JP2020153960A - 微量液滴に含まれる微粒子の光学・電子顕微鏡による定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
なお、上記課題はいずれも、光学顕微鏡による高倍率での観察時にも同様に当てはまる課題である。
また、本発明は、第二に、試料支持体上に滴下された試料液中の微粒子の分布の均一性を向上させることを課題としている。
また、本発明は、第三に、試料支持体上に滴下される試料液の液滴量のバラつきを低減することを課題としている。
具体的には、試料支持体上に、微粒子を含有する微量の試料液を滴下した後、上記先行発明の電子顕微鏡観察用保護剤を塗布してスピンコートした場合、試料支持体表面に完全には付着していない微粒子が、回転遠心力によって試料液の着液点よりも外側に拡散してしまう可能性があるという懸念があった。また、試料支持体上に滴下された試料液の量に対して、塗布する電子顕微鏡観察用保護剤の量が多過ぎると、成膜される薄膜の膜厚が大きくなり、光学顕微鏡観察や電子顕微鏡観察において微粒子の同定や定量が困難になる可能性があるという懸念があった。
(1)体積が1fLから100pLの範囲の液滴に含まれる微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法において、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように前記液滴を形成する、方法。
(2)前記微粒子を含有する試料液を、観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を表面に備える試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、(1)に記載の方法。
(3)前記観察用保護剤を含有する溶液が、ポリビニルアルコールを含有する、(1)または(2)に記載の方法。
(4)前記微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、(1)から(3)のいずれか一項に記載の方法。
(5)前記試料液に含まれる観察用保護剤の濃度が、0.01%から1.0%の範囲である、(4)に記載の方法。
(6)前記微粒子を含有する試料液、または前記微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を、温度および湿度が制御された環境下で試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、(1)から(5)のいずれか一項に記載の方法。
(7)電子顕微鏡による定量方法である、(1)から(6)のいずれか一項に記載の方法。
(8)光学顕微鏡による定量方法であって、前記光学顕微鏡が蛍光顕微鏡である、(1)から(6)のいずれか一項に記載の方法。
(9)定量対象の微粒子を含有する試料液が滴下される光学顕微鏡用または電子顕微鏡用試料支持体であって、表面に観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を備える、試料支持体。
(10)前記観察用保護剤を含有する溶液が、ポリビニルアルコールを含有する、(9)に記載の試料支持体。
また、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、試料支持体上に滴下された液滴中の微粒子の分布の均一性を向上させることができる。より具体的には、試料支持体上に滴下された液滴を乾燥させた際にコーヒーリングが生じたり(コーヒーリング現象)、結晶化が起こったりすることを抑制することができる。
また、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、試料支持体上に滴下される液滴量のバラつきを低減することができる。
また、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、試料支持体上に滴下された微量液滴に含まれる微粒子が着液点の外側に拡散する可能性を抑制し、かつ、当該微量液滴に含まれる微粒子の表面を、当該微粒子の光学顕微鏡観察または電子顕微鏡観察に適した膜厚で、観察用保護剤で形成された薄膜で覆うことができる。
観察用保護剤の原液の組成および調製方法の具体例:水 500mLに、スクロース 5g、フルクトース 5g、塩化ナトリウム 5gを溶解させたものに、クエン酸 1.25g、グルタミン酸ナトリウム 0.05gを加え、pHを7.4に調整し、この水溶液とグリセリンを、水溶液:グリセリン=1:2の比率で混合する。
観察用保護剤の原液を水で希釈する場合、例えば、上記原液を1/100から1/1000の範囲の濃度に希釈する、すなわち、上記原液を0.1%から0.01%の範囲で含有するように希釈することができる。この範囲内であると、光学顕微鏡または電子顕微鏡観察において、ウイルスやエクソソーム等の微粒子の外形がより明瞭になるため、顕微鏡画像における微粒子の同定がより迅速かつ容易に行うことができ、より正確な定量が可能となる。
本実施形態において、液滴の形成に用いる原理、装置の種類は、体積が1fLから100pLの範囲の液滴が形成できれば、どのような形成手法でもよい。以下では、静電力を利用して液滴を形成する場合を例にして説明する。
静電力を利用する液滴形成装置として、例えば、浜松ナノテクノロジー社製の静電分注パターニング装置(ODS−P01)を用いることができる。
この静電式分注装置では、ノズル内の液体に挿入された電極と、試料支持体(基板)にパルス電源が接続されており、パルス電源からパルス電圧を印加すると、静電力によりノズル先端の液面が円錐形に変形し、ノズル先端から基板に向けてジェット流が射出され、このジェット流が基板上に蓄積して液滴が形成される。なお、基板は可動式の試料台に載置されており、試料台を前後左右に移動させることによって、基板上の複数箇所に液滴を形成することができる。この静電式分注装置によれば、ノズル径に依存することなく、fLからpLオーダーの微量液滴を分注することができる。
本実施形態では、定量対象の微粒子を含有する試料液を、観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を表面に備える試料支持体上に滴下することによって、微量液滴を形成する。
観察用保護剤の溶液からなる薄膜層は、例えば、試料支持体の表面に観察用保護剤の溶液を滴下し、スピンコーティングした後、乾燥させることによって作製することができる。なお、観察用保護剤の溶液の溶媒に水を含む場合、予め試料支持体の表面を親水化処理しておくことが好ましく、そのための手法として、例えば、プラズマ等のエネルギー線を試料支持体の表面に照射してもよい。試料支持体の表面に滴下する観察用保護剤の溶液の量は特に限定されず、試料支持体の材質、表面の特性、表面積等に応じて、試料支持体の表面の、試料液が滴下される範囲に均一に薄膜層が形成されるように適宜調整される。
なお、使用した観察用保護剤の溶液は、上記の組成を有する観察用保護剤の原液を、水で1.0%の濃度に希釈した溶液であり、後述する図2〜図4についても同様である。
図3(a)は、観察用保護剤の溶液を用いて表面に薄膜層を形成したガラス基板上に、試料液として0.09%食塩水を滴下して得られた微量液滴の走査電子顕微鏡画像である。図3(a)に示すように、滴下された液滴の着液点(輪郭)が明瞭に確認されるが、塩の析出は見られない。一方、図3(b)に示すように、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を有しないガラス基板を用いた場合には、液滴の着液点(輪郭)は明瞭であるが、着液点の内側のほぼ全体に渡って塩の析出が生じており、微粒子の同定・定量はおよそ不可能な状態であることが分かる。
本実施形態では、定量対象の微粒子を含有する試料液に観察用保護剤を含有させ、当該試料液を試料支持体上に滴下することによって、微量液滴を形成する。
また、試料液に観察用保護剤が含まれていることによって、液滴形成装置のノズルから吐出された液滴が試料支持体上に着液するまでの間に試料液の体積が減少することが抑制され、試料支持体上に滴下される液滴量のバラつきが軽減される。より具体的には、液滴形成装置のノズルから吐出される液滴の溶媒がノズルの先端部で蒸発することが抑制され、試料支持体上に着液する液滴の体積にバラつきが生じることが軽減される。
また、本発明者等は、金微粒子を含有する試料液に観察用保護剤を含有させ、透過型電子顕微鏡観察用のTEMグリッド上に当該試料液を滴下したところ、各グリッドの中央付近に安定して液滴が着液し、グリッドの金属格子部分への金微粒子の偏りが抑制されることを確認している。
本実施形態では、定量対象の微粒子を含有する試料液、または定量対象の微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を、温度および湿度が制御された環境下で試料支持体上に滴下することによって、微量液滴を形成する。
本発明に係る微粒子の定量方法は、微量液滴に含まれる微粒子を光学顕微鏡観察または電子顕微鏡によって直接観察すること以外の手法への応用が可能である。その一例として、イムノクロマト法での利用について説明する。
また、従来のイムノクロマト法キットのように、テストラインの発色の程度や、コントロールラインとテストラインの発色の差を目視により評価する方式と比較して、光学顕微鏡、電子顕微鏡を用いることによって、より客観的な判定が可能となる。さらに、光学顕微鏡観察、電子顕微鏡観察による判定を、機械学習(マシンラーニング)や深層学習(ディープラーニング)を用いた画像認識システムによって行うことや、人工知能(AI)を用いた自動解析システムとすることも可能である。
このような状況を踏まえると、本発明に係る微粒子の定量方法を利用した検査・診断法を、光学顕微鏡、卓上型の電子顕微鏡と組み合わせて実用化することで、従来の手法による簡便さ・迅速性を確保しつつ、より正確な判定や診断が可能になると考えられる。
そして、このことによって、将来的には、光学顕微鏡、電子顕微鏡を用いる検査・診断法が、都道府県や市区町村といった地方自治体レベルで普及すること、さらには、地域コミュニティや一般家庭での利用にまで広がる可能性がある。
Claims (10)
- 体積が1fLから100pLの範囲の液滴に含まれる微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法において、
定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように前記液滴を形成する、方法。 - 前記微粒子を含有する試料液を、観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を表面に備える試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、請求項1に記載の方法。
- 前記観察用保護剤を含有する溶液が、ポリビニルアルコールを含有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料液に含まれる観察用保護剤の濃度が、0.01%から1.0%の範囲である、請求項4に記載の方法。
- 前記微粒子を含有する試料液、または前記微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を、温度および湿度が制御された環境下で試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 電子顕微鏡による定量方法である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 光学顕微鏡による定量方法であって、前記光学顕微鏡が蛍光顕微鏡である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 定量対象の微粒子を含有する試料液が滴下される光学顕微鏡用または電子顕微鏡用試料支持体であって、表面に観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を備える、試料支持体。
- 前記観察用保護剤を含有する溶液が、ポリビニルアルコールを含有する、請求項9に記載の試料支持体。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021220755A1 (ja) * | 2020-04-30 | 2021-11-04 | 国立大学法人浜松医科大学 | イムノクロマトグラフィーによる測定方法、イムノクロマトグラフィー測定用補助液、イムノクロマトグラフィーチップ、及びイムノクロマトグラフィー測定キット |
CN114486411A (zh) * | 2020-11-12 | 2022-05-13 | 邑流微测股份有限公司 | 显微镜观测载台及其使用方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015141083A (ja) * | 2014-01-28 | 2015-08-03 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 顕微鏡用試料担持片の作製方法およびその装置 |
WO2015115502A1 (ja) * | 2014-01-29 | 2015-08-06 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 含水状態の生物試料の電子顕微鏡観察用保護剤、電子顕微鏡観察用キット、電子顕微鏡による観察、診断、評価、定量の方法並びに試料台 |
WO2018020877A1 (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 微細粒子の分散固定方法 |
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2015141083A (ja) * | 2014-01-28 | 2015-08-03 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 顕微鏡用試料担持片の作製方法およびその装置 |
WO2015115502A1 (ja) * | 2014-01-29 | 2015-08-06 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 含水状態の生物試料の電子顕微鏡観察用保護剤、電子顕微鏡観察用キット、電子顕微鏡による観察、診断、評価、定量の方法並びに試料台 |
WO2018020877A1 (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 微細粒子の分散固定方法 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021220755A1 (ja) * | 2020-04-30 | 2021-11-04 | 国立大学法人浜松医科大学 | イムノクロマトグラフィーによる測定方法、イムノクロマトグラフィー測定用補助液、イムノクロマトグラフィーチップ、及びイムノクロマトグラフィー測定キット |
CN114486411A (zh) * | 2020-11-12 | 2022-05-13 | 邑流微测股份有限公司 | 显微镜观测载台及其使用方法 |
JP2022077974A (ja) * | 2020-11-12 | 2022-05-24 | 邑流微測股▲ふん▼有限公司 | 顕微鏡用観察キャリアおよびその使用方法 |
JP7155377B2 (ja) | 2020-11-12 | 2022-10-18 | 邑流微測股▲ふん▼有限公司 | 顕微鏡用観察キャリアおよびその使用方法 |
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