KR101878214B1

KR101878214B1 - 최소세제곱 알고리즘을 기반으로 하는 암시야 조명을 이용한 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 방법 및 시스템

Info

Publication number: KR101878214B1
Application number: KR1020160111466A
Authority: KR
Inventors: 강성호; 장펭; 이승아
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2016-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2018-08-17
Also published as: KR20180024719A

Abstract

본 개시 내용에 따르면, 암시야 하에서 다양한 타입의 나노 입자(즉, 구형의 나노 입자와 같은 대칭 물질뿐만 아니라 로드(rod) 형상의 나노 입자와 같은 비대칭 입자 또는 물질)로부터 검출된 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 적용한 가우시안 맞춤을 적용하여 3차원의 증강된 분해능을 제공함으로써 나노 입자에 대한 3차원 초고분해 영상 이미지를 획득하는 방법 및 관련 시스템이 제공된다.

Description

최소세제곱 알고리즘을 기반으로 하는 암시야 조명을 이용한 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 방법 및 시스템{Method and System for Obtaining Images of Augmented 3D Super-resolution of Fluorescence-free Nanoparticles Using Enhanced Dark-field Illumination Based on Least-cubic Algorithm}

본 개시 내용은 최소세제곱 알고리즘을 기반으로 하는, 암시야 조명을 이용한 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 방법 및 시스템에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시 내용은 암시야 하에서 다양한 타입의 나노 입자(즉, 구형의 나노 입자와 같은 대칭 물질뿐만 아니라 로드(rod) 형상의 나노 입자와 같은 비대칭 입자 또는 물질)로부터 검출된 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 적용한 가우시안 맞춤을 적용하여 3차원의 증강된 분해능을 제공함으로써 나노 입자에 대한 3차원 초고분해 영상 이미지를 획득하는 방법 및 관련 시스템에 관한 것이다.

기공지된 바와 같이, 광학 현미경은 대물렌즈 및 접안렌즈를 이용하여 샘플 또는 시료의 확대 이미지를 관찰하는 장치로서, 이를 이용한 광학 현미경 영상화 기술은 생물학적 의학 분야 및 분자 생물학 연구에 있어서 가장 널리 사용되고 있는 분석 법에 해당된다. 그러나, 통상적인 광학 현미경의 공간 분해능은 광 회절 한계로 인하여 약 200 nm로 제한된다. 이러한 한계를 극복하기 위하여 점상 강도분포함수(point spread function; PSF) 및 단일-분자 국소화 기반의 방식이 최근 개발되었는데, 이러한 개량 방법으로서 STED(stimulated emission depletion), GSD(ground-state depletion), SSIM(saturated structured illumination microscopy), STORM(stochastic optical reconstruction microscopy), 및 PALM(photoactivated localization microscopy)가 알려져 있다(Klar, T. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 8206-8210 (2000); Hell, S. W. et al., Appl. Phys. B 60, 495-497 (1995); Gustafsson, M. G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 13081-13086 (2005); Rust, M. J. et al., Nat. Methods 3, 793-795 (2006)). 이러한 테크닉은 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 부회절-한계 횡 분해(subdiffraction-limited lateral resolution)(x-y)를 얻도록 개발되었다.

보다 최근에는 3차원(3D) 초고해상도 형광 현미경(super-resolution microscopy; SRM)의 개발과 함께, 회절-한계 분해를 횡(lateral) 차원에서 약 10 nm까지, 그리고 축(axial) 차원에서는 약 20 nm까지 좁힐 수 있었다. 이러한 신규 기술은 모든 3차원에서의 고-분해 영상화를 이용하여 세포 소기관(cellular organelles)의 모호한 구조를 분해하고 분석하는데 효과적인 수단을 제공한다(Small, A. R. et al., Annu. Rev. Phys. Chem. 65, 107-125 (2014)). 3D SRM 기술의 주된 개발은 축 방향에서의 단일 방출체(emitter)의 상대적인 중심 위치를 분해하기 위하여 PSF의 변형 및 인코딩에 기반한다. 따라서, 3D SRM 기술은 원통형 렌즈, 상 마스크, 다중-대물 렌즈(multi-objective lenses), 공간 광 모듈레이터, 빔-스플리터, 적응 광학 디바이스(adaptive optics devices) 및 다초점 광 요소와 같은 추가적인 광 요소를 이용하여 종래의 현미경을 변형하는 것이 밀접하게 의존한다. 추가적인 광 요소는 기기의 복잡성 및 비용을 증가시킬 뿐만 아니라, 3D SRM 영상화 시스템의 안정성 및 유용성을 감소시킨다.

이와 같이, 추가적인 광 요소를 이용하여 축 방향 PSF의 변형 및 인코팅을 도입하는 대신에, 공초점 현미경과 같이 스캐닝을 이용하는 광학 절편법(optical sectioning methods)은 시간에 걸쳐 축 방향으로 대상을 절편하여 대상의 3D 이미지를 생성한다(Conchello, J. A. et al., Nat. Methods 2, 920-931 (2005)). 예를 들면, 3D 공초점 이미지는 3D 가우시안 함수(Gaussian function)로 직접 피딩되어 완전한 3D SRM 이미지를 생성할 수 있다.

그러나, 현재까지는 이러한 광 절편 3D SRM 방법은 형광 분자 및 양자점을 이용한 공초점계 형광 현미경에서만 성공적으로 적용되었다. 상기 초고해상도 형광 현미경에서는 광의 회절 한계를 극복하기 위하여 형광 염료(또는 표지)를 결합시킨 샘플이 이용되며, 그 결과 분해능이 100 nm 내지 20 nm까지 향상될 수 있다. 초고해상도 형광 현미경은 형광 염료가 결합된 시료의 검출만 가능하기 때문에 형광 염료의 의존도가 높다.

그러나, 형광 표지(fluorescent labeling agents)는 광-표백(photo-bleaching), 광-깜빡임(photo-blinking) 및 세포 독성(cytotoxicity)으로 인하여 살아있는 세포에 대한 장기 관찰 시 추가적인 문제점을 유발한다(Ruthardt, N. et al., Mol. Ther. 19, 1199-1211 (2011)). 더욱이, 복잡한 복수의 기술을 사용하지 않는 한, 다수의 타겟 세포는 생체 내 형광체로 표지하기 곤란하다(예를 들면, 미토콘드리아-표적 약물 전달 캐리어)((Marrache, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 16288-16293 (2012)).

이러한 문제점을 극복하기 위하여, DIC(differential interference contrast) 현미경에 기반하여 비형광 3D 초국소화 기술이 개발되었다(Gu, Y. et al., Anal. Chem. 84, 4111-4117 (2012)). 그러나, DIC 현미경은 본질적으로 초고해상도를 얻을 수 있는 문제점이 있다. 따라서, 광학 현미경의 의존성을 유지하면서도 시간 경과에 걸쳐 고정확도 및 고정밀도의 3D SRM 이미지를 획득하기 위한 비형광 방법이 특히 요구되고 있다.

비형광계 기술에 상당하는 암시야 현미경(dark-field microscopy, EDF)는 특별히 설계된 증강 암시야(EDF) 디바이스를 이용하여, 높은 3차원에서의 바탕색-대-신호비 비(S/N)로 생체 내에서 금속 나노 입자의 영상화 가능성을 보여준 바 있다(Vallotton, P. et al., J. Microsc. 257, 166-169 (2015)). 그러나, 광 제어 및 데이터 피팅 프로세스 없이는, EDF를 이용한 3차원에서의 초분해능은 여전히 극복해야 할 대상이다.

본 개시 내용에서는 전술한 종래의 초고해상도 형광 현미경 기술의 기술적 한계를 해결하고, 이와 동시에 3차원의 증강된 분해능을 제공하여 생체 외(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서의 비대칭 나노 입자를 비롯한 다양한 나노 입자의 위치(구체적으로 중심 위치 또는 좌표)를 높은 정밀성 및 정확도로 측정(분해)할 수 있는 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 방법 및 관련 시스템을 제공하고자 한다.

본 개시 내용의 제1 면에 따르면,

비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지를 획득하는 방법으로서,

a) 적어도 1 종의 플라즈몬 나노 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;

b) 상기 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하면서 광 가이드 유닛을 통과한 상기 샘플로부터 유래하는 공명 산란 광의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터를 광 검출 유닛에 의하여 검출하는 단계;

c) 상기 광 검출 유닛에 의하여 검출된 샘플의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤(fitting)을 적용함으로써 상기 이미지 데이터에 대한 3차원 초고분해 과정을 수행하는 단계;

d) 상기 3차원 초고분해된 나노 입자의 이미지 데이터를 3차원 영상 공간 내 CRLB(Cramer-Rao lower bound)에 기반하는 국소화 정밀도(localization precisions)에 의하여 재구성하는 단계; 및

e) 이미지 표시 장치에 의하여 상기 재구성된 이미지 데이터로부터 3차원 초고해상도 현미경 이미지를 얻는 단계;

를 포함하는 방법이 제공된다.

일 구체예에 따르면, 상기 단계 c)에 앞서 검출된 샘플의 산란 광의 파장을 선택하기 위하여 상기 산란 광을 대역 통과 필터에 의하여 파장 변조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 단계 c)는 하기 수학식 1로 표시되는 3차원 가우시안 함수를 이용하여 수행될 수 있다:

[수학식 1]

.

상기 식에서, I ₀ 는 바탕잡음(background noise)으로부터 기인하는 상수항(constant term)이고, A는 진폭(amplitude)이고, x₀, y₀ 및 z₀은 중심의 좌표이고, 그리고 σ_x, σ_y, 및 σ_z는 각각 x 방향, y 방향 및 z 방향에서 분포의 표준 편차이다.

일 구체예에 있어서, 상기 상수(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z)는 하기 수학식 2에 의하여 표시되는 목적 함수(objective function) F(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z)를 최소화하는 최소세제곱 알고리즘에 의하여 결정될 수 있다:

[수학식 2]

상기 식에서, p는 3이고,

는 실험으로부터 구한 위치(x, y, z)에서의 강도 값이며, 그리고 강도 값은 직사각형의 평행육면체(rectangular parallelepiped) 체적

으로 관찰되는 것으로 가정함.

예시적 구체예에 있어서, 상기 3차원 가우시안 함수는 Born-Wolf 모델에 근거하여, x, y 및 z 방향으로 특정 폭(specific width)을 갖는 타원형 프로파일 수 있고(σ_x=σ_y≠σ_z), 이의 종횡비(aspect ratio)는 하기 수학식 3으로 표시될 수 있다:

[수학식 3]

.

예시적 구체예에 있어서, 상기 프로파일의 FWHM(full width at half maximum)은 하기 수학식 4에 의하여 계산될 수 있다:

[수학식 4]

.

예시적 구체예에 있어서, 상기 단계 c)는 상기 가우시안 맞춤(fitting)이 적용된 샘플의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)는 상기 수학식 1에 따라 나노 입자의 중심 위치를 결정하기 위하여 바탕잡음을 제거하도록 수행될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 플라즈몬 나노 입자는 금 나노 입자(GNP), 금 나노-로드(GNR), 및 은 나노 입자(SNP)로 이루어진 군으로부터 적어도 1종을 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 샘플은 상기 플라즈몬 나노 입자를 자연적으로 함유하고 있거나, 또는 전처리 과정을 통하여 상기 플라즈몬 나노 입자를 인위적으로 부착한 것일 수 있다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 증강된 암시야 조명을 제공하는 단계는 암시야 조명을 생성하는 광원, 및 상기 광원에 광 섬유를 통하여 연결되며 생성된 암시야 조명을 증강시켜 상기 샘플에 제공하는 광 컨덴서를 포함하는 암시야 제공 조명 유닛에 의하여 수행될 수 있다.

본 개시 내용의 제2 면에 따르면,

암시야 조명을 이용한 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템으로서,

적어도 1종의 플라즈몬 나노 입자를 포함하는 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하여 상기 플라즈몬 나노 입자의 공명 산란 광의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터를 검출하는 이미지 검출 유닛;

상기 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤을 적용함으로써 상기 이미지 데이터에 대한 3차원 초고분해 과정을 수행하고, 또한 상기 3차원 초고분해된 나노 입자의 이미지 데이터를 3차원 영상 공간 내 CRLB(Cramer-Rao lower bound)에 기반하는 국소화 정밀도(localization precisions)에 의하여 재구성하는 이미지 처리 유닛; 및

상기 이미지 처리 유닛에 의하여 재구성된 이미지를 표시하는 이미지 표시 유닛;

을 포함하는 시스템이 제공된다.

예시적 구체예에 있어서, 상기 이미지 검출 유닛은,

상기 샘플이 배치되는 재물대;

상기 재물대에 배치된 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하는 암시야 제공 조명 유닛;

상기 샘플로부터 방출되는 공명 산란 광을 가이드하는 광 가이드 유닛; 및

상기 광 가이드 유닛에 의하여 가이드된 공명 산란 광을 검출하는 광 검출 유닛;

을 포함할 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 재물대는 플라즈몬 나노 입자의 방향각 측정을 위하여 360° 회전하도록 구성될 수 있다.

예시적 구체예에 따르면, 상기 샘플의 3차원 영상 획득을 위하여 재물대를 상하로 승강시키도록 구성된 z-스테이지 컨트롤러를 더 포함할 수 있다.

본 개시 내용에 따른 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지를 획득하는 방법은, 증강된 암시야 조명을 이용하여 샘플 내 플라즈몬 나노 입자의 공명 산란 광을 검출하고, 이의 3차원 점상 강도분포함수(PSF) 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤(fitting)을 적용함으로써 특히 축 방향(z-방향)으로 미세 두께(예를 들면, 약 10 nm 수준의 두께) 슬라이싱 성능을 갖는 비형광 나노 입자의 증강된 3차원 부회절한계 분해능을 제공할 수 있다. 특히, 종래의 초고해상도 현미경법에서 채택된 최소제곱 알고리즘이 아닌 최소세제곱 알고리즘을 3차 점상 강도분포 함수의 데이터의 프로세싱에 적용함으로써 개별 나노 입자의 3차원 좌표에 관한 증강된 분해능을 얻을 수 있다.

상술한 장점을 통하여, 나노-로드(nano-rod)와 같은 비대칭 나노 입자의 위치(특히, 중심 위치)를 특정(식별)하는데 유용할 뿐만 아니라, 높은 정밀성 및 정확도를 제공할 수 있기 때문에 3차원 공간에서 부회절 한계 분해능을 갖는 다양한 나노 입자의 위치를 공간 분해하는데 효과적으로 적용 가능하다.

더 나아가, 본 개시 내용에 따른 3차원 초고분해 영상 이미지 획득 방법은 종래의 형광 표지 기반의 기술과 달리 비형광 나노 입자를 사용하기 때문에 형광 표지의 사용으로 인하여 발생되는 다양한 문제점 및 부수적 단점(샘플 또는 시료 전처리에 따른 시간 소모, 표적 샘플 또는 시료의 오염 등)을 극복할 수 있는 장점을 갖는다.

따라서, 향후 광범위한 적용이 기대된다.

도 1a는 기재(구체적으로 글라스 기재) 상에 플라즈몬 나노 입자로서 금 나노 입자(GNP), 은 나노 입자(SNP) 및 금 나노-로드(GNR)를 고정하는 예를 도시하는 도면이고;
도 1b는 다른 예시적 구체예에 따라 기재로서 금 나노 패턴(또는 나노 스팟) 상에 플라즈몬 나노 입자로서 금 나노 입자(GNP), 은 나노 입자(SNP) 및 금 나노-로드(GNR)를 고정하는 예를 도시하는 도면이고;
도 2a는 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템의 예시적인 구체예를 개략적으로 도시하는 도면이고;
도 2b는 도 2a에 도시된 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템 중 검출 유닛의 실제 적용 예를 보여주는 도면이고;
도 3a 및 도 3b는 각각 예시적 구체예에 따른 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템에 있어서, z-방향으로 슬라이싱하는 과정을 개략적으로 도시하는 도면, 그리고 증강된 암시야 조명에 기반한 3차원 검출 시스템으로부터 도출한 3차원 PSF의 프로파일을 도시하는 그래프이고;
도 4는 다양한 개구수(NA) 값에 따른, (a) Born-Wolf 모델에 기반한 시뮬레이션 및 (b) 실험적인 3차원 현미경 이미지를 나타내는 도면이고;
도 5는 103 nm 사이즈의 금 나노 입자(GNP), 80 nm 사이즈의 은 나노 입자(SNP) 및 40 nm 사이즈의 금 나노-로드(GNR)의 ESEM 및 TEM 이미지를 나타내는 도면이고;
도 6은 GNP, GNR 및 SNP의 수분산물의 소광 스펙트럼을 UV-Vis 분광기를 이용하여 측정한 결과를 단일-입자 상태에서의 EDF 이미지와 함께 나타낸 도면이고;
도 7은 실시예에서 최적화된 개구수(NA) 및 검출 파장에 따라 Born-Wolf 모델을 기반으로 하여 (a) GNP, (b) SNP 및 (c) GNR에 대하여 시뮬레이션된(모사된) 광학 성능을 나타내는 도면이고;
도 8은 실시예에서 특정 플라즈몬 파장에서 PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상의 GNP, SNP, 및 GNR에 대하여 실험적으로 얻어진 3차원 SRM 이미지를 나타내는 도면이고;
도 9는 실시예에서 다양한 가우시안 노이즈(GN)를 갖는 GNP의 3차원 EDF 이미지를 모사한 결과를 나타내는 도면이고;
도 10은 최소제곱법(p=2) 및 최소세제곱법(p=3) 맞춤 알고리즘에 의하여 다양한 량의 가우시안 노이즈에 대한 횡 방향(xy) 및 축 방향(z)에서의 중앙 국소화 에러 분포를 나타내는 도면이고;
도 11은 원본 이미지 및 이의 보다 낮은 강도의 컷-오프(cut-off) 이미지의 예로서 (a) 원본 이미지, 그리고 (b-j) 다양한 강도의 역치 값(w=5-45%)으로 컷-오프한 후의 이미지를 나타내는 도면이고;
도 12는 GNP, SNP, 및 GNR의 중심 위치를 구하기 위하여 테스트를 수행한 결과를 나타내는 도면이고;
도 13은 GNP의 시뮬레이션된(모사된) EDF 이미지의 3차원 및 xz 도면이고;
도 14는 EDF 시스템 하에서 재구성된 (a) GNP, (b) SNP 및 (c) GNR의 3차원 이미지를 나타내는 도면이고;
도 15는 PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상에서 인접하는 GNP, SNP 및 GNR의 원본 이미지(a-d) 및 재구성된 SRM 이미지(e-h)를 나타내는 도면이고;
도 16은 (a) 금(Au) 나노 스팟 상의 GNP, SNP 및 GNR의 3차원 SRM 이미지, 그리고 (b) xz 투사 도면이고;
도 17은 (a) 컬러 카메라를 이용한 xy-도면 및 (b) CCD 카메라를 이용한 xy-도면에서 살아있는 단일 HEK293 세포 내 GNP, SNP 및 GNR의 EDF 이미지, (c) 동일 세포의 xz-도면, (d) 동일 세포의 yz-도면, 및 (e) 3차원 도면, 그리고 (f) 횡 방향(xy-도면)에서 선택된 나노 입자의 재구성된 SRM 이미지 및 (g) 선택된 나노 입자의 원본 이미지 3차원 도면(좌측 사진)과 재구성된 3차원 SRM 이미지(우측 사진)의 대비 결과를 보여주는 도면이고;
도 18은 (a) 나노 입자로 라벨링되기 전, 및 (b) 나노 입자로 라벨링된 후에 파장-변조된, 살아있는 단일 HEK 293 세포의 EDF 이미지를 나타낸다. 상기 도면에서, (i)은 컬러 디지털 이미지, (ii) 내지 (v)는 EMCCD 이미지 및 다양한 대역 통과 필터를 이용하여 (i) 내에서 흰색 점선의 직사각형 영역의 확대도이고;
도 19는 최소제곱법(푸른색) 및 최소세제곱법(붉은색)에 의하여 산출되는, 글라스 슬라이드 및 금(Au) 나노 스팟 상에서, 그리고 살아있는 HEK 239 세포 내에서 GNP, SNP 및 GNR의 중심 위치를 xy-도면 및 yz-도면이고; 그리고
도 20은 EDF 하에서 GNP의 산란 강도-시간 프로파일을 나타내는 도면이다.

본 발명은 하기의 설명에 의하여 모두 달성될 수 있다. 하기의 설명은 본 발명의 바람직한 구체예를 기술하는 것으로 이해되어야 하며, 본 발명이 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 하기와 같이 정의될 수 있다.

"비형광 검출(fluorescence-free detection)"은 일반적으로 형광 이외의 수단을 이용한 검출 방법을 의미할 수 있는 바, 대표적으로 흡수, 산란 등을 이용한 검출방법을 포함할 수 있다.

"나노 패턴"은 나노미터 단위의 반복된 패턴을 의미할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 나노 패턴은, 예를 들면 약 0.1 내지 1000 nm, 보다 구체적으로는 약 1 내지 500 nm의 직경을 가질 수 있다. 또한, 나노 패턴의 간격(pitch)은, 예를 들면 약 1 nm 내지 100 μm, 보다 구체적으로 약 10 nm 내지 약 10 μm 범위일 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 나노 패턴은 금속으로 나노 패턴화된 것으로, 예를 들면 나노 사이즈의 스팟이 가로 및/또는 세로로 배열된 형태일 수 있다. 이를 위하여, 잉크젯 나노프린팅, 전자빔 식각(e-beam lithography), 원자힘 현미경-딥펜 나노식각(atomic force microscope-dip pen nanolithography, AFM-DPN) 등의 나노식각(nanolithography) 기술 중 하나를 선택하여 제조할 수 있다.

"나노 입자"는 협의로는 예를 들면 약 1 내지 200 nm, 구체적으로 약 10 내지 100 nm 범위의 사이즈 또는 평균 직경을 갖는 입자를 의미할 수 있으나, 경우에 따라서는 마이크로 사이즈의 입자 등을 포함하는 것으로 이해될 수 있다. 특히, 본 개시 내용의 취지 하에서 플라즈몬 공명 산란을 일으킬 수 있는 임의의 사이즈를 갖는 입자 역시 포함하는 개념으로 이해될 수 있다. 예시적 구체예에 있어서, 나노 입자는 금속 재질일 수 있는데, 특히 나노 영역에서는 입자 사이즈에 따라 색상이 변화할 수 있다.

"생체 분자"는 생체 내 또는 생체 외에서 발견 가능한 물질로서, 생체에 특정 반응을 일으키거나 특정 상태나 반응에 의하여 생성되는 임의의 물질을 의미할 수 있다. 이러한 생체 분자의 예로서 DNA, RNA, 항원, 항체, 리간드, 킬레이트, 수용체, 폴리머, 유기화합물, 금속이온 및 폴리펩티드를 들 수 있다.

"샘플"은 특별히 한정되는 것은 아니나, 본 개시 내용의 일 구체예에서 제시된 검출 플랫폼에 적용 가능한 액상 샘플일 수 있다. 특히, 표적 생체분자를 함유할 수 있는 임의의 물질 또는 성분일 수 있으며, 더 나아가 생체가 노출되거나, 또는 생체에 의하여 처리되는 각종 물질, 생체로부터 분리된 물질일 수 있다.

"광원(light source)"은 광학적 분석을 위한 광을 공급하는 소스로서, 광의로는 원하는 분석 특성에 따라 X-선, 자외선(UV) 또는 가시광선과 같이 특정 파장 영역의 광을 일정한 강도로 제공할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 광원으로서 단일파장 또는 다중파장 광원을 사용할 수 있다. 다만, 광원의 구체적인 예로서 프리즘으로 입사되는 광의 각도를 용이하게 조절하기 위하여 특정 파장(단일 파장)의 레이저를 광원으로 사용하는 것이 유리할 수 있다.

"파장 변조(wavelength modulation)"는 개별 포인트 광원이 상이한 광 방출 파장을 갖도록 하는 것을 의미할 수 있다.

"영상 이미지의 획득 시스템"은 샘플로부터 유래하는 현미경의 이미지(영상) 신호를 감지하고, 이를 프로세싱하여 데이터화 및/또는 이미지화(영상화)할 수 있는 장치를 의미할 수 있다. 특히, 현미경으로부터 제공되는 이미지(영상)를 처리할 수 있도록 현미경에 연결되어 구비되고, 또한 영상처리를 위한 프로그램을 구비한 컴퓨터 또는 마이크로프로세서를 구비한 이미지 처리 유닛 및 이미지 표시 유닛을 포함할 수 있다.

"플라즈몬 나노 입자"는 광이 입사될 경우에 그 내부의 자유 전자가 입사광의 특정 전자기장과 공명하면서 이로부터 강한 산란광이 방출되는 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)을 유도하는 나노 입자를 의미할 수 있다. 예시적으로, 플라즈몬 나노 입자는, 예를 들면 금 나노 입자(GNP), 금 나노-로드(GNR), 및/또는 은 나노 입자(SNP)를 들 수 있으나, 본 개시 내용이 이에 한정되는 것은 아니며, 표면 플라즈마 공명을 일으키는 다른 타입의 플라즈몬 나노 입자 또는 물질을 사용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 개시 내용의 구체예에 따라 암시야 조명을 이용한 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 방법은 종래의 초고해상도 형광 현미경에서 사용되는 형광 염료 대신 플라즈몬 나노 입자를 이용하는 비형광 방식을 채택한다. 즉, 플라즈몬 나노 입자에 표면 플라즈몬 공명을 발생시켜, 이로부터 방출되는 산란 광을 검출하는 방식이다.

이때, 나노 입자에 대한 3차원 초고분해 영상 이미지를 획득하기 위하여 검출된 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 적용한 가우시안 맞춤을 적용하여 3차원 초고분해 과정을 수행하고, 이를 국소화 정밀도에 의하여 재구성하는 방식으로 프로세싱함으로써 3차원 초고해상도 현미경의 이미지(영상)를 얻을 수 있다.

본 개시 내용에 따른 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 방법 및 관련 시스템의 경우, 3차원 초고해상도 현미경법에 있어서 최소제곱법을 이용하는 종래 기술과 비교하면, 생체 외(in vitro) 및/또는 생체 내(in vivo)에서, 다양한 나노 입자, 특히 나노-로드와 같은 비대칭 나노 입자의 위치(구체적으로 중심 위치 또는 좌표)를 높은 정밀성 및 정확도로 용이하게 측정(분해)할 수 있다. 특히, 본 개시 내용의 구체예에 따르면, 3차원의 파장-의존성 증강 암시야(EDF) 조명 검출에 기반하여 직접적으로 점상 강도분포함수(PSF)를 이용하고, 더 나아가 정확도 및 실현가능성을 높이기 위하여 임의의 추가적인 광학 요소 없이도 신규의 최소세제곱 알고리즘을 이용한다.

예시적 구체예에 있어서, 검출 대상인 샘플은, 예를 들면 생체에서 분리된 물질 또는 성분을 포함할 수 있으며, 구체적으로 혈액, 소변, 콧물, 세포, 추출된 DNA 및 RNA와 같은 유전 물질, 효소, 단백질, 이의 조합 등의 생체 내 임의의 생체 분자를 포함할 수 있다.

플라즈몬 나노 입자를 자연적으로 또는 본래부터 함유하고 있는 샘플의 경우에는 플라즈몬 나노 입자의 부착(또는 고정)을 위한 전처리 과정을 요하지 않는다. 그러나, 이와 달리 샘플에 플라즈몬 나노 입자가 부착(또는 고정)되지 않은 경우에는 인위적인 전처리를 통하여 샘플에 부착(또는 고정)하는 과정이 선택적으로 수행될 수 있다.

이와 관련하여, 도 1a 및 도 1b는 각각 기재 및 금(Au) 나노 패턴(또는 나노 스팟) 상에 플라즈몬 나노 입자로서 금(Au) 나노 입자(GNP), 은(Ag) 나노 입자(SNP) 및 금(Au) 나노-로드(GNR)를 고정하는 예를 도시한다.

도 1a를 참조하면, 기재로서 실리콘, 글라스(glass), 용융 실리카(fused silica), 석영(quartz), 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane; PDMS) 또는 폴리메틸메타크릴레이트(poly(methyl methacrylate); PMMA)와 같은 광 투과성 고체 구조물을 사용할 수 있다.

이때, 상기 언급된 기재(예를 들면, 글라스 슬라이드)를 사용할 경우, 기재 표면 상에 -OH기가 존재하는데, 수소이온 농도가 낮아지면 수소 이온을 해리하여 산소 이온 형태가 되므로 음의 극성을 나타내는 반면, 수소이온농도가 높아지면 샘플 내의 수소 이온과 기재 표면의 산소 이온이 반응하여 극성이 없어지게 된다. 나노 입자를 정전기력에 의하여 기재 표면에 서로 부착 또는 고정을 위하여 기재의 표면이 양(+)의 전하를 갖도록 표면 처리를 하고, 음(-)으로 하전된 플라즈몬 나노 입자를 표면 처리된 글라스 상에 고정시킬 수 있다. 상기 표면 처리는, PLL(poly-L-lysine), 3-aminopropyltriethoxysilane(APTS), cetyltrimethylammonium bromide(CTAB), cetyltrimethylammonium chloride(CTAC) 등으로부터 적어도 하나를 선택하여 적용할 수 있다. 또한, 나노 입자는 mercaptopropionic acid(MPA), mercaptoundecanoic acid(MUA), mercaptohexanoic acid(MHA) 등의 카르복실기를 이용하여 음(-)으로 하전될 수 있다.

택일적 구체예에 따르면, 도 1b에 도시된 바와 같이, 금속 나노 패턴 또는 나노 스팟(도면에서는 황색 영역)이 형성된 기재 상에 플라즈몬 나노 입자가 고정된다(생접합(bioconjugation) 방식에 의함). 이때, 금속 나노 패턴 또는 나노 스팟의 재질은, 예를 들면 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 이의 조합 등일 수 있다. 또한, 플라즈몬 나노 입자와 금속 나노 패턴(또는 나노 스팟)은 서로 상이한 재질일 수 있다. 상기 구체예에 있어서, 나노 입자를 나노 패턴(또는 나노 스팟) 상에 고정하기 위하여 나노 입자의 표면을 개질할 수 있다.

이러한 개질 방법의 대표적인 예는 알칸티올(HS(CH₂)_nX) 단일층을 형성하는 것으로(여기서, n은 1 내지 15), 알칸티올의 말단 위치에 존재하는 관능기 X에 의하여 분자 수준에서 금속 표면 구조를 변경하여 계면 특성을 조절할 수 있다. 보다 구체적으로, 카르복시기-말단 알칸티올 단일층을 형성하는 방식으로 개질할 수 있다. 이를 위하여, 카르복시기-함유 화합물로서 화학식 [HS-(CH₂)_n-COOH](n은 1 내지 15)으로 표시되는 머캅토카르본산(mercapto carbonic acid) 등을 사용할 수 있고(즉, X가 -COOH임), 또한 알칸티올-함유 화합물로서, 예를 들면 머캅토알코올, 구체적으로 머캅토헥산올(보다 구체적으로, 6-mercapto-1-hexanol)을 사용할 수 있다(즉, X가 -OH임). 이와 같이 개질된 나노 입자는, 예를 들면 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide), 그리고 N-hydroxysuccinimide(NHS) 또는 N-hydroxysulfosuccinimide(NHSS)를 이용하여 추가적으로 활성화할 수 있다(즉, carbodiimide 반응). 이후, NHS(NHSS)-개질된 나노 입자는 나노 패턴 또는 나노 스팟 상에 접합(conjugation)된다.

택일적 구체예에 따르면, 플라즈몬 나노 입자는 생체 분자(예를 들면, 항체)와 접합(생접합)된 형태로 존재할 수 있는 바, 앞서 설명한 바와 같이 알칸티올(HS(CH₂)_nX) 단일층을 형성하고, 예를 들면 EDC와 NHS(또는 NHSS)를 이용하여 생체 분자와 접합시킬 수 있다.

또 다른 구체예에 따르면, 살아있는 세포와 함께 나노 입자를 배양하는 방식으로서, 전술한 바와 같이 생체 분자와 접합된 플라즈몬 나노 입자를 함유하는 매질에 살아있는 세포를 접촉시킨 후에 일정 시간(예를 들면 약 15 내지 30 시간, 구체적으로 약 18 내지 25 시간) 동안 배양함으로써 세포가 나노 입자에 부착(고정)되도록 한다.

전술한 전처리 과정은 예시적인 것으로 이해될 수 있으며, 다양한 형태로 존재하는 플라즈몬 나노 입자를 적용할 수 있을 것이다.

한편, 도 2a는 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템의 예시적인 구체예를 개략적으로 도시하는 도면이고, 도 2b는 도 2a에 도시된 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템 중 검출 유닛의 실제 적용 예를 보여준다.

도 2a 및 2b를 참고하면, 일 구체예에 따라 암시야 조명을 이용한 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템(1)은, 크게 이미지 검출 유닛(100), 이미지 처리 유닛(200), 및 이미지 표시 유닛(300)을 구비한다.

이미지 검출 유닛(100)은 샘플의 이미지를 확대하여 검출하도록 구성되는 바, 이때 샘플 내에 적어도 1종의 플라즈몬 나노 입자가 함유된다. 또한, 샘플 내 플라즈몬 나노 입자의 산란 광을 검출하기 위하여 이미지 검출 유닛(100)은 샘플에 증강된 암시야(enhanced dark-field) 조명을 제공한다.

상기 도시된 구체예에 따르면, 이미지 검출 유닛(100)은, 샘플이 배치(장착)되는 재물대(110), 상기 재물대(110)에 배치된 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하는 암시야 제공 조명 유닛(120), 암시야 조명에 의하여 샘플로부터 방출되는 광을 가이드하는 광 가이드 유닛(130), 및 광 가이드 유닛(130)에 의하여 가이드된 광을 검출하는 광 검출 유닛(140)을 포함할 수 있다. 이때, 재물대(110)는 조명 유닛(120)과 광 가이드 유닛(130) 사이에 배치되고, 그 위에 샘플이 배치된다. 상기 재물대(110)는 플라즈몬 나노 입자의 방향각 측정을 위하여 360° 회전하는 회전 분석기(rotation analyzer) 형태로 구비될 수 있다.

금 나노-로드(GNR)와 같은 비대칭 나노 입자의 경우, 액상 내에서 자유회전 상태를 나타내며, 그 회전 상태가 광학적 특성에 중대한 영향을 주게 된다. 이와 관련하여, 금 나노-로드의 회전에 따른 방향각의 변화로 인하여 이의 산란 광은 편광을 나타내므로, 검출 이미지는 방향각의 변화에 따라 달라질 수 있다.

암시야 제공 조명 유닛(120)은 암시야 조명을 생성하는 광원(121), 및 암시야 조명을 증강시켜 시료에 제공하는 광 컨덴서(122)를 포함할 수 있다. 이때, 광원(121) 및 광 컨덴서(122)는 광섬유(123)에 의하여 상호 연결되어 있기 때문에, 조명 유닛(120)은 샘플에 대하여 증강된 암시야 조명을 제공하게 된다.

상기 조명 유닛(120) 상에 배치되는 광 가이드 유닛(130)은 앞서 설명한 암시야 조명에 의하여 샘플로부터 배출되는 광을 수집하고 확대하는 대물 렌즈(131), 그리고 상기 대물 렌즈(131)를 통과한 광을 수집하는 프리즘(132)을 구비할 수 있다. 선택적으로, 광 굴절 현상을 최소화하기 위하여 글라스 슬라이드와 유사한 굴절률을 갖는 오일 층을 도포한 오일 타입의 대물 렌즈가 적용될 수 있다. 한편, 프리즘(132)은 샘플로부터 유래하여 대물 렌즈(131)를 통과한 광을 수집하는 방식을 통하여 광 강도(intensity)를 증가시킨다.

증강된 암시야 조건 하에서 샘플로부터 유래하는 광은 회절 현상으로 인하여 입자의 크기, 모양 등의 고유 특성이 상실되며, 또한 각각의 나노 입자들이 공명 산란에 따라 특이적 색을 나타내기는 하나, 상호 간의 혼선 산란(cross-talk scattering)에 의하여 복수 입자들의 다양한 색이 혼합되어 있는 이미지가 얻어지게 된다.

이러한 점을 고려하여, 본 개시 내용에 따른 광 가이드 유닛(130)은 샘플로부터 유래하는 광에 대하여 특정 대역의 파장의 광을 선택적으로 통과시키는 1 이상의 대역 통과 필터를 포함하는 필터 박스(133)를 구비할 수 있다. 구체적으로, 필터 박스(133)는 대물 렌즈(131)와 프리즘(132) 사이에 배치되며, 도 2b에 도시된 바와 같이 박스 형태의 외부 케이스 내에 여러 장의 대역 통과 필터를 장착하는 방식으로 구성 가능하다.

앞서 기술한 바와 같이, 플라즈몬 나노 입자로서 금 나노 입자(GNP), 금 나노-로드(GNR) 및/또는 은 나노 입자(SNP)를 사용할 수 있는 바, 상기 예시된 나노 입자 각각의 플라즈몬 공명 산란 광의 파장은 서로 상이한 파장에서 피크를 갖는다. 따라서, 샘플에 플라즈몬 나노 입자로서 금 나노 입자(GNP), 금 나노-로드(GNR) 및/또는 은 나노 입자(SNP)가 포함된 경우, 광 가이드 유닛(130) 중 필터 박스(133)는 상기 나노 입자들 각각에 대응하는 개수의 대역 통과 필터를 포함할 수 있다. 이처럼, 증강된 암시야 조건 하에서 샘플로부터 유래하는 광은 대역 통과 필터에 의하여 파장 변조(wavelength modulation)를 거치게 되며, 나노 입자의 특이적인(specific) 플라즈몬 파장과 매칭될 수 있다.

한편, 광 검출 유닛(140)은 광다이오드 어레이(photodiode array: PDA), 전하 주입 장치(charge injection device: CID), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD), 및 디지털 일안 반사식 카메라(digital single lens reflex camera) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 도시된 구체예에 있어서, 광 검출 유닛(140)은 샘플의 이미지를 고감도 흑백 이미지로 검출하는 CCD(charge-couple device: 141), 및 샘플의 이미지를 컬러 이미지로 검출하는 CDC(칼라 디지털 카메라: 142)로 구성할 수 있다. 샘플로부터 유래하는 광이 CCD(141) 및 CDC(142) 각각에 적절히 가이드될 수 있도록, 전술한 광 가이드 유닛(130)은 빔 스플리터(beam spliter: 134)를 더 포함할 수 있다.

도 2b에 도시된 바와 같이, 이미지 검출 장치(100)는 재물대(110)를 상하로 승강시키는 z-스테이지 컨트롤러(z-모터; 150)를 더 포함할 수 있다. 이러한 z-스테이지 컨트롤러(150)를 통하여 재물대(110)에 배치된 샘플을 상하 방향(z-축 방향)으로 이동시킬 수 있으며, 이러한 샘플의 상하 이동을 통하여 샘플에 대한 3차원 이미지를 얻을 수 있다.

이와 관련하여, 도 3a는 z-스테이지 컨트롤러(150)를 이용하여 증강된 암시야 조명 하에서 샘플로부터 유래하는 광을 z-방향으로 슬라이싱(slicing)하는 것을 개략적으로 도시한다. 예시적으로, 상기 슬라이싱 두께는, 예를 들면 약 5 내지 30 nm, 구체적으로 약 6 내지 20 nm, 보다 구체적으로 약 8 내지 12 nm 범위일 수 있다.

도 3b는 일 구체예에 따른 암시야 조명 하에서 얻어지는, 3차원 초고분해 현미경(SRM) 시스템을 이용한 3차원(3D) 점상 강도분포함수(PSF)의 프로파일을 나타낸다.

3차원의 PSF의 광학적 프로파일을 시뮬레이션(모사)하는데 사용 가능한 수학적 모델로서 Born-Wolf 모델, Gibson-Lanni 모델, Richards-Wolf 모델 등을 고려할 수 있으나, 이중 Born-Wolf 모델에 따른 광학적 프로파일(대물 렌즈의 개구수 값의 변화시키면서 측정 시)이 상대적으로 적합하다.

대면적 현미경(wide-field microscopy)의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)에 Born-Wolf 모델을 적용하는 바, 상기 모델은 현미경 내에서 발생하는 크기(scalar)-기반의 회절을 기술하며, 하기 수학식 5로 표시될 수 있다.

[수학식 5]

상기 식에서,

;

는 0차의 Bessel 함수이고; r, a 및 f는 각각 좌표, 출구 동공(exit pupil)의 반경, 및 사물의 초점 거리이다. 또한, λ는 광의 파장이고, n은 대상 매질의 굴절율이며, NA는 대물 렌즈의 개구수이고, 그리고 A는 진폭 인자(amplitude factor)이다.

3차원의 회절 패턴의 강도 분포는 하기 수학식 6으로 표시될 수 있다.

[수학식 6]

상기 식에서 암시야 현미경의 경우에는 N이 0이다.

따라서, 암시야 조명 하에서의 3차원 해절 패턴의 강도 분포는 하기 수학식 7로 표시된다.

[수학식 7]

기하학적 초점(geometrical focus)에서,

이고, 강도는 하기 수학식 8로 표시될 수 있다.

[수학식 8]

초점 면(focal plane) 내 지점의 경우,

이고, 강도 분포는 하기 수학식 9로 표시된다.

[수학식 9]

특정 굴절율(n) 및 고정된 검출 파장(λ)을 갖는 샘플의 경우, 도 4에 도시된 바와 같이 PSF 형상 및 사이즈는 대물 렌즈의 개구수(NA)에 의존도가 높다. 구체적으로, 개구 수가 클수록 보다 높은 공간 분해를 갖는 3차원 이미지를 얻을 수 있다.

그러나, 암시야 현미경의 기본 개념 상, 대물 렌즈의 개구수 값은 조명 광이 검출 시스템으로 들어오는 것을 방지하기 위하여 암시야 광 컨덴서의 개구수 값보다 작아야 한다. 따라서, 증강된 암시야 검출에 대한 개구수의 최적화가 요구될 수 있는 바, 상기 도면에 따르면, 암시야 검출을 위하여는 약 0.9의 개구수가 적합하고, 과도한 개구수는 이미지의 품질을 급격히 저하시킬 수 있다.

Born-Wolf 모델에 있어서, 3차원으로 광학적 성능을 모사하는데 요구되는 또 다른 인자는 이미징에 사용되는 파장(λ)이다. 이때, 나노 입자의 이미징 파장은 나노 물질의 국소화된 표면 플라즈몬 공명 파장에 상당한다. 그러나, 증강된 암시야 조건 하에서 광 검출 유닛에 의하여 샘플을 검출하여 얻은 광은 본질적인 회절 한계로 인하여, 특히 축 방향으로 개별 나노 입자를 식별(identification)하기 곤란하다.

따라서, 본 구체예에 따르면, 이미지 처리 장치(200)에서는 크게 (i) 검출된 샘플의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤(fitting)을 적용하는 방식으로 상기 이미지 데이터에 대한 3차원 초고분해 과정을 수행하는 단계; 및 (ii) 3차원 초고분해된 나노 입자의 이미지 데이터를 3차원 영상 공간 내에서 국소화 정밀도(localization precisions)에 의하여 재구성하는 단계를 수행하도록 구성된다.

일 구체예에 있어서, 증강된 암시야 조명 하에서 검출된 나노 입자의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터(특히, 대역 통과 필터를 통하여 파장 변조 과정을 거친 증강된 암시야(EDF) 조명 하에서의 나노 입자의 이미지 데이터)는 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤(fitting)에 의하여 수정(또는 변형)된다.

이와 관련하여, 가우시안 맞춤에 사용되는 3차원 가우시안 함수는 하기 수학식 1로 표시된다.

[수학식 1]

.

특히, 상기 가우시안 맞춤이 적용된 샘플의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)는 수학식 1에 따라 나노 입자의 중심 위치를 결정하기 위하여 바탕잡음을 제거하도록 수행될 수 있다.

이때, 가우시안 함수는 최소세제곱 알고리즘을 적용하여 나노 입자의 중심 좌표(x₀, y₀ 및 z₀)를 찾을 수 있도록 적용된다.

구체적으로, 상수(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z는 하기 수학식 2에 의하여 표시되는 목적 함수(objective function) F(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z)를 최소화하는 최소세제곱 알고리즘을 강도 값에 적용함으로써 결정될 수 있다:

[수학식 2]

상기 식에서, p는 3이고,

으로 관찰되는 것으로 가정한다.

상기 수학식 2에서 p=2인 경우, 종래에 수학식 1에서 상수를 구하기 위하여 사용된 최소제곱 알고리즘에 해당된다. 그러나, 본 구체예에서는 적용된 최소세제곱법 알고리즘(p=3인 경우)은 비대칭 입자(구체적으로, 나노-로드)의 이미지를 효과적으로 처리할 수 있는 바, 그 결과 비대칭 입자의 3차원 PSF를 통한 입자 중심의 추정 시, 오차를 줄일 수 있게 된다.

예시적 구체예에 있어서, Born-Wolf 모델에 따르면, 3차원 가우시안 함수는 x, y 및 z 방향으로 특정 폭(specific width)을 갖는 타원형 프로파일이다(σ_x=σ_y≠σ_z). 이때, 프로파일의 종횡비(aspect ratio)는 하기 수학식 3으로 표시될 수 있다:

[수학식 3]

.

또한, 프로파일의 FWHM(full width at half maximum)은 하기 수학식 4에 의하여 계산될 수 있다:

[수학식 4]

이와 관련하여, FWHM는 이상적인 조건 하에서 암시야 현미경의 회절-한계일 수 있다.

전술한 바와 같이 3차원 초고분해된 나노 입자의 이미지 데이터는 3차원 영상 공간으로 재구성하는 과정을 거치게 되며, 이는 3차원(σ_x, σ_y, 및 σ_z) CRLB(Cramer-Rao lower bound)에 기반하는 국소화 정밀도(localization precisions)에 의하여 수행될 수 있다. 주어진 PSF의 이론적 정밀도는 가장 낮은 이론적 국소화 분산(localization variance)을 이용한 CRLB에 의하여 정량화할 수 있다. 횡 방향 국소화 정밀도(σ_xy)는 다중 이미지로부터 산출될 수 있다. 축 방향 국소화 정밀도(σ_z)는 직적 측정할 수 없으나, 타원형 프로파일을 갖는 가우시안 함수의 종횡비에 의하여 수학식 3으로부터 구할 수 있다. 즉, 각각의 나노 입자의 횡 방향 차원 및 축 방향 차원에서의 CRLB 값은 다중 이미지로부터 산출될 수 있는 것이다.

이처럼, 나노 입자의 초-분해 이미지는 분해된 중심(x₀, y₀ 및 z₀)을 갖는 타원형의 가우시안 프로파일, 그리고 횡 방향 및 축 방향 차원의 측정된 국소화로 재구성될 수 있다.

최종적으로, 나노 입자는 단일 이미지 공간 내에서 렌더링(rendering)되어 3차원의 초고분해 이미지를 재구성하게 된다.

상술한 이미지 처리 유닛(200)은 앞서 설명한 이미지 처리 알고리즘이 컴퓨터 프로그램으로 장착된 마이크로프로세서 또는 상기 마이크로프로세서를 구비한 각종 전산 장치로 구현될 수 있다. 이후, 이미지 표시 유닛(300)은 이미지 처리 유닛(200)에 의하여 재구성된 샘플의 이미지를 표시하는데, 상기 이미지 표시 유닛(300)에 의하여 표시되는 이미지는 정적 영상 또는 동영상일 수도 있다. 이미지 표시 유닛(300)으로는 이미지 처리 유닛(200)에 연결되어 이미지 처리 유닛(200)에 의하여 제공되는 이미지를 표시할 수 있는 한, 당업계에서 알려진 임의의 장치를 이용할 수 있다. 예시적으로, 이미지 표시 유닛(300)은 이미지 표시 유닛(300)에 통합된 디스플레이로 구현되거나 별도의 모니터 형태로 구현될 수도 있다.

이와 같이, 종래의 최소제곱법이 아닌 최소세제곱법을 적용함으로써 3차원 부회절-한계 분해 하에서도 다양한 나노 입자의 위치를 분해할 수 있어 생체 외는 물론 생체 내에서 3차원 비형광 초고분해 현미경 기술을 성공적으로 적용할 수 있다.

구체적으로, 본 구체예에 따른 방법은, 예를 들면 금속(예를 들면, 금(Au)) 나노 패턴 또는 나노 스팟과 접합된 나노 입자, 그리고 살아있는 단일 세포 내 나노 입자-미토콘드리아에서 나노 입자를 식별하는 등의 분야에 적용될 수 있는 바, 양자 모두 3차원(횡 방향 및 축 방향) 모두에서 나노 입자에 대한 우수한 분해 성능을 얻을 수 있다. 더욱이, 종래의 형광 표지법과 달리 나노 입자의 산란이 장기간의 검출 기간(약 10분)에서도 양호한 광-안정성을 나타낼 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 명확히 이해될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적에 불과하며 발명의 영역을 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

본 실시예에서 사용된 물질 및 시약은 하기와 같다.

- 103 nm 사이즈의 금 나노 입자(GNP), 40 nm 사이즈의 구연산염이 캡핑된(citrate-capped) 금 나노-로드(GNR; 40 nm ㅧ 97 nm) 및 80 nm 사이즈의 은 나노 입자(SNP) 콜로이드 용액은 NanopartzTM(Salt Lake City, UT, USA) 및 BBI Life Sciences (Cardiff, UK)으로부터 구입하였다.

- Poly-L-lysine (PLL; 농도: 0.01%, 정제수에 용해됨), 11-머캅토운데칸산 (MUA, 95%), 6-머캅토-1헥산올(MCH, 97%), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC), 디메틸 설폭사이드(DMSO, 99.5%), 2-(몰폴리노)에탄설포닉산(MES), 글리신 및 인산염 완충 식염수 (PBS)는 Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

- 설포-NHS(Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide, NHSS) 및 디티오비스(숙신이미딜 프로피오네이트(DSP), 및 Protein A/G는 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다.

- Tris(base)는 Mallinckrodt Baker, Inc.(Phillipsburg, NJ, USA)으로부터 구입하였다.

- StabilGuard는 SurModics (Esuden Prairie, MN, USA)로부터 구입하였다.

- 모노크로날 항체(X306) 는 HyTest (Turku, Finland)로부터 구입하였다.

사용에 앞서, 1×PBS (pH 7.4, 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl) 및 50 mM MES 완충액은 0.2-mm 멤브레인 필터를 통하여 여과하였고, UV-B lamp (G15TE, 280-315 nm, Philips, The Netherlands)를 이용하여 하룻밤동안 광 표백하였다.

100 nm 나노 스팟의 제작

금(Au) 나노 스팟 기재는 나노종합기술원(National Nanofab Center, 대전, 대한민국)에서 제작하였다. 간략하게 기술하면, 글라스 웨이퍼를 피라나(piranha) 용액(1:1 = H₂SO₄:30%H₂O₂, v/v)을 이용하여 세정하였다. 글라스 웨이퍼를 전자-민감성 포토레지스트(구체적으로, 150 nm-두께의 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 층으로 코팅하였다. 그 다음, 원하는 패턴으로 고분자를 연소시키기 위하여 전자-빔(Elionix E-beam system, 100 KeV/100 pA)을 사용하였다. Au/Cr(20/5 nm 두께)를 열 증발에 의하여 증착하였고, 디클로로메탄을 이용하여 PMMA를 제거하여 10 ㎛ 피치 및 100 nm 직경을 갖는 나노 스팟을 형성하였다.

전자 현미경 이미지

나노 입자의 사이즈 및 형태학적 특징(morphology)은 환경 주사전자현미경(environmental scanning electron microscope; ESEM, Quanta FEG 650, FEI Company, Hillsboro, OR, USA)(가속 전압: 30 kV) 및 투과전자 현미경(a transmission electron microscope (TEM) (2100F, JEOL Ltd, Tokyo, Japan) 이용하여 특성화하였다. ESEM 이미징용 샘플은 증류수에 분산된 샘플 일 부분을 실리콘 웨이퍼 상에 떨어뜨린 다음, 건조기(desiccator) 내에서 상기 웨이퍼를 건조시켰다. 5 ㎕의 나노 입자 혼합물(GNPs, GNRs, 및 SNPs)의 서스펜션을 Cu-그리드(탄소 코팅됨, 200-메쉬, Ted Pella, Inc., Redding, CA, USA) 상으로 떨어뜨렸고, 완전히 건조시킨 후에 TEM에 의하여 영상화하였다.

이와 관련하여, 도 5는 103 nm 사이즈의 금 나노 입자(GNP), 80 nm 사이즈의 은 나노 입자(SNP) 및 40 nm 사이즈의 금 나노-로드(GNR)의 ESEM 및 TEM 이미지를 나타낸다.

나노입자 및 금(Au) 나노 스팟의 광학 물성

GNP, GNR, 및 SNP의 수분산물의 소광 스펙트럼(extinction spectra)을 UV-Vis 분광기(MultiSpec-1501, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 단일-입자 상태에서의 EDF 이미지와 함께 도 6에 나타내었다. 상기 도면에 따르면, GNP, GNR, 및 SNP의 소광 피크는 각각 577 nm, 663 nm, 및 477 nm이었다.

PLL-코팅된 글라스 상에 단일 나노 입자의 고정

나노 입자 용액(3.5 ㎕, 약 10⁷ 입자/mL)을 PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상에 떨어뜨렸다. 음으로 하전된 나노 입자를 정전기력을 통하여 양으로 하전된 글라스 표면 상에 고정시켰다(도 1a 참조).

금(Au) 나노 스팟 상에 단일 나노입자의 접합

하기의 단계를 이용하여 금(Au) 나노 스팟 상에 단일 나노 입자를 접합시켰다:

먼저, 표면 상에 카르복시산-말단 알칸티올 단일층을 갖는 NP-MUA-MCH를 형성하기 위하여 나노 입자를 개질하였다. 그 다음, 개질된 나노 입자를 EDC 및 설포-NHS로 활성화시켜 NP-MUA-MCH-NHSS를 형성하였다. 그 다음, DMSO에 DSP 용해시킨 용액(4 mg/mL)에 30분 동안 침적시켰고, 이후 증류수로 세정하였다. Protein A/G를 0.1 mg/mL의 농도로 첨가하여 항체 Fc 영역의 바인딩을 촉진시켰다. 상기 용액을 1 시간 동안 인큐베이팅하였다. 10 mM Tris (pH 7.5) 및 1M 글리신을 첨가하고 30분 동안 인큐베이팅함으로써 미반응 숙신이미드 그룹을 블로킹하였다.

안정화를 위하여 나노 스팟을 StabilGuard로 30분 동안 인큐베이팅한 다음, 몇 방울의 증류수로 간편하게 세정하였다. 이후, PBS (pH 7.4)에 2 mg/mL 항체(X306)를 용해시킨 용액 20 ㎕를 이용하여 1 시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 후, 20㎕ NHS-개질된 나노 입자를 첨가하여 금(Au) 나노 입자 상에 나노 입자를 접합시켰고(도 1b 참조), 2 시간 동안 반응이 진행되도록 하였다.

나노 입자의 산란 스펙트럼은 나노 입자 및 금(Au) 나노 스팟의 플라즈몬 커플링으로 인하여, 특히 SNP에 대하여 약간 적색-이동 되었음을 나타낸다(약 40 nm 이동됨).

항체와 나노 입자의 접합

하기와 같이 GNP, GNR, 및 SNP를 항-미토콘드리아 항체(MAB 1273, Millipore, Schwalbach, Germany)와 접합시켰다.

10 mM MUA 및 30 mM MCH를 에탄올에 용해시킨 후에 물에 분산되어 있는 나노 입자 용액에 첨가한 다음, 10분 동안 초음파 처리하였고 2 시간 30분 동안 인큐베이팅시켜 GNP 표면 상에 MUA-MCH의 자기-조립된 단일층(SAM)을 형성시켰다. 이후, 원심분리(12 000 rpm, 90 min, 4℃)에 의하여 초순도수로 단일층을 세척하였다. GNP-MUA-MCH를 50 mM MES 및 0.1 M NaCl(pH 6.0) 내에 재분산시켰다. 이러한 절차를 통하여 GNP의 표면 상에 카르복시산-말단 알칸티올 단일층이 형성되도록 하였다. 항체와 SNP의 접합은 EDC 및 설포-NHS를 사용하여 수행되었다. EDC (40 mg, 2 mg/mL in 50 mM MES pH 6.0) 및 설포-NHS (196 mg, 2 mg/mL in 1×PBS, pH 7.4)를 SNPs-MUA-MCH 용액에 첨가하였다. 상온에서 40분 동안 교반시킨 후에, 원심분리(17 000 rpm, 30 min, 4℃)를 이용하여 SNP-MUA-MCH-NHSS를 세척하였고, 그 다음 PBS 내에 재용해시켰다.

항-미토콘드리아 항체 용액을 PBS 내에서 400배 희석시켜 활성화된 GNP, GNP, 및 SNP에 첨가하였고, 상온에서 4 시간 동안 로터리 쉐이커를 이용하여 반응하도록 하였다. 그 다음, 상기 혼합물을 4℃에서 12 시간 동안 저장하였다. Tris (10 mM, pH 7.5) 및 1 M 글리신을 첨가하였고, 해당 용액을 15분 동안 인큐베이팅시켜 과량의 히드록실아민을 억제하였다.

최종 나노 입자-항체 서스펜션을 원심 분리하여(17000 rpm, 90 min, 4℃), 임의의 결합되지 않은 항체를 제거하고, PBS 완충액 내에 재분산시켜 4℃에서 저장하였다.

살아있는 세포와 나노 입자의 인큐베이션

HEK293 세포의 배양물을 플레이팅하여 세포 배양 매질 내에서 성장시켰다. 세포는 5% CO₂를 함유하는 습윤 분위기를 이용하여 37℃에서 플라스틱 조직 배양 디쉬(BD Biosciences, Bedford, MA, USA) 내에 유지시켰다. 단일-세포 영상화를 위하여, 세포를 22mm X 22mm 커버-글라스(No. 1, Deckglaser, Freiburg, Germany) 상에 놓고 24 시간 동안 인큐베이팅시켰다. DPBS(Dulbecco`s Phosphate Buffered Saline)로 부착 세포를 2회 세정하였고, 그 다음 함체와 접합된 GNP, GNR, 및 SNP를 함유하는 매질에 즉시 노출시킨 후, 24 시간 동안 인큐베이팅시켰다. 부착 세포를 갖는 커버 글라스를 DPBS로 3회 세척하여 과량의 나노 입자를 제거한 후, 영상화를 위하여 대물 렌즈 아래에 배치하였다.

실험실에서 제작된 z-모터(z-스테이지 컨트롤러)를 구비한 3차원 파장-의존 SRM 시스템

CytoViva EDF 조명 디바이스(CytoViva Inc., Auburn, AL, USA) 및 100ㅧ 대물 렌즈 (UPLANFLN; 조절 가능한 개구수: 0.6 내지 1.3; Olympus)가 장착된 Olympus BX-51 정립형(upright) 현미경 (BX-51, Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 도 2b에 도시된 랩-제작된 EDF 조명 현미경 시스템을 제작하였다. 10 nm 두께를 갖는 z-축 구획화는 z-모터(z-컨트롤러)LEP MAC 5000, LUDL Electronic Products Ltd., Hawthorne, NY, USA)를 이용하여 수행하여 샘플의 3차원 정보를 획득하였다.

EMCCD(electron multiple charge-coupled device camera; QuantEM, 512 SC, Photometrics, Tucson, AZ, USA) 및 컬러 Nikon D3S 디지털 카메라(Tokyo, Japan)를 현미경 상측에 장착하여 동시에 단일-입자의 이미지를 검출하도록 하였다.

Semrock (Rochester, NY, USA)로부터 구매한, 다양한 파장(473±10 nm, 575±15 nm, 및 680±10 nm)을 갖는 대역통과 필터를 사용하여 샘플의 검출된 산란 파장을 선택하도록 하였다.

MetaMorph (Universal Imaging, Sunnyvale, CA, USA), the ThunderSTORM plug-in of ImageJ (NIH), 및 Matlab (Mathworks, Torrance, CA, USA)에 기반하는 랩-제작된 최소세제곱 3차원 데이터 맞춤 프로그램을 이용하여 이미지를 획득하고 데이터 처리를 수행하였다.

샘플의 3차원 EDF 영상화

샘플(PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상의 나노 입자, 나노 입자-접합된 금(Au) 나노 스팟, 및 살아있는 세포 내에서 나노 입자와 접합된 항체)를 z-모터 구동 스테이지 상에 고정시키고, 10 nm씩 증가시켜 축 방향을 따라 이동시켜 이의 특정 LSPR 파장에서 단일 입자의 3차원 정보를 획득하였다(도 3a 및 도 3b 참조).

축 방향에서의 가우시안 함수가 대칭적이므로 개별 입자의 상대적 위치는 특유하지 않게 된다. 이처럼, 상대적 위치의 모호성을 회피하기 위하여, 모든 사이클의 스캐닝 방향은 동일하였고(상단으로부터 하단까지), 상대적 위치 정보는 슬라이스 순서로부터 분해될 수 있었다.

시뮬레이션 및 실험에 의하여 얻어진 3차원 SRM 이미지

본 실시예에서 사용된 103 nm 사이즈의 금 나노 입자(GNP), 80 nm 사이즈의 은 나노 입자(SNP) 및 40 nm 사이즈의 금 나노-로드(GNR)의 경우, 이미징 파장은 각각 575 nm, 473 nm, 및 680 nm이었다.

그 다음, 3차원 영상화는 최적화된 개구수(NA) 및 검출 파장을 이용하여 모사하였으며, 특히 Born-Wolf 모델을 기반으로 한 (a) GNP, (b) SNP 및 (c) GNR에 대한 시뮬레이션된 광학 성능을 도 7에 나타내었다.

상기 도면에 있어서, a(i), b(i), 및 c(i)은 각각 GNP, SNP, 및 GNR의 3차원 프로파일을 도시하고; a(ii), b(ii), 및 c(ii)는 각각 GNP, SNP, 및 GNR의 초점 면에서 xy 투사(projection)를 보여주며; a(iii), b(iii), 및 c(iii)는 GNP, SNP, 및 GNR의 xz 투사를 보여주고; a(iv), b(iv), 및 c(iv)는 GNP, SNP, 및 GNR의 yz 투사를 보여주고; a(v), b(v), 및 c(v)는 GNP, SNP, 및 GNR의 횡 방향 차원에서의 FWHM을 보여주고; 그리고 a(vi), b(vi), 및 c(vi)는 GNP, SNP, 및 GNR의 축 방향 차원에서의 FWHM을 보여준다.

상기 도면에 따르면, λ=575 nm에서 횡 방향 차원에서의 FWHM(FWHM_xy)는 277 nm(도 7a(v))이었고, 축 방향 차원에서의 FWHM(FWHM_z)는 1498 nm(도 7a(vi))이었다. λ=473 nm에서 FWHM_xy는 227 nm(도 7b(v))이었고, FWHM_z는 1250 nm(도 7b(vi))이었다. λ=680 nm에서 FWHM_xy는 379 nm(도 7c(v))이었고, FWHM_z는 1840 nm(도 7c(vi))이었다. 특정 플라즈몬 파장에서 PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상의 GNP, SNP, 및 GNR에 대하여 실험적으로 얻어진 3차원 SRM 이미지를 도 8에 나타내었다.

구체적으로, 도 8a(v, vi)은 238 nm의 FWHM_xy 및 3424 nm의 FWHM_z를 보여준다. 이러한 실험 결과는 횡 방향 차원에서의 이론적 예상과 유사하였으나, 축 방향에 있어서는 관찰된 강도 분포는 시뮬레이션된 결과보다 2배 더 큰 값이다. 도 8b 및 도 8c에서도 SNP 및 GNR에 대하여 이와 유사한 불일치가 발견된다. 모든 초점 내(in-focus) 이미지 면의 축 방향 차원의 이미지 내에서 현저한 강도 분산 성분은 인접하는 초점 외(out-of-focus) 이미지 면으로부터의 기여, 상이한 이미징 슬라이스 간의 간섭 및 검출 시스템으로부터의 노이즈를 포함하며, 이들 모두는 시뮬레이션(모사)하기 곤란하다. 몇몇 하드웨어 및 수학-기반의 방법(예를 들면, 공초점 현미경 및 디컨벌루션(deconvolution) 프로세스)은 각각의 이미지 면 내에서 초점 외 광의 기여를 저감하여 축 방향 분해를 개선할 수 있으나, 부회절-한계 분해는 불가능하다.

최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤에 기반한, 증강된 3차원 초국소화

나노 입자의 3차원 초-국소화(super-localization)를 위하여, 전술한 수학식 1에 의하여 표시되는 3차원 가우시안 함수를 106 nm × 106 nm × 10 nm (d_x × d_y × d_z)의 화소(voxel) 사이즈를 갖는 주어진 PSF의 강도 분포를 기반으로 맞춤시켰다. 전술한 바와 같이, 수학식 1에서 상수(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z)는 강도 값에 최소세제곱 알고리즘을 적용함으로써 구하였다.

이와 같이 최소세제곱법 알고리즘이 적용된 가우시안 맞춤의 유효성을 시뮬레이션 데이터에 의하여 확인하였다. 공지의 상수를 이용하여 가우시안 함수를 평가하고, 평균 제로 값의 가우시안 노이즈 및 주어진 표준 편차를 이용하여 다양한 량의 가우시안 노이즈를 부가함으로써 PSF의 강도 분포를 모사하였다. 이후, 본 구체예에서 도입된 맞춤 알고리즘을 이용하여 상수를 역으로 도출하였다. 주어진 입자 중심과 도출된 입자 중심 간의 평균 차이는, 심지어 현저히 높은 가우시안 노이즈(최대 20%의 강도 값)에서도 x, y, 및 z 방향 각각 0.01 d_x (1 nm), 0.01 d_y (1 nm), 및 0.5 d_z (5 nm) 미만이었다. 이는 도 9 및 도 10에 의하여 확인 가능하다.

이와 관련하여, 도 9는 다양한 가우시안 노이즈(GN)를 갖는 GNP의 3차원 EDF 이미지를 모사한 결과를 나타낸다. 또한, 도 10은 최소제곱법(p=2) 및 최소세제곱법(p=3) 맞춤 알고리즘에 의하여 다양한 량의 가우시안 노이즈에 대한 횡 방향(xy) 및 축 방향(z)에서의 중앙 국소화 에러 분포를 나타내는 도면이다.

구체적으로, 주어진 입자 중심과 도출된 입자 중심 간의 평균 및 최대 차이는, 최소제곱 알고리즘 및 최소세제곱 알고리즘 모두에 있어서 x, y 및 z 방향 각각에서 0.01 d_x (1 nm) 및 0.03 d_x (3 nm), 0.01 d_y (1 nm) 및 0.04 d_y (4 nm), 그리고 0.5 d_z (5 nm) 및 1.0 d_z (10 nm) 미만이었다.

또한, 바탕 잡음의 영향을 회피하기 위하여 실험적으로 얻은 이미지를 이용할 경우, 낮은 레벨의 강도 값을 경험적으로 도출된 역치(w) 미만으로 컷-오프하였다. 즉, 강도 값의 가장 낮은 25%를 컷-오프하였다.

그 결과를 도 11 및 하기 표 1에 나타내었다.

상기 표의 경우, 3가지 입자의 실험 이미지를 이용하여, 다양한 컷-오프 역치(w)에 대하여 최소세제곱 알고리즘 및 최소제곱 알고리즘에 의하여 도출된 중심 좌표의 예를 나타낸다.

또한, 도 11은 원본 이미지 및 이의 보다 낮은 강도의 컷-오프 이미지의 예를 나타내는 바, 도 11a는 원본 이미지, 그리고 도 11b 내지 11j는 다양한 강도의 역치 값(w=5-45%)으로 컷-오프한 후의 이미지를 나타낸다.

상기 도면에 있어서, 컷-오프 후의 (x, y, z)에서 규준화된(normalized) 강도 값은 하기 수학식 10으로 나타낼 수 있다.

[수학식 10]

상기 수학식에서,

는 얻어진 이미지 내 (x, y, z)에서의 강도 값이고, I_Max는 얻어진 이미지 내 최대 강도 값이고, I_Min는 얻어진 이미지 내 최소 강도 값이며, 그리고

는 컷-오프 후의 (x, y, z)에서 규준화된 강도 값이다. 그 다음, 앞서 제시된 수학식 2에서

를

에 의하여 대체하였다.

또한, 3가지 입자의 실험 이미지를 이용하여 최소세제곱 알고리즘 및 최소제곱 알고리즘에 대하여 0 내지 30%까지의 역치 값(w)을 테스트하였다(표 1 참조). 상기 표에 따르면, 30%보다 큰 역치 값은 유의미한 강도 값의 제거를 유도할 수 있다. 약 20 내지 30%의 역치 값이 최소세제곱 알고리즘 및 최소제곱 알고리즘 모두에 대하여 합리적인 결과를 제공하였다. 더욱이, 역치 값이 증가함에 따라 최소세제곱 알고리즘은 보다 신속하게 안정한 값을 달성하였다. 또한, 0 내지 5% 컷-오프를 갖는 중심의 경우, 최소제곱법에 비하여 최소세제곱법에서 25 내지 30% 컷-오프를 갖는 중심에 보다 근접하였다.

본 실시예에서 사용된 GNP, SNP, 및 GNR에 대하여 이의 중심을 구하기 위하여 테스트를 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다. 상기 도면에 있어서, GNP, SNP, 및 GNR의 TEM 이미지 및 EDF 이미지(xy-, xz-, 및 yz-도)로서, 붉은색 및 노란색 스팟(spot)은 각각 최소제곱법 및 최소세제곱법을 이용하여 계산된 중심을 나타낸다.

대칭적인 형상을 갖는 GNP 입자 및 SNP 입자를 사용할 경우, 최소세제곱 알고리즘을 이용하여 얻은 중심은 최소제곱 알고리즘을 이용하여 얻은 중심과 상당히 유사하였다. 그러나, GNR의 중심은 알고리즘에 대하여 의존성을 나타내었는 바, 그 차이는 GNR의 비대칭적 형상으로부터 기인한 것이다(도 12에서 GNR에 대한 TEM 이미지 참조).

한편, 입자의 중심을 찾기 위하여 또 다른 비대칭 이미지에 대한 테스트를 수행하였다. 이때, 이미지는 도 9에서 사용된, 가우시안 노이즈가 없는 GNP의 시뮬레이션된 3차원 EDF 이미지의 상측 200 슬라이스의 강도 값을 제거함으로써 얻어졌다.

도 13은 GNP의 시뮬레이션된 EDF 이미지의 3차원 및 xz 도면으로서, 백색 선은 z-방향으로(z=0) 실제 중심선을 나타내고, 붉은색 및 노란색 스팟(spot)은 각각 최소제곱법 및 최소세제곱법을 이용하여 계산된 중심을 나타낸다.

최소세제곱 알고리즘 및 최소제곱 알고리즘 각각에 의하여, 중심은 (0.0 d _x , 0.0 d _y , -20.7 d _z ) 및 (0.0 d _x , 0.0 d _y , -23.6 d _z )에서 예측된 반면, 초기(original) 중심은 (0 d _x , 0 d _y , 0 d _z )에 위치하였다. 이러한 결과로부터 최소세제곱 알고리즘에 의하여 구한 중심이 최소제곱 알고리즘을 사용하여 구한 중심에 비하여 보다 밝은 스팟에 근접했음을 알 수 있다.

상기 도 12 및 도 13에 의하여 확인되는 바와 같이, 최소제곱법과 대비할 때, 최소세제곱법은 비대칭 케이스에 있어서 높은 정밀도로 중심을 구하는데 보다 유용한 것으로 판단된다. 최종적으로, GNP, SNP, 및 GNR의 중심은 맞춤 방법을 경험적 강도 분포에 적용함으로써 분해되었다.

상대적 위치 수집(collation)

축 방향에서 단일 나노 입자의 중심은 각각의 스캔의 슬라이스 위치로부터 분해되기 때문에, 개별 나노 입자의 상대적 중심 위치는 기준점(fiducial marker)를 이용하여 수집하였다. 수집 후, GNP, SNP, 및 GNR의 최종 중심 위치(초기 지점에 대하여, 나노미터 단위)는 동일한 초기 지점(0, 0, 0)에 대하여 각각 (312.0, 312.0, 3320.6), (320.8, 219.3, 3314.6), 및 (234.0, 257.5, 3368.7)이었다.

3차원 초고분해 이미지의 재구성

나노 입자의 3차원 이미지를 재구성하기 위하여, 3D(σ_x, σ_y, 및 σ_z)에서 CRLB(Cramer-Rao lower bound)에 기반하는 국소화 정밀도를 생성하였다. 주어진 PSF의 이론적 정밀도는 가장 낮은 이론적 국소화 변화를 이용하여 CRLB에 의하여 정량화될 수 있다. 횡 방향 국소화 정밀도(σ_xy)는 다중 이미지를 이용하여 직접 측정될 수 있었다. 축 방향 국소화 정밀도(σ_z)는 직접 측정될 수 없음에도 불구하고, 타원형의 가우시안 함수의 종횡 비를 확인함으로써 수학식 3으로부터 도출될 수 있다.

EDF 시스템 하에서 재구성된 (a) GNP, (b) SNP 및 (c) GNR의 3차원 이미지를 도 14에 나타내었다.

상기 도면에서, a(i), b(i), 및 c(i)은 각각 GNP, SNP, 및 GNR의 3차원 프로파일을 보여주고; a(ii), b(ii), 및 c(ii)는 각각 GNP, SNP, 및 GNR의 초점 면에서 xy 투사(projection)를 보여주며; a(iii), b(iii), 및 c(iii)는 GNP, SNP, 및 GNR의 xz 투사를 보여주고; a(iv), b(iv), 및 c(iv)는 GNP, SNP, 및 GNR의 yz 투사를 보여주고; a(v), b(v), 및 c(v)는 GNP, SNP, 및 GNR의 횡 방향 차원에서의 FWHM을 보여주고; 그리고 a(vi), b(vi), 및 c(vi)는 GNP, SNP, 및 GNR의 축 방향 차원에서의 FWHM을 보여준다. 또한, FWHM는 재구성된 이미지의 사이즈를 나타낸다.

상기 도면에 따르면, 플라즈몬 파장(575 nm)에서 GNP의 경우, 최적화된 횡 방향 국소화 정밀도는 2.5 nm이고, 이의 축 방향 국소화 정밀도(σ_z)는 13.7 nm로 추산되었다. 이때, 초고분해된 GNP의 이미지는 분해된 중심 (x ₀, y ₀, z ₀) 및 횡 방향 차원 및 축 방향 차원에서 측정된 국소화를 갖는 타원형의 가우시안 프로파일로서 재구성되었다(도 14a). 또한, SNP 및 GNR에 대하여도 동일한 접근 방법을 적용하였는 바, 이들의 CRLB-기반의 국소화는 각각 15.9 nm 및 27.4 nm이었다(도 14b 및 도 14c 참조).

마지막으로, 3가지 나노입자 모두 단일 이미지 공간에서 렌더링함으로써 초고분해된 이미지를 재구성하였다. 이와 관련하여, 도 15는 PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상에서 인접하는 GNP, SNP 및 GNR의 원본 이미지(a-d) 및 재구성된 SRM 이미지(e-h)를 나타낸다. 여기서, (a, e)는 횡 방향 도면(xy-도면)이고, (b, f)는 xz-도면이며, (c, g)는 yz-도면이고, 그리고 (d, h)는 나노 입자의 3차원 도면이다.

도시된 바에 따르면, 재구성된 3차원 SRM 이미지는 특정 3D 화소(voxel) 사이즈(2.5nm × 2.5nm × 5nm)를 갖는 이미지 공간(530nm × 530nm × 300nm) 내에서 렌더링되었다. 3개의 인접하는 나노 입자의 원본 이미지에 있어서, 나노 입자는 축 방향(xy-방향, 도 15a 참조) 및 축 방향(xz-방향 및 yz-방향; 도 15b 및 도 15c 참조)에서 분해되지 않았다. 이러한 인접 나노 입자의 원본 3차원 이미지는 개별 나노 입자 각각을 식별하는데 요구되는 정보를 제공하지 못하였다(도 15d 참조). 반면, 재구성 후, 개별 GNP, SNP 및 GNR 입자는 3가지 차원 모두에서 분해되었고(도 15e 내지 도 15g 참조), 부회절 분해를 나타내었다. 이와 같이 재구성된 3차원 이미지는 명확히 PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상의 3가지 나노 입자의 상대적 위치를 나타내었다(도 15h 참조).

금(Au) 나노 스팟 상의 나노 입자 및 살아있는 단일 세포 내 나노 입자의 재구성된 3차원 SRM 이미지

금(Au) 나노 스팟 상의 나노 입자 및 살아있는 단일 세포 내 나노 입자의 3차원 이미지를 본 개시 내용에 따른 증강된 3차원 초-국소화 방법을 이용하여 재구성하였으며, 그 결과를 도 16 및 도 17에 나타내었다.

도 16은 (a) 금(Au) 나노 스팟 상의 GNP, SNP 및 GNR의 3차원 SRM 이미지, 그리고 (b) xz 투사 도면을 도시한다.

상기 도면에 나타난 바와 같이, 금(Au) 나노 스팟 상의 나노 입자의 재구성된 이미지는 축 방향 차원에서 개별 나노 입자의 위치에 있어서 차이를 명확히 보여준다. 또한, 나노 입자와 금(Au) 나노 스팟 간에 접합되어 있음을 명확히 뒷받침하고 있다.

도 17은 (a) 컬러 카메라를 이용한 xy-도면 및 (b) CCD 카메라를 이용한 xy-도면에서 살아있는 단일 HEK293 세포 내 GNP, SNP 및 GNR의 EDF 이미지, (c) 동일 세포의 xz-도면, (d) 동일 세포의 yz-도면, 및 (e) 3차원 도면, 그리고 (f) 횡 방향(xy-도면)에서 선택된 나노 입자의 재구성된 SRM 이미지 및 (g) 선택된 나노 입자의 원본 이미지 3차원 도면(좌측 사진)과 재구성된 3차원 SRM 이미지(우측 사진)의 대비 결과를 보여준다.

상기 도면에 따르면, 살아있는 인간 배아 신장(human embryonic kidney; HEK) 293 세포 내에서의 GNP, SNP 및 GNR의 3차원 SRM 이미지가 분해되었음을 확인할 수 있다.

한편, 도 18은 (a) 나노 입자로 라벨링되기 전, 및 (b) 나노 입자로 라벨링된 후에 파장-변조된, 살아있는 단일 HEK 293 세포의 EDF 이미지를 나타낸다. 상기 도면에서, (i)은 컬러 디지털 이미지, (ii) 내지 (v)는 EMCCD 이미지 및 다양한 대역 통과 필터를 이용하여 (i) 내에서 흰색 점선의 직사각형 영역의 확대도이다. 또한, (b)에서 노란색, 파란색 및 붉은색 화살표 각각은 GNP, SNP 및 GNR를 가리킨다. 나노 입자를 제외하고는 (a) 및 (b)에서 세포는 동일 절차에 따라 처리된다.

상기 도면에 따르면, 세포 구조로부터의 산란은 불가피하나(도 18a 참조), 살아있는 세포 내 나노 입자는 현저한 LSPR 특성으로 인하여 구별될 수 있었다. GNP, SNP 및 GNR이 항-미토콘드리아 항체를 통하여 미토콘트리아에 접합되었기 때문에, 높은 감도의 증강된 암시야 현미경을 사용한다 해도 각각의 접합된 나노 입자를 분해하는 것은 불가능하였다(도 17a 내지 도 17d 참조). 그러나, 본 실시예에 따른 3차원 SRM 테크닉을 이용하여 재구성한 후에는 미토콘드리아 상에 접합된 3가지 인접하는 나노 입자가 부회절-한계 분해를 이용하여 깨끗하게 분해되었다(도 17e 내지 도 17g 참조).

이와 같이 증강된 3차원 초-국소화법을 성공적으로 적용함으로써 본 개시 내용에서 제시된 방법이 생체 외 및 생체 내에서 플라즈몬 나노 입자의 고정밀 3차원 SRM 이미지를 획득하기 위한 신뢰성 있는 방안에 해당됨을 확인할 수 있다.

또한, 도 19는 최소제곱법(푸른색) 및 최소세제곱법(붉은색)에 의하여 산출되는, 글라스 슬라이드 상, 금(Au) 나노 스팟 상, 그리고 살아있는 HEK 239 세포 내 GNP, SNP 및 GNR의 중심 위치를 xy-도면 및 yz-도면으로 나타낸다.

상기 도면에 있어서, 이상적인 경우에 입자 중심이 가장 밝은 스팟에 위치한다는 가정은 최소세제곱 알고리즘이 주어진 입자, 심지어 다양한 조건에 있는 나노 입자(예를 들면, PLL-코팅된 글라스 슬라이드 상의 나노 입자, 금(Au) 나노 스팟 상의 나노입자 및 살아있는 단일 HEK 239 세포)의 중심을 확인하는데 적절하다는 점을 시사한다.

또한, 도 20은 EDF 하에서 GNP의 산란 강도-시간 프로파일을 나타낸다. 상기 도면에서, 검은색 라인 및 붉은색 라인 각각은 검출 기간 중 측정된 강도 및 평균 강도를 나타내고, 붉은색 영역은 검출 기간 중 표준 편차(SD)를 나타낸다. 상기 도면에 따르면, 형광 라벨링(표지) 방법과 달리, 긴 검출 구간(약 10분)에서도 나노 입자의 산란이 높은 광-안정성을 나타내었다.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지를 획득하는 방법으로서,
a) 적어도 1 종의 플라즈몬 나노 입자를 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
b) 상기 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하면서 광 가이드 유닛을 통과한 상기 샘플로부터 유래하는 공명 산란 광의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터를 광 검출 유닛에 의하여 검출하는 단계;
c) 상기 광 검출 유닛에 의하여 검출된 샘플의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤(fitting)을 적용함으로써 상기 이미지 데이터에 대한 3차원 초고분해 과정을 수행하는 단계;
d) 상기 3차원 초고분해된 나노 입자의 이미지 데이터를 3차원 영상 공간 내 CRLB(Cramer-Rao lower bound)에 기반하는 국소화 정밀도(localization precisions)에 의하여 재구성하는 단계; 및
e) 이미지 표시 장치에 의하여 상기 재구성된 이미지 데이터로부터 3차원 초고해상도 현미경 이미지를 얻는 단계;
를 포함하며,
상기 샘플은 상하로 승강시키도록 구성된 재물대 상에 배치되어, 상기 단계 b)에서 증강된 암시야 조명 하에서 샘플로부터 유래하는 공명 산란 광을 z-방향으로 슬라이싱하여 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터를 생성하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 c)에 앞서 암시야 조명 하에서 검출된 샘플의 공명 산란 광의 파장을 선택하기 위하여, 상기 공명 산란 광을 대역 통과 필터에 의하여 파장 변조하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 c)는 하기 수학식 1로 표시되는 3차원 가우시안 함수를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법:
[수학식 1]

.
상기 식에서, I ₀ 는 바탕잡음으로부터 기인하는 상수항(constant term)이고, A는 진폭(amplitude)이고, x₀, y₀ 및 z₀은 중심의 좌표이고, 그리고 σ_x, σ_y, 및 σ_z는 각각 x 방향, y 방향 및 z 방향에서 분포의 표준 편차임.
제3항에 있어서, 상기 상수(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z)는 하기 수학식 2에 의하여 표시되는 목적 함수(objective function) F(I₀, A, x₀, y₀, z₀, σ_x, σ_y, 및 σ_z)를 최소화하는 최소세제곱 알고리즘에 의하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법:
[수학식 2]

상기 식에서, p는 3이고,
는 실험으로부터 구한 위치(x, y, z)에서의 강도 값이며, 그리고 강도 값은 직사각형의 평행육면체(rectangular parallelepiped) 체적
으로 관찰되는 것으로 가정함.
제4항에 있어서, 상기 3차원 가우시안 함수는 Born-Wolf 모델에 근거하여, x, y 및 z 방향으로 특정 폭(specific width)을 갖는 타원형 프로파일(σ_x=σ_y≠σ_z)인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 타원형 프로파일의 종횡 비(aspect ratio)는 하기 수학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
[수학식 3]

.
제5항에 있어서, 상기 프로파일의 FWHM은 하기 수학식 4에 의하여 계산되는 것을 특징으로 하는 방법:
[수학식 4]

.
제3항에 있어서, 상기 단계 c) 중 상기 가우시안 맞춤(fitting)이 적용된 샘플의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)는 상기 수학식 1에 따라 나노 입자의 중심 위치를 결정하기 위하여 바탕잡음을 제거하도록 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 플라즈몬 나노 입자는 금 나노 입자(GNP), 금 나노-로드(GNR), 및 은 나노 입자(SNP)로 이루어진 군으로부터 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 파장 변조된 산란 광은 상기 나노 입자의 특이적인(specific) 플라즈몬 파장과 일치되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 생체에서 분리된 물질 또는 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 생체에서 분리된 물질 또는 성분은 혈액, 소변, 콧물, 세포, 추출된 DNA 및 RNA, 효소, 단백질 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 플라즈몬 나노 입자를 자연적으로 함유하고 있거나, 또는 전처리 과정을 통하여 상기 플라즈몬 나노 입자를 인위적으로 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 전처리 과정은 기재 상에 PLL(poly-L-lysine), CTAB 및 CTAC로 이루어진 군으로부터 적어도 하나를 선택하여 전처리하고, 상기 전처리된 기재의 표면 상에 플라즈몬 나노 입자를 정전기력에 의하여 부착하는 단계를 포함하며,
상기 기재는 기재로서 실리콘, 글라스, 용융 실리카, 석영, 폴리디메틸실록산 또는 폴리메틸메타크릴레이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 전처리 과정은 금속 나노 패턴 또는 나노 스팟이 형성된 기재 상에 플라즈몬 나노 입자를 접합하여 고정하는 단계를 포함하며,
상기 금속 나노 패턴 또는 나노 스팟의 재질은 금(Au), 은(Ag), 팔라듐(Pd), 또는 이의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 전처리 과정은 나노 입자를 생체 분자와 접합하는 단계, 또는 살아있는 세포와 함께 상기 생체 분자와 접합된 나노 입자를 배양하여 나노 입자를 살아있는 세포에 부착하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 증강된 암시야 조명을 제공하는 단계는 암시야 조명을 생성하는 광원, 및 상기 광원에 광 섬유를 통하여 연결되며 생성된 암시야 조명을 증강시켜 상기 샘플에 제공하는 광 컨덴서를 포함하는 암시야 제공 조명 유닛에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 b)에서 광 가이드 유닛은 상기 재물대 상에 배치되는 대물 렌즈 및 상기 대물 렌즈를 통과한, 샘플로부터 유래하는 광을 수집하는 프리즘을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 광 가이드 유닛은, 상기 대물 렌즈와 상기 프리즘 사이에 특정 대역의 파장을 선택적으로 통과시키는 적어도 하나의 대역 통과 필터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 광 검출 유닛은, 광다이오드 어레이(photodiode array: PDA), 전하 주입 장치(charge injection device: CID), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD), 및 디지털 일안 반사식 카메라(digital single lens reflex camera)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
암시야 조명을 이용한 비형광 나노 입자의 3차원 초고분해 영상 이미지의 획득 시스템으로서,
적어도 1종의 플라즈몬 나노 입자를 포함하는 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하여 상기 플라즈몬 나노 입자의 공명 산란 광의 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터를 검출하는 이미지 검출 유닛, 상기 이미지 검출 유닛은 상기 샘플이 배치되는 재물대를 구비함;
상기 3차원 점상 강도분포함수(PSF)를 갖는 이미지 데이터에 최소세제곱 알고리즘을 이용한 가우시안 맞춤을 적용함으로써 상기 이미지 데이터에 대한 3차원 초고분해 과정을 수행하고, 또한 상기 3차원 초고분해된 나노 입자의 이미지 데이터를 3차원 영상 공간 내 CRLB(Cramer-Rao lower bound)에 기반하는 국소화 정밀도(localization precisions)에 의하여 재구성하는 이미지 처리 유닛;
상기 이미지 처리 유닛에 의하여 재구성된 이미지를 표시하는 이미지 표시 유닛; 및
상기 샘플의 3차원 영상 획득을 위하여 상기 재물대를 상하로 승강시키도록 구성된 z-스테이지 컨트롤러;
을 포함하며,
상기 z-스테이지 컨트롤러는 증강된 암시야 조명 하에서 샘플로부터 유래하는 공명 산란 광을 z-방향으로 슬라이싱하도록 구성되는 시스템.
제21항에 있어서, 이미지 검출 유닛은,
상기 재물대에 배치된 샘플에 증강된 암시야 조명을 제공하는 암시야 제공 조명 유닛;
상기 샘플로부터 방출되는 공명 산란 광을 가이드하는 광 가이드 유닛; 및
상기 광 가이드 유닛에 의하여 가이드된 공명 산란 광을 검출하는 광 검출 유닛;
을 포함하는 시스템.
제22항에 있어서, 상기 광 가이드 유닛은 상기 재물대 상에 배치되는 대물렌즈 및 상기 대물 렌즈를 통과한 샘플로부터 유래하는 광을 수집하는 프리즘을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제23항에 있어서, 상기 광 가이드 유닛은, 상기 대물 렌즈와 상기 프리즘 사이에 특정 대역의 파장을 선택적으로 통과시키는 적어도 하나의 대역 통과 필터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제22항에 있어서, 상기 암시야 제공 조명 유닛은, 상기 암시야 조명을 생성하는 광원; 및
광섬유를 통하여 상기 광원에 연결되며 암시야 조명을 증강시켜 상기 샘플에 제공하는 광 컨덴서;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
제22항에 있어서, 상기 광 검출 유닛은, 광다이오드 어레이(photodiode array: PDA), 전하 주입 장치(charge injection device: CID), 전하-쌍 장치(charge-couple device, CCD), 및 디지털 일안 반사식 카메라(digital single lens reflex camera)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
삭제
제21항에 있어서, 상기 슬라이싱은 5 내지 30 nm의 두께로 수행되는 것을 특징으로 하는 시스템.