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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur scannenden Mikroskopie einer Probe, wobei zwischen einem Probenträger und einem Mikroskopobjektiv ein Immersionsmedium verwendet wird, das eine Oberfläche des Probenträger benetzt, und zur Abbildung das Mikroskopobjektiv über die Oberfläche des Probenträger relativverschoben wird. Die Erfindung bezieht sich weiter auf einen Probenträger oder ein Deckglas zur scannenden Mikroskopie einer auf dem Probenträger oder unter dem Deckglas anzuordnenden Probe.
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In der Mikroskopie bietet der Einsatz von Immersionsobjektiven zahlreiche Vorteile, die sich letztendlich aus den höheren, erzielbaren Aperturen der Objektive ergeben. Ein Immersionsmedium mit einem möglichst hohen Brechungsindex, der die des Deckglases der Probe nicht überschreitet, maximiert die Apertur bei der Mikroskopie. Je nach Art der Probe, werden verschiedene Immersionsmedien verwendet, darunter auch organische Ersatzmedien für Wasser, z.B. Carl Zeiss Immersol W und Immersol G. Die Immersionsmedien sind bei gebräuchlicher Temperatur in der Regel flüssig. Bei der Mikroskopie an lebenden Zellen, die sich in wässriger Umgebung befinden, werden wasserbasierte Immersionsmedien verwendet. Da dort der Brechungsindex von Immersionsmedium und Probenmedium sehr ähnlich ist, das Deckglas jedoch in der Regel einen abweichenden Brechungsindex hat, ist eine optische Korrektur erforderlich, um sphärische Aberrationen beim tieferen Eindringen in die Probe zu vermeiden. Diese Korrektur gilt jedoch nur für eine bestimmte Deckglasdicke und -art, weshalb Wasserimmersionsobjektive in der Regel eine Korrekturmechanik haben, die Abweichungen von der Deckglasdicke und -art, welche der Korrektur zugrunde gelegt wurde, durch Verschieben einer Linse oder Linsengruppe im Objektiv korrigiert.
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Im Stand der Technik sind verschiedene Ansätze bekannt, um ein möglichst vollständiges Benetzen einer Frontlinse eines Mikroskopobjektivs mit einem Immersionsmedium zu sichern. Die
EP 1717628 A1 und
EP 2256535 A1 offenbaren einen Mechanismus für inverse Mikroskopobjektive, also Mikroskopobjektive, die eine Probe von unten mikroskopieren. Am frontseitigen Rand der Objektivhülle ist ein Mechanismus vorgesehen, welcher verhindert, dass ein auf die Frontlinse aufgesetzter Tropfen an Immersionsflüssigkeit über den frontseitigen Rand der Objektivhülle abläuft. Zudem sind Abflussschläuche vorgesehen, die Immersionsflüssigkeit gezielt nach unten ableiten. Eine innere Zone des Randes ist abstoßend für die Immersionsflüssigkeit ausgestaltet, für die das Mikroskop ausgelegt ist. Eine umgebende äußere Zone ist genau gegensätzlich ausgestaltet, so dass sie Immersionsflüssigkeit, die auf sie gelangt ist, nach außen ableitet. Die
JP 4603295 diskutiert unter Bezugnahme auf weitere Veröffentlichungen verschiedene Konzepte, die ein Verschmutzen des Objektivinneren mit Immersionsflüssigkeit vermeiden. Zwei der darin geschilderten Lösungen entsprechen denen der genannten EP-Schriften. Eine dritte Lösung, die in der japanischen Veröffentlichung geschildert wird, sieht eine Nut am Objektiv vor, die verhindert, dass überschüssige Immersionsflüssigkeit in das Objektiv läuft. Weiter schlägt die
JP 4603295 für ein ölimmersionsbasiertes Mikroskop eine lipophile Beschichtung auf der Linsenoberfläche umgeben von einer lipophoben Beschichtung am Rand der Linsenoberfläche vor. Der Stand der Technik befasst sich also in verschiedenen Ansätzen damit, eine Verschmutzung eines Objektivs mit Immersionsflüssigkeit zu vermeiden bzw. überschüssige Immersionsflüssigkeit gezielt abzuleiten.
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Die
US 2015/0241682 A1 sieht elastomere Immersionsmedien vor. Es handelt sich dabei um formfeste, aber elastisch verformbare Kunststoffe oder Polymere, deren Glasübergangspunkt sich unterhalb der Einsatztemperatur befindet. Solche elastomeren Immersionsmedien können sich bei Zug- und Druckbelastung elastisch verformen, finden danach aber wieder ihre ursprüngliche unverformte Gestalt zurück.
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Bei der Anwendung von Immersionsmedien stellen sich besonders bei der scannenden Mikroskopie Schwierigkeiten ein. Die Verfahrgeschwindigkeit, mit der das Objektiv über die Probe verschoben werden kann, ist dadurch begrenzt, dass bei zu hohen Bewegungsgeschwindigkeiten Scherkräfte auftreten, welche zum Abreißen des Immersionsfilms oder zum unzulässigen Verformen eines elastomeren Immersionsmediums führen können. Bei einem elastomeren Immersionsmedium kann auch mitunter eine zu hohe Scherkraft das Deckglas verschieben und so zu einer Zerstörung der Probe führen. Auch ein nicht vollständig fixierter Probenhalter kann auf diese Weise deplatziert werden, was ein erneutes Anfahren definierter Koordinaten in der Probe unmöglich machen würde. Diesen Problemen kann nur dadurch entgegengewirkt werden, dass zu Beginn des Mikroskopieprozesses ein Übermaß an Immersionsmedium eingesetzt wird, um es auszugleichen, dass durch die Verfahrgeschwindigkeit und die daraus resultierenden Scherkräfte Immersionsmedium verlorengeht oder sich so verformt, dass Teile des Strahlengangs ohne Immersionsmedium sind. Dadurch verschmutzt aber die Probe durch das Immersionsmedium und der Immersionsmediumverbrauch ist mitunter recht hoch, was kostenträchtig ist.
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Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur scannenden Immersionsmikroskopie der eingangs genannten Art anzugeben, bei dem die genannte Problematik der Scangeschwindigkeit und des Immersionsmediumverbrauchs behoben ist.
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Die Erfindung ist in den unabhängigen Ansprüchen definiert. Die abhängigen Ansprüche definieren bevorzugte Ausgestaltungen.
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Bei der scannenden Immersionsmikroskopie wird die Oberfläche des Probenträgers oder des Deckglases, über welche das mit dem Immersionsmedium benetzte Immersionsobjektiv relativverschoben wird, so ausgestaltet, dass sie das Immersionsmedium abstößt, z.B. durch eine abstoßende Behandlung, insbesondere Beschichtung. Auf diese Weise wirken sehr viel geringere Scherkräfte im Immersionsmedium. Bei einer Immersionsflüssigkeit wird die Oberfläche nicht mit Immersionsflüssigkeit verschmiert. Ein einmal aufgebrachter Tropfen bleibt am Objektiv, da er aufgrund der abstoßenden Eigenschaften nicht an der Oberfläche des Probenträgers oder Deckglases anhaftet oder dort verschmiert. Eine Elastomerimmersion wird sehr viel weniger oder gar nicht verzerrt, so dass im Ergebnis durch die immersionsabweisende Beschichtung der Oberfläche die Relativgeschwindigkeit zwischen Mikroskopobjektiv und Probenträger/Deckglas erhöht werden kann und zugleich die Verschmutzungsproblematik verringert ist. Dabei hat sich überraschend gezeigt, dass eine an und für sich auf den ersten Blick nachteilige Beschichtung des Probenträgers/Deckglases mit immersionsabstoßenden Eigenschaften zu einer hohen Qualität bei der Mikroskopie führt, da das Immersionsmedium zuverlässig im Spalt zwischen Mikroskopobjektiv und Probenträger/Deckglas und vor der Frontlinse des Mikroskopobjektivs konzentriert bleibt.
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Der Begriff der Behandlung der Oberfläche stellt darauf ab, dass diese die gewünschten abstoßenden Eigenschaften erhält. Bei der Behandlung kann es sich um eine Beschichtung handeln. Solche ist bevorzugt und wird nachfolgend rein beispielhalber beschrieben. Gleichermaßen ist es aber auch möglich, in die Oberfläche eine Struktur einzubringen, welche die abstoßenden Eigenschaften erzeugt, oder die Oberfläche anderweitig, beispielsweise chemisch, zu behandeln, um die abstoßenden Eigenschaften zu erhalten.
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Für die Mikroskopie wird ein Probenträger oder ein Deckglas bereitgestellt, dessen eine Oberfläche entsprechend behandelt ist. Die Begriffe „Probenträger“ und „Deckglas“ sind hierbei breit aufzufassen und umfassen insbesondere Membranen oder andere Probenbegrenzungselemente. Soweit nachfolgend vom Probenträger oder Deckglas gesprochen ist, sind solche Elemente mitumfasst. Je nach Anwendungsfall sind auch beidseitige abstoßende Eigenschaften möglich, nämlich dann, wenn sie das Aufbringen der Probensubstanz auf der gegenüberliegenden Seite nicht stören. Bei einer nur einseitigen Abstoßung kann es bevorzugt sein, eine Markierung anzubringen, welche die abstoßende Seite erkennen lässt. Die Markierung kann entweder auf der abstoßende Seite oder gegenüberliegend angebracht werden; sie dient letztlich nur zur Unterscheidung zwischen den beiden Seiten, insbesondere in Fällen, in denen die Abstoßung selbst optisch nicht erkennbar ist.
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Besonders bevorzugt ist eine omniphobe Abstoßung, also eine Oberflächeneigenschaft, die sowohl hydrophob als auch lipophob ist. Dann ist der Probenträger/das Deckglas für Ölimmersionsmikroskopie gleichermaßen geeignet wie für Wasserimmersionsmikroskopie.
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Die abstoßende Behandlung des Probenträgers oder Deckglases erlaubt es, das Immersionsobjektiv so von der Probe zu entfernen, dass möglichst keine Immersionsflüssigkeit am Probenträger/Deckglas verbleibt. Hierbei gibt es verschiedene Möglichkeiten. Zum einen kann man das Objektiv einfach von der Oberfläche des Probenträgers/Deckglases entfernen. Dabei wird der Abstand zwischen Objektiv und behandelter Oberfläche erhöht, bis durch die abstoßenden Eigenschaften der Oberfläche des Probenträgers/Deckglases die Immersionsflüssigkeit möglichst vollständig am Objektiv verbleibt. Alternativ oder ergänzend kann das Objektiv lateral verschoben werden, bis es über den Rand des Probenträgers/Deckglases bewegt wurde. Auf diese Weise wird die Immersionsflüssigkeit ebenfalls so manipuliert, dass sie am Objektiv verbleibt und nicht am Probenträger/Deckglas. Dieses Vorgehen hat den Vorteil, dass ein Wechsel zwischen einem Objektiv mit Immersion und einem, beispielsweise als Übersichtsobjektiv ausgebildeten Objektiv ohne Immersion problemlos möglich ist, ohne dass sich das Bild verschlechtert. Dadurch, dass nach dem Entfernen des Immersionsobjektivs keine Immersionsflüssigkeit auf der Oberfläche verbleibt, entstehen auch keine Störungen für das immersionsfreie Objektiv, beispielsweise das Übersichtsobjektiv.
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Die vorgesehenen Maßnahmen sind bei einem inversen Mikroskop möglich, gleichermaßen aber auch in der aufrechten Mikroskopie oder für die Lichtblattmikroskopie.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung einsetzbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen, die ebenfalls erfindungswesentliche Merkmale offenbaren, noch näher erläutert. Diese Ausführungsbeispiele dienen lediglich der Veranschaulichung und sind nicht als einschränkend auszulegen. Beispielsweise ist eine Beschreibung eines Ausführungsbeispiels mit einer Vielzahl von Elementen oder Komponenten nicht dahingehend auszulegen, dass alle diese Elemente oder Komponenten zur Implementierung notwendig sind. Vielmehr können andere Ausführungsbeispiele auch alternative Elemente und Komponenten, weniger Elemente oder Komponenten oder zusätzliche Elemente oder Komponenten enthalten. Elemente oder Komponenten verschiedener Ausführungsbespiele können miteinander kombiniert werden, sofern nichts anderes angegeben ist. Modifikationen und Abwandlungen, welche für eines der Ausführungsbeispiele beschrieben werden, können auch auf andere Ausführungsbeispiele anwendbar sein. Zur Vermeidung von Wiederholungen werden gleiche oder einander entsprechende Elemente in verschiedenen Figuren mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet und nicht mehrmals erläutert. In den Figuren zeigen:
- 1 eine Schemadarstellung eines inversen Mikroskops,
- 2 eine Ausschnittsvergrößerung der Darstellung der 1,
- 3 die Verhältnisse eines Mikroskops mit Elastomerimmersionsmedium bei der aufrechten Mikroskopie, und
- 4A-4B verschiedene Möglichkeiten, eine Beschichtung auf einen Probenträger oder ein Deckglas aufzubringen.
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1 zeigt schematisch ein Mikroskop 1, das einen Objektivrevolver 2 in einer Basis eines Stativs 3 aufweist. Am Stativ 3 befindet sich weiter ein Probentisch 4, auf dem eine Probe 5 angeordnet ist. Eine Beleuchtungseinrichtung beleuchtet die Probe 5 von oben, ein im Objektivrevolver 2 gehaltenes Objektiv 7 bildet die beleuchtete Probe 5 von deren, dem Objektiv zugewandten Oberfläche 6 (vgl. 2) ab.
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2 zeigt vergrößert die Verhältnisse zwischen dem Objektiv 7 und der Probe 5, die aus einem Probenträger 5a, hier eine Petrischale, mit aufliegender Probensubstanz 5b besteht.
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Das Objektiv 7 umfasst eine Frontlinse 8, auf die eine Immersionsflüssigkeit 9 aufgebracht ist. Die Immersionsflüssigkeit wird je nach Anwendung, d.h. Probe, geeignet gewählt. In der Regel ist das Objektiv 7 auf eine bestimmte Immersionsflüssigkeit hin ausgelegt. Die Immersionsflüssigkeit 9 befindet sich in einem Spalt zwischen dem Probenträger 5a und der Frontlinse 8 des Objektivs 7. Objektiv 7 und Probenträger 5a werden relativ zueinander verschoben, was in 2 durch einen Pfeil 11 veranschaulicht ist. In diesem Ausführungsbeispiel wird das Objektiv 7 verschoben. Gleichermaßen ist es möglich, den Probenträger 5a zu bewegen oder beide. Auch kann das Objektiv 7 die Probe 5b über ein Deckglas abbilden. Damit die Immersionsflüssigkeit 9 sich nicht während der Verschiebung längs des Pfeiles 11 am Probenträger 5a verschmiert und so aus dem Spalt zwischen Frontlinse 8 und Probenträger 5a verloren geht, ist die dem Objektiv 7 zugewandte Oberfläche 6 des Probenträgers 5a mit einer Beschichtung 10 versehen, die für das Immersionsmedium 9 abstoßend wirkt. Ist das Immersionsmedium 9 wasserbasiert, kann beispielsweise eine hydrophobe Beschichtung 10 verwendet werden. Bei ölbasierten Immersionsflüssigkeiten kann eine lipophobe Beschichtung 10 zum Einsatz kommen. Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform, bei der eine omniphobe Beschichtung 10 eingesetzt wird - also eine Beschichtung, die sowohl lipophob als auch hydrophob ist. Eine solche Beschichtung ist für alle möglichen Arten von Probenträgern 5a geeignet, z.B. auch für eine Membran oder ein Probenaufnahmegefäß. Um zu erkennen, welche die Oberfläche 6 ist, die mit der Beschichtung 10 versehen ist, hat der Probenträger 5a, wenn er symmetrisch ausgebildet ist, z.B. als Glasträger, optional eine Markierung 13, die in der in 2 dargestellten Ausführungsform auf die Beschichtung 10 aufgebracht ist und erkennen lässt, welche die beschichtete Oberfläche ist. Dies hat den Vorteil, dass die Beschichtung 10 einseitig ist und nicht auf der Oberfläche des Probenträgers 5a angeordnet ist, auf der die Probensubstanz 5b liegt. Eine Wechselwirkung der Beschichtung 10 mit der Probensubstanz 5b ist damit ausgeschlossen. Sie wäre in der Regel nachteilig, da die Art der Immersionsflüssigkeit in der Regel der Art der Probensubstanz 5b gleicht. Für wässrige Proben 5b oder in wässrigen Medien gelagerte Proben 5b benötigt man ein wasserbasiertes Immersionsmedium 9. Die Beschichtung 10 ist dann mindestens hydrophob (oder omniphob) und würde bei beidseitigem Auftrag auf den Probenträger 5a/das Deckglas auch die wässrige Probe 5b abstoßen. Analoges gilt für eine ölhaltige Probe 5b.
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Die Beschichtung 10 hat die Wirkung, dass die Immersionsflüssigkeit 9 an der Oberfläche 6, auf der die Beschichtung 10 angebracht ist, abgestoßen wird. 2 verdeutlicht dies durch einen Kontaktwinkel α von über 90° (in der Figur ist der Gegenwinkel 180° - α eingetragen).
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3 zeigt die Verhältnisse im Falle eines aufrechten Mikroskops, wobei zusätzlich als Immersionsmedium eine elastomere Immersion eingesetzt wird. Die Probe 5b ist hier mit einem Deckglas 5c abgedeckt, dessen zum Objektiv 7 weisende Oberfläche 6 ebenfalls mit der Beschichtung 10 versehen ist, die in diesem Ausführungsbeispiel omniphob ist. Durch diese Beschichtung wird verhindert, dass sich bei der Relativverschiebung längs des Pfeiles 11 die elastomere Immersion so verformt, wie dies durch die gestrichelte Form 12' angedeutet ist. Eine solche Verformung würde eintreten, wenn die abstoßende Beschichtung 10 fehlen würde. Exemplarisch ist auch hier gezeigt, dass die Markierung 13 nicht nur auf die Beschichtung 10 aufgebracht werden sein kann, sondern auch in der Beschichtung 10 vorgesehen sein kann. Gleichermaßen ist es möglich, die Markierung 13 auf der gegenüberliegenden Seite vorzusehen. Wichtig ist bloß, dass man anhand der Markierung 13 erkennen kann, auf welcher Seite die nur einseitig vorgesehene Beschichtung 10 angebracht ist.
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Die bei der Mikroskopie verwendete Beschichtung 10 kann, wie in den 2 und 3 gezeigt, bereits auf dem Probenträger oder dem Deckglas vorgehalten sein. Es ist in Ausführungsformen gleichermaßen möglich, die Beschichtung erst im Rahmen der Herstellung des Präparates, welches mikroskopiert wird, aufzubringen. Die 4A und 4B zeigen Möglichkeiten hierfür. In 4A wird die Beschichtung 10 aus der Flüssigphase mit einem Applikator 14 aufgetragen, der eine mit einer flüssigen Substanz benetzte Walze 15 aufweist, wobei die Substanz nach dem Auftrag die Beschichtung 10 bildet. Der Applikator 14 wird längs des Pfeiles 16 so über die Oberfläche 6 des Deckglases 5c oder des Probenträgers 5a geführt, das die Walze 15 über die Oberfläche 6 rollt und dabei die Beschichtung 10 aufbringt. Die Walze 15 wird im Applikator 14 ständig mit der Substanz benetzt.
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4B zeigt einen Applikator 14, der in Art eines Filzstiftes ausgebildet ist. Über ein Auftragelement 17, das aus einem im Applikator 14 vorgesehenen Tank gespeist wird, wird die Beschichtung 10 auf die Oberfläche 6 des Deckglases 5c aufgebracht.
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Es ist in Ausführungsformen des Mikroskopieverfahrens somit vorgesehen, zuerst die Probe 5a auf einen Probenträger 5a aufzubringen, gegebenenfalls mit einem Deckglas 5c abzudecken, und dann diejenige Oberfläche 6, welche später dem Mikroskopobjektiv 7 gegenüberliegen wird, mit der Beschichtung 10 zu versehen. Die Applikatoren der 4A und 4B sind hierfür einige von mehreren Möglichkeiten. Eine weitere Möglichkeit wäre das Aufsprühen einer Substanz, welche die Beschichtung 10 bildet, das Aufbringen mit einem Beschichtungstuch etc.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- EP 1717628 A1 [0003]
- EP 2256535 A1 [0003]
- JP 4603295 [0003]
- US 2015/0241682 A1 [0004]
