JP6851582B2 - 細胞培養用顕微鏡スライドの改良およびそれに関連する改良 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養用顕微鏡スライド、特に、排他的ではないが免疫測定法、とりわけ免疫細胞化学（ＩＣＣ）の分野におけるイメージングのための細胞培養用スライドに関する。

免疫測定目的で顕微鏡スライド上において細胞培養液を成長させることは公知である。概して、使用者は、ガラススリップを使い捨て皿の底に配置することによって、該ガラス上で細胞を成長させる。細胞型に応じて、ガラススリップは、ガラス表面への細胞の付着を促進する表面処理剤、例えばポリリジンでコーティングされても、またはされなくてもよい。使用されるスリップのサイズは、通常１２ｍｍの円形から２５ｍｍ角、２５×７５ｍｍ角にまで及ぶ。所定の時間において、使用者は、望ましくは壊れやすいガラスを破壊することなく、スリップをピンセットで使い捨て皿から取り出す。このスリップは固定液、通常リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中のホルムアルデヒド内に配置されるが、固定液はメタノールであってもよい。これにより、タンパク質の架橋によりその場で発現タンパク質が化学的に固定される。スリップは、固定液から取り出され、ＰＢＳですすがれる。使用者はその後、一次抗体をカバーガラスに添加し、すすぎ、二次抗体を添加し、すすぎ、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール核染色液）を添加し、すすぎ、次いで少量の市販の封入剤を添加し、および密封剤、通常マニュキア液で、または硬化封入剤を使用することのいずれかによって、該スリップをさらなるガラススライドに添付する工程を開始する。密封剤または封入剤は硬化し、スライドアセンブリは、２つのガラス片の間に挟まれた染色標識タンパク質のイメージングを容易にする。念入りに、上記のステップを異なるスリップで繰り返し、それによって２以上のスリップを単一のガラススライドに載置することも可能である。

使用者は、組み立てられたスライドを検査するために倍率を選択する。対物レンズが液浸媒質を必要とする場合、該液浸媒質はその対物レンズで検査する前に添加する必要がある。一部の使用者は、焦点面を大まかに決定して対象領域を特定するために低倍率の空気対物レンズ（ａｉｒ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｌｅｎｓ）を使用し、高倍率でイメージングすることもある。組み立てたスライドをその後取り出し、対物レンズを変更し、適切な浸液をスライドまたは対物レンズのいずれかに添加して、該スライドを顕微鏡に戻し、該顕微鏡を試料に対して再度焦点合わせする。

この方法は問題を伴う。実際に、顕微鏡の最も困難な部分は試料調製であり、試料が光学的結果において果たす効果を完全に理解している使用者は少ない。下記は、使用者が免疫蛍光法において新たに直面するいくつかの問題である。

１．ガラススリップの操作：
ガラススリップは壊れやすく、もろいので、扱いを誤りやすい。このことは、操作の間にガラスを反転させる可能性がある。細胞はガラスの片面にだけ存在し、細胞は肉眼では見ることができないので、ガラスの間違った面を調製し、高価または希少な材料を浪費することにつながる。さらに、ガラスは、操作に必要なピンセットにより容易に損傷される細胞で覆われている。一般的な問題は、ガラスが多数の調製ステップの１つの間に破損されることであり、これは試料の変形、試料および材料の浪費ならびに試料の汚染につながる。加えて、ガラスの過剰な操作は、実験の反復を必要とし得る試料の識別ミスをもたらす可能性があり、さらに悪い場合は間違った結果をもたらす可能性がある。

２．ガラススリップの載置：
スライド上のガラススリップの配置、サイズおよび分布は実質的にランダムであり、載置されたスリップを見つけるための自動スキャンの選択肢は、スライド全体をスキャンするほかにはない。さらに、ガラススリップの両側に密封剤が存在することがあり、該密封剤は要素の数に応じてさまざまな厚みであり得るので、その場合、１つの載置ガラススリップからもう１つへ自動的に移行する選択肢は、高さの違いがあるので限定される。多くの場合、スライド上には複数のガラススリップが載置されている。封入剤の添加およびカバーガラスの載置は手作業で行われるので、これらのスリップは普通焦点面が異なり、使用者が各ガラススリップ領域に対して再度焦点合わせすることを要求される。顕微鏡における最も大きな問題は、焦点面を見つけることなので、このことは失敗およびスライドの破損につながる。

３．材料の選択：
ＩＣＣの最も一般的な問題の１つは、材料の選択である。高開口数レンズは、単一のガラスの厚みに対して特別に設計されている。無数の封入剤の選択があり、利用可能な選択の多くはイメージング不足をもたらす。試料（例えば細胞）と検出器（例えばカメラ）との間のすべてが、試料から得ことができるコントラストおよび解像度に影響を与える。ガラスの厚みが正しくないと、球面収差および軸上色収差につながる。間違った封入剤は、多数の収差、高いバックグラウンドおよびコントラスト不足につながる。

４．顕微鏡、シーン選択および試料バイアス：
顕微鏡を使用することのうち最も困難な部分の１つは、焦点面を見つけることである。このことは希薄な試料に対して特に困難であるが、密集した試料であっても悩ましいことがあり得る。「熟練した」顕微鏡学者であっても、時としてスライドを上下反対に載置し、焦点面を見つけようと長い時間を費やし、結局その後問題を認識することがある。ほぼすべての使用者が知らぬうちに誤りを犯すおそれがあるのは、選択バイアスに関する問題である。顕微鏡学者は通常、細胞の目視検査に基づきどの細胞をイメージングするか選択する。このことは、「良好な細胞」の定義に基づく使用者のバイアスにつながる。このバイアスは意識下であり、回避が困難である。さらに、「良好な細胞」は主観的なので、他者が実験を反復することを困難にする。収集された画像が明確な画像分析に移送されたとしても、この選択バイアスは存在する。科学者はシーンまたは細胞の選択に先入観を持ってはならないが、そのような事例は稀である。このことは疑わしい結果を導き、他者が再現できない問題のある論文となる。

米国特許第７９１９３１９号明細書は、培養細胞のサイズに相当する距離の間隔を空けた、したがって、顕微鏡により経時的に観察可能な細胞の単層を提供する、２つの透明板の間の細胞培養を開示している。大部分の細胞は平面アレイではなく、塊で成長することが最良であり、細胞老廃物を洗い流すことができなくなるので、この技術は細胞培養に対してゆがんだ環境を提供する。細胞が妨害されることは意図されておらず、上記の洗浄および染色ステップに問題が生じるので、上記の技術はＩＣＣへの使用には不向きである。

米国特許出願公開第２０１３／２５２８４７号明細書

本発明者らは、上記の問題に対処する顕微鏡スライドを考案した。本発明は、請求項１に従属する請求項により定義される好ましい特徴を有する、請求項１に記載の顕微鏡スライドを提供する。本発明はさらに、請求項６およびこれに従属する請求項により定義される方法も提供する。

本発明は、本明細書において明確に述べられているかどうかにかかわらず、本明細書に開示の特色の任意の組み合わせにまで拡がる。さらに、２以上の特色が組み合わせて述べられる場合、このような特色は、本発明の範囲を拡げることなく、個別に特許請求され得ることが意図される。

本発明は多数の方法で実行でき、その例示的実施形態を、図面を参照しながら下記に記載する。

顕微鏡スライドの平面図を示す。 図１の線ＩＩ−ＩＩに沿った、使用時のスライドの断面図を示す。

本発明ならびにその目的および有利性は、下記の説明を添付の図面と併せて参照することによってより理解を深められると考えられ、図面において同様の参照番号は図中の同様の要素を特定するものである。

図１および２を参照すると、光学的に透明なおおむね平坦な基板２０、この場合ホウケイ酸ガラスを備える顕微鏡スライド１０を示し、該基板は、対向する上面２７および下面２８ならびにプラスチック成形外周フレーム４０を有する。該フレームの外法は、ＡＮＳＩ／ＳＢＳ１−２００４および２−２００４の基準に合わせる。基板は概して、０．１６５ｍｍから０．１７５ｍｍ、好ましくは０．１７ｍｍの均一な厚さを有する。基板は、公知の技術に従って細胞を成長させ、染色が実行される細胞培養領域２２を含む。この実施形態において、２つの直径１３ｍｍの円形領域が例示されるが、１領域だけを利用しても、またはそれ以上の領域を使用してもよく、例えば最大３０，０００マイクロの領域を使用することができる。この領域は、領域２２を除くすべての範囲において、基板に適用された疎水性材料２４により互いに分離される。マイクロ領域に関して、疎水性材料は、ドットマトリックスプリンターまたは同様の技術により適用することができる。水性の液体は疎水性領域２４を回避し、細胞は疎水性領域を超えることはないので、疎水性材料２４は、ウェルを互いから分離するために機能する。これら培養領域２２は場合により、α−ポリリジンまたは細胞をガラスに付着させる他の市販の材料でコーティングされる。さらに、固有の識別子２６が基板上に配置される。この場合、該識別子はバーコードストリップであり、スライド１０が載置された顕微鏡によるものを含む、任意選択の手段により読み取ることができる。基板は、この実施形態においてフレームの一隅に配置され、３つの隆起したディンプルにより形成される整合表示４８をさらに備える。この表示は、スライド１０を顕微鏡に対して正しい方向にさせ、必要に応じて顕微鏡により読み取ることが可能である。

外周フレーム４０は基板２０をその場に保持し、連続的に平坦な上面４２および下面４４を有する。本明細書において「連続的に平坦な表面」は基板の周りの一平面において破断されない外周を画定する表面を意味する。表面４２および４４は、概して互いに平行である。下面４４は、基板の下面２８がフレームの下面４４と同一平面で置かれるように、ガラス基板２０とぴったりと合う凹んだ窓４６を備える。フレームの上面４２は基板２０の上面２７より高く、初期使用において細胞培養培地が含有されるウェル３２を提供する。

使用において、細胞を含有する培地は領域２２の一方または両方に配置され、蓋（図示せず）はスライド１０の上に配置され、該スライドはインキュベーター（図示せず）内に配置される。数時間後、細胞が領域内の基板２０上に定着し、広がり、基板表面に付着する。長期培養のために、細胞を含有する培地を、約８時間後に取り除き、ウェル３２をさらなる培地であふれさせてもよい。細胞は疎水性材料２４を避け、したがって、ウェル３２をあふれさせてもウェルの間の細胞の混合は起こらない。この技術は、細胞の成長、固定、洗浄およびＩＣＣプロトコル全体を非常に単純化する。

使用者がＩＣＣを開始する用意がある場合、培地を領域２２またはウェル３２から取り除き、（１３ｍｍの領域に対して）およそ１００μｌの市販の固定液を各領域２２に加える。さらに従来型のＩＣＣ洗浄、インキュベーション、洗浄、インキュベーション、洗浄のステップを、公知の技術に従って実施するが、従来の技術にあるような壊れやすいガラススリップを扱う必要はない。目的のタンパク質は、標識された抗体を使用して公知の技術に従って染色される。ＩＣＣステップの完了において、およそ５μｌの従来の封入剤を各領域２２に添加し、密封用スライド５０をフレームの上面４２の上に配置する。これは領域を脱水および接触損から保護する。

スライド１０ならびに密封用スライド５０（組み立てられたスライド）は顕微鏡系に配置される。実践において、整合表示を読みとり、顕微鏡載物台と組み立てたスライドとを整合させ、バーコード識別子２６を該系により読みとり、スライドの同一性を決定し、それによってその内容物を決定する。バーコードと公知のスライドのリストとの相互参照により、領域２２の位置が容易に決定可能である。さらに、バーコードは特定のスライドを独自に定義する識別子を備える。この方法において、イメージングされる特定の試料について曖昧さはなく、スライドそれ自体の上の手書きの識別子の必要が取り除かれる。浸漬油５２をスライドに適用し、該スライドを、必要に応じて、後続のより高い解像度のイメージングのために、高開口数の４×対物レンズ５４を使用してスキャンする。

上記のスライド１０およびその使用は、試料を含有するスライド、特に多数のスライド調製ステップが必要なＩＣＣ実験の間の免疫蛍光法のためのスライドの調製および使用の容易さを大幅に増す。外周プラスチックフレーム４０の使用は、必要に応じてスライド１０の自動操作を可能にし、該フレームは、顕微鏡によるスキャニング手順の自動化を支援する用に構成される。例えば、スライド１０は完全に平坦な下面２８／４４を有し、これにより対物レンズ（例えばレンズ５４）は任意の突出物にぶつかるリスクなしにその表面をスキャンできる。固有の識別子を使用することにより、誤操作を減らし、一貫した自動イメージング場所を提供する。

１つの実施形態だけを記載および例示してきたが、特許請求する発明の範囲から逸脱することなくそれらの実施形態に対する付加、省略および改良が可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、好ましい基板２０はガラスであるが、他の透明材料、例えばプラスチックを用いてもよい。フレーム４０はプラスチックで形成されることがむしろ好ましいが、これは熱可塑性および熱硬化性プラスチックを含む。繊維強化が企図される。ウェル３２の好ましい深さは、細胞培養培地の正しい容積を受容するサイズの約２から６ｍｍ、より好ましくは３から５ｍｍであるが、さまざまな必要性に合わせてより浅いまたはより深いウェルも使用することができる。

バーコード２６を記載したが、他の識別手段も使用可能であり、その調製の進行およびその後に取り組む任意のイメージング結果を記録するために、例えばＲＦＩＤ装置を識別データおよび他のデータをスライドに自動的に書き込むために使用できる。

スライド１０は、イメージングの際に上から見るように図２と比較して反転されてもよい。その場合、上、下などの用語はそれに応じて理解すべきであり、図２に示すスライド１０の配向に限定される意図のものではない。

１０ 顕微鏡スライド
２０ ガラス基板
２２ 細胞培養領域
２４ 疎水性材料、疎水性領域
２６ バーコード識別子、バーコード
２７ 基板の上面
２８ 基板の下面
３２ ウェル
４０ プラスチック成形外周フレーム、外周プラスチックフレーム
４２ フレームの上面、表面
４４ フレームの下面、表面
４６ 凹んだ窓
４８ 整合表示
５０ 密封用スライド
５２ 浸漬油
５４ 対物レンズ

Claims (12)

1. 対向する基板上面および下面（２７、２８）を備える光学的に透明で平坦な基板（２０）、および
   前記基板（２０）を囲む、フレーム下面（４４）およびフレーム上面（４２）を有する外周フレーム（４０）を備え、
   前記フレーム下面（４４）と前記基板下面（２８）とは同一平面であり、
   前記フレーム上面（４２）は前記基板上面（２７）より上にあって、単一のウェル（３２）を形成し、
   前記フレーム上面および下面（４２、４４）は平行であり、ならびに
   前記基板上面（２７）が、疎水性材料で覆われた疎水性領域（２４）と、前記疎水性領域（２４）で水平方向においてのみ囲まれ、疎水性材料を含まない、１つまたは複数の細胞培養領域（２２）と、を有する、
   細胞培養用顕微鏡スライド（１０）。
2. 機械により読み取り可能なスライド識別子（２６）をさらに備える、請求項１に記載の細胞培養用顕微鏡スライド（１０）。
3. 前記外周フレーム（４０）の一隅に配置された、光学的な機械により読み取り可能な整合表示（４８）をさらに備えた、請求項１に記載の細胞培養用顕微鏡スライド（１０）。
4. 前記基板（２０）がガラスであり、０．１６５ｍｍから０．１７５ｍｍの均一な厚さを有する、請求項１に記載の細胞培養用顕微鏡スライド（１０）。
5. フレームの上面および下面（４２、４４）が連続的に平坦である、請求項１に記載の細胞培養用顕微鏡スライド（１０）。
6. ａ）対向する基板上面および下面（２７、２８）を備える光学的に透明な平坦な支持表面（２０）および基板（２０）を囲む、フレーム下面（４４）およびフレーム上面（４２）を有する外周フレーム（４０）、を備え、
   前記フレーム下面（４４）と前記基板下面（２８）とは同一平面であり、
   前記フレーム上面（４２）は前記基板上面（２７）より上にあって、単一のウェル（３２）を形成し、
   前記フレーム上面および下面（４２、４４）は連続的に平坦であり平行であり、ならびに
   前記基板上面（２７）が、疎水性材料で覆われた疎水性領域（２４）と、前記疎水性領域に水平方向においてのみ囲まれ、疎水性材料を含まない、１つまたは複数の細胞培養領域（２２）と、を有する、
   という特色を備える細胞培養用顕微鏡スライド（１０）を提供するステップ、
   ｂ）細胞を、基板上面の前記細胞培養領域（２２）に播種するステップ、および
   ｃ）前記細胞を、前記細胞培養領域（２２）に付着させるステップ、
   ｄ）前記播種された細胞をインキュベートするステップ、
   ｅ）前記基板上面（２７）を洗浄するステップ、
   ｆ）少なくとも１種の抗体を前記細胞培養領域（２２）に適用して、前記細胞培養領域（２２）を染色するステップ、ならびに
   ｇ）前記細胞培養領域（２２）を、前記基板（２０）を通して観察またはイメージングするステップ、
   を含む、顕微鏡スライド（１０）の調製方法。
7. ステップｄ）およびｅ）がステップｆ）の前に少なくとも１回反復される、請求項６に記載の方法。
8. 少なくともインキュベーションの間に、ウェル（３２）を細胞培養培地であふれさせるステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
9. 前記細胞培養領域（２２）の位置を、機械により読み取り可能なスライド識別子（２６）により決定させる、請求項６に記載の方法。
10. 機械により読み取り可能なスライド識別子（２６）により決定された細胞培養領域（２２）の位置を使用して、イメージング機器（例えば、顕微鏡）を観察またはイメージングのための１または複数の目的の領域に向かわせる、請求項９に記載の方法。
11. 前記スライド識別子（２６）が、生物学的材料、化学処理、治療的処置（薬剤）、処理過程（抗体、化学標識など）の１または複数に関するデータを含むデータ蓄積と通信して、前記顕微鏡スライド（１０）に実施される処理ステップの記録を可能にする、請求項９に記載の方法。
12. 前記スライド識別子（２６）が、画像および画像分析の決められた方法から派生するデータの識別および前記画像および派生データが得られた細胞培養領域（２２）を識別することを可能にする、請求項１１に記載の方法。

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