。图1(a)所示的空隙配置结构体1为，从其主面10a侧观察时正方形的空隙部11沿着与该正方形的各边平行的两个排列方向(图中的纵向和横向)以相等的间隔设置的板状结构体。

空隙配置结构体的空隙部的大小、配置、空隙配置结构体的厚度等没有特别限制，但空隙配置结构体的空隙部的大小优选为被测定物不能通过、或难以通过的大小。另外，根据空隙配置结构体的材质特性、使用的电磁波的频率等来适当设计。

具体来说，例如，在空隙部如图1(a)所示那样沿纵横规则配置的空隙配置结构体1中，图1(b)中d所表示的空隙部的孔尺寸优选为被测定物的大小(例如，连接被测定物的表面上的2点间的直线中最长的直线的长度)以下，最优选空隙部的孔尺寸与被测定物的大小为同等程度。具体的孔尺寸根据被测定物的大小来决定，没有特别限定，但优选为0.15～150μm，从测定灵敏度提高的观点出发，孔尺寸更优选为0.9～9μm。

需要说明的是，用于测定的电磁波的波长优选设定为这样的孔尺寸的十分之一以上且十倍以下。由此，散射的电磁波的强度变得更强，变得更容易检测信号。

另外，在空隙部如图1(a)所示沿纵横规则配置的空隙配置结构体1中，图1(b)中s所表示的空隙部的栅格间隔(间距)优选为用于测定的电磁波的波长的十分之一以上且十倍以下。通过按这种方式设置，散射变得更容易发生。具体的栅格间隔优选为0.15～150μm，从测定灵敏度提高的观点出发，栅格间隔更优选为1.3～13μm。

另外，空隙配置结构体的厚度优选为用于测定的电磁波的波长的5倍以下。通过按这种方式设置，散射的电磁波的强度变得更强，从而变得容易检测信号。

空隙配置结构体的整体的尺寸没有特别限制，根据照射的电磁波的光束点的面积等来决定。

空隙配置结构体优选至少其表面的一部分由导体形成。空隙配置结构体1的表面是指，图1(a)所示的主面10a、侧面10b和空隙部的内壁11a的表面。需要说明的是，空隙配置结构体的整体也可以由导体形成。

在此，导体是指导电的物体(物质)，不仅包括金属还包括半导体。作为金属，可以举出：能够与具有羟基、硫醇基、羧基等官能团的化合物的官能团键合的金属；能够使羟基、氨基等官能团覆盖于表面的金属；以及这些金属的合金。具体而言，可举出金、银、铜、铁、镍、铬、硅、锗等，优选为金、银、铜、镍、铬，进一步优选为金、镍。在使用金、镍的情况下，特别是在主分子具有硫醇基(－SH基)的情况下，能够使用该硫醇基将主分子键合于空隙配置结构体的表面，因此是有利的。另外，在使用镍的情况下、特别是主分子具有烷氧基硅烷基的情况下，能够使用该烷氧基硅烷基将主分子键合于空隙配置结构体的表面，因此是有利的。另外，作为半导体，可以举出例如IV族半导体(Si、Ge等)、II－VI族半导体(ZnSe、CdS、ZnO等)、III－V族半导体(GaAs、InP、GaN等)、IV族化合物半导体(SiC、SiGe等)、I－III－VI族半导体(CuInSe2等)等化合物半导体、有机半导体。

(1)过滤工序

在本发明中的过滤工序中，通过将上述的空隙配置结构体用作过滤器，从而从检体中过滤被测定物，被测定物被保持于空隙配置结构体。

另外，从通过提高测定灵敏度、抑制测定的偏差从而进行高再现性的测定的观点出发，优选使被测定物直接附着于空隙配置结构体的表面。可以举出例如：在使用空隙配置结构体由液体检体过滤出被测定物后，对残存在空隙配置结构体的空隙部等的湿润状态的被测定物进行干燥，由此将被测定物保持于空隙配置结构体的方法。

此外，可以举出在空隙配置结构体的表面与被测定物之间直接形成化学键等的方法。作为化学键，可以举出共价键(例如，金属－硫醇基间的共价键等)、范德瓦尔斯键、离子键、金属键、氢键等。

需要说明的是，优选在所述空隙配置结构体的表面实施被测定物容易吸附那样的修饰。对于被测定物容易吸附那样的修饰而言，可以举出例如利用与被测定物亲和性高的物质进行的涂敷。

此外，可以实施在空隙配置结构体的表面键合主分子的修饰，以使该主分子键合被测定物。在此，主分子是指能够使被测定物特异性地键合的分子等，作为主分子和被测定物的组合，可以举出例如抗原和抗体、糖链和蛋白质、脂质和蛋白质、低分子化合物(配体)和蛋白质、蛋白质和蛋白质、单链DNA和单链DNA等。

另外，作为将主分子键合的修饰以外的方法，可以举出浸渍(将结构体浸在液体中后拉起的方法)、蒸镀(CVD、PVD)。

需要说明的是，过滤工序可以是独立于测定工序的工序，也可以是与测定工序连续的工序。具体来说，例如：可以在利用过滤工序从检体中过滤被测定物，使被测定物保持于空隙配置结构体后，使保持有被测定物的空隙配置结构体移动至另外设置的测定机器，然后实施测定工序；也可以不移动保持有被测定物的空隙配置结构体等，而在原本的状态下照射电磁波，实施测定工序。

(2)测定工序

利用图2对本发明的测定工序的一例的概况进行说明。图2是示意性地表示在测定工序中使用的测定装置的一例的整体结构的图。该测定装置利用电磁波(例如，具有20GHz～120THz的频率的太赫兹波)脉冲，所述电磁波脉冲是通过向半导体材料照射由激光器2(例如，短光脉冲激光器)照射的激光而产生的。

在图2的结构中，将从激光器2射出的激光利用半透明反光镜20分支为两个路径。一个路径向电磁波产生侧的光导元件71照射，另一路径通过采用多个反射镜21(同样功能的部件省略编号)，经由时间延迟台26而向接收侧的光导元件72照射。作为光导元件71、72，可以采用在LT－GaAs(低温生长GaAs)形成有具有间隙部的偶极天线的普通元件。另外，作为激光器2，可以使用纤维型激光器、或采用了钛蓝宝石等固体的激光器等。此外，电磁波的产生、检测中，可以以无天线的方式使用半导体表面、或使用诸如ZnTe晶体这样的电光学晶体。在此，通过电源3对成为产生侧的光导元件71的间隙部施加有适当的偏压。

产生的电磁波由抛物面镜22变成平行光束，并通过抛物面镜23向空隙配置结构体1照射。透过空隙配置结构体1的太赫兹波通过抛物面镜24、25而由光导元件72接收。由光导元件72接收的电磁波信号被放大器6增幅后，以时间波形的形式而被锁定放大器4获得。然后，利用包括计算单元在内的PC(个人电脑)5进行傅里叶变换等信号处理后，计算出空隙配置结构体1的透过率光谱等。为了由锁定放大器4获得，而以振荡器8的信号对施加于产生侧的光导元件71的间隙的来自电源3的偏压进行调制(振幅5V～30V)。由此，通过进行同步检波，而能够提高S/N比。

以上说明的测定方法是通常被称为太赫兹时域分光法(THz－TDS)的方法。

图2示出了散射为透过的情形、即测定电磁波的透过率的情形。本发明中“散射”是指，包括作为前向散射的一种方式的透过、和作为反向散射的一种形态的反射等在内的广义的概念，优选透过、反射。进一步优选0阶方向的透过、0阶方向的反射。

需要说明的是，通常而言，在将衍射光栅的栅格间隔设为s、入射角设为i、衍射角设为θ、波长设为λ时，由衍射光栅衍射了的光谱可以表示为

s(sin i-sinθ)＝nλ…(1)。

上述“0阶方向”的0阶是指上述式(1)的n为0的情况。由于s及λ不能为0，所以只有在sin i-sinθ＝0的情况下n＝0成立。因此，上述“0阶方向”是指，入射角与衍射角相等时、即电磁波的行进方向不改变的方向。

本发明中使用的电磁波只要是能够根据空隙配置结构体的结构发生散射的电磁波则没有特别限定，可以使用电波、红外线、可见光线、紫外线、X射线、伽马射线等中的任一种，其频率也没有特别限定，但优选为1GHz～1PHz、进一步优选为具有20GHz～200THz的频率的太赫兹波。

电磁波可以使用例如具有规定的极化(日文：偏波)方向的线性极化的电磁波(线性极化波)、无极化的电磁波(无极化波)。作为线性极化的电磁波，可以举出例如：以短光脉冲激光器为光源并通过ZnTe等电光学晶体的光整流效应而产生的太赫兹波、从半导体激光器射出的可见光、光导天线辐射的电磁波等。作为无极化的电磁波，可以举出从高压汞灯、陶瓷灯辐射的红外光等。

在测定工序中，基于按上述方式求出的与空隙配置结构体中散射的电磁波的频率特性相关的至少一个参数，测定被测定物的特性。例如，能够基于在空隙配置结构体1中发生前向散射(透过)的电磁波的频率特性所产生的跌落波形、发生反向散射(反射)的电磁波的频率特性所产生的峰波形等根据被测定物的存在而变化这一情况，测定被测定物的特性。

在此，跌落波形是指，在检测到的电磁波相对于照射的电磁波的比率(例如，电磁波的透过率)相对变大的频率范围内，空隙配置结构体的频率特性(例如，透过率光谱)中部分地观察到的谷型(向下凸)的部分的波形。另外，峰波形是指，在检测到的电磁波相对于照射的电磁波的比率(例如，电磁波的反射率)相对地变小的频率范围内，空隙配置结构体的频率特性(例如，反射率光谱)中部分地观察到的山型(向上凸)的波形。

根据本发明的测定方法，能够通过比以往更简便的工序测定更微量的被测定物。具体来说，例如，即使在被测定物为液体检体中所含的微量的大肠杆菌等微生物时，也可以在不进行培养等的情况下，从检体中过滤浓缩微生物，当即测定被测定物。

另外，若应用于经由通向洁净室的气体配管等的尘埃侵入的检测，则通过将兼任提取过滤器和测定器件的空隙配置结构体设置于配管，从而能够简便地进行高精度的检测。

实施例

以下，举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。

(实施例1)

在本实施例中，使用空隙配置结构体从检体中过滤提取酵母，对附着了酵母的空隙配置结构体直接照射电磁波，由此测定检体中的酵母数。以下，对其详细内容进行说明。

首先，准备培养有平均细胞径为5μm的酵母的培养液。利用离心沉淀法，进行2次培养液的纯水洗涤后，对沉淀物(酵母)添加纯水进行混合，得到酵母悬浊液。

对于得到的酵母悬浊液，进行亚甲基蓝染色，将死亡的酵母染色后，使用细胞自动计数装置(Cellometer(注册商标)Nexcelom Bioscience公司)测定水溶液中的生存细胞数，结果为5×10⁷[个/mL]。

对于确认了该生存细胞数的酵母悬浊液，进行(1)1/10稀释、(2)1/30稀释、(3)1/100稀释，分别作为检体1～3。

如图3所示，作为空隙配置结构体，准备正方形的空隙在主面方向上配置成正方栅格状的Ni制的结构体、且尺寸是间距(图3(b)的s)为6.5μm、开口尺寸(图3(b)的d)为4μm、厚度为1.5μm的结构体。另外，平板状结构体的整体为圆盘状，其外径为6mm。

接下来，为了使酵母变得容易向空隙配置结构体吸附，用骨胶原涂敷空隙配置结构体的表面。具体来说，用0.02N的乙酸水溶液来溶解骨胶原I(日本BD公司制)而制备1[μg/mL]的骨胶原乙酸溶液，使空隙配置结构体含浸于该溶液中在室温放置约2小时后，用超纯水洗涤，并干燥，从而得到在表面吸附有骨胶原的空隙配置结构体。

如图3(b)所示，按照用外径15mm的2片树脂制夹具12夹住空隙配置结构体1的方式进行固定，在该空隙配置结构体1露出的部分(参照图3(a))，用200μL移液管滴加上述的检体1～3中的任一种，通过抽滤除去水分后，进行干燥，从而将检体中的酵母过滤，并保持于空隙配置结构体。

图4中示出从检体1中过滤的、保持在空隙配置结构体的空隙部的酵母的SEM照片。图4的像球被压破那样的形状的物质是酵母，通过对平均细胞径为5μm的酵母使用开口为4μm见方的空隙配置结构体，确认到确实实现了酵母的过滤和向空隙配置结构体的保持。需要说明的是，在图4所示的空隙配置结构体的空隙部的角部，按照向空隙部内突出的方式形成有突起。

接着，测定通过上述工序提取检体1～3后的空隙配置结构体(试样1～3)的透过率特性(透过率光谱)。得到的透过率光谱示于图5。作为参照，还一并示出了对纯水(没有加入酵母的情形)同样地进行处理后的结果。需要说明的是，使用PE公司制的spectrum one作为测定装置，以空气为基准，以4次累计、4cm－1的条件进行测定。

由图5所示结果可知，随着由空隙配置结构体提取出的酵母数增加(随着酵母悬浊液的酵母密度增加)，空隙配置结构体的透过率降低。

另外，对于上述试样1～3，拍摄10处空隙配置结构体上的酵母的SEM照片，对每1张以目视确认单位面积(100μm²)的酵母数。将10张照片的平均值作为空隙配置结构体上的每单位面积的酵母数。图6是表示空隙配置结构体上的酵母数与空隙配置结构体的透过率的关系的图表。图6中，以空隙配置结构体上的每单位面积(100μm²)的酵母数为横轴，以图5所示试样1～3的透过率光谱中的透过率的峰值(透过率峰)为纵轴。

由图6所示结果可知，空隙配置结构体上的酵母数与空隙配置结构体的透过率峰具有高相关性。由此可知，可以通过用空隙配置结构体过滤提取酵母，测定空隙配置结构体的透过特性，从而以高精度测定检体中的酵母数。

此次公开的实施方式及实施例在所有的方面均应被看作例示而非限制性解释。本发明的范围通过权利要求书而不是通过上述的说明表示，意在包括与权利要求书等同的意思及范围内的所有变更。

符号说明

1 空隙配置结构体、10a 主面、10b 侧面、10c 外周、11 空隙部、11a 内壁、12 树脂制夹具、2 激光器、20 半透明反光镜、21反射镜、22，23，24，25 抛物面镜、26 时间延迟台、3 电源、4 锁定放大器、5 PC(个人电脑)、6 放大器、71，72 光电导元件、8 振荡器。

Claims

1.一种测定方法，其特征在于，

所述测定方法是测定检体中的被测定物的有无或量的方法，其包括如下工序：

2.如权利要求1所述的测定方法，其中，所述空隙配置结构体的空隙部的大小为所述被测定物不能通过、或难以通过的大小。

3.如权利要求1或2所述的测定方法，其中，所述空隙配置结构体的表面按照被测定物容易吸附的方式进行修饰。

4.如权利要求1～3中任一项所述的测定方法，其中，所述检体为液体或气体。

5.如权利要求4所述的测定方法，其中，所述被测定物为液体中的微生物，或者，气体中的无机物、有机物、或其复合物。