JP6252043B2 - 培地充填方法 - Google Patents

Description

本発明は、培地充填方法に関し、例えば受精卵などの細胞を培養するための培養容器に培地を充填する方法に関するものである。

従来から、家畜領域のみならずヒトの不妊医療などにおいて、培養系で精子と卵子とを体外受精させて受精卵（接合子）を作製し、さらに受精卵を卵割、桑実胚、胚盤胞の段階を経て、透明帯から孵化した脱出胚盤胞の段階まで培養することが可能となり、この卵割から胚盤胞の段階にある受精卵を子宮に移植して産子を得る補助的生殖技術（ＡＲＴ）が確立されている。

上記した受精卵の培養方法としては、培養容器上のウェル内に５００μＬ程度の培養液を入れ、該培養液中で受精卵を培養する方法、培養容器上のウェル内に２０μＬ程度の微小滴を載せ、該微小滴の表面をミネラルオイルで被覆し、その中に受精卵を入れる方法などが知られている。また、近年では、培養容器上に複数の窪みを設け、それぞれの窪みごとに受精卵を導入して培養することにより受精卵を個別に管理する方法なども適用されている。

ところで、培養容器上に複数の窪みを設け、それぞれの窪みごとに受精卵を導入して培養する場合、培養容器への培地の導入に際して前記窪みに気泡が残存する可能性があることが知られている。特に、培養容器がポリスチレン等の疎水性の高い材料から形成されている場合や表面張力が高い培地を使用する場合には、前記窪みに気泡が残存し易くなることが本発明者等により確認されている。培養容器への培地の導入に際して前記窪みに気泡が残存すると、培養環境の変化や、気泡との接触による細胞のダメージ、雑菌による汚染リスクなど細胞への影響が懸念されること、その窪みにおいて細胞を培養できなくなることから、前記窪みに存在する気泡を確実に除去し得る技術の開発が望まれている。

このような要請に対し、特許文献１には、プレートを振る方法、プレートの一方の面から真空に引く方法、静電気の力を利用する方法、浮力によって空気が置き換えられるようにプレートを傾ける方法などが開示されている。また、特許文献２には、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を用いる方法、細胞の接着を促すタンパク質であるコラーゲン等を塗布する方法が開示されている。さらに、特許文献３には、真空ポンプを利用して減圧する方法が開示されている。

特開２００９−９６９９２号公報 特開２００７−２２８８１８号公報 特許第４１４８３６７号公報

特許文献１に開示されている技術によれば、内面が親水性になるように化学的な処理が施された貫通穴の中にある空気を液体で置き換えることできる。しかしながら、特許文献１には、気泡の除去がより難しいと考えられる凹状の窪みに残存する気泡を除去する方法については一切言及されていない。

また、特許文献２や特許文献３に開示されている技術によれば、マイクロウェルの微細な突起への気泡の付着を防止したり、マイクロウェル内の気泡を除去できるものの、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を施したり、コラーゲン等を塗布して細胞培養容器に有機膜や無機膜を形成したり、真空ポンプを使用して減圧する必要があり、培養容器へ培地を充填する工程が煩雑となるといった課題が生じ得る。また、低温プラズマ処理、コロナ放電処理、紫外線照射等を施したり、有機膜や無機膜を形成した細胞培養容器の表面特性が経年変化等により変化し、マイクロウェル内に気泡が残存し易くなるといった課題も生じ得る。

本発明は、前記課題に鑑みてなされたものであって、その目的とするところは、培養容器上に設けられた凹状の窪みに残存する気泡を簡単にかつ確実に除去することのできる培地充填方法を提供することにある。

上記する課題を解決するために、本発明者等は、鋭意研究の結果、培地が導入された培養容器を加振することによって、極めて容易に凹状の窪みに残存する気泡を除去し得ることを見出した。

すなわち、本発明の培地充填方法は、細胞を培養するための培養領域を画成する底面と側面とを有し、前記底面に凹部を有する細胞収容部が設けられている培養容器へ培地を充填する培地充填方法であって、前記培養容器の前記細胞収容部に培地を導入する培地導入工程と、前記培養容器を加振して前記細胞収容部の前記凹部に存在する気泡を除去する加振工程と、からなる方法である。

また、上記する培地充填方法は、前記加振工程において、前記培養容器を前記底面と直交する方向へ加振することが好ましく、前記培養容器の加振周波数が５ｋＨｚ以上かつ１ＭＨｚより小さいことが望ましい。

また、上記する培地充填方法は、前記加振工程に続いて、前記培養容器の温度を一定に保持する保温工程を含むことが好ましい。

本発明の培地充填方法によれば、凹部を有する細胞収容部に培地が導入された培養容器を加振することによって、凹部に存在する気泡を簡単にかつ確実に除去することができる。

本発明に係る培地充填方法の実施形態を説明するフロー図である。 本発明に係る培地充填方法で適用される培養容器の一例を示す図であって、（ａ）はその斜視図であり、（ｂ）は図２ａの培養容器の細胞収容部を拡大して示す拡大平面図であり、（ｃ）は図２ｂのＢ−Ｂ矢視図であり、（ｄ）はその縦断面図である。 図２で示す培養容器の蓋の一例を示す斜視図である。 加振工程で使用される加振装置の一例を示す図であって、（ａ）はその斜視図であり、（ｂ）はその本体部の上面図であり、（ｃ）はその本体部の側面図であり、（ｄ）はその本体部の一部を拡大して示す拡大断面図である。 実施例１の検査用試料による細胞収容部の凹部を撮像した撮像画像である。 実施例２の検査用試料による細胞収容部の凹部を撮像した撮像画像である。 加振周波数と気泡除去率の関係を示す図である。

以下、本発明に係る培地充填方法の実施形態を図面を参照して説明する。

図１は、本発明に係る培地充填方法の実施形態を示したものである。図示するように、本実施形態の培地充填方法は、主に、準備工程（Ｓ１１）と培地導入工程（Ｓ１２）とオイル導入工程（Ｓ１３）と加振工程（Ｓ１４）と保温工程（Ｓ１５）とから構成されている。

［準備工程］
本実施の形態の培地充填方法では、まず、細胞を培養するための培養容器を用意する（Ｓ１１）。

ここで、本発明の培地充填方法で適用される細胞は、個別管理が必要とされる細胞であり、培養中及び培養後において個々の細胞を特定する必要があるもの、すなわち複数の細胞を培養している培養容器において互いに混同してしまうことが望ましくない細胞である。個別管理が必要とされる細胞としては、例えば、受精卵、卵細胞、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）及びｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）等が挙げられる。卵細胞は、未受精の卵細胞をさし、未成熟卵母細胞及び成熟卵母細胞が含まれる。受精卵は、受精後、卵割により２細胞期、４細胞期、８細胞期と細胞数が増えていき、桑実胚を経て、胚盤胞へと発生する。受精卵には、２細胞胚、４細胞胚及び８細胞胚などの初期胚、桑実胚、胚盤胞（初期胚盤胞、拡張胚盤胞及び脱出胚盤胞を含む）が含まれる。胚盤胞は、胎盤を形成する潜在能力がある外部細胞と胚を形成する潜在能力がある内部細胞塊からなる胚を意味する。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から得られる未分化な多能性又は全能性細胞をさす。ｉＰＳ細胞は、体細胞（主に線維芽細胞）へ数種類の遺伝子（転写因子）を導入することにより、ＥＳ細胞に似た分化万能性を持たせた細胞をさす。すなわち、本発明において培養対象となる細胞には、受精卵や胚盤胞のように複数の細胞の集合体も包含される。本発明の培地充填方法は、好ましくは哺乳動物及び鳥類の細胞、特に哺乳動物の細胞の培養に好適である。哺乳動物は、温血脊椎動物をさし、例えば、ヒト及びサルなどの霊長類、マウス、ラット及びウサギなどの齧歯類、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ならびにウシ、ウマ及びブタなどの家畜等が挙げられる。

また、本発明の培地充填方法で適用される培養容器１０は、図２ａで示すように、略円板状の底部１と該底部１の外縁から立設する側壁２とを有し、底部１の上面（底面）１ａと側壁２の内周面（側面）２ａとから細胞を培養するための培養領域が画成されている。底部１の略中心には、細胞を収容するための凹部（マイクロウェルとも言う）４を有する細胞収容部３が設けられ、その細胞収容部３の周囲に内壁５が立設されている。なお、細胞収容部３の凹部４は、図２ｂで示すように、底部１の上面１ａに沿って５×５の正方格子状に２５個近接して設けられ、各凹部４は、略円形状の開口を有し、図２ｃで示すように、底部１の上面１ａに略垂直な側面４ａと上面１ａに略平行な底面４ｂとから形成されている。また、内壁５は、図２ｄで示すように、側壁２より高さが低く形成され、底部１に設けられた細胞収容部３と内壁５の内周面５ａとから培地を導入するための培地領域が画成されている。

なお、培養容器１０を構成する底部１の形状は特に制限されず、三角形及び四角形等の多角形状や楕円形状であってもよい。また、細胞収容部３の凹部４は、培養容器１０の底部１の表面に直接窪みとして形成してもよいし、底部１から突出した部材により細胞収容部３を形成して該細胞収容部３の表面に窪みとして形成してもよい。また、培養容器１０に細胞収容部３を複数設けてもよいし、細胞収容部３の凹部４の基数や配列、各凹部４の開口部や側面４ａや底面４ｂの形状や寸法等は、収容する細胞の種類に応じて適宜に変更してもよい。

例えば、受精卵を培養する場合、胚盤胞の段階まで培養することが望ましいため、凹部４の円形状の開口部の直径（開口幅）は、胚盤胞の段階の細胞の最大寸法より大きいことが望ましい。胚盤胞の段階の細胞の最大寸法は通常１００μｍ〜２８０μｍであることから、円形状の開口部の直径は通常１００μｍ以上である。また、例えば、凹部４の側面４ａが、凹部４の最も低い位置から凹部４の外縁へ向かってその高さが高くなるように円錐状又は円錐台状に傾斜している場合には、細胞を配置したい場所（凹部４の最深部）へ移動させ易くなる。また、例えば、細胞を凹部４内に保持するために、凹部４の深さは細胞の最大径の１／３以上であることが好ましく、１／２以上であることがさらに好ましい。また、例えば、凹部４内への培養液の導入を容易にするために、凹部４の深さは凹部直径の１倍以下であることが好ましく、１／２以下であることが特に好ましい。また、凹部４の直径が小さく、その深さが深いほど対流が起き難くなるため、細胞の呼吸や代謝に伴って、周辺の培養液の組成変化が起き易くなる可能性がある。細胞は、周辺の培養液の組成の影響を受けて成長し易さが変化するため、細胞の成長を促すように生物学的な影響を考慮して直径と深さを設定することが好ましい。一般に、細胞の種類に応じて異なるが、凹部４の深さは５０μｍ〜２００μｍ程度であることが好ましい。

また、培養容器１０の材質は特に制限されず、具体的には、金属、ガラス、及びシリコン等の無機材料、プラスチック（例えば、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂）で代表される有機材料を挙げることができる。また、培養容器１０は、当業者に公知の方法で製造することができる。例えば、プラスチック材料からなる培養容器を製造する場合には、慣用の成形法、例えば射出成形により製造することができる。さらに、培養容器１０は、受精卵の発育を促進するような表面処理又は表面コートがなされていてもよい。特に、受精卵の発育を促進するために、他の器官の細胞（例えば、子宮内膜細胞や卵管上皮細胞）と共培養をする場合、これらの細胞を予め培養容器に接着させる必要がある。このような場合に、培養容器の表面に細胞接着性の材料をコートすると有利である。

［培地導入工程］
上記した培養容器１０を用意した後、培養容器１０の細胞収容部３、特に細胞収容部３の周囲に立設された内壁５の内部に画成される培地領域に例えばピペットやガラスキャピラリー等を用いて受精卵等を含む培地を導入する（Ｓ１２）。なお、培地は、内壁５の高さまで導入され、当該培地の表面張力により内壁５の外側へ漏出しないように保持されている。培養のための培地は、細胞を培養する能力を有するものであれば特に制限されず、例えば受精卵培養用の培養液としてはＭ１６やＣＲ１ａａ等が挙げられる。

［オイル導入工程］
次いで、培養容器１０の側壁２の内側、すなわち培養容器１０の底部１の上面１ａと側壁２の内周面２ａとから画成される培養領域にミネラルオイルを導入する（Ｓ１３）。ミネラルオイルは、培養容器１０に導入された培地を覆う高さまで導入され、これにより培地の乾燥が防止される。

［加振工程］
上記したように細胞収容部３の凹部４は極めて小さいため、Ｓ１２の培地導入工程に際して、細胞収容部３の凹部４には気泡が残存する可能性がある。特に、培養容器１０がポリスチレン等の疎水性の高い材料から形成されている場合や表面張力が高い培地を使用する場合には、その可能性が高くなる。そこで、培地およびミネラルオイルが収容された培養容器１０に例えば図３に示す蓋１１を装着した後、その培養容器１０を加振して細胞収容部３の凹部４に存在する気泡を除去する（Ｓ１４）。

具体的には、図４に示す加振装置５０を使用して培養容器１０を加振する。加振装置５０は、図４ａに示すように、主に、培養容器１０を設置するための設置部２０と該設置部２０に設置された培養容器１０を底部１の上面（底面）１ａと直交する方向（鉛直方向）へ加振する加振部２１とを有する本体部３０と、該本体部３０の加振部２１の出力（振幅）を調整する調整部４０とを備え、本体部３０と調整部４０とは通信ケーブル３９を介して電気的に接続されている。なお、本体部３０と調整部４０とは通信ケーブル３９を介さず一体に構成してもよい。

本体部３０の設置部２０は、略円筒状の筺体２０ａと該筺体２０ａの上端に設けられた上板２０ｂと筺体２０ａの下端に設けられた底板２０ｃとからなり、上板２０ｂの略中心に開口部２０ｅが形成されている（図４ｂ参照）。本体部３０の加振部２１は例えば金属製の振動子からなり、設置部２０の筺体２０ａ内に埋設され、その先端部（培養容器１０との接触部）２１ａが上板２０ｂの開口部２０ｅに摺動可能に配置され、加振時において加振部２１の先端部２１ａが上板２０ｂの上面２０ｄから延出して培養容器１０の底部１の下面と接触するようになっている。

なお、加振部２１の先端部２１ａは、加振時において培養容器１０の底部１への衝撃を緩和するために例えば弾性部材２１ｂで覆われている（図４ｄ参照）。この弾性部材２１ｂの材質は特に限定されず、具体的には、天然ゴムの他にニトリルゴム、シリコーンゴム、ウレタンゴム、アクリルゴム、ブタジエンゴム、スチレンブタジエンゴム、フッ素ゴム、エチレンプロピレンゴム等が挙げられる。また、加振部２１の先端部２１ａの上面、特に加振部２１の先端部２１ａに設けられた弾性部材２１ｂの上面（培養容器１０との接触面）の形状は特に限定されず、例えば平面状であってもよいし、上方に向かって凸となる形状であってもよい。

設置部２０の上板２０ｂには、棒状の支持部２０ｆが立設され、該支持部２０ｆに板ばね等からなる付勢部２０ｇが取付けられている。この付勢部２０ｇにより、設置部２０の上板２０ｂ上に設置された培養容器１０は上板２０ｂ方向（鉛直下方）へ付勢された姿勢で、当該培養容器１０が、設置部２０の上板２０ｂと付勢部２０ｇにより挟持されるようになっている（図４ｃ参照）。

また、設置部２０の上板２０ｂには、培養容器１０を設置する位置を規定する規定部（不図示）が設けられている。この規定部は、視覚的に培養容器１０の設置位置を規定するマークであってもよいし、物理的に培養容器１０の設置位置を規定する突起などであってもよい。この規定部により、設置部２０の上板２０ｂ上に設置された培養容器１０は、加振部２１の先端部２１ａと培養容器１０の底部１とが培養容器１０の中心から離間する位置、特に加振部２１の先端部２１ａと培養容器１０の底部１とが培養容器１の細胞収容部３以外の位置で接触するように設置される。

上記した加振工程Ｓ１４では、設置部２０の上板２０ｂ上に設けられた規定部により、培養容器１０を上板２０ｂ上の所定の位置に設置する。図４ｃに示すように、培養容器１０の蓋１１の上側に支持部２０ｆに取付けられた付勢部２０ｇを当接配置し、その付勢部２０ｇにより培養容器１０を上板２０ｂ方向（鉛直下方）へ向かって付勢した姿勢で、設置部２０の上板２０ｂと付勢部２０ｇにより培養容器１０を挟持して固定する。この状態で加振部２１を駆動させると、図４ｄに示すように、加振部２１の先端部２１ａが設置部２０に設置された培養容器１０の底部１の下面、特に培養容器１の細胞収容部３以外の位置の下面と接触し、培養容器１０が底部１の上面（底面）１ａと直交する方向へ加振される。なお、その際、付勢部２０ｇのうち培養容器１０の蓋１１と接触する部分も培養容器１０の底部１の上面（底面）１ａと直交する方向（鉛直下方）へ振動する。

なお、加振部２１の先端部２１ａの上面、特に加振部２１の先端部２１ａに取付けられた弾性部材２１ｂの上面は、加振開始時において、設置部２０の上板２０ｂの上面と面一に設定されてもよいし、上板２０ｂの上面よりも僅かに突出して設定されてもよい。また、培養容器１０の加振時には支持部２０ｆに取付けられた付勢部２０ｇを用いることなく、例えば使用者自身が培養容器１０を設置部２０の上板２０ｂ上で保持してもよい。また、培養容器１０を加振する際に、底部１と直交する方向以外に、底部１の上面（底面）１ａと平行な方向や底部１の上面（底面）１ａに対して斜めの方向へ加振して細胞収容部３の凹部４内の気泡を当該凹部４から除去してもよい。さらに、培養容器１０を加振する際には、培養容器１０の底部１の下面以外に、培養容器１０の側壁２の外周面や培養容器１０の蓋１１の上面から培養容器１０に対して振動を付与してもよい。

この加振工程Ｓ１４における培養容器１０の振幅等は、各凹部４の開口部や側面４ａや底面４ｂの形状や寸法、培養容器１０自体の固有振動数、収容する細胞の種類等に応じて、調整部４０の前面に設けられた調整ダイヤル４０ａ等を用いて調整することができる。ただし、細胞収容部３の周囲に立設された内壁５の内部の培地領域にはより多くの培地を導入することが有利であるため、培養容器１０の加振周波数や振幅は、内壁５の高さまで導入された培地が当該培地の表面張力により内壁５の外側へ漏出しない値であって細胞収容部３の凹部４内の気泡が当該凹部４から離脱し得る値に設定されることが望ましい。そのような培養容器１０の加振周波数は、以下の実施例に基づき説明するように例えば５ｋＨｚ〜１ＭＨｚ程度である。また、その鉛直方向の振幅は、上記したように凹部４の深さが５０μｍ〜２００μｍ程度であることから凹部４の深さと同等の約５０μｍ以上であり、かつ、培地の表面張力を考慮すると例えば１ｍｍ程度以下であることが好ましい。また、凹部４内の気泡サイズが５０μｍ程度であることから、その鉛直方向の振幅は、凹部４内で気泡を滑動させられればよく、例えば気泡サイズの約１／１０以上、すなわち約５μｍ以上であってもよい。

［保温工程］
そして、上記したように培養容器１０を加振して細胞収容部３の凹部４に存在する気泡を除去した後、その培養容器１０を培養細胞の発育及び維持に必要なガスを含む環境雰囲気及び一定の環境温度をもたらすインキュベータに投入する（Ｓ１５）。必要なガスには、水蒸気、遊離酸素（Ｏ_２）及び二酸化炭素（ＣＯ_２）が含まれる。環境温度とＣＯ_２含有量を調節することにより、培地のｐＨを一定時間内に安定させることができる。安定なＣＯ_２含有量と安定な温度により安定なｐＨが得られる。なお、例えば画像比較プログラムにより、培養中の細胞の画像を予め撮像して保存しておいた画像と比較することにより、培養の際の温度、ガス及び培地などの培養条件を調節することもできる。例えば、ラット受精卵を培養する際のインキュベータの培養条件は、５％ＣＯ_２、５％Ｏ_２、９０％空気、３７℃、湿度飽和である。

このように、本実施形態の培地充填方法によれば、培地が導入された培養容器１０を加振する、特に培養容器１０を底部１の上面（底面）１ａと直交する方向、すなわち鉛直方向であって凹部４の開口方向へ向かって加振することによって、細胞収容部３の凹部４に存在する気泡を簡単にかつ確実に除去することができる。また、加振後の培養容器１０を一定の環境温度をもたらすインキュベータに投入することによって、加振後においても凹部４に残存する気泡を膨張もしくは活性化させて前記凹部４から離脱させることができるため、細胞収容部３の凹部４に存在する気泡をより確実に除去することができる。

なお、上記する実施形態の培地充填方法では、オイル導入工程の後に加振工程を実施したが、加振工程は培地導入工程の後に実施してもよいし、培養容器１０に導入された培地の蒸発を許容し得る場合にはオイル導入工程自体を省略してもよい。培養領域にミネラルオイルを導入する前に培養容器を加振する場合には、培地が内壁５の外側へ漏出し易くなるため、それに応じて調整部４０の調整ダイヤル４０ａ等を用いて培養容器１０の加振周波数や振幅等を調整する必要がある。

＜実施例の検査用試料による凹部の気泡除去率を測定した実験とその結果＞
本発明者等は、異なる加振周波数で加振した複数の培養容器（実施例１、２、比較例１）において細胞収容部の凹部の画像を撮像し、その撮像画像から凹部の気泡除去率を測定した。

気泡除去率の測定方法を概説すると、培養容器として図２で示す形態の培養容器１０を用意した。なお、培養容器はポリスチレン樹脂製であり、その底部の厚さは約１ｍｍ、内壁の厚さは約０．５ｍｍ、内壁の内周は約φ７ｍｍ、内壁の高さは約２ｍｍであった。また、細胞収容部の凹部の開口部の直径は約２８０μｍ、凹部の深さは約１６０μｍ、隣接する凹部の中心同士の間隔は約４００μｍであった。その培養容器の培地領域にＣＲ１ａａを７０μＬ導入し、培養容器の培養領域にミネラルオイルを導入した後、細胞収容部の凹部の画像を撮像用カメラにより撮像した（この撮像画像を画像１とする）。そして、その培養容器を図４で示す形態の加振装置に設置し、底部の上面と直交する方向すなわち鉛直方向へ向かって１ＭＨｚ（実施例１）、４０ｋＨｚ（実施例２）、１ｋＨｚ（比較例１）で加振した後、細胞収容部の凹部の画像を撮像用カメラにより撮像し（この撮像画像を画像２とする）、双方の撮像画像１、２を比較して以下の数式１により凹部内の気泡の除去率を算出した。

（数１）
１−（画像２中の気泡が存在する凹部の数）/（画像１中の気泡が存在する凹部の数）

実施例１の検査用試料では、図５で示すように、凹部内の気泡除去率が約３２％（１−１７/２５）であった。また、実施例２の検査用試料では、図６で示すように、凹部内の気泡除去率が約１００％であった。また、比較例１の検査用試料では、凹部内の気泡がほとんど除去されなかった。

この実験結果より、培養容器を底部の上面と直交する方向、すなわち鉛直方向であって凹部が開口する方向へ向かって加振することにより、細胞収容部の凹部に存在する気泡を除去し得ることが実証された。特に、図７で示すように、加振時の加振周波数が５ｋＨｚ以上かつ１ＭＨｚより小さければ、細胞収容部の凹部内に存在する気泡の約１／３以上を除去し得ることが確認された。

１：底部、１ａ：底部の上面（底面）、２：側壁、２：側壁の内周面（側面）、３：細胞収容部、４：細胞収容部の凹部、４ａ：凹部の側面、４ｂ：凹部の底面、５：内壁、１０：培養容器、１１：蓋、２０：設置部、２０ｅ：開口部、２０ｇ：付勢部、２１：加振部、２１ａ：加振部の先端部、２１ｂ：弾性部材、３０：本体部、３９：通信ケーブル、４０：調整部、４０ａ：調整ダイヤル、５０：加振装置

Claims (6)

1. 細胞を培養するための培養領域を画成する底面と側面とを有し、前記底面に凹部を有する細胞収容部が設けられている培養容器へ培地を充填する培地充填方法であって、
   前記培養容器の前記細胞収容部に培地を導入する培地導入工程と、
   前記培養容器の前記細胞収容部以外の位置の下面に加振部を接触させて前記培養容器を加振して前記細胞収容部の前記凹部に存在する気泡を除去する加振工程と、を含む培地充填方法。
2. 前記加振工程において、前記培養容器を前記底面と直交する方向へ加振する、請求項１に記載の培地充填方法。
3. 前記培養容器の加振周波数が５ｋＨｚ以上かつ１ＭＨｚより小さい、請求項２に記載の培地充填方法。
4. 前記加振工程に続いて、前記培養容器の温度を一定に保持する保温工程を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の培地充填方法。
5. 前記加振工程において、前記培養容器の加振周波数が５ｋＨｚ以上かつ１ＭＨｚより小さく、振幅が５μｍ以上かつ１ｍｍ以下である、請求項１に記載の培地充填方法。
6. 前記加振工程において、前記培養容器の振幅が５０μｍ以上かつ１ｍｍ以下である、請求項５に記載の培地充填方法。

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