CN108884133A - 使用水合状态成像定量测量颗粒含量的方法 - Google Patents

Abstract

该方法用于使用诸如CryoTEM的水合状态成像定量测量颗粒含量。提供了病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒的样品(100)。优选地，样品(100)在低温下快速冷冻成低温液体。在低温下，在CryoTEM中观察冷冻样品中每个VLP的颗粒含量。确定VLP的颗粒含量的量以评估VLP是否是空的。

Description

使用水合状态成像定量测量颗粒含量的方法

技术领域

本发明涉及通过使用诸如CryoTEM(冷冻透射电子显微术)的水合状态成像方法定量测量颗粒含量的方法。

背景技术和发明内容

在制药工业中，病毒样颗粒(VLP)和野生型(wt)或修饰的病毒，例如腺相关病毒(AAV)颗粒被广泛用作基因递送的载体。通常，与真实病毒颗粒相反，VLP或复制缺陷型AAV不能复制/繁殖，并且通常优选作为基因递送的载体。对它们的遗传物质含量的评估至关重要，因为它与处理效率直接相关。通常使用不同的方法来评估病毒样颗粒(VLP)和AAV颗粒的含量。一种方法是实时聚合酶链式反应，也称为定量聚合酶链式反应(qPCR)。历史上，负染色透射电子显微术(nsTEM)已经用作正交直接方法，其用作可视化VLP和AAV颗粒含量的参照。其一个原因是nsTEM快速，简单并提供了良好的分辨率，因此实际上可以看到VLP和AAV颗粒。另一个原因是nsTEM被认为是准确的，并且是确定颗粒含量的良好方法。然而，最近发现nsTEM具有固有的特性，使其不可靠，不稳健，甚至在评估VLP、AAV颗粒和wt病毒颗粒的含量时出错。

在nsTEM中，在将样品施加到载网上之前或之后对样品施加染色剂以增强对比度并保护颗粒。nsTEM的一个缺点是染色剂覆盖颗粒并且不一定渗透颗粒。这防止直接原生观察颗粒的含量。也就是说，染色剂使得nsTEM中颗粒含量的分析成为一种间接方法。换句话说，仅当颗粒壳中存在开口时，例如当颗粒破碎时，染色剂进入颗粒并产生表示颗粒内部的对比度。染色剂也可能对样品的形态产生不利影响，并且由于印迹步骤(使用滤纸去除进入液体)和染色剂溶液的低pH值，令人惊讶地意识到颗粒通常在空间上局部地受到制备的影响。出乎意料地发现，在制备过程中染色剂层的厚度不能完全控制，并且在染色剂较薄的区域中，颗粒没有得到良好保护。结果是，空颗粒的形状有时会受到染色和印迹过程的影响，即使它们是完整的。制备过程可以在颗粒顶部的壳上产生凹痕或内陷，在其中染色剂可以聚集。这更可能是空颗粒，因为内部含量无助于保持形状。这使得它在显微镜中看起来是空的，而在染色剂较厚的区域中，颗粒形状是完整的并且在空和填充的完整颗粒之间没有可见的差异。这使得分析困难且不可靠。

在nsTEM中，如果颗粒看起来具有明亮的外边缘和暗的内部部分，则它们通常被看到、分类并计数为空的。原因是，一旦在载网上，空颗粒就会塌陷，染色剂会填充中空部分。满颗粒是那些看起来像亮盘的颗粒，中心部分略亮。原因是，由于颗粒被填充，它们在制备过程中不会塌陷，因此没有中空部分。通常有大部分颗粒无法明确分类。它们是所谓的不确定颗粒。

另一个问题是，当空颗粒在制备期间不塌陷时，它看起来是填充的，而另一方面，当填充的颗粒塌陷时，由于局部水平上的高机械约束，它可能会塌陷并看起来是空的。本发明的一个重要见解是认识到使用nsTEM的方法易于产生大量假阳性和假阴性。

需要一种更好和更可靠的量化颗粒含量的方法。本发明的方法是一种可靠的方法，通过该方法可以以良好的稳健性、准确性、可重复性和特异性评估VLP、AAV和wt病毒的含量。更具体地，该方法用于通过将它们以其天然水合状态成像，例如通过使用冷冻透射电子显微术(CryoTEM)来定量表征VLP、AAV和wt病毒颗粒的含量。还发现，通过使用离子液体来制备用于TEM成像的样品或使用用于液体样品的特殊样品保持器(有时称为液体TEM或原位TEM)，可以可靠地进行分析。离子液体制备方法类似于CryoTEM，因为离子液体的添加使颗粒保持水合状态，因此不需要使用染色剂来增强对比度。然而，可以有利地添加少量染色剂或化学品以保持颗粒的结构。

本发明的方法提供了对上述问题的解决方案。更具体地，该方法用于使用成像定量测量颗粒含量。提供了病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒的样品。制备样品以使样品保持水合状态。在成像装置中观察样品中每种VLP或病毒颗粒的颗粒含量。确定一定量的颗粒含量以评估VLP或病毒颗粒是空的(104)、完整的(102)还是不明确的(106)。更具体地，该方法用于通过使用诸如CryoTEM的水合状态成像方法来定量测量颗粒的颗粒含量。提供了病毒或病毒样颗粒(VLP)的样品，例如AAV颗粒或病毒颗粒。制备样品以使样品保持水合状态。这可以通过几种方式完成。对于优选实施例中的CryoTEM，样品在低温下快速冷冻成低温液体。在低温下，在CryoTEM成像装置中观察冷冻样品中每种VLP的颗粒含量。对于其他水合状态成像方法，成像在TEM成像装置中进行，但不在低温下进行，通过使用液体样品架，或通过在制备时向样品中添加离子液体。确定颗粒含量的测量值以评估VLP是否为空。

在可选实施例中，该方法进一步包括自动或手动检测图像中的颗粒并在显示器上显示检测到的颗粒并自动或手动删除小于尺寸下限和大于尺寸上限的颗粒的步骤。也可以在不首先显示颗粒的情况下向图像自动或手动移除或添加颗粒。还可以显示VLP或病毒颗粒并向图像交互地删除或添加VLP或病毒颗粒。

在另一可选实施例中，该方法进一步包括自动或手动将具有在颗粒壳和颗粒核心之间没有明显边界的内部密度的颗粒分类为填充颗粒的步骤。

在又一可选实施例中，该方法进一步包括自动或手动将具有明显外壳和微小内部密度的颗粒分类为空颗粒的步骤。

在可选实施例中，该方法进一步包括使用冷冻透射电子显微术确定VLP的颗粒含量的步骤。

在另一可选实施例中，该方法进一步包括确定腺相关病毒(AAV)颗粒的颗粒含量的步骤。

在又一可选实施例中，该方法进一步包括使用AAV颗粒作为基因递送载体的步骤。

在可选实施例中，该方法进一步包括将含有一个或多个基因拷贝的AAV颗粒分类为填充颗粒的步骤。

在另一可选实施例中，该方法进一步包括将不含基因的AAV颗粒分类为空颗粒的步骤。

在另一实施例中，该方法进一步包括向样品中加入离子液体以将VLP保持在水合状态。

在另一实施例中，该方法进一步包括通过使用液体样品保持器将VLP颗粒在其原生、液体和水合状态下成像。

附图说明

图1是通过CryoTEM观察的AAV样本的示意图。

具体实施方式

本发明涉及使用诸如CryoTEM的水合状态成像方法来评估和定量测量VLP、AAV颗粒和wt病毒颗粒内部的含量程度的方法。颗粒含量测量值可以是度量(数量)，其对应于颗粒的满或空的程度。它可以例如颗粒内部的总强度的测量值，或用颗粒外壳上的强度归一化的强度。它也可以测量颗粒内部的多少区域是明亮或暗的。如以上所提到的，本发明的一个重要方面是意识和发现nsTEM不适用于填充/空颗粒的评估/分析，因为当在载网上成像时，颗粒外观取决于若干参数，例如：

-染色剂的厚度(在整个载网中变化)；

-样本干燥的程度(在整个载网中变化)；以及

-颗粒的完整性(由于颗粒经受的机械应力的局部变化，可能会或可能不会受到染色过程和制备过程的影响)。

由于染色剂厚度会影响颗粒的外观，因此也会影响结果。染色剂厚度在载网上变化，这不能可靠地控制。例如，当染色剂相对较薄时，颗粒在制备中更多地暴露于物理力，并且一些颗粒可能会塌陷，使得染色剂包含在凹穴中而不会渗透到颗粒内部。当染色剂残留在颗粒的凹穴中时，其呈现的外观与已由染色剂填充的空颗粒非常相似。因此，颗粒含量分析很大程度上取决于是否对具有厚或薄染色剂的区域中的颗粒进行成像和分析。当使用nsTEM时，由于颗粒上染色剂的不均匀分布，颗粒通常表现为具有不同的含量，尽管它们实际上没有。这是过去尚未意识到的见解。

通过使用CryoTEM作为代替，染色剂的不均匀分布不会不利地影响颗粒的外观(因为没有使用染色剂)，因此在观察区域的所有区域中颗粒趋于看起来相同，这使得CryoTEM对本发明的含量分析非常有效。换句话说，虽然与nsTEM相比，使用CryoTEM进行含量分析更复杂，但却意外地发现，更准确结果的优点大于使用更繁琐的CryoTEM技术的缺点。在CryoTEM中，根据本发明的方法，将小等份的样品沉积在覆盖有薄碳膜的亲水化铜载网上。然后通过使用滤纸将过量的样品吸干。然后在样品干燥之前，将载网迅速投入低温液体，在其中颗粒样品立即冻结。快速冻结允许样品/样本嵌入接近其原生(即未染色)水合形式的无定形冰中，因此颗粒在样品中的任何地方都具有正确的外观，因为它们不受任何染色剂的影响。然后在整个过程中将样本保持在低温，同时将其插入并在透射电子显微镜中观察。本发明方法的一个优点是它允许直接看到未改变的颗粒，并有可能看到它们的内部特征。这使得可以更准确地评估颗粒是否为空。在CryoTEM中，空颗粒显示为具有微小内部密度的圆盘。一种解释是使用CryoTEM可以看到颗粒的内部部分，而空颗粒具有低内部密度。填充的颗粒显示为暗的均匀圆盘。同样，使用CryoTEM可以看到颗粒的内部部分，并且内部含有遗传物质的填充颗粒具有均匀的内部密度。

实例

以下是如何使用CryoTEM来实施本发明方法的详细实例。

载网制备

首先将合适的载网，例如400目铜(Cu)载网，亲水化。这是通过对载网进行辉光放电来完成的。更具体地，将覆盖有碳膜的铜载网放置在辉光放电器中。施加真空直至腔室中的压力达到约0.5毫巴。施加电流，例如约20mA，持续约1分钟。然后将压力增加至环境压力。移除载网并关闭辉光放电器。

载网冻结

开启投入式冷冻机。将样品室平衡至所需的温度和湿度。更换样品室中的吸干纸。制备冷却站中的乙烷浴。在镊子上装上一个新辉光放电的载网。冷冻过程开始。将约3μL的样品沉积在载网上。在大约10秒的等待时间之后，用滤纸对载网进行吸干并进行投入式冷冻。将载网转移到冷冻载网箱中并储存在液氮中。将乙烷和液氮安全地解冻并关闭投入式冷冻机。

载网转移

将冷冻载网箱从其储存位置转移到用液氮预先冷却的冷冻工作站中，冷冻保持器初级泵插入其中。将载网转移到冷冻保持器上的载网槽中。将冷冻保持器插入CryoTEM中并填充液氮容器。

载网成像

在载网成像步骤中，重要的是确保显微镜已根据制造商描述的方案正确对准，并且来自相机的空白图像是水平的。(应该理解，载网成像步骤可以自动完成，其中图像是自动获取的，而不需要操作者坐在显微镜下来获取图像。载网被筛选直到找到合适的区域。)然后将放大倍数设置有约600-1000nm的视场。在将显微镜设置为约6μm的轻微散焦之前发现焦点0。该散焦步骤可以手动完成或在具有自动聚焦和散焦功能的显微镜中自动完成。获取图像并将其移动到附近区域。重复获取图像的步骤，直到获得所需数量的图像。

后续图像处理和分析

通过合适的分析软件(例如Vironova Analyzer Software(VAS))保存和导入图像。选择要保存在显微镜中的图像并以适当的格式保存，例如16位tiff格式，或者可选地在自动图像采集后自动保存。创建了与VAS中的项目对应的文件夹，并完成了不同节点中的所有所需信息。通过右键单击节点，选择“Open image(s)”和在单击“Open”之前选择合适的文件，将图像导入“Microscopy”节点。

颗粒检测和分类

在“Microscopy”节点中，在“Particle Type”字段中输入“VLP(cryo)”。在右键单击其中一个之前，选择其中颗粒要检测的图像。选择了“Run detection…”。输入以下参数：

检测算法

椭圆分割

通过使用散点图显示在Plot Control上显示检测到的颗粒，“尺寸”在x轴上，“信噪比”在y轴上。在删除它们之前首先选择具有<0.1的信噪比的检测到的颗粒。

然后在删除它们之前选择具有<17nm且>28nm的尺寸的检测到的颗粒。在屏幕上目测评估图像，并且移除错误地和不正确地检测到的AAV颗粒。使用验证工具接受正确检测到的颗粒。通过自动检测未检测到的AAV颗粒被手动加框。

更一般地说，执行了以下分析步骤：

1)手动或通过使用合适的检测算法(例如，模板匹配、圆形物体检测、基于区域或边界的检测方法等)检测图像中感兴趣的颗粒；

2)移除基于每个颗粒的尺寸、形状和信噪比的测量值的错误检测(自动或手动或其两者的组合)；以及

3)如果使用自动检测算法，如果需要，添加未检测到的颗粒。

颗粒分类

在Plot控件工具栏的颗粒类节点中，选择了“Content”。使用Plot控件工具栏中的RDP PCA工具显示了所有检测到的颗粒。旋转Plot以便在两个簇之间获得清晰的分离。选择一个簇的颗粒并分配给它们相应的类。通过使用以下参数确定类：

-将显示出内部密度，在壳和核心之间没有明显的边界的AAV颗粒分类为填充颗粒；以及

-将显示明显外壳和微小内部密度的AAV颗粒分类为空颗粒。

然后选择来自另一个簇的颗粒并分配给它们相应的类。目视分析所有图像以评估分类。将“不确定”类分配给在分析师评估和半自动分类之间发现差异的所有颗粒。

更一般地说，执行了以下步骤：

1)通过分析颗粒内部的总强度和强度分布来测量颗粒的含量；以及

2)基于这些测量值对颗粒进行分类。这可以通过多种方式完成，例如通过手动阈值化每个测量的特征(例如，如果比某个强度Tf更暗，则分类为满，如果比另一个强度Te更亮，则分类为空，如果在Tf和Te之间，则分类为不确定)。它也可以通过在特征的散点图中标记颗粒组或通过使用自动/半自动聚类和分类方法来完成。通过观察颗粒的内部密度分布，可以以完全自动化的方式区分填充颗粒和空颗粒。

图1是通过CryoTEM观察的来自AAV样本100的VLP的典型图像的示意图。样本包含填充颗粒102，其显示为纯暗色圆盘。因此，颗粒102填充有例如药学物质或基因。空颗粒104显示为暗色圆圈，具有对应于低内部密度的明亮内部强度，因为它们不含有或携带基因。分类不明确的颗粒106似乎显示填充颗粒和空颗粒之间的特征。因此，分析确定含有药学物质(基因)的颗粒的量/数量以及每个颗粒填充药学物质或基因的程度。一些颗粒可能仅部分地填充有药学物质，而对于基因，颗粒或者含有一个或多个基因拷贝或者是空的。图1的比例尺108表示100nm。

虽然已经根据优选的组合和实施例描述了本发明，但应理解，在不脱离所附权利要求的精神和范围的情况下，可对其进行特定替换和改变。

Claims (11)

1.一种使用成像定量测量颗粒含量的方法，包括：

提供病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒的样品(100)；

制备所述样品以将所述样品(100)维持在水合状态；

在成像装置中观察所述样品中每个VLP或病毒颗粒的所述颗粒含量；以及

确定所述颗粒含量的量以评估所述VLP或病毒颗粒是否是空的(104)，满的(102)或不明确的(106)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括自动或手动检测图像中的颗粒，并删除小于尺寸下限和大于尺寸上限的颗粒的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述方法进一步包括显示VLP或病毒颗粒，并向所述图像交互地删除或添加VLP或病毒颗粒。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括将具有在颗粒壳和颗粒核心之间没有明显边界的内部密度的颗粒分类为填充颗粒的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括将具有明显外壳和微小内部密度的颗粒分类为空颗粒的步骤。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括使用冷冻透射电子显微术确定VLP的颗粒含量的步骤。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括确定腺相关病毒(AAV)颗粒的颗粒含量的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述方法进一步包括将含有基因的AAV颗粒分类为填充颗粒(102)的步骤。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法进一步包括将不含基因的AAV颗粒分类为空颗粒(104)的步骤。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括向所述样品中加入离子液体以将所述VLP保持在水合状态。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括通过使用液体样品保持器将所述样品在水合液体状态下成像。