CN109715259A - 用于定量显微镜下可视的颗粒样品纯度的方法 - Google Patents
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Abstract
所述方法用于将显微镜下可视的样品的纯度量化。将待分析的样品置于电子显微镜中，以获得所述样品的电子显微镜图像(100)。所述样品包含物体(114)。增强具有与初级颗粒(120)的大小范围不同的大小和在所述初级颗粒(120)的大小范围内的大小的所述物体(114)。将所述物体(114)检测为初级颗粒(120)或碎片(106)。从所述物体(114)中排除检测到的所述初级颗粒(120)，使得所述物体(114)包含碎片(106)，但不包含初级颗粒(120)。测量检测到的所述碎片(106)的第一总面积(T1)。测量检测到的所述初级颗粒(120)的第二总面积(T2)。
Description
技术领域
本发明涉及使用电子显微镜评估和定量测量样品纯度的方法。
背景技术
开发和生产生物药物通常涉及若干纯化步骤，在这些步骤中，应该去除细胞碎片、破碎颗粒、其他污染物和团簇等，使得最终产品只包含所期望的初级颗粒。所感兴趣的初级颗粒(即，非聚集初级颗粒)在最终产品中的纯度和分散性对于其质量和功效而言是重要的。因此，定量评估纯度对于最终产品而言是重要的，而且在上游开发和生产过程中也是如此，以评估每个纯化步骤的功效和效果。电子显微镜是一种方法，通过该方法可以以足以识别样品中的所感兴趣颗粒(初级颗粒)以及不期望碎片、污染物和团簇的分辨率对显微镜下可视的颗粒进行成像。在许多过程中，客观地定量测量液体样品中的显微镜下可视的颗粒(诸如，病毒颗粒、病毒样颗粒、无机珠和其他纳米颗粒和微粒)的纯度是重要的。例如，修饰的病毒载体通常用于基因治疗应用，修饰的病毒颗粒用作疫苗。然而，目前可用的定量评估纯度的方法不是很准确，而且常常涉及可能扭曲最终结果的手动步骤。需要用更有效和可靠的方法来评估和测量含有显微镜下可视的初级颗粒和污染物/碎片的液体样品的纯度。
发明内容
本发明的方法提供了对上述问题的解决方案。更具体地，该方法用于将在显微镜下才能看到的颗粒样品的纯度量化。将待分析的样品置于电子显微镜中，以获得样品的电子显微镜图像。样品包含初级颗粒物以及碎片。碎片可能是破碎的或者是初级颗粒的部分(子单元)和/或污染物和/或初级颗粒或碎片的团簇或聚集物和/或来自生产阶段的剩余材料。图像中的物体被增强，并且具有与初级颗粒的大小范围不同的大小和在初级颗粒的大小范围内的大小。图像中的物体被检测为初级颗粒或碎片。从剩余物体中排除检测到的初级颗粒，使得被检测为碎片的物体只包含碎片，不含初级颗粒。测量检测到的碎片的第一总面积(T1)。测量检测到的初级颗粒的第二总面积(T2)。计算第一总面积(T1)与第二总面积(T2)的比率，以确定样品纯度的定量测量值。
在另一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近。对物体的圆度进行分析，以识别初级颗粒。
在另一个实施例中，将具有与初级颗粒基本类似的形状的图像中的物体识别为初级颗粒。
在另一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且分析物体的径向密度分布，以识别初级颗粒。
在又一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且通过测量物体内部的平均强度与恰在物体外部的平均强度相比较来分析物体边界处的信噪比。
在又一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且通过分析物体外边缘的清晰度来测量物体的局部对比度。
在又一个实施例中，增强图像中的物体边缘，并且物体的大小与初级颗粒的大小范围大体相近，并且利用纹理分析来测量物体的结构，以识别初级颗粒。
在另一个实施例中，利用纹理分析来测量图像中的物体的结构，并且分析该结构，以识别初级颗粒。
在另一个实施例中，将含有病毒颗粒或病毒样颗粒的样品置于电子显微镜中。
在又一个实施例中，用两个平滑滤波器对图像进行滤波，以创建第一滤波图像和第二滤波图像并且从第二滤波图像中减去第一滤波图像。
附图说明
图1是溶液中的经负染色的生物颗粒样品的透射电子图像；
图2是示出已经使用高斯差分方法来增强精细边缘之后的结果的图像；
图3是使用特定检测方法在图2所示的图像中检测到的初级物体的图像；
图4是示出利用对原始图像进行的高斯差分方法来增强典型碎片大小的物体之后的结果的图像；
图5是示出对物体增强后的图像进行阈值处理之后的结果的图像；
图6是示出去除与初级颗粒对应的物体之后的结果的图像；以及
图7是示出包括初级颗粒和碎片的最终结果的图像。
具体实施方式
本发明描述了一种独特的方法，其基于对样品的电子显微镜图像进行自动客观图像分析来定量测量在溶液中包含显微镜下可视的或纳米颗粒(可例如具有大约100nm的大小)的样品的纯度。样品可例如是液体、溶解的固体或粉末样品。
可使用负染色透射电子显微镜图像。总体上，本发明的纯度测量值优选地是初级颗粒与非初级颗粒(包括小碎片以及大碎片团簇)的面积比。本发明的方法的主要步骤是：
1.将待分析的样品置于电子显微镜中，以获得样品的电子显微镜图像；
2.增强图像中初级颗粒的边缘(诸如，精细边缘)，这些边缘的大小对于初级颗粒来说是典型的；
3.通过使用适于识别特定初级颗粒的方法来具体检测图像中的所有初级颗粒；
4.增强图像中的对于碎片团簇和污染物而言典型大小的物体；
5.使用例如阈值方法来检测步骤4中的所有增强物体；
6.从检测到的增强物体中排除(减去)所识别的初级颗粒；
7.测量步骤6中检测到的和剩余的碎片团簇和污染物的总面积；
8.测量步骤3中检测到的检测到的初级颗粒的总面积；以及
9.计算步骤7中得到的面积与步骤8中得到的面积的比率。
在图1中示出典型的示例图像100，在图2至图6中示出步骤2至6。图7示出最终结果102，即，初级颗粒120和碎片物体106。在步骤7至9中分别使用所测得的初级颗粒和碎片物体的面积来导出纯度测量值。
更具体地，图1是溶液中的经负染色的生物颗粒样品的透射电子显微镜图像100。生物颗粒可以是病毒颗粒或任何其他有机颗粒。也可用本发明的方法来分析含有无机颗粒的样品。可使用诸如高斯差分或任何其它合适方法的合适方法来增强例如图像中物体116的精细边缘(或对比度/细区域)，物体116具有对于待分析初级颗粒(步骤2)典型的大小。图2示出了在使用高斯差分方法来增强所识别物体116的精细边缘之后的结果105。所识别的物体116大部分是初级颗粒，但是可能含有一些不期望的碎片和污染物106(下面更详细地解释)。某种类型的病毒颗粒可具有100nm的预期大小，使得大小显著不同的颗粒最有可能不是初级颗粒，而是不期望的碎片颗粒106。应该注意，步骤2中的分析可不限于全部颗粒的大小。还有可能可以集中在初级颗粒的特定于所期望的初级颗粒的部分结构(诸如，颗粒的图案或外边缘的厚度)。然后，可以增强颗粒的特定部分，诸如，颗粒的外边缘的图案或厚度。
图像中的选定颗粒或初级颗粒的精细边缘的增强(诸如，通过使用高斯差分)已经带来了意想不到且令人惊讶的好结果。例如，由于样品的不同部分以及不同大小的物体/颗粒周围的不同厚度的染色，导致生物样品(诸如，病毒颗粒)的染色造成图像中物体/颗粒周围的染色量不同。染色量(厚度)进而在网格上纯度测量值的计算直接影响纯度测量值并且可使得测量值不太正确。如以上指示的，通过使用例如高斯差分方法来增强图像中的所选择大小范围内的边缘或物体。要理解，也可使用其他边缘或物体增强方法。在高斯差分方法中，用两个高斯平滑滤波器(具有不同的平滑因子σ)对图像进行滤波。然后，从一个经滤波的图像中减去另一个过滤的图像，从而得到具有增强边缘的图像或例如特定大小的增强物体。结果部分取决于所使用的平滑因子的组合。然后，在这些修改的图像上检测到初级颗粒、碎片和污染物。如以上指示的，边缘/物体增强步骤减弱了染色的不同量和不均匀分布的效果。因此，这种重要且创新的步骤在染色存在不均匀问题的应用/情况下是必需的，诸如，当分析病毒颗粒或其他颗粒的生物样品时。在只含有无机材料/颗粒的样品中，可不包括边缘增强步骤。另外，在根据(下述的)步骤4检测到进行增强之后的所有物体之前，增强所选择的一定大小或特性(诸如，边缘厚度或图案)的物体(即，步骤2/3中的初级颗粒)，使图像中的不均匀背景着色和点亮问题减少，这个问题原本会容易造成物体边界的定位错误，甚至导致问题错误地或不正确地错过或检测。换句话讲，步骤2中的增强使得依据来自显微镜的不同背景颜色和点亮，更容易地识别初级颗粒。例如，增强消除或减少了图像中某些部分的颜色更亮的效果以及强度梯度的效果。
然而，一些不期望的碎片和污染物颗粒可具有与待分析的初级颗粒的大小相近的大小。换句话说，步骤2中的增强可增强碰巧具有相近大小或具有与初级颗粒相近的其他特性的颗粒，但是它们不是初级颗粒。然后，有必要通过例如分析物体116的形状或圆度来进一步分析步骤2中的增强对象，以便识别并区分初级颗粒120与可具有在初级颗粒的大小范围内的大小的碎片。这是在步骤3中进行的(并且在图3中示出结果107)，步骤3通过如图2中所示地使用诸如分析在步骤2中识别的颗粒/物体的径向对称性的检测方法来识别(用白色)检测到的初级颗粒120。
为了使本发明的方法和定量纯度测量值客观(即，用户无偏差)且稳健，本方法中的步骤应该优选地自动执行，只提供用户输入来选择初级颗粒的大致大小以及非初级颗粒/物体(碎片和团簇)的下限和上限。本发明的重要方面是自动区分初级颗粒与非初级颗粒/物体的能力。如关于步骤3所指示的，可例如基于圆形对称特征或特异性检测初级颗粒120的其他方法来检测圆形初级颗粒(诸如，病毒载体)。例如，径向对称的病毒颗粒结构可以转换成灰度级轮廓。它可用于通过计算从病毒颗粒结构的中心向外朝着周缘或壳的距离中心达各距离处的平均灰度级来描述结构。也可以开发数学算法来描述病毒颗粒结构或形状，而不是依赖于灰度轮廓。
本发明方法的一个重要特征是，可以基于灰度轮廓来创建模板，以客观地描述病毒颗粒。也可使用数学方法来创建模板。以这种方式，可将一定大小范围内的所有检测到的物体与代表典型初级颗粒的轮廓或模板进行比较，并且使用该轮廓/模板来确定检测到的物体是否与将被归类为真实初级颗粒120的轮廓/模板足够相近。在步骤3中可能也可以使用其他方法(诸如，检测椭圆形、棒状或晶体状形状的方法)来识别初级颗粒120。
要理解，以上对病毒颗粒的提及仅仅是示例，本发明不限于病毒颗粒。另外，对颗粒的环状/圆度的提及仅仅是示例，也可使用诸如特定图案、特定形状和物体表面的其他特性。
关于与原始颗粒120的特定检测(以及消除大小与初级颗粒相近的的非初级颗粒)相关的步骤3，可包括在物体116的边界处使用信噪比或局部对比度的附加步骤。这样做是为了进一步改进初级颗粒120的检测以及自动判断它是否是初级颗粒。优选地，信噪比被测得为与恰在颗粒外部的平均强度相比的颗粒内部中的平均强度。可使用局部对比方法来分析颗粒的外边缘和/或内边缘有多清晰，以便能够更好地确定它是否是初级颗粒。另外，关于步骤3，对于非球形颗粒，也可使用用于检测初级颗粒120的特定形状或其他特性，诸如纹理(颗粒表面上的图案)而设计的其他方法。
下一个步骤是检测样品中不期望的碎片和污染物。图4示出了在原始图像上已经增强了物体之后的结果108。一个问题是，步骤4中的分析和增强还识别并且包括步骤3中识别的一些或全部初级颗粒120。在步骤4中，通过使用例如高斯差分方法来增强图像中的所有物体114。例如，也可通过诸如Otsu阈值方法的(自动)强度阈值方法来检测碎片和团簇。手动选择强度阈值也会起作用，但是可能容易引起不期望的用户偏差。
优选地，通过关注对于碎片团簇和污染物而言典型的某个大小范围来识别物体114，因为碎片/污染物可具有任何形状和颜色。可以首先关注具有对于碎片和污染物而言典型但小于初级颗粒的大小的物体，然后关注大小大于初级颗粒的物体。优选地，分析物体114的强度，以识别包括碎片和污染物的区域或范围。
以这种方式，在步骤5中检测图像中的所有增强后的物体114，并且在图5中示出结果110。换句话讲，在步骤4中使用的识别方法对于专用于排除初级颗粒120是不充分的，以致于碎片颗粒和初级颗粒中的一些或全部被识别为物体114并且在结果110中示出。
在步骤6中，从图5所示的物体114中排除或减去在步骤3中所识别的也包括在物体114中的所识别的初级颗粒120，使得在图6中的结果112中只示出检测到的碎片和污染物106。这意味着因步骤5中使用的增强方法而碰巧被包括在物体114中的任何初级颗粒被去除，使得结果112只示出碎片和污染物颗粒106。
在步骤7中，测量在步骤6之后即在初级颗粒已经被去除之后剩余物体或碎片106的总面积T1。在步骤8中，测量如图3中所示的检测到的初级颗粒120的总面积T2。在步骤9中，计算分别在步骤7和步骤8之后得到的面积的比率R。
将纯度量化为初级颗粒与其他物体的面积比率的所描述方法是稳健的。由于测量是基于也代表样品的大量图像，因此新错误检测到的或漏掉的初级颗粒只以不明显的方式影响结果，该大量图像是由自动化图像获取(用户无偏差)或手动获取图像得到的。
虽然已经根据优选的组成和实施例描述了本发明，但是要理解，可在不脱离所附权利要求书的精神和保护范围的情况下，对其进行某些替换和更改。
Claims (7)
1.一种用于将显微镜下可视的颗粒样品的纯度量化的方法，包括：
将待分析的样品置于电子显微镜中，以获得所述样品的电子显微镜图像(100)，所述样品包含物体(114)；
增强所述图像中的所述物体(114)，所述物体(114)具有与初级颗粒(120)的大小范围不同的大小和在所述初级颗粒(120)的大小范围内的大小；将所述图像中的所述物体(114)检测为初级颗粒(120)或碎片(106)；
从所述物体(114)中排除检测到的所述初级颗粒(120)，使得所述物体(114)包含碎片(106)，但不包含初级颗粒(120)；
测量检测到的所述碎片(106)的第一总面积(T1)；
测量检测到的所述初级颗粒(120)的第二总面积(T2)；以及
计算所述第一总面积(T1)与所述第二总面积(T2)的比率，以确定所述样品的纯度的定量测量值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：增强大小与所述初级颗粒(120)的大小范围大体相近的所述图像中的物体(116)的边缘，并且分析所述物体(116)的圆度，以识别所述初级颗粒(120)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：增强大小与所述初级颗粒(120)的大小范围大体相近的所述图像中的物体(116)的边缘，并且分析所述物体(116)的径向密度分布，以识别所述初级颗粒(120)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：增强大小与所述初级颗粒(120)的大小范围大体相近的所述图像中的所述物体(116)的边缘，并且通过测量与所述物体(116)正外侧的平均强度相比所述物体内部的平均强度来分析所述物体(116)的边界处的信噪比。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括：增强大小与所述初级颗粒(120)的大小范围大体相近的所述图像中的物体(116)的边缘，并且通过分析所述物体的边缘的清晰度来分析所述物体(116)的局部对比度。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括将含有病毒或病毒样颗粒的样品置于所述电子显微镜中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括用两个平滑滤波器对所述图像进行滤波，以创建第一滤波图像和第二滤波图像并且从所述第二滤波图像中减去所述第一滤波图像。
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