CN1007905B - 由培养液分离动物细胞的方法 - Google Patents
由培养液分离动物细胞的方法Info
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Abstract
由动物细胞培养液分离出动物细胞和/或动物细胞碎片的方法,包括用多聚半乳糖醛酸来絮凝细胞,以及把这些絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片从培养分离出来。
Description
本发明是关于由动物细胞培养液中分离出动物细胞和/或动物细胞碎片的方法,这方法最适合用于由培养液分离出杂种瘤细胞。
分子生物学近年来的发展,导致对精细发酵方法和仪器的需求的增加,特别是经多种技术处理的动物细胞进行大量培养,以便由这些细胞生产出多肽提取物和蛋白质。这过程的一个步骤,是要把动物细胞和/或动物细胞碎片,从培养液分离出来,这是从培养液分离出细胞产物的首要步骤。
按传统的分离方法,是把动物细胞用离心分离方法,从培养液分离出来。这方法通常效率低,因为要保证分离完全的话,就需要较长的时间来获得相当的加速度。另外一种办法,就是过滤出培养液,但是这个做法很容易使过滤器被动物细胞和细胞的残片堵塞。所有两种办法,都可能由动物细胞弃除及带走有用的细胞产物,并且没法把细胞碎片和培养液上清液完全分离。
本发明的目的是提高由液体培养基分离动物细胞的效能。
已经知道絮凝微生物培养液有助于由培养液分离微生物细胞。这种方法的例子是把澄清剂加进不透明的爱尔啤酒内,澄清剂会使酵母菌和酵母菌碎片絮凝,最后沉淀在酿酒器的底部。
在一般情况下,动物细胞物质的表面都带有净负电荷。由于静电引力,不同极性的颗粒聚集形成絮凝。我们可以预期,带有正电荷的物质会絮凝动物细胞和动物细胞碎片。出乎意料的是我们发觉带负电的溶解了的聚合物竟然对絮凝动物细胞和动物细胞碎片很有功效。此外,我们
试验了多种带负电溶解的聚合物,只有一种显示出有絮凝的极满意效果,我们假定,这是由于聚合物表面上的电荷分布和细胞上的带正电荷区域相互配合所造成的。
按照本发明,我们提出一种把动物细胞和/或动物细胞碎片从动物细胞培养液分离出来的方法,其中包括在培养液内混入多聚半乳糖醛酸,使动物细胞和/或动物细胞碎片絮凝,再从培养液分离出絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片。
使用多聚半乳糖醛酸作絮凝剂有多种好处。这种在物理分离前进行的动物细胞和/或动物细胞碎片的絮凝,可以显著地增加产品产量,培养基的纯度,及加快整体分离过程的速度。动物细胞碎片,由于它们的体积细小,很多时候都很难除去,但是使用本发明的话,就不但能够絮凝动物细胞,还能够絮凝动物细胞碎片。此外,使用本发明的方法,只有少量的动物细胞由培养液的上清液中带走。多聚半乳糖醛酸本身不含毒素,供应方便,价线也便宜,它是由果胶经脱酰化得到的。
所述多聚半乳糖醛酸可以是多聚半乳糖醛酸本身,或是任何能够使动物细胞或动物细胞碎片絮凝的可溶性多聚半乳糖醛酸衍生物。如果多聚半乳糖醛基本上溶于动物细胞培养液,它的分子量可以在一较大的范围内变化。同样地,由于实际上有效浓度对于细胞密度的依赖关系无法精确地确定,多聚半乳糖醛酸的浓度通常也可以在大范围变化。不过,可行的浓度上限由使细胞培养液变为凝胶的多聚半乳糖酸浓度决定。该现象显然是不希望产生的。浓度的下限是由动物细胞或动物细胞碎片基本上开始絮凝的浓度来确定的。在一般的培养液内,多聚半乳糖醛酸浓度至少可以是0.004%(重量/体积),最好是大约0.03%重量/体积。
任选地使絮凝的动物细胞和/或动物细胞碎片随重力沉淀后,可以使用过滤或离心分离法,从液体分离絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片。所获得清澈液上清液,再可进行纯化,得到由动物细胞所产生的
多肽或蛋白质。上述的方法,当然可以应用于经细胞分裂(例如用超声处理)的动物细胞培养液。
动物细胞可以是在活体外生长的天然存在的动物细胞,不过最好是一些遗传变异的动物细胞,优选的动物细胞有杂种瘤细胞,例如是从小鼠或大鼠衍生的杂化种细胞,此外,这些动物细胞也可以是人体的类淋巴母细胞。在动物细胞产生抗体(IgM或IgG)的情况下,在动物细胞和/或动物细胞碎片絮凝的过程中,只有少量抗体由培养基液中排出,因此可以保持抗体的高产率。
最好至少在絮凝时将培养液调整至酸性的pH值,酸性的pH值可确保细胞表面的氨基团和组氨酸残余物的质子化作用,由此增加细胞上正电荷区域。pH低于3时,聚合物仍为离子化;较好的pH值是在4和7之间,pH值最好是在5和6之间。
培养液可以任何合适培养基,例如是Dulbecco Mcdified Eagle Medium(DMEM)或L-Broth。
通过下列举例方法进一步说本发明。
例一
实施本实验可用来证明,多种带负电的可溶聚合物对在培养液中产生抗体IgM的杂种瘤细胞的培养基的絮凝能力。这实验的结果,着重说明多聚半乳糖醛酸在这方面的独特性能。
在含有5%小牛胎血清和Dulbecco Modified Eagle Medium(DMED)培养基内,使用标准滚筒培养技术。培养出产生IgM的杂种瘤细胞(NBI-一种小鼠杂种瘤)。细胞繁殖通常在对数生长的阶段的末期应用,这时候细胞的密度和细胞碎片的数量最大。制备下列的带负电的聚合物水溶液:多聚半乳糖醛酸(4%重量/体积)、分子量8000的葡聚糖硫酸酯(10%重量/体积)、分子量500,000的葡聚糖硫酸酯(8%重量/体积)、藻酸、角叉藻聚糖、DEAE-葡聚糖、聚谷氨酸、聚硫酸乙烯酯。
使用1MHCl或固态三HCl碱。把培养基(50ml)的pH值分别调到5.0、7.0及9.0,在15ml刻度试管内。加入10ml每钟pH值样品。再加进要试验的絮凝剂、重覆倒转试管来混合液体。把全部试管直立放置。及分别在2小时后、18小时后来观察。用离心法澄清一组pH值为5.0含多聚半乳糖醛酸试管。由澄清的上清液抽样,然后使用ELISA测定法测量IgM的浓度。
实验结果列于表一。
pH
絮凝剂 浓度%重量/体积 5.0 7.0 9.0
多聚半乳糖醛酸 两小时后,每一pH值试样都出现
大量的絮凝现象
0.4 pH5的上清液比pH7和pH9的上
清液更清澄
0.004 同上
0.0004 没有絮凝
分子量8000的 1.0 没有絮凝
葡聚硫酸酯
分子量500.000 0.3 没有絮凝
的葡聚糖硫酸酯
没有絮凝剂(对 没有絮凝
照物)
藻酸、角叉藻聚糖、D.E.A.E葡聚糖、聚谷氨酸、以及聚硫酸乙烯酯等,都不能在1%(重量/体积)浓度产生絮凝。由浓度0.04%-0.0004%(重量/体积)的多聚半乳糖醛酸絮凝的培养基产生的上清液中没检测
出IgM的损失。
例二
例一描述的实验说明多聚半乳糖醛酸在培养液内絮凝杂种瘤细胞的能力。将该试验扩大到实验工厂的水平。
用下列的方法繁殖及得到30升的培养基。把CO2鼓入培养发酵器内,便培养液的pH下降到5.0至6.0之间。视杂种瘤细胞和细胞碎片的密度,多聚半乳糖醛酸以0.04%至0.1%间浓度加进培养液中,再加入大约50毫升体积的絮凝剂。把它们在发酵器内混合之后,停止CO2气体的供应,让絮凝过程进行。需1个小时让絮凝了的细胞和细胞碎片沉淀。跟着把絮凝了的细胞和细胞碎片,用卷曲的聚丙烯深过滤筒(标称0.1微米小孔直径)来过滤,或使用Westfalia SA-I分离器进行连续离心分离。使用这两种方法获得的上清液比使用传统分离技术获得的上清液更清澄。以100升及1000升的培养基成功地重覆进行扩大试验。另外,已表明用5M H2SO4,也可降低pH值。并且在加入前可将多聚半乳糖醛酸溶解水中形成20%(重量/体积)浓度溶液进行试验。
例三
用100升培养基量的小鼠杂种瘤细胞系和人体的类淋巴母细胞系(EB变异的淋巴细胞)来重覆例二所描述的实验。在这两种情况中都能成功地絮凝和分离动物细胞和动物细胞碎片。
当然,大家应该知道,这里所描述的内容及例子纯碎是举例性质。可以在不脱离本发明的范围内及原则下可适当改变某些细节。
Claims (6)
1、应用絮凝剂来絮凝细胞而从细胞培养液分离出细胞或细胞碎片的方法,其特征是细胞或细胞碎片是动物细胞或动物细胞碎片,絮凝剂是多聚半乳糖醛酸,所述方法包括将有效量的多聚半乳糖醛与含有细胞或细胞碎片的培养液混合以絮凝细胞或细胞碎片,以及把絮凝了的动物细胞或动物细胞碎片从培养液分离出来,此外其中培养介质的pH值为足于产生絮凝的有效pH值。
2、根据权利要求1方法,特征是其中絮凝了的动物细胞和/动物细胞碎片是用过滤法或离心法从培养液分离出来。
3、根据权利要求1或2的方法,特征是其中动物细胞是遗传变异的动物细胞。
4、根据权利要求3的方法,特征是其中动物细胞是杂种瘤细胞。
5、根据权利任何3的方法,特征是其中动物细胞是类淋巴母细胞。
6、根据上述任何一项权利要求的方法,特征是其中培养液的pH值至少在絮凝期间需控制在3-7。
Priority Applications (1)
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CN 85103552 CN1007905B (zh) | 1985-05-04 | 1985-05-04 | 由培养液分离动物细胞的方法 |
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Publications (2)
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Families Citing this family (2)
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US7655457B2 (en) | 2003-11-17 | 2010-02-02 | Hitachi, Ltd. | Cell culture vessel and cultured cell |
-
1985
- 1985-05-04 CN CN 85103552 patent/CN1007905B/zh not_active Expired
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