CN116731970B - 基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型构建方法及其应用，属于医学仿生器官模型技术领域，使用水凝胶作为仿生器官模型的骨架进行制备，本发明构建具有生物活性的食管癌的体外仿生器官模型，更好的模拟食管癌患者Pg的体内感染，最后引入临床常见的化疗药物，确证Pg与食管癌恶变的关联，对模型的药物筛选功能进行验证并与临床疗效进行比对。

Description

基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及医学仿生器官模型技术领域，具体涉及一种基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型构建方法及其应用。

背景技术

癌症生物学研究越来越趋向于构建创新的体外3D培养模型，因为传统和当前的2D细胞培养无法重现体内癌症生物学行为。人们通常是在体外和体内模型系统中双管齐下，致力开发治疗癌症的有效方法。

然而，这些仍然不能模拟癌症的病理生理。在聚苯乙烯(TCP)上进行二维癌细胞培养很容易，但它们不能代表生理培养系统，往往导致欺骗性的结论。即使2D板被细胞外基质(ECM)蛋白(如层粘连蛋白、胶原蛋白和纤维连接蛋白)包裹，特定生理模式的缺失也会抑制细胞在空间中的粘附、增殖、信号转导、迁移以及对治疗刺激的反应。

现有3D仿生器官模型是通过非细胞支撑的骨架进行建立的，例如授权公告号为CN104382670 B的一种人工器官的仿生构建方法，其使用3D模型构建树脂模型，然后建设金属薄膜，沉积微纳纤维结构层除去树脂的方式，构建成了器官骨架，后再外覆仿生器官模型薄膜的方式，形成人造仿生器官模型，其生理模式与2D的薄膜相似，所得出的实验以及测试结果相差不大，无法形成真正生理意义上的培养系统，即仿生器官模型也会抑制细胞在空间撒黄瓜的黏附、增殖、信号转导、迁移以及对治疗刺激的反应。

另一方面，使用小鼠模型和异种移植是一种非常昂贵的方法，需要很高的经济与时间成本，需要具备操作小鼠的专业知识和操作技巧，还不可避免一些道德伦理问题。此外，小鼠和人类间质细胞的基因型和生物学特性也存在客观差异。近年来，组织工程在制造3D体外模型方面成果显著，这些模型能够更好地模拟体内微观和大体内环境的复杂性，以重建原生食管癌微生态，上调肿瘤增殖和干性标志物，这样的仿生模型更可能有助于预测患者的预后，为从根本上完善治疗提供建设性意见。

食管癌体内模型：致癌物质诱导模型很大程度上取决于小鼠的基因背景，很难模拟病人的肿瘤形成情况；重度免疫缺陷鼠的饲养成本高，难度大；

基因工程鼠模型的背景明晰，成瘤在食管原位，但成本高，繁殖周期太长；食管癌细胞系培养，种类单一，在细胞永生化的过程中，遗传信息发生偏移，丢失或者增加了某些特定染色体片段；

仿生器官模型培养能在低经济和时间成本的条件下，高度还原体内肿瘤生长的微环境和行为。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型构建方法及其应用，构建具有生物活性的食管癌的体外仿生器官模型，更好的模拟食管癌患者Pg的体内感染，最后引入临床常见的化疗药物，确证Pg与食管癌恶变的关联，对模型的药物筛选功能进行验证并与临床疗效进行比对。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，使用水凝胶作为仿生器官模型的骨架进行制备，所述水凝胶的组分以及质量百分浓度如下：

甲基丙烯酸酐化明胶（GelMa）5-15%；

聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）2-4%；

苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP） 0.1-0.5%；

超纯水80.5-92.9%；

所述食管癌仿生器官模型的构建方法具体包括如下步骤：

S1、水凝胶的配置，将甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂与纯水涡旋混合，得到水凝胶；

S2、塑型玻璃单元的搭建，使用两根直径不同的粗中空玻璃管和细中空玻璃管同轴放置，使得细中空玻璃管的内外两侧形成内腔与外腔，并使用两个注射针头分别连接内腔与外腔；

S3、微流控制单元的构建，使用软管将注射针头与注射器相连接，并将注射器连接于微流量泵上，在连接于内腔的注射器内装入内相逃逸材料，在连接于外腔的注射器内装入水凝胶外相；

S4、仿生器官模型骨架的形成与细胞负载，驱动微流量泵，使得内相逃逸材料与水凝胶外相通过内腔与外腔形成管状的流体，在使用紫外固化灯对管状的流体进行照射，得到固态的水凝胶骨架，使用肿瘤细胞与血管内皮细胞分别贴壁生长于水凝胶骨架的内壁与外壁上，得到食管癌仿生器官模型，内相流速与外相流速的比值为1：2-10。

本发明中采用了2-4%聚乙二醇二丙烯酸酯（Poly(ethylene glycol)diacrylate, PEGDA）和5-15%甲基丙烯酸酐-明胶（GelMA），其复合组分形成的预制胶在光引发剂0.1%Lap的催化下物理交联形成超分子交联网络。

PEGDA是由乙二醇单体聚合为聚乙二醇(PEG)后，在PEG大分子链两端修饰上丙烯酸分子获得的。PEGDA相比原本的PEG分子多了碳碳双键结构，在特定的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(Lap)作用下，Lap在合适波长的光激发下均裂为两个自由基，可催化碳碳双键基团发生分子间交联，形成超分子互穿网络，使预制胶从液态转化为固态，实现光固化。而在发生交联后，不同浓度的PEGDA拥有不同的吸水性和机械硬度；浓度越高，硬度越大，凝胶含水量降低，孔隙越小。在本发明的发明过程中，发明人发现：当PEGDA浓度低于2%时，水凝胶完全交联后的机械强度较低，不能通过微流控同轴打印出连续长度的纤维，当PEGDA浓度高于4%时，水凝胶交联后的硬度过大，表面结构过于致密，不利于细胞的持续黏附和生物活性成分的自由交换。

明胶(gelatin)通过化学修饰加上甲基丙烯酸酐(MA)制备。由于明胶在动物皮肤、肌膜等组织中广泛存在，是一种易获得的天然细胞外基质，具备良好的生物相容性，可作为神经干细胞(nSC)、间充质干细胞(mSC)等多种干细胞的培养基质。在本发明的发明过程中，发明人发现：当GelMA浓度低于5%时，预制胶黏度过低，流动性大，在UV固化前不能维持稳定，容易分散在收集液中，当GelMA浓度高于15%时，预制胶黏度过大，对环境温度变化敏感，在室温低于25℃时容易凝固，堵塞装置，流动性和打印适性降低。

GelMA分子也可以通过光引发剂催化自身或与其他含有碳碳双键的大分子的PEGDA交联形成复合水凝胶。

Lap作为光引发剂，其浓度对两种光固化的水凝胶的最终交联度至关重要，水凝胶的交联度又决定了形成材料的孔隙率和含水量。在本发明的发明过程中，发明人发现：当Lap浓度低于0.1%时，水凝胶不能充分和快速交联，不能在收集液中形成连续螺旋下降的纤维丝或形成的纤维机械强度低，中空通道塌陷变形，当Lap浓度高于0.5%时，水凝胶交联度过高交联过快，容易在装置出口处交联，堵塞导管，且浪费光引发剂，增耗成本。

进一步的，所述步骤S2中粗中空玻璃管与细中空玻璃管的直径比为3：1，所述粗中空玻璃管的内径与外径之比为1：2，所述细中空玻璃管的内径与外径比为1：1.2。

进一步的，所述步骤S3中内相逃逸材料为聚乙烯醇的水溶液，所述聚乙烯醇在水溶液中的质量百分浓度为10%。

进一步的，所述步骤S4中所述水凝胶骨架所处环境温度为25-28℃。

进一步的，所述肿瘤细胞位于所述水凝胶骨架的内侧壁上，所述血管内皮细胞位于所述水凝胶骨架的外侧壁上。

进一步的，所述步骤S4中紫外固化灯的波长为365nm，功率为100W，所述紫外固化灯的照射时长为20s。

进一步的，所述步骤S4中肿瘤细胞与血管内皮细胞均为细胞悬液，所述肿瘤细胞与血管内皮细胞进行贴壁生长的要求如下：

肿瘤细胞在T75 培养瓶中处于对数增长期时，使用胰酶消化，培养基重悬，计数，所述肿瘤细胞的细胞浓度为1×10⁷个/mL；

血管内皮细胞在T75培养瓶中处于对数增长期时，使用胰酶消化，培养基重悬，计数，所述血管内皮细胞的细胞浓度为5×10⁵个/mL。

进一步的，将肿瘤细胞贴壁生长在所述水凝胶骨架的内侧壁方法如下：

采用自制的尖端为100µm的针头将肿瘤细胞的细胞悬液注射入水凝胶骨架的管道内部，继而将水凝胶骨架转移至6孔板中，放入37℃温箱孵育，4h后，肿瘤细胞在纤维通道中贴壁。

进一步的，将血管内皮细胞贴壁生长在所述水凝胶骨架的外侧壁方法如下：

将高浓度的血管内皮细胞细胞悬液通过注射器少量多次滴加到纤维外表面，平稳转移至温箱，孵育培养，4h后，血管内皮细胞在水凝胶骨架的外表面贴壁。

本发明的另一目的在于使用基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法在构建仿生器官模型时的应用。

附图说明

图1为本发明不同交联度形成不同孔隙大小的水凝胶骨架的SEM照片；

图2为本发明形成涡流，层流，湍流时水凝胶骨架的体式光镜照片；

图3为本发明不同通道内径对细胞分布密度和黏附状态影响的倒置光镜照片；

图4为本发明水凝胶骨架内外表面分别负载ESCC和HUVEC的倒置光镜明场照片；

图5为本发明水凝胶骨架负载细胞的场发射扫描电镜图片；

图6为本发明塑型玻璃单元的示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-6，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP

实施例一

本实施例是对甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂和超纯水的比例进行的相关测试以及论证，具体实施步骤如下：

第一步、水凝胶外相与的配置，称取GelMa固体，并用超纯水配置成10%质量百分浓度的第一溶液，在第一溶液中加入PEGDA溶液得到第二溶液，使得PEGDA溶液在第二溶液中的体积浓度占比为2.5%，然后在第二溶液中加入LAP得到第三溶液，LAP占第三溶液质量百分浓度的比值为0.1%，将第三溶液在26℃的环境下进行涡旋混匀得到水凝胶外相，称取PVA-205并使用超纯水在26℃的环境下配置成10%质量百分浓度的内相逃逸材料。

第二步、去用两根粗中空玻璃管，粗中空玻璃管的内径为580μm，粗中空玻璃管外径为1.00mm，取其中一根粗中空玻璃管，使用拉管仪将一端拉出锥形尖端，然后使用砂纸将锥形尖端磨出平口，该平口的直径为400-500μm；取另一根粗中空玻璃管，使用便携式喷枪煅烧、热拉，并利用石刻笔在合适的位置裁取出长度约5cm的细中空玻璃管，细中空玻璃管的内径为100-150µm；将两根中空玻璃管浸没于无水乙醇放入超声清洗机中处理3-5min，去除管内静电吸附的粉尘和研磨产生的玻璃残渣，中空玻璃管清洁干燥后，将较粗的作为外管，细长的作为内管，同轴排列置于载玻片上，使用环氧树脂固定，细中空玻璃管与平口之间的距离控制为200µm左右，且空间居中；取两个平口的注射器针头用刀片分别切割出一个和两个豁口分别放在内外管的入口处，同样使用环氧树脂固定，放于通风干燥处，固化时间约6h，保证良好气密性，即完成微流控装置的搭建。

第三步、使用两根30cm的塑胶软管 将注射针头与吸有水凝胶的注射器相连接，塑胶软管的外径为1.5 mm,内径为1.02 mm，水凝胶外相的流体通道置于五光环境下，将注射器固定于微流量泵上，开启微流量泵，使得内相流速0.8 mL/h，外相流速2mL/h，水凝胶外相以及内相逃逸材料进行流动，进行微流控纺丝,二者相配合生成单层中空结构的水凝胶骨架，如图2中左二所示，两相流体形成层流，产生平滑通道的水凝胶骨架，微流控纺丝前，内外相通道均要用超纯水充盈，保持通道润滑。

使用PBS作为收集液收集水凝胶骨架，使用5cm高度的玻璃瓶来接收PBS收集液与水凝胶管，用紫外灯固化仪直射流出的水凝胶骨架20s，状态稳定时可见螺旋下降的纤维丝状水凝胶骨架；外相的水凝胶在紫外光照条件下转变为凝固状态，而内相的PVA-205溶液流散溢出到收集液中，形成具有平滑的通道的中空纤维。

第四步、将通过微流控纺丝得到的水凝胶骨架使用PBS清洗3-4次，再将水凝胶骨架在75%浓度的酒精内浸泡，然后在紫外光下照射1h，在使用无菌PBS洗去水凝胶骨架中的酒精，然后将水凝胶骨架至于1640培养基内浸泡过夜；

将肿瘤细胞在T75 培养瓶中培养至对数增长期时，使用胰酶消化，培养基重悬，计数。用1ml注射器吸取密度为1×10⁷个/mL的细胞悬液，采用自制的尖端为100µm的针头将肿瘤细胞的细胞悬液注射入水凝胶骨架的管道内部，继而将水凝胶骨架转移至6孔板中，放入37℃温箱孵育，4h后，肿瘤细胞在纤维通道中贴壁，将水凝胶骨架夹取转移至另外孔；

在T75培养瓶中培养血管内皮细胞至对数增长期，使用胰酶消化，培养基重悬，计数，稀释为5×10⁵个/mL；将高浓度的血管内皮细胞细胞悬液通过注射器少量多次滴加到纤维外表面，平稳转移至温箱，孵育培养，4h后，血管内皮细胞在水凝胶骨架的外表面贴壁，得到仿生器官模型。

对上述仿生器官模型进行电镜扫描，观察得到如图一中右上所示。

实施例二

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为5%、2.5%、0.1%，其余成分为超纯水；

实施例三

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为15%、2.5%、0.1%，其余成分为超纯水；

实施例四

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%、2%、0.1%，其余成分为超纯水；

实施例五

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%、4%、0.1%，其余成分为超纯水；

实施例六

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%、2.5%、0.3%，其余成分为超纯水；

实施例七

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%、2.5%、0.5%，其余成分为超纯水；

实施例八

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为8%、3.5%、0.2%，其余成分为超纯水；

实施例九

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为12%、3.5%、0.3%，其余成分为超纯水；

实施例十

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为12%、3%、0.4%，其余成分为超纯水；

实施例十一

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为14%、2.5%、0.4%，其余成分为超纯水；

实施例十二

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为7%、3%、0.35%，其余成分为超纯水；

对比例一

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%、5%、0.1%，其余成分为超纯水；

对按照上述比例制得的仿生器官模型进行电镜扫描，观察得到如图一中左上所示。

对比例二

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%、2.5%、1%，其余成分为超纯水；

对按照上述比例制得的仿生器官模型进行电镜扫描，观察得到如图一中左下所示。

对比例三

本实施例与实施例一的区别在于对甲基丙烯酸酐化明胶：GelMa、聚乙二醇二丙烯酸酯：PEGDA、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂：LAP三者的浓度进行了调整，获得了不同硬度和孔隙的仿生器官模型，具体浓度如下：、

甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂的浓度分别为10%：0%：0.1%，其余成分为超纯水；

对按照上述比例制得的仿生器官模型进行电镜扫描，观察得到如图一中右下所示。

对比例四

本实施例与实施例一的区别在于对为流量泵控制内相流速与外相流速的关系进行相关验证与测试。

本实施例与实施例一的区别在于第三步的不同，具体不同如下：

第三步、使用两根30cm的塑胶软管 将注射针头与吸有水凝胶的注射器相连接，塑胶软管的外径为1.5 mm,内径为1.02 mm，水凝胶外相的流体通道置于五光环境下，将注射器固定于微流量泵上，开启微流量泵，使得内相流速0.1 mL/h，外相流速2mL/h，水凝胶外相以及内相逃逸材料进行流动，进行微流控纺丝,二者相配合生成单层中空结构的水凝胶骨架，如图2中左一所示，两相流体形成涡流，产生局部无孔道或缩窄弯曲通道的水凝胶骨架，微流控纺丝前，内外相通道均要用超纯水充盈，保持通道润滑。对比例五

本实施例与实施例一的区别在于对为流量泵控制内相流速与外相流速的关系进行相关验证与测试。

本实施例与实施例一的区别在于第三步的不同，具体不同如下：

第三步、使用两根30cm的塑胶软管 将注射针头与吸有水凝胶的注射器相连接，塑胶软管的外径为1.5 mm,内径为1.02 mm，水凝胶外相的流体通道置于五光环境下，将注射器固定于微流量泵上，开启微流量泵，使得内相流速0.4 mL/h，外相流速0.4mL/h，水凝胶外相以及内相逃逸材料进行流动，进行微流控纺丝,二者相配合生成单层中空结构的水凝胶骨架，如图2中左三所示，两相流体形成湍流，产生具有局部褶皱曲折通通道的水凝胶骨架，微流控纺丝前，内外相通道均要用超纯水充盈，保持通道润滑。

功能验证

水凝胶骨架负载细胞的食管癌仿生模型相对于培养基是开放的体系，在培养基中加入特定比例的Pg菌液或一定浓度的药物实现对整体模型的转染和用药。

Pg复苏和传代；革兰染色观察其纯度和状态；测OD值计算菌液浓度；

取1mL OD值为1的Pg菌液12000 rpm离心10min，弃上清用无菌PBS重悬；细菌与细胞10:1感染细胞24h，观察细菌感染前后细胞生长行为改变；、

取Sg（戈登链球菌）作为阴性对照组，以相同浓度感染细胞相同时间发现并不能对纤维中的细胞增殖和活性产生显著影响。

用无血清培养基溶解配置不同浓度梯度的药液，阿霉素从0.5-64μg/mL，5-氟尿嘧啶从10-1000μg/mL，每组设置10个浓度，换液处理24h。

测算得阿霉素，5-氟尿嘧啶的半数致死量分别为1.5μg/mL，160μg/mL。

对仿生食管模型进行组织原位的免疫荧光，免疫组化，ELISA，水凝胶表面的细胞层可以被胰酶消化，回收支架表面的混合细胞系，进行流式细胞分选，WesternBlot，PCR等功能试验，在体外构建的全新平台表征牙龈卟啉单胞菌对食管癌恶性进展的影响，以及临床常用的化疗药物在新设模型中的应用反应和预后。

分析

通过实施例一、对比例一、对比例二和对比例三电镜扫描结果可知，在图1中，当GelMA浓度保持为10%不变时，PEGDA1与LAP的比值越大，水凝胶的交联度升高，孔隙变小。

GelMA和PEGDA混合进行微流控纺丝，既能保障固化后材料的机械强度，且可通过PEGDA，LAP的比例对固化后材料机械模量进行调节，获得不同硬度和孔隙率的生物材料如图1；

同时，GelMA的混入为材料整体提供了较好的生物相容性，通过这种方式，具有特定形态的水凝胶在体外负载细胞形成具有生物响应性的微组织和类有机物。

通过实施例一、对比例四和对比例五的体式光镜的照片的观测可知，控制外相流速为2 mL/h，随着内相流速增高，通道内径变大；内相流速固定为0.4mL/h，随着外相流速增高，通道内径变小。

当外相与内相的流速比例在2-10间变化时，均可形成稳定层流，同轴打印具有平滑通道的水凝胶骨架，如图2左二所示；

但若外相流速过高，内相流速相对过低，两相流体形成涡流，则会打印出局部无孔道或缩窄弯曲通道的水凝胶骨架，如图2左一所示；

若外相流速过低，内相流速相对过高，两相流体形成湍流，则会打印出具有局部褶皱曲折通道的水凝胶骨架，如图2左三所示。

通过对不同内径的水凝胶骨架进行细胞负载，如图3所示，当通道内径偏小，不便于细胞向中空通道的注射，操作性降低，且细胞不能充分舒展和黏附，会倾向于聚团，成簇分布。

当通道内径偏大，注射入通道未贴壁的细胞又会在换液等操作期间脱落溢出到游离培养基中，降低纤维支架的细胞负载效率。

综合内外相流体在同轴装置中的稳定性和不同通道内径下细胞的表面黏附，我们选择设置外相流速2 mL/h，内相流速0.8 mL/h。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于，使用水凝胶作为仿生器官模型的骨架进行制备，所述水凝胶的组分以及质量百分浓度如下：

甲基丙烯酸酐化明胶 5-15%；

聚乙二醇二丙烯酸酯 2-4%；

苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂 0.1-0.5%；

超纯水 80.5-92.9%；

所述食管癌仿生器官模型的构建方法具体包括如下步骤：

S1、水凝胶的配置，将甲基丙烯酸酐化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂与纯水涡旋混合，得到水凝胶；

S2、塑型玻璃单元的搭建，使用两根直径不同的粗中空玻璃管和细中空玻璃管同轴放置，使得细中空玻璃管的内外两侧形成内腔与外腔，并使用两个注射针头分别连接内腔与外腔；所述粗中空玻璃管一端是锥形平口，所述细中空玻璃管与所述锥形平口之间的距离为190~210μm；

S3、微流控制单元的构建，使用软管将注射针头与注射器相连接，并将注射器连接于微流量泵上，在连接于内腔的注射器内装入内相逃逸材料，在连接于外腔的注射器内装入水凝胶外相；所述内相逃逸材料为聚乙烯醇溶液，所述聚乙烯醇溶液的质量百分浓度为10%；

S4、仿生器官模型骨架的形成与细胞负载，驱动微流量泵，使得内相逃逸材料与水凝胶外相通过内腔与外腔形成管状的流体，再使用紫外固化灯对管状的流体进行照射，得到固态的水凝胶骨架；在所述固态的水凝胶骨架的内壁上贴壁培养肿瘤细胞，外壁上贴壁培养血管内皮细胞，得到食管癌仿生器官模型，内相流速与外相流速的比值为1：2-10；

所述步骤S2中粗中空玻璃管与细中空玻璃管的直径比为3：1，所述粗中空玻璃管的内径与外径之比为1：2，所述细中空玻璃管的内径与外径比为1：1.2。

2.如权利要求1所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中所述水凝胶骨架所处环境温度为25-28℃。

3.如权利要求1所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞位于所述水凝胶骨架的内侧壁上，所述血管内皮细胞位于所述水凝胶骨架的外侧壁上。

4.如权利要求1所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中紫外固化灯的波长为365nm，功率为100W，所述紫外固化灯的照射时长为20s。

5.如权利要求1所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中肿瘤细胞与血管内皮细胞均为细胞悬液，所述肿瘤细胞与血管内皮细胞进行贴壁生长的要求如下：

肿瘤细胞在T75 培养瓶中处于对数增长期时，使用胰酶消化，培养基重悬，计数，所述肿瘤细胞的细胞浓度为1×10⁷个/mL；

血管内皮细胞在T75培养瓶中处于对数增长期时，使用胰酶消化，培养基重悬，计数，所述血管内皮细胞的细胞浓度为5×10⁵个/mL。

6.如权利要求1所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于，将肿瘤细胞贴壁生长在所述水凝胶骨架的内侧壁方法如下：

采用自制的尖端为100µm的针头将肿瘤细胞的细胞悬液注射入水凝胶骨架的管道内部，继而将水凝胶骨架转移至6孔板中，放入37℃温箱孵育，4h后，肿瘤细胞在纤维通道中贴壁。

7.如权利要求1所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法，其特征在于将血管内皮细胞贴壁生长在所述水凝胶骨架的外侧壁方法如下：

将高浓度的血管内皮细胞细胞悬液通过注射器少量多次滴加到纤维外表面，平稳转移至温箱，孵育培养，4h后，血管内皮细胞在水凝胶骨架的外表面贴壁。

8.权利要求1-7任一项所述的基于复合水凝胶的食管癌仿生器官模型的构建方法在构建仿生器官模型时的应用。