JP2024071066A - ウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法 - Google Patents

Abstract

【課題】ウェル内に一つずつ細胞等の粒子を捕捉しやすく、多数の粒子のスクリーニングが容易で、自動での画像解析も行いやすいウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法を提供する。【解決手段】このウェルアレイフィルター１は、フィルタ本体２に複数のウェル３が形成され、ウェル３の開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなし、ウェル３の開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下であり、ウェル底部４には貫通孔８が少なくとも一つ形成され、ウェル隔壁６の最大厚さは１μｍ以上２０μｍ以下であり、ウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率は４０％以上であり、ウェル３の深さはウェル隔壁６の厚さの２倍以上である。【選択図】図１

Description

本発明は、細胞やビーズ等の粒子を捕捉するためのウェルアレイフィルター、粒子整列デバイス、および粒子捕獲方法に関する。

近年、特に創薬分野において、細胞解析のターゲッ卜が細胞群レベルから単一細胞レベルへと細分化され、細胞スクリーニングデバイス（粒子整列デバイス）を用いて、ウェルアレイフィルターの微細かつ多数のウェル内に細胞を１つ１つ捕捉したうえ、多数の細胞に対し一斉にスクリーニングテストを行い、目的の特性を有する細胞を選別する手法が使用されている。細胞をスクリーニングする方法としては、例えば、多数のウェル内に捕捉した細胞を、特定の抗体と結合するキャッチャーなどの試薬を分散させた液と接触させ、キャッチャーと結合した分泌物を分泌した細胞を探し出し、ウェルから回収する方法などが採用されている。

特許文献１に開示された粒子整列デバイスは、レジストで作製されたウェルアレイフィルターを備え、このウェルアレイフィルターには、底部に貫通孔を有するウェルが多数配列されて形成されている。各ウェルの開口形状は、細胞に類似させて、円形または楕円形とされている。特許文献１の実施例では、ウェルの開口径は１００μｍ、ウェルの深さは３０～１００μｍ、貫通孔の開口径は２～５μｍとされたウェルアレイフィルターが開示されている。

特許文献２に開示された粒子整列デバイスは、シリコンウェハで作製されたウェルアレイフィルターを備え、このウェルアレイフィルターには、エッチングにより多数のウェルが配列されて形成され、各ウェルの底部には、貫通孔を形成したＳｉＮｘ膜が設けられている。各ウェルの開口形状は円形とされている。このウェルアレイフィルターは、シリコンウェハから作製されているので、特許文献２の実施例は、フィルタ本体の厚さが３８０μｍ、ウェルの開口径は１００μｍ程度で、ウェル中心間距離は１５０μｍ程度とされている。

特許文献３に開示された粒子整列デバイスは、細胞を格納するための底部に貫通孔を有するウェル基板と、その細胞からの分泌物を検出するための細胞を格納するための基板の２層からなる分泌アッセイ用のウェルアレイフィルターを備えている。前記ウェル基板は、レジストで作製されている。特許文献３の実施例では、ウェルは円形で開口径は１２μｍと細胞に近いサイズであるが、ウェル中心間の距離は１００μｍ程度とされている。

米国特許第１０３７０６３０号明細書 米国特許第９６３８６３６号明細書 特開２０１９－２１３５６６号公報

特許文献１～３に記載されたウェルアレイフィルターでは、いずれもウェル間の距離が大きくされているため、ウェルに細胞やビーズ等の粒子が入らずに、ウェル間の隔壁上に残ってしまう頻度が大きかった。また、ウェル間の距離が大きいため、ウェルを高密度に配列できず、多数の細胞等を一度にスクリーニングするにはウェル配列密度が不十分であった。

また、ウェルの配列密度が低いため、ウェル底部の貫通孔を細胞等が確実に捕獲できる、すなわち細胞等が通り抜けない大きさにすると、ウェルアレイフィルターの面積に占める貫通孔の合計開口面積の比率が小さく、ピペット操作だけでは、ウェルアレイフィルターに十分な量のサンプルを通液しにくいという問題があった。

また、ウェルの開口形状が円形または楕円形にされているため、ウェル内に捕獲された細胞等を自動で画像解析する場合に、細胞とウェルの形状が似ており、画像解析がしにくいという問題もあった。
また、特許文献１～３のいずれもウェル隔壁が厚く、さらに特許文献２では硬いシリコンで形成されているため、フィルターの可撓性が乏しく、細いガラスキャピラリーを用いてウェルから細胞等を回収する際に、キャピラリーの先端がウェル隔壁に当たって破損する可能性があり、作業がしにくいという問題も有していた。

本発明は前記事情に鑑みてなされたものであり、ウェル内に一つずつ細胞等の粒子を捕捉しやすく、多数の粒子のスクリーニングが容易で、自動での画像解析も行いやすいウェルアレイフィルター、粒子整列デバイスおよび粒子捕獲方法を提供することを課題としている。

［態様１］本発明に係る一態様のウェルアレイフィルターは、平板状のフィルタ本体を有し、前記フィルタ本体には前記フィルタ本体の上面のウェル形成領域に開口する複数のウェルが形成され、互いに隣接する前記ウェル同士の間はウェル隔壁によりそれぞれ仕切られ、前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、前記ウェルの開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなし、前記ウェルの開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下であり、前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する貫通孔が少なくとも一つ形成され、前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さは１μｍ以上２０μｍ以下であり、前記ウェル形成領域の面積に対する前記ウェルの合計開口面積の比率は４０％以上であり、前記ウェルの深さは、前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さの２倍以上であることを特徴としている。

前記態様１のウェルアレイフィルターによれば、ウェル間のウェル隔壁が十分に薄いため、ウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により複数の粒子が一つのウェルの中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、さらに高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできる利点を有する。

［態様２］前記態様１において、前記貫通孔の最大内接円直径は４μｍ以下であってもよい。
この場合、前記貫通孔を細胞またはビーズ等の粒子が通り抜けてしまうことを効果的に抑制することができる。

［態様３］前記態様１または２において、前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であってもよい。
この場合、前記貫通孔の合計開口面積が適切であるためピペット操作でウェルアレイフィルターに通液することが容易である。

［態様４］前記態様１～３のいずれか１つにおいて、前記多角形状は、三角形状、四角形状、または六角形状のいずれかであってもよい。
この場合、ウェル形状が三角形状、四角形状、または六角形状のいずれかであることにより、フィルタ本体上にウェルを最密配列することが可能である。

［態様５］前記態様１～４のいずれか１つにおいて、前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されていてもよい。
この場合、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されているから、ウェルアレイフィルター全体の強度を高めつつ、前記ウェル壁部の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルターの反りや歪を低減できる。

［態様６］前記態様１～５のいずれか１つにおいて、前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部はそれぞれ前記ウェルの開口部の形状に対応したタイル形状に分割されて隣接する前記ウェル底部の間には間隙が形成され、これら間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料が侵入して固化していてもよい。
この構造によれば、前記ウェル底部がタイル形状に分割されて相互に間隙が形成された状態としたのち、前記ウェル隔壁を形成して前記間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料を侵入固化させることができるため、ウェル底部が一枚板で形成されている場合に比して、固化収縮のためにウェルアレイフィルターに生じる反りや歪を低減できる。

［態様７］前記態様１～６のいずれか１つにおいて、少なくとも前記ウェルの内面に細胞接着を抑制するポリマーが塗布されていてもよい。前記ポリマーは例えば、ＭＰＣポリマー、ＰＥＧ、ＰＶＡ、ＰＭＥＡ、およびこれらの混合物であってもよい。
この場合、前記ウェルの内面に塗布されたポリマーが細胞接着を抑制するから、ウェルからの細胞または粒子の取り出しが容易になる。前記ポリマーを塗布するのは、前記ウェルの内面だけでなく、前記ウェル隔壁の上面、前記貫通孔の内面、および前記フィルタ本体の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、前記ウェル隔壁の上面に細胞等が付着したり、前記フィルタ本体の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。

［態様８］前記態様１～７のいずれか１つにおいて、前記ウェル底部の厚さは、１ｎｍ以上２μｍ以下であってもよい。
この場合、前記ウェル底部が薄いために、倒立顕微鏡でウェル内の捕捉物をウェル底部を通して観察しやすい上に、薄い分自家蛍光が小さいために自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。

［態様９］本発明の態様９に係る粒子整列デバイスは、前記態様１～８のいずれか１つに記載のウェルアレイフィルターと、前記ウェルアレイフィルターを支持するとともに前記ウェルアレイフィルターの前記ウェルの開口部側から前記貫通孔を通じて前記ウェルの底面側へ向けてサンプル流路を有するデバイス本体を備えたものである。
前記態様９に係る粒子整列デバイスによれば、ウェル間のウェル隔壁が薄いためウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を一つずつ安定的にトラップできる。さらに、高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできるメリットを有する。

［態様１０］本発明の態様１０に係る粒子捕獲方法は、前記態様９の粒子整列デバイスの前記サンプル流路に前記ウェルアレイフィルターおよび前記デバイス本体を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液を前記水溶液で置換する工程と、前記水溶液で置換された前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する。前記有機溶媒を含む液体は限定されないが、例えば、エチルアルコールや、３０～８０％程度のエチルアルコール等の有機溶媒を含む水溶液等の液体、好ましくは７０％エチルアルコール水溶液などが使用できる。
態様１０に係る粒子捕獲方法によれば、前記有機溶媒を含む液体を前記サンプル流路に通液させ、次いで前記サンプル流路内を水溶液に置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、ウェルアレイフィルターの通液抵抗が低減されるとともに、ウェルに気泡が残留しにくく、各ウェル内に一つずつ前記細胞または前記粒子を捕獲することが容易である。

以上説明したように、本発明のウェルアレイフィルターによれば、ウェル間のウェル隔壁が十分に薄いため、ウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により過剰の粒子が一つのウェルの中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、さらに高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできるという優れた効果を奏する。

本発明の第１実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。 同実施形態のウェルアレイフィルターの断面拡大図である。 同実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第２実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第３実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第４実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第５実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第６実施形態のウェルアレイフィルターのウェルの平面拡大図である。 第７実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。 第８実施形態のウェルアレイフィルターの平面拡大図である。 （ａ）～（ｆ）はそれぞれ本発明の実施形態のウェルアレイフィルターの製造方法を示す断面拡大図である。 本発明の一実施形態の粒子整列デバイスを示す平面図である。 同実施形態の粒子整列デバイスを示す縦断面図である。 本発明の実施例の効果を示すグラフである。 本発明の実施例の効果を示すグラフである。 本発明の実施例の効果を示すグラフである。 本発明の実施例の効果を示す写真である。

以下、本発明の実施形態を図面を用いて説明する。
［第１実施形態］
図１および図２は、ウェルアレイフィルターの第１実施形態を示す平面拡大図および断面拡大図である。このウェルアレイフィルター１は、一定の厚さで平板状のフィルタ本体２を有し、フィルタ本体２には、フィルタ本体２の上面のウェル形成領域に、開口する多数のウェル３が形成されている。ウェル形成領域とは、フィルタ本体２のフィルタとして使用される領域を示し、フィルタ本体２はウェル形成領域の周囲に、フィルタを支持するための、ウェルが形成されていない支持領域等を有していてもよい。

互いに隣接するウェル３同士の間は、ウェル隔壁６によりそれぞれ仕切られている。個々のウェル３の下端には、図２に示すように平板状のウェル底部４がそれぞれ形成され、ウェル３の下端を塞いでいる。ウェル３の開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなしている。この実施形態では、ウェル３は正六角形状をなし、各ウェル３およびウェル隔壁６は、ハニカム状に配列されている。倒立顕微鏡でウェル３内の細胞Ｃ等の粒子をウェル底部４を通して観察できるように、少なくともウェル底部４は透明な材質で形成されている。ウェル隔壁６も透明な材質で形成されていてもよいが、不透明な材質で形成することも可能である。

ウェル３の開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下にされている。円相当径とは、ウェル３の開口部と面積が等しい円の直径を示す。ウェル３の開口部の円相当径が５μｍ以上であると、細胞またはビーズ等の粒子を捕捉することが可能となり、２００μｍ以下であると、細胞またはビーズ等の粒子を各ウェル３に一つまたは適切な一定数ずつ、捕捉することが容易になる。ウェル３の開口部の円相当径は、ウェル３で細胞を一つずつ捕捉できるように、より好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは１５μｍ以上６０μｍ以下であってもよい。

なお、ビーズとは、細胞の成分や分泌物を付着させて分析に供するための、樹脂などからなる粒子であり、ウェル３の外で細胞の成分を放出させてビーズに付着させ、前記細胞の成分や分泌物が付着したビーズをウェル３に捕捉して分析に供したり、あるいは、ウェル３内に細胞とビーズを入れ、細胞を壊して細胞の成分や分泌物をウェル３内でビーズに付着させる場合もある。また、磁気を帯びたビーズを使用して、ウェルアレイフィルター１の下方に配置された磁石でビーズを吸い寄せて、ウェル３に捕捉する場合もある。

ウェル底部４のそれぞれには、フィルタ本体２の下面に達する貫通孔８が少なくとも一つずつ形成されている。この実施形態では、貫通孔８の数はウェル３毎に２つであり、図３に示すように、ウェル底部４の中央に互いに間隔Ｗを開けて、ウェル底部４を垂直に貫通して形成されている。本発明では貫通孔８の数は限定されず、１個でも、３個でも、４個以上であってもよいが、１個だけ中央に貫通孔８を形成する場合には、十分な流量を確保しようとして貫通孔８の径Ｄをある程度大きくすると、細胞Ｃが変形しつつ貫通孔８を通り抜ける可能性が生じる。ウェル底部４に貫通孔８を複数形成した場合は、十分な流量を確保した場合にも細胞Ｃが貫通孔８を通り抜けにくい利点があるとともに、ウェル底部４の中心から外れた位置に少なくとも一部の貫通孔８が形成されるため、細胞Ｃによって全ての貫通孔８が閉塞されることが少なく、細胞Ｃが捕捉された後も貫通孔８を通じてウェル３内の液体を適度に流通させることが容易である。

ウェル隔壁６の水平方向の最大厚さＢ（図１参照）は、１μｍ以上２０μｍ以下とされている。最大厚さＢが１μｍ以上であることにより、ウェル隔壁６の強度を適切にすることができ、例えばピペットＰをウェル隔壁６の上面に当てて細胞Ｃを吸う場合などに、ウェル隔壁６が崩れてしまうことを防止できる。また、最大厚さＢが２０μｍ以下であることにより、ウェル隔壁６の上に細胞やビーズ等の捕捉すべき粒子が留まってしまうことが抑制でき、ウェル３の密度も高めることができる。また、ピペットＰを当てたときにウェル隔壁６に適度な可撓性をもたらすことができ、ピペットＰの先端の破損を抑制することができる。ウェル隔壁６の最大厚さＢは、好ましくは２μｍ以上２０μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは２μｍ以上１２μｍ以下であってもよい。

ウェル形成領域の面積に対する、ウェル３の合計開口面積の比率は４０％以上とされている。この比率は４０％以上であると、ウェルアレイフィルター１に供給される細胞等の粒子のうち、ウェル３内に捕捉される粒子の割合、すなわち粒子捕捉率を十分に高めることができる。ウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率は、好ましくは４０％以上９５％以下であってもよく、さらに好ましくは４０％以上７５％以下であってもよい。前記比率が高いということは、ウェル隔壁６が薄いということに繋がる。

ウェル３の深さは、ウェル隔壁６の水平方向の最大厚さＢの２倍以上とされている。ウェル３の深さがウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上であると、ウェル３内に捕捉された細胞Ｃ等の粒子が、液体の流れの乱れ等によりウェル３外に抜け出てしまうことが抑制できるから、いったん捕捉された粒子は安定的にウェル３内に保持することができる。より好ましくはウェル３の深さがウェル隔壁６の厚さＢの２倍以上４０倍以下であってもよく、さらに好ましくは２倍以上１５倍以下であってもよい。

貫通孔８の平面視形状は、この実施形態では円であるが、本発明は円に限定されず、楕円形、三角形、四角形、五角形、六角形などの多角形、角の丸められた多角形、長方形、星形、スリット、鉄アレイ形状、Ｈ型、その他不定形などいかなる形状であってもよい。

貫通孔８の最大内接円直径は本発明では限定はされないが、４μｍ以下であることが好ましい。最大内接円直径とは、一つの貫通孔８の中に最大の内接円を描いた時の内接円の直径を示す。最大内接円直径が４μｍを越えると、捕捉すべき細胞やビーズなどの粒子がすり抜ける可能性が生じる。好ましくは最大内接円直径は０．１μｍ以上４μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは０．５μｍ以上３．５μｍ以下であってもよい。

ウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口面積の比率は、本発明では限定されないが、０．５％以上３．５％以下であることが好ましい。貫通孔８の合計開口面積とは、ウェル形成領域内に形成されている全ての貫通孔８の開口面積（＝流路断面積）の合計値である。貫通孔８の合計開口面積の比率が０．５％以上であると、貫通孔８を通過する流液抵抗が適度に小さくなるため、ピペットＰの操作でウェルアレイフィルター１に通液することが容易である。貫通孔８の合計開口面積の比率が３．５％以下であると、ピペットＰの操作でウェルアレイフィルター１に通液する際に、液体サンプルが流れすぎることがなく、操作性に優れる。前記貫通孔８の合計開口面積の比率は、好ましくは０．５％以上３．５％以下であってもよく、より好ましくは０．７５％以上３．２％以下であってもよい。

ウェル３の平面視形状は、多角形状または角を丸められた多角形状であれば、自動画像解析の際に粒子とウェル３とを識別することが容易であるが、多角形状の中でも、三角形状、四角形状、または図示のように六角形状のいずれかであることが好ましい。三角形状、四角形状、または六角形状であると、同一形状のウェル３を規則的に配列してウェル３の配列密度を高めることが可能である。中でも、正三角形状、正四角形状、または正六角形状であると、幾何学的に単純な配列で、ウェル３の配列密度を高めることが可能であるから好ましい。

ウェル隔壁６とウェル底部４は、互いに同じ材質で形成されていてもよいが、好ましくは、互いに異なる材質で形成され、ウェル底部４はウェル隔壁６よりも強度の高い材質で形成されていてもよい。この場合、ウェルアレイフィルター１全体の強度を高めつつ、ウェル底部４の成形時の収縮を緩和してウェルアレイフィルター１の反りや歪を低減できる。ウェルアレイフィルター１に反りが無いことは、ウェル３に捕捉された粒子を倒立顕微鏡で観察する際に観察範囲全面に焦点を合わせるために重要である。

ウェル隔壁６とウェル底部４の材質は限定されないが、その微細構造を実現するために各種フォトレジストで形成されていてもよく、フォトレジストの種類や組成を変える、および／または露光条件を変えることにより、ウェル底部４はウェル隔壁６よりも強度の高い材質で形成することが好ましい。ウェル隔壁６とウェル底部４をフォトレジストで形成する場合、例えば、ウェル隔壁６を形成する隔壁レジスト６Ａ（図１１参照）を多官能エポキシ量が相対的に少ないフォトレジストで形成し、ウェル底部４を形成する底部レジスト４Ａ（図１１参照）を多官能エポキシ量が相対的に多いフォトレジストで形成し、ウェル底部４の材質の強度をウェル隔壁６の材質の強度よりも高めることが可能である。この場合、ウェル隔壁６の材質の自家蛍光が相対的に弱く、ウェル底部４の材質の自家蛍光が相対的に強くなりはするが、ウェル底部４の厚さは小さいため、倒立顕微鏡による観察に悪影響を与えることはない。

本発明ではウェル底部４とウェル隔壁６の形成方法は限定されないが、ウェルアレイフィルター１の応力を緩和するために、好ましくは、ウェル隔壁６とウェル底部４は互いに別々に形成され、ウェル底部４はそれぞれウェル３の開口部の形状に対応したタイル形状に分割され、隣接するウェル底部４の間には間隙が形成され、これら間隙内にウェル隔壁６を形成する材料が侵入して固化している構造とされてもよい。具体的な製造方法の一例を後述する。このようなタイル状にウェル底部４が分割されて、ウェル隔壁６がウェル底部４の間隙に侵入する構造でウェルアレイフィルター１を形成することにより、ウェル底部４の固化収縮のためにウェルアレイフィルター１に反りや歪が生じることを一層抑制できる。

本発明では必須ではないが、ウェル３の内面の少なくとも一部に、細胞接着を抑制するポリマーが予め塗布されていてもよい。この場合、ウェル３の内面に塗布されたポリマーが細胞Ｃの接着を抑制するから、ウェル３からの細胞Ｃまたは粒子の取り出しが容易になる。この種のポリマーとしては、例えば、ＭＰＣポリマー（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＶＡ（ポリビニルアルコール）、ＰＭＥＡ（ポリ（２－メトキシエチルアクリレート））、およびこれらの混合物が採用できる。ポリマーの塗布位置はウェル３の内面だけでなく、ウェル隔壁６の上面、貫通孔８の内面、フィルタ本体２の下面にも前記ポリマーを塗布してもよい。その場合、ウェル隔壁６の上面に細胞等が付着したり、フィルタ本体２の下面に細胞等が付着したりする問題を抑制できる。

本発明では限定されないが、ウェル底部４の厚さは１ｎｍ以上２μｍ以下であってもよい。この場合、ウェル底部４が十分に薄いために、倒立顕微鏡でウェル３内の細胞Ｃ等の捕捉物をウェル底部４を通して観察しやすい上に、ウェル底部４が薄い分、ウェル底部４の自家蛍光が小さく抑えられ、自家蛍光による観察への悪影響も低減できる。ウェル底部４の厚さはより好ましくは１００ｎｍ以上２μｍ以下であってもよく、さらに好ましくは５００ｎｍ以上１．５μｍ以下であってもよい。

前記構成からなるウェルアレイフィルター１によれば、ウェル３間のウェル隔壁６が十分に薄いため、ウェル隔壁６上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により複数の粒子が一つのウェル３の中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェル３で粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェル３が多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェル３とを識別することが容易であり、さらに高密度にウェル３を配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできる利点を有する。

［ウェルアレイフィルターの第２実施形態］
図４は、ウェルアレイフィルター１の第２実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に合計３つの貫通孔８が形成されている。貫通孔８は正三角形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。一本の線分上に等間隔または不等間隔で３つの貫通孔８を形成してもよい。その場合、線分上にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。第２実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第２実施形態においても、第１実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの第３実施形態］
図５は、ウェルアレイフィルター１の第３実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に合計４つの貫通孔８が形成されている。貫通孔８は正方形の頂点位置にそれぞれ形成されていてもよいが、正方形以外の長方形、台形、不等辺四角形の頂点にそれぞれ形成されていてもよい。四角形に配列した場合は、四角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。また、３つの貫通孔８を三角形の頂点位置に配列し、三角形の内側もしくは３辺のいずれかの上に、４つ目の貫通孔８を配置してもよい。この場合、三角形は正三角形でもよいが、正三角形以外の二等辺三角形、直角三角形、不等辺三角形であってもよい。三角形に配列した場合は、三角形の内側、好ましくは重心位置にウェル底部４の中心が位置することが好ましい。さらに一本の線分上に等間隔または不等間隔で４つの貫通孔８を形成してもよい。その場合、ウェル底部４の中心が線分上に位置することが好ましい。第３実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第３実施形態においても、第１実施形態および第２実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの第４実施形態］
図６は、ウェルアレイフィルター１の第４実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に合計７つの貫通孔８が形成されている。図６の例では、６つの貫通孔８が正六角形の頂点位置にそれぞれ形成され、７つ目の貫通孔８が正六角形の中央に形成されている。図示の配列に限らず、本発明では、Ｍ角形（Ｍ≧３）の頂点位置と、前記Ｍ角形の内側または１以上の辺上にＮ個（Ｎ≧１）の貫通孔８を形成してもよい。第４実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第４実施形態においても、第１～３実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの第５実施形態］
図７は、ウェルアレイフィルター１の第５実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、二つの円をスリットでつないだ平面形状（鉄アレイ形状）の貫通孔８Ａが形成されている。貫通孔８Ａは単純な長穴であってもよい。貫通孔８Ａは曲線状、屈曲線状であってもよい。このような形状を有する貫通孔８Ａの場合、貫通孔８Ａの最大内接円直径が４μｍ以下である場合にも、貫通孔８Ａの開口面積（流路断面積）を大きく確保することができ、細胞やビーズ等の粒子が貫通孔８Ａを通り抜けることを阻止しつつ、貫通孔８Ａの流量を大きくすることができる。この場合、ウェル底部４の中心が貫通孔８Ａ上に位置することが好ましい。第５実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第５実施形態においても、第１～第４実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの第６実施形態］
図８は、ウェルアレイフィルター１の第６実施形態を示し、この例では、ウェル底部４の中央に、中心から放射状に延びる３本以上のスリットと、スリットの末端に形成された円孔からなる平面形状（放射形状）の貫通孔８Ｂが形成されている。貫通孔８Ｂの各スリットは単純な長穴であってもよい。このような形状を有する貫通孔８Ｂの場合にも、貫通孔８Ａの最大内接円直径が４μｍ以下であっても、貫通孔８Ｂの開口面積（流路断面積）を大きく確保することができ、細胞やビーズ等の粒子が貫通孔８Ｂを通り抜けることを阻止しつつ、貫通孔８Ｂの流量を大きくすることができる。この場合、ウェル底部４の中心が貫通孔８Ｂの中心に位置することが好ましい。第６実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第６実施形態においても、第１～第５実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの第７実施形態］
図９は、ウェルアレイフィルターの第７実施形態２０を示し、この例では、ウェル隔壁６が正方眼形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正方形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正方眼形状に限定されず、斜方眼形状であっても、直方眼形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。ウェル３を一列ごとに互い違いに配列してもよい。貫通孔８は、第１～第６実施形態のいずれかと同様でよい。第７実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第７実施形態においても、第１～第６実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの第８実施形態］
図１０は、ウェルアレイフィルターの第８実施形態３０を示し、この例では、ウェル隔壁６が正三角形を交互に逆向きに並べた、いわゆるトラス形状に形成され、ウェル底部４はそれぞれ正三角形に形成されていることを特徴とする。ウェル隔壁６は正三角形状に限定されず、二等辺三角形状であっても、直角三角形形状であっても、不等辺三角形状であってもよいが、個々のウェル３の形状は互いに同一であることが好ましい。貫通孔８は、第１～第６実施形態のいずれかと同様でよい。第８実施形態の他の構成は、第１実施形態と同様でよく、前述の説明を援用する。この第８実施形態においても、第１～第７実施形態と同様の効果が得られる。

［ウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態］
図１１（ａ）～（ｆ）は、ウェルアレイフィルター１，２０，３０の製造方法の一例を示す断面図である。まず、図１１（ａ）に示すように、Ｓｉウェーハ等からなる基板１０上に、レジスト溶媒および現像液に溶解しない犠牲膜１２を形成する。犠牲膜１２は例えばスチレン系エラストマー、デキストリン、またはデキストラン等から形成することができる。

次に、図１１（ｂ）に示すように、犠牲膜１２上に、ネガ型の底部レジスト４Ａを、ウェル底部４として必要な一定の厚さに形成する。底部レジスト４Ａを所定のパターンで光リソグラフィーにより露光し、さらに現像を行って、図１１（ｃ）に示すように、貫通孔８を有するウェル底部４が、多角形のタイル状をなして、互いに間隙１４を空けて配列された状態とする。間隙１４の幅はウェル隔壁６の厚さよりも若干小さい程度とされる。また、ウェル底部４同士の間隙１４は、部分的に細いブリッジで架橋された状態としてもよい。その場合、ブリッジによりウェル底部４同士の配列が乱れないように位置決めできる。

次に、図１１（ｄ）に示すように、ウェル底部４を覆う隔壁レジスト６Ａをウェル隔壁６として必要な厚さに形成する。この時、例えば、隔壁レジスト６Ａを多官能エポキシ量が相対的に少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａを多官能エポキシ量が相対的に多いフォトレジストで形成し、ウェル底部４の材質の強度をウェル隔壁６の材質の強度よりも相対的に高めることが好ましい。この場合、副次効果として、ウェル隔壁６の材質の自家蛍光が相対的に弱く、ウェル底部４の材質の自家蛍光が相対的に強くなりはするが、ウェル底部４の厚さは小さいため、倒立顕微鏡による観察に悪影響を与えることはない。隔壁レジスト６Ａに所定のパターンで光リソグラフィーにより露光し、さらに現像を行って、図１１（ｅ）に示すように、ウェル隔壁６を形成する。これにより、間隙１４の内部には隔壁レジスト６Ａが侵入し、露光により間隙１４内で不溶化され、ウェル底部４同士を連結する。

次に、ウェル底部４およびウェル隔壁６の全体を例えば１８０℃に加熱し、レジストをさらに熱硬化させたのち、レジストを変質させない溶媒で犠牲膜１２を溶解し、基板１０をウェル底部４から剥離して、前記第１～第８実施形態に示すようなウェルアレイフィルター１，２０，３０が完成する。

前記製造方法によれば、形状精度の高いウェル３を有するウェルアレイフィルター１，２０，３０が効率よく製造できる。また、この製造方法によれば、ウェル底部４がタイル形状に分割されて相互に間隙１４が形成された状態としたのち、ウェル隔壁６を形成して間隙１４内にウェル隔壁６を形成する材料を侵入固化させるため、ウェル底部４の固化収縮のためにウェルアレイフィルター１，２０，３０に生じる反りや歪を低減できる。

［粒子整列デバイスの実施形態］
図１２および図１３は、本発明に係る粒子整列デバイスの一実施形態４０を示す平面図および縦断面図である。この粒子整列デバイス４０は、長方形状の底板部４２と、底板部４２の中央部に形成された壁部４４とを有する。壁部４４は、底板部４２から起立する四角い枠状の周壁部と、この周壁部の内側に起立して互いに平行に形成された２枚の隔壁を有し、周壁部の内側が隔壁により、第１室４６、第２室４８、および第３室５０に区画されている。第１室４６の底部には円筒状の開口部５２が形成され、第３室５０の底部にも円筒状の開口部５４が形成されている。

第２室４８の底は開いており、図１３に示すように、ウェルアレイフィルター１，２０，３０が底板部４２から僅かな流路５６を空けて壁部４４の下端に固定されている。第１室４６の底部と底板部４２の間、第３室５０の底部と底板部４２の間もそれぞれ一定の間隙が空けられ、流路５６を形成している。これにより、第２室４８内に細胞Ｃやビーズ等の粒子を含む液体サンプルを入れ、開口部５２または開口部５４から液体を流出させることにより、ウェルアレイフィルター１のウェル３内に細胞Ｃやビーズ等の粒子を捕捉することが可能である。すなわち、第２室４８、ウェルアレイフィルター１、流路５６へと到るサンプル流路が形成される。また、開口部５２または開口部５４から試薬を入れて第２室４８内の細胞Ｃやビーズ等の粒子と反応させることもできる。

［粒子捕獲方法の実施形態］
本発明に係る粒子捕獲方法の一実施形態は、粒子整列デバイス４０のウェルアレイフィルター１，２０，３０を通じるサンプル流路、すなわち、ウェル３の開口部側から貫通孔８を通じてウェル３の底面側へ通じるサンプル流路に、ウェルアレイフィルター１およびデバイス本体４０を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、前記サンプル流路に水溶液を通液させて前記有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、前記サンプル流路に、ウェル３で捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ、ウェル３内に粒子を捕獲する工程とを有する。

具体的には、粒子整列デバイス４０の第２室４８にエチルアルコール等の水溶性かつ低界面張力の有機溶媒、あるいは、３０～８０％程度のエチルアルコール等の有機溶媒を含む水溶液等の液体を供給し、ウェルアレイフィルター１，２０，３０に有機溶媒を含む液体を通液させる。前記液体としては、例えば７０％エチルアルコール水溶液なども好適に使用できる。これにより、貫通孔８にも有機溶媒が満たされる。次に、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ)などの緩衝液等の水溶液を第２室４８に加え、開口部５２および／または開口部５４から有機溶媒を含む液体を吸引する。これを数回繰り返して、第２室４８、貫通孔８、および流路５６の内部の有機溶媒を含む液体をリン酸緩衝液の水溶液で置換する。

次に、リン酸緩衝液等に細胞Ｃおよび／またはビーズ等の粒子を分散させたサンプル液体を第２室４８に供給し、開口部５２および／または開口部５４からリン酸緩衝液を吸引することにより、細胞Ｃおよび／またはビーズは各ウェル３に一つずつもしくはほぼ一定の個数ずつ捕捉される。

次に、ターゲットとする細胞Ｃまたは細胞分泌物が付着したビーズと結合する試薬を第２室４８または開口部５２，５４から加え、ターゲットをマーキングした後、倒立顕微鏡でターゲットを特定し、ピペットＰやキャピラリー等でウェル３からターゲットとなる細胞Ｃまたはビーズを補集する。

以上の粒子捕獲方法によれば、ウェルアレイフィルター１を通じるサンプル流路に有機溶媒を含む液体を通液させ、さらに水溶液で置換した後に、細胞、細胞の成分や分泌物を付着させたビーズ、または、細胞の成分や分泌物を付着させるためのビーズ等の粒子を含む水溶液を通液させることにより、通液抵抗が減少するとともに、ウェル３に気泡が残留しにくくなり、各ウェル３内に一つずつもしくは所定数ずつ細胞Ｃまたはビーズ等の粒子を捕獲することが容易となる。したがって、多数の粒子のスクリーニングが安定して行える利点を有する。

以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明はこれら実施形態のみに限定されず、特許請求の範囲に記載された範囲内で、構成要件の追加、削除、および変更が可能である。

次に、実施例を挙げて本発明の効果を実証する。
［実験１］
図１４は、図１および図２に示すように、ウェル３の開口部を正六角形としたウェルアレイフィルター１を、ウェル３の開口幅とウェル隔壁６の水平方向厚さを様々に変えて作成した場合の、ウェル３の開口率を示したグラフである。図１４中、「Ｈｅｘ１０」はウェル３が正六角形で平行な２辺間の開口幅が１０μｍ、「Ｈｅｘ２０」は同様に開口幅が２０μｍ、「Ｈｅｘ５０」は同様に開口幅が５０μｍ、「Ｈｅｘ１００」は同様に開口幅が１００μｍであることを示す。横軸の隔壁幅（μｍ）は、ウェル隔壁６の隔壁の水平方向の厚さ（μｍ）を示す。ウェル３が正六角形で平行な２辺間の開口幅がＡ（μｍ）の場合、ウェル３の円相当径は１．０５００７５×Ａとなる。縦軸の開口率は、ウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率を示す。図１４に示すように、点線内で囲まれる場合に、隔壁幅１～２０μｍ、開口率０．４（＝４０％）以上となることがわかる。

［実験２］
図１５は、図１および図２に示すように、ウェル３の開口部を正六角形としたウェルアレイフィルター１を、ウェル３の開口幅と、ウェル隔壁６の厚さと、貫通孔８の寸法、形状および個数を様々に変えて作成した場合の、貫通孔８の合計開口率（％）を示したグラフである。図１５中、「Ｈｅｘ１０」～「Ｈｅｘ１００」は図１４と同じであり、「Ｈｅｘ１２５」はウェル３の平行な２辺間の開口幅が１２５μｍであることを示す。横軸の「ウェル開口径＋壁厚」は、ウェル３の平行な２辺間の開口幅（μｍ）＋ウェル隔壁６の水平方向の厚さ（μｍ）を示す。縦軸の貫通孔開口率（％）は、ウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口面積の比率（％）を示す。「２．５μｍΦ×４」は直径２．５μｍの円径の貫通孔８を各ウェル３毎に４個形成したことを示す。「２．８μｍ×４．６μｍ×４」は、２．８μｍ×４．６μｍの長方形の貫通孔８を各ウェル３毎に４個形成したことを示す。図１５に示すように、点線内で囲まれる場合に、ウェル３の開口幅が５μｍ以上、ウェル隔壁６の厚さが１μｍ以上、貫通孔開口率が０．５～３．５％となることがわかる。

［実験３］
図１１およびウェルアレイフィルターの製造方法の一実施形態で説明した方法により、実施例１～８および比較例のウェルアレイフィルターを実際に製造した。ウェル３の開口部は正六角形とした。隔壁レジスト６Ａは多官能エポキシ量が相対的にネガ型の少ないフォトレジストで形成し、底部レジスト４Ａは多官能エポキシ量が相対的に多いネガ型のフォトレジストで形成した。

表１は、製造された実施例１～８および比較例のウェルアレイフィルターの各パラメータを示し、「Ｈｅｘ１０－２０」はウェル３が正六角形で、平行な２辺間の開口幅の目標値が１０μｍ、ウェル３の深さの目標値が２０μｍであることを示している。他も同様である。「ウェル形状」における「開口径（μｍ）」は正六角形の平行な２辺間の開口径、「隔壁幅（μｍ）」はウェル隔壁６の水平方向の厚さ、「深さ（μｍ）」はウェル３の深さ、「開口率」はウェル形成領域の面積に対するウェル３の合計開口面積の比率（％）、「密度（ｃｍ^－２）」はウェル形成領域の１ｃｍ^２当たりに形成されているウェル３の個数を示している。「貫通孔形状」における「貫通孔数」はウェル３一つ当たりの貫通孔８の個数、「開口形状」は個々の貫通孔８の開口形状、「開口部寸法」の「２．８」は円の直径、「３．１５／５．１９」は３．１５μｍ×５．１９μｍの角が丸く面取りされた長方形であることを示し、「開口率」はウェル形成領域の面積に対する貫通孔８の合計開口率（％）を示している。

表１に示すように、実施例１～８は貫通孔８の合計開口率が０．５０％以上となったが、比較例は０．５０％に満たず、０．３８％となった。

［実験４］
実施例２，６，７，８および比較例のウェルアレイフィルターを用いて、エチルアルコールの通液時間の測定を行った。各ウェルアレイフィルターを図１２および図１３に示すような粒子整列デバイス４０に装着した。ウェルアレイフィルターのウェル形成領域は１７ｍｍ×１７ｍｍの正方形とした。第２室４８にエチルアルコールを０．５ｍｌ注入し、ウェルアレイフィルターを通過して流路５６にエチルアルコールの全量が流れ込むまでの通液時間（秒）を測定した。結果を表２に示す。

実施例２，６，７，８では５１秒以内に通液が完了したが、比較例では通液に９９秒を要した。実用上、エチルアルコールの通液時間が６０秒以下であると使用しやすいため、貫通孔開口率は０．５％以上が望ましいことがわかった。図１６は、表２の結果をプロットしたグラフである。

［実験５］
実施例２のウェルアレイフィルター（ウェル形成領域：１７ｍｍ×１７ｍｍ）を粒子整列デバイス４０に装着し、エチルアルコールの通液後、リン酸緩衝液 (ＰＢＳ)を３回通液した。次に、各種の細胞を所定の播種細胞数だけ分散させたリン酸緩衝液１ｍｌを第２室４８に入れて、ウェルアレイフィルターに通液した。次に、カルセイン水溶液でウェル３内の細胞を染色し、倒立型蛍光顕微鏡で底板部４２を通してウェル３内の細胞を観察し、顕微鏡の視野内で、ウェル３に細胞Ｃが一つだけ捕捉されているウェル３の個数を全ウェル３の個数で除したシングルセル率（％）を計測した。

細胞としては、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）、ＰＣ３（前立腺癌細胞）、ＨＬ６０（白血病細胞）、ＭＣＦ７（乳がん細胞）、およびＡ５４９（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）を使用した。ウェルアレイフィルターへの播種細胞数は１００００、１０００００、２０００００とした。その結果を表３に示す。

表３の「ポアソン分布」の数値は、播種細胞数とウェル数の比率から統計的に計算されたシングルセル率（％）を示す。表３に示すように、５種類のいずれの細胞でも、統計的な確率計算で求められたポアソン分布のシングルセル率よりも、高いシングルセル率が得られた。これは、ウェル３に一つ目の細胞が捕捉された後は、２つ目の細胞が入りにくくなることを示し、ウェル３の形状や貫通孔８の設定が適切であることを示している。

特に、細胞の大きさが１０ｍｍ程度であり、貫通孔８の開口径に対して大きい粒径を有するがん細胞株（ＰＣ３、ＨＬ６０、ＭＣＦ７、Ａ５４９）では、細胞数／ウェル数比によらず、高いシングルセル率が得られた。

図１７は、Ａ５４９細胞を２００，０００個播種した場合に、ウェルアレイフィルターのウェル３に格納された細胞のカルセイン染色後の蛍光顕微鏡写真（倍率：１０倍）である。図１７に示すように、Ａ５４９細胞はすべてウェル３に規則的に格納され、ウェル隔壁６上に残ったＡ５４９細胞は見られなかった。

［実験６］
実施例２および実施例６のウェルアレイフィルターを粒子整列デバイス４０に搭載し、リン酸緩衝液に分散させたＡ５４９細胞を播種し、ウェル３にシングルセルとしてＡ５４９細胞を格納した。次に、自動細胞ピックアップ装置：ALS Automated Lab Solutions社製商品名「CellCelector」を用い、内径２０μｍのガラスキャピラリーの下端を、細胞が格納された所定のウェル３の直上に垂直に当接して配置し、ウェル３内から１００ｎＬの液体を吸引した。吸引によって、所定のウェル３の周囲のウェル３に格納された細胞を吸い上げることはなく、所定のウェル３に格納された細胞のみをガラスキャピラリーで回収することができた。ガラスキャピラリーの先端が破損することもなかった。

本発明によれば、ウェル間のウェル隔壁が十分に薄いため、ウェル隔壁上に細胞やビーズ等の粒子が残留しにくいうえ、開口径の適切な設定により過剰の粒子が一つのウェルの中に進入する率も減らすことができ、開口径に比して十分に深さのあるウェルで粒子を安定的に捕捉できる。また、ウェルが多角形状であるから自動画像解析の際に粒子とウェルとを識別することが容易であり、さらに高密度にウェルを配置できるため多数の粒子を一度にスクリーニングできるという優れた効果を奏する。したがって、産業上の利用が可能である。

１ ウェルアレイフィルター
２ フィルタ本体
３ ウェル
４ ウェル底部
４Ａ 底部レジスト
６ ウェル隔壁
６Ａ 隔壁レジスト
８ 貫通孔
１０ 基板
１２ 犠牲膜
１４ 間隙
２０ ウェルアレイフィルター
３０ ウェルアレイフィルター
４０ 粒子整列デバイス
４１ デバイス本体
４２ 底板部
４４ 壁部
４６ 第１室
４８ 第２室
５０ 第３室
５２ 開口部
５４ 開口部
５６ 流路
Ａ 開口径
Ｂ 隔壁厚さ
Ｃ 細胞
Ｐ ピペット
Ｗ 離間幅
Ｄ 直径

Claims (10)

1. 平板状のフィルタ本体を有し、
   前記フィルタ本体には前記フィルタ本体の上面のウェル形成領域に開口する複数のウェルが形成され、
   互いに隣接する前記ウェル同士の間はウェル隔壁によりそれぞれ仕切られ、
   前記ウェルの下端にはウェル底部がそれぞれ形成され、
   前記ウェルの開口部は多角形状もしくは角が丸められた多角形状をなし、
   前記ウェルの開口部の円相当径は５μｍ以上２００μｍ以下であり、
   前記ウェル底部には前記フィルタ本体の下面に達する貫通孔が少なくとも一つ形成され、
   前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さは１μｍ以上２０μｍ以下であり、
   前記ウェル形成領域の面積に対する前記ウェルの合計開口面積の比率は４０％以上であり、
   前記ウェルの深さは、前記ウェル隔壁の水平方向の最大厚さの２倍以上であることを特徴とするウェルアレイフィルター。
2. 前記貫通孔の最大内接円直径は４μｍ以下であることを特徴とする請求項１に記載のウェルアレイフィルター。
3. 前記ウェル形成領域の面積に対する前記貫通孔の合計開口面積の比率は０．５％以上３．５％以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
4. 前記多角形状は、三角形状、四角形状、または六角形状のいずれかであることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
5. 前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部は前記ウェル隔壁よりも強度の高い材質で形成されていることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
6. 前記ウェル隔壁と前記ウェル底部は互いに異なる材質で形成され、前記ウェル底部はそれぞれ前記ウェルの開口部の形状に対応したタイル形状に分割されて隣接する前記ウェル底部の間には間隙が形成され、これら間隙内に前記ウェル隔壁を形成する材料が侵入して固化していることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
7. 少なくとも前記ウェルの内面に細胞接着を抑制するポリマーが塗布されていることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
8. 前記ウェル底部の厚さは、１ｎｍ以上２μｍ以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のウェルアレイフィルター。
9. 請求項１または２に記載のウェルアレイフィルターと、前記ウェルアレイフィルターを支持するとともに前記ウェルアレイフィルターの前記ウェルの開口部側から前記貫通孔を通じて前記ウェルの底面側へ向けて通じるサンプル流路を有するデバイス本体を備えたことを特徴とする粒子整列デバイス。
10. 請求項９の粒子整列デバイスの前記サンプル流路に前記ウェルアレイフィルターおよび前記デバイス本体を溶解または変質させない有機溶媒を含む液体を通液させる工程と、
    前記サンプル流路に水溶液を通液させて有機溶媒を含む液体を前記水溶液で置換する工程と、
    前記サンプル流路に、前記ウェルで捕捉すべき粒子を含む水溶液を通液させ前記ウェル内に前記粒子を捕獲する工程を有する粒子捕獲方法。

Images