CN112424331A - 用于制造具有至少一个膜的细胞培养嵌入物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一个用于制造具有至少一个膜尤其至少一个生物膜的细胞培养嵌入物的方法，所述方法包括以下步骤：提供具有至少一个开口的至少一个嵌入物坯件；并且借助于生物打印法在嵌入物坯件中构成膜。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于制造具有至少一个膜的细胞培养嵌入物的方法，所述膜尤其是生物膜，和一种根据该方法制造的细胞培养嵌入物。
背景技术
对细胞培养的大规模的检查和测试标准地在多孔板中执行。为了在这种多孔板中培养单层的细胞层(所谓的单层)，已经开发了适合的嵌入物，其通常被称为细胞培养嵌入物。
细胞培养嵌入物是实用的、可渗透的或半渗透的支承设备，其具有用于研究与粘附相关的(附着的)和与粘附不相关的(非附着的)细胞系的易于使用性。所述细胞培养嵌入物设计用于实现一个比替选的二维的培养系统更具生理性的细胞培养环境。
根据多孔板的标准化的尺寸，也相应地调整细胞培养嵌入物的直径，使得其悬挂地定位在多孔中。
细胞培养嵌入物底部/足部处的膜形成细胞培养嵌入物的决定性部分。该膜能够具有不同的孔隙度并且由惰性塑料构成。在实验室日常工作中，细胞被播种在该膜上。经播种的细胞在正常情况中会长成汇合的单层。然后能够执行屏障或渗透实验。
如果在常规的细胞培养嵌入物中移除塑料膜并且引入生物聚合物，那么由于界面张力会构成弯月面。如果聚合物固化，产生具有凹状的膜的细胞培养嵌入物。该膜无法或者只能差地繁殖细胞，因为该膜由于重力/弯月面的组合被拉入细胞培养嵌入物的中心。在该路径上，在细胞培养嵌入物的中心产生细胞团聚并且不产生汇合的单层。
发明内容
因此，本发明基于如下目的：提供一种细胞培养嵌入物，其具有尽可能扁平且平面的、不具有锥体的生物膜。
该目的通过具有权利要求1的特征的方法和具有权利要求16的特征的借助于该方法制造的细胞培养嵌入物来实现。
相应地，提供一种用于制造具有至少一个膜尤其至少一个生物膜的细胞培养嵌入物的方法，所述方法包括以下步骤：
-提供具有至少一个开口的至少一个空心的嵌入物坯件；并且
-借助于生物打印法在嵌入物坯件中构成膜。
按照根据本发明的变型形式，所述方法包括以下步骤：
-提供具有至少一个开口的至少一个空心的嵌入物坯件，
-将用于产生膜的起始材料引入嵌入物坯件中，
-以生物打印法(例如通过辐照)构成膜，以及
-移除嵌入物坯件，其中所构成的膜保留在嵌入物坯件中。
将用于产生膜的起始材料引入嵌入物坯件中能够以不同的方式进行。因此，能够将嵌入物坯件引入包含用于产生膜的起始材料的容器中。在这种情况下，将嵌入物坯件浸入包含起始材料的液体中。
但是也可行的是，也能够将包含起始材料的液体引入(例如滴入)嵌入物坯件中。在这种情况下，需要通过嵌入物坯件的开口的适合的覆盖部或密封件来避免液体从嵌入物坯件的内部中流出。
根据另一根据本发明的变型形式，所述方法相应地包括以下步骤：
-提供具有至少一个开口的至少一个空心的嵌入物坯件，
-将嵌入物坯件引入包含有用于产生膜的起始材料的容器中，
-以生物打印法构成膜(例如通过辐照)，以及
-从容器中移除嵌入物坯件，其中所构成的膜保留在嵌入物坯件中。
根据另一根据本发明的变型形式，本方法包括以下步骤：
-提供至少一个空心的嵌入物坯件，
-覆盖嵌入物坯件的开口，并且通过嵌入物坯件的另一开口将用于产生膜的起始材料引入嵌入物坯件中，
-以生物打印法构成膜(例如通过辐照)，以及
-从一个开口移除覆盖部，其中所构成的膜保留在嵌入物坯件中。
在该方法中使用的嵌入物坯件在该变型形式中作为单独的、已经预制的坯件提供。嵌入物坯件优选圆形地构成有下部的和上部的开口。
在一个优选的实施方式中，所述方法包括以下步骤：
-提供至少一个圆形的、空心的嵌入物坯件，其具有下部的和上部的开口；
-以相对于嵌入物坯件的下部的开口相距预定的距离hm的方式将至少一个圆形的间隔保持器引入和设置到嵌入物坯件中，其中圆形的间隔保持器距嵌入物坯件的下部的开口的距离hm由在嵌入物坯件(内腔)中要产生的膜的厚度来确定；
-将用于产生膜的起始材料引入嵌入物坯件中；例如通过将设有至少一个间隔保持器的嵌入物坯件浸入包含用于产生膜的起始材料的容器中，或者通过将起始材料直接引入(滴入)设有至少一个间隔保持器的嵌入物坯件中；
-构成膜(例如通过辐照)，以及
-从嵌入物坯件中移除间隔保持器，其中所构成的膜保留在嵌入物坯件中。
因此，提供了如下方法，借助于所述方法利用打印技术在培养嵌入物中产生无锥体的、平面的生物膜。该膜被打印到“空”细胞培养嵌入物中。为此，提供了细胞培养嵌入物坯件，所述细胞培养嵌入物坯件然后能够通过压印膜完成批量生产生物的膜载体。在制成后，用生物聚合物膜代替塑料膜密封培养嵌入物。
生物聚合物的优点是更好的生长并且膜个性化地匹配待播种的细胞，因为并非任何细胞类型都可在塑料膜上培养，并且需要非常精确地协调其细胞外环境。尤其使用所谓的细胞外基质的所有生物聚合物作为聚合物，尤其胶原蛋白、透明质酸、明胶等。
相对于常规的细胞培养嵌入物，可借助于本方法制造的培养嵌入物具有许多改进：
提供由一种或多种生物聚合物构成的生物膜。这为细胞提供更生理性的培养环境。生物实验的所获得的结果比借助于常规的培养皿或细胞培养嵌入物所能够产生的结果有信服力得多。
膜能够被改型，因为物理化学性质会受到基质的成分影响。
膜例如能够光学透明地产生，这实现实时无创地控制细胞群体。
检测物质能够与基质耦合，以便检测在实验期间不同的现象。
除此之外，能够在基质上产生不同的体系结构。除了完全平坦的面之外，也能够产生不同的隔室、沟道等。此外，例如能够将导电元件压印到膜中，以便提供电刺激或记录来自细胞的电信号。
已经能够将细胞、细菌、病毒和植物病菌引入生物膜中。
能够在一个平面中使用多于一种的材料类型，例如以便产生具有变化的基质成分的区域。
膜能够由多个打印层构成，使得不仅能够在X-Y平面中而且能够在Z平面中产生不同的膜成分。
膜的高度能够通过所述方法确定。
在本方法的一个实施方式中，使用的嵌入物坯件空心柱体状地或截锥状地构成。
在空心的、截锥状的嵌入物的情况中，截锥具有朝向下部的开口减小的直径(锥形的渐缩部)、半径为R的底面G(上部的开口)、半径为r的顶面D(下部的开口)和高度hk。
嵌入物坯件的材料是细胞和生物相容的聚合物，但尤其是PP、PE、PLA、PS、PC、PTFE、PVC、PMMA、PAA、PAN、PEG、PET、PU、硅酮等。
嵌入物坯件的典型尺寸适应于正常的多孔板的高度和宽度。在表1中列举了传统使用的多孔板的典型尺寸。
| 培养皿 | 高度(mm) | 直径(mm) | 面积(cm<sup>2</sup>) | 体积(ml) |
| 100mm | 20 | 100 | 55 | 20 |
| 6孔 | 20 | 35 | 9.5 | 16.8 |
| 12孔 | 20 | 22 | 4 | 6.9 |
| 24孔 | 20 | 16 | 2 | 3.4 |
| 48孔 | 20 | 10 | 1 | 0.95 |
| 96孔 | 20 | 6 | 0.3 | 0.35 |
表1当前的细胞培养嵌入物的尺寸相应如下(参见表2)：
| 培养皿 | 高度(mm) | 直径(mm) |
| 100mm | 在19和5之间，例如15 | 在54和23之间，例如44 |
| 6孔 | 在19和5之间，例如15 | 在34和23之间，例如25 |
| 12孔 | 在19和5之间，例如15 | 15在21和11之间，例如15 |
| 24孔 | 在19和5之间，例如15 | 在15和6之间，例如10 |
| 48孔 | 在19和5之间，例如15 | 在9和2之间，例如5 |
| 96孔 | 在19和5之间，例如15 | 在9和2之间，例如5 |
表2
当前的培养嵌入物的尺寸不经受精确的划分，因为各个多孔板的规格因制造商而异。因此，当前提供培养嵌入物的平均值。
能够使用标准坯件或个性化地生产的嵌入物坯件。个性化的生产实现嵌入物与其功能匹配。在此，其大小和其形状能够变化。这例如可以涉及细胞培养嵌入物处的悬置或足部的形状。因此，细胞培养嵌入物能够在其上侧或在其上端具有向外朝向的突起部，使得能够悬挂式地培养细胞培养嵌入物。除此之外，细胞培养嵌入物能够在其下侧或在其下端(即细胞培养嵌入物的与多孔板的底部接触的部分)设有向外朝向的并且成角度的突起部(足部)。这实现细胞培养嵌入物自动地竖立在多孔板中。
除此之外，例如也能够在生物基质的平面中产生留空部或凹槽，以便实现更好地附着于细胞培养嵌入物。此外，也能够将导电元件引入细胞培养嵌入物中，以便获得信号导出或传感器装置。
此外，嵌入物坯件的边缘能够连续地构成，使得仅经由膜本身的介质交换是可行的。
但是也可行的是，切割边缘。这样形成的切口能够具有可任意调节的高度，例如切口能够低于在多孔板中存在的细胞介质的填充高度。相应地，经由切口对培养嵌入物的内腔进行供给并且穿流膜载体是可行的。在后一种情况下，在外部的多孔板和坯件的内腔之间相应地不存在坯件的屏障功能。这样的载体用于纯培养而不用于屏障功能。
在本方法的另一实施方式中，待设置到嵌入物坯件中的间隔保持器设有至少一个开口，所述开口实现气泡从随后制造的膜中导出并从而避免气泡在膜中聚集。开口应尽可能设置在间隔保持器的边缘上。
该开口也能够被描述为“气泡捕捉器”。气泡捕捉器是间隔保持器中的切口或将在下文中描述的辅助膜中的被释放的部位，所述部位确保空气流出。在将嵌入物坯件引进间隔保持器(或辅助膜)之间的膜聚合物溶液中时所产生的气泡能够在该路径上逸出。如果空气留在间隔保持器或辅助膜下方，那么该空气可能作为气体夹杂嵌置于基质中，或者基质可能在该部位处没有平坦的面。为了确保平坦的沉降面，必须防止空气的夹杂。在理想情况下，气泡捕捉器应稍微用膜聚合物溶液填充，以便保证间隔保持器或辅助膜下方的所有空气都挤出。
在本方法的另一实施方式中，至少一个间距保持器以印模的形式构成。这样的印模适合于截锥状的或空心柱体状的嵌入物坯件。印模的高度或长度在此预设距嵌入物坯件的下部的开口的所期望的距离hm并因此预设之后的膜的厚度。有利的是，将印模涂覆在外面上，以便防止在移除印模时膜尤其生物膜的附着。
印模的材料由非附着的聚合物构成。在这种情况下，非附着是指在打印过程期间和之后，在占位器/印模和生物膜之间的附着。印模的材料尤其能够是PTFE、PEG或硅酮。
使用印模实现批量制造具有膜的细胞培养嵌入物。
在一个实施方案变型形式中，所述方法包括以下步骤：
-提供唯一的印模或多个印模的阵列，其中一个或多个印模竖直地取向；
-将至少一个嵌入物坯件与每个印模相关联，其中印模中心地设置在相应的嵌入物坯件中；
-设置固定机构，以便将嵌入物坯件与相应的印模连接；
-经由自由的开口将用于产生膜的起始材料，优选包含起始材料的液体引入嵌入物坯件中；
-优选用抗粘膜(例如PDMS、FEP、PTFE)覆盖嵌入物坯件的自由的开口，
-通过辐照(优选从上方穿过膜的辐照)构成聚合物膜；
-移除覆盖部和固定机构，和
-移除印模或印模阵列。
在将嵌入物坯件与印模相关联时，嵌入物坯件例如能够套到印模上，或者印模被引入嵌入物坯件中。用于将嵌入物坯件与相应的印模连接的固定机构能够是夹紧机构(例如由弹簧构成)，所述夹紧机构引起对嵌入物坯件的所述开口之一的防漏的封闭，使得随后待引入的用于产生膜的(液态的)起始材料保留在嵌入物坯件中并且不漏出。
也可行的是，在批处理方法中改变方法步骤的顺序。因此，能够按以下顺序执行所述方法：
-提供基体，尤其膜(例如PDMS膜)；
-在基体上的分别设置用于嵌入物坯件的部位处提供用于产生膜的起始材料的等分试样(使用移液器或多沟道移液器)
-在基体上围绕用于产生膜的起始材料的相应的等分试样设置嵌入物坯件；
-设置固定机构，以便将嵌入物坯件固定在基体上；
-将单个印模或多个印模的阵列引入相应的嵌入物坯件中，其中一个或多个印模竖直地取向；
-通过辐照(优选从下方穿过膜)构成聚合物膜；
-从嵌入物坯件中移除印模或印模阵列；和
-移除嵌入物坯件与在其中构成的聚合物膜，其中所构成的膜保留在嵌入物坯件中。
在另一实施方式中，至少一个间隔保持器构成为盘。
盘的材料与印模的材料相对应。盘由PTFE、PEG或硅酮构成。盘的直径对应于常见的细胞培养嵌入物规格。盘的厚度对应于所期望的膜厚度，其在10μm与1000μm之间，优选在50μm与1000μm之间，尤其优选在200μm与800μm之间，更优选在300μm与500μm之间。
这种盘尤其适用于直径朝向下部的开口减小的截锥状的嵌入物坯件。优选地，盘贴靠在嵌入物坯件的内壁上。盘的直径是可个性化地设定，使得盘距嵌入物坯件的下部的开口的距离通过盘的直径确定；也就是说，盘直径越接近下部的开口的半径r，盘和打开的顶面之间的距离hm就越小，其中距离hm限定待产生的膜的厚度(或高度)。
在本方法的另一变型形式中，间隔保持器，尤其盘形的间隔保持器与辅助膜组合使用。
在这种情况下，辅助膜优选在间隔保持器，尤其盘状的间隔保持器的上侧(即间隔保持器的朝向上部的开口指向的一侧)上，通过加入包含适合于构成辅助膜和随后的固化的起始材料的液态组分(例如通过用光辐照或类似的物理化学过程)构成。
辅助膜由如下材料构成，所述材料可通过物理化学或酶促过程溶解，尤其PEG、泊洛沙姆、透明质酸、壳聚糖、甲壳质、胶原蛋白等。
辅助膜借助打印机在嵌入物坯件中产生。在此，将嵌入物坯件引入打印机中，例如Cellbricks公司的生物打印机，并且通过立体光刻产生辅助膜。也就是说，将坯件置于液态的聚合物中，并且通过从浴上方和下方进行辐照来固化。
除此之外，辅助膜能够借助于作为间隔保持器的盘产生。在此，将嵌入物坯件浸入具有液态的辅助基质的载体中，间隔保持器例如盘位于所述载体的底部中。盘的直径在此与坯件的内腔齐平。如果在这种状态中通过从浴上方或下方进行辐照使嵌入物坯件内的液态的基质固化，那么会在嵌入物坯件中产生固态的辅助膜。如果将嵌入物坯件与辅助膜从具有液态的、未固化的辅助基质的载体中拉出，那么间隔保持器会保留在具有液态的辅助基质的器皿中。在具有辅助膜的嵌入物坯件中，由此在辅助基质和嵌入物坯件的封闭部之间产生自由空间，所述自由空间可在下一步骤中能够被铺设另一膜。辅助膜在此能够固化，使得在辅助膜的下侧上产生如下结构，所述结构作用为用于使随后待建立的膜成形的阴模。
在辅助膜固化之后，移除间隔保持器，尤其盘形的间隔保持器，使得稳定的辅助膜/辅助层保留在嵌入物坯件中。该辅助膜包含用于导出气泡的开口(也参见如上所述的“气泡捕捉器”)。
紧接着，能够将设有至少一个辅助膜的嵌入物坯件引入到容器中，所述容器包含用于产生膜的起始材料。膜例如通过辐照构成(也参见下文)，并且在膜构成之后，通过合适的物理化学方法(例如溶解)将辅助膜从嵌入物坯件中移除，其中所构成的(扁平的)膜保留在嵌入物坯件中。
辅助膜是完全平坦的，因为该层已经借助于间隔保持器预先制成。除此之外，辅助膜包含作用为气泡捕捉器的凹口。在引入生物聚合物时形成的潜在气泡能够经由该排出口流出，并且不会保留并且在固化中合并到生物聚合物中。在填入生物聚合物之后，该生物聚合物固化。然后，能够借助物理化学反应，例如温度升高/降低、pH值变化、溶解等来溶解辅助膜，使得在溶解结束后仅保留平坦的生物聚合物膜(除了因气泡捕获器引起的小的连接片)。
如已经多次提到的那样，在将具有间隔保持器的培养嵌入物浸入包含用于产生膜的起始材料的容器中之后，构成膜并且在此优选构成生物膜。起始材料尤其是可光聚合的物质。
膜的构成利用生物打印法实现，例如在WO 2016/075103A1中所描述的那样。
在这种情况下，在将具有间隔保持器的培养嵌入物引入具有与可光聚合的液体的容器或反应皿后，将光辐射聚焦到第一焦平面上，所述第一焦平面位于反应皿的填充有液体的区域内。于是，通过该光辐射在反应皿中产生聚合的结构。聚合的结构在此位于第一层中。
能够任意地将其他层施加到该第一层上。为此，将另一可光聚合的液体引入反应皿中，其中先前产生的聚合的结构至少部分地通过所述另一可光聚合的液体覆盖。优选地，先前产生的聚合的结构完全地被所述另一可光聚合的液体覆盖。此时在另一焦平面中执行进一步的光辐照，所述另一焦平面位于反应皿的填充有其他液体的区域内。因此，该另一焦平面至少在已经产生的聚合的结构或该聚合的结构的层的方面与第一焦平面不同。
现在，能够借助于相应其他可光聚合的液体任意地重复上述引入另一可光聚合的液体、将光聚焦到另一焦平面上并且在另一层中产生另一聚合的结构的步骤，直到产生所期望的膜为止。
待生成的膜的层厚度能够任意地设定并且匹配于相应的要求。因此，膜的层厚度能够在10μm至1000μm之间，优选在50μm至1000μm之间，尤其优选在200μm至800μm之间，更优选在300μm至500μm之间，例如在310μm至325μm之间。
可光聚合的液体也能够包含生物细胞或其他物质。如果由于光辐照而引起聚合，那么包含在液体中的细胞也将嵌入相应的聚合物中。
通过这种打印方法，膜能够由任意的聚合物，优选生物聚合物制造。
相应地，所述膜能够由以下材料构造或包括以下材料：工程生物聚合物，例如明胶；α和β多糖，如果胶、甲壳质、胼胝质和纤维素；脂质，尤其成膜的脂质，如磷脂、鞘脂、糖脂和醚脂；聚羟基链烷酸酯；生物基聚合物，如聚丙交酯、聚羟基丁酸酯；石油基聚合物，如聚酯，尤其聚乙二醇、聚乙烯醇、聚己二酸丁二酯(PBAT)、聚丁二酸丁二酸酯(PBS)、聚己内酯(PCL)、聚乙交酯(PGA)；合成肽，如重组地制造的氨基酸、酰胺；细胞外基质的组成部分，如胶原质、原纤蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖，尤其透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和硫酸角质素。优选的膜材料是胶原质、透明质酸、壳聚糖、明胶、PLA、PEG及其组合。
在一个实例中，膜由明胶和作为添加剂的胶原质构成。为了制造起始材料，使用适合的光引发剂，例如苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂(LAP)。
在另一实施方式中，设有用于将膜保持在嵌入物中的闭锁机构。在此优选的是，至少一个闭锁机构以载体的形式构成，所述载体由匹配于膜材料的不同的结构构成，尤其由栅格状的或辐条状的结构构成。
在另一方法变型形式中，利用上述打印方法由嵌入物坯件和膜一件式地(一锅合成法)构成细胞培养嵌入物。与在WO 2016/075103A1中所描述的方法类似，一锅合成法与可光聚合的材料相加地进行。在此，首先支架的基底由第一(排斥细胞的)生物材料打印。然后由第二生物材料制成生物相容层。在最后的步骤中，支架通过边缘来完备。这两种材料在一个打印过程中处理。
在此形成的嵌入物坯件包括(上部的)开口，并且能够包括底部。嵌入物坯件优选由第一排斥细胞的生物材料或生物聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或其它针对嵌入物坯件在上文中所提到的可行的聚合物材料之一制造。在嵌入物坯件的能够生长有细胞材料的底部上，加入例如由明胶构成的另一生物相容的和有生物功能性的生物聚合物作为膜。通过两种不同的材料的组合产生支架，所述支架能够在生物相容的材料上有针对性地繁殖细胞。
在较长的培养时间期间，可能产生生物膜的变化，例如由于细胞收缩或变化引起。闭锁机构，例如栅格，在这种情况中防止生物膜滑出或掉出培养嵌入物。在其最简单的实施方式中，能够将闭锁机构置于细胞培养嵌入物的下侧上，即承载膜的一侧。闭锁机构例如栅格的保持基于简单的压配合。为了后续又从培养嵌入物中移除闭锁机构(并且还有膜)，压配合例如能够借助于一种开瓶器再次移除。在这种情况下，压配合简单地撤除。
如在上文中已经说明的那样，可行的是，由两种或更多种聚合材料，优选生物聚合物在坯件中制造生物膜。所述材料在此能够以不同的体系结构设置。因此，不同的聚合物材料能够一个接一个层状地叠置，其中层的数量可任意地自由选择。在一个变型形式中，分别设有第一聚合物的层和第二聚合物的层。也可以考虑，聚合物材料并排地设置在一层中。因此，在一个变型形式中，能够设有由第一聚合物材料构成的膜部段，其中所述膜部段(中心地)集成到第二聚合物材料中，也就是说，由第一聚合物材料构成的膜部段由第二聚合物材料包围。
在另一实施方式中，设有膜的三维体系结构。为此，能够利用几何形状打印膜。因此，例如能够引入绒毛、沟道、堆起部、凹处等——也由不同的材料构成——。因此，待进行繁殖的膜表面能够构成有规则或不规则的结构(堆起部、凹处)。
在一个实施方式中，能够将至少一个沟道引入膜中。所述沟道例如能够用于对坯件的内部的隔室进行供给。沟道在此作用为具有营养介质的介质载体，所述营养介质通过沟道被冲掉。在膜上的隔室内部中繁殖的细胞能够从沟道中穿过膜来供给。
此外可行的是，将功能材料引入膜中。例如能够在打印过程期间将附加的检测器、染料、酶、趋化因子、纳米颗粒等集成到膜中。随着时间的推移，该材料能够用于细胞培养的在线监测。例如能够通过荧光染料或者当前的氧饱和度或pH值检测细胞死亡。功能材料在此能够与内部的边界层和外部的边界层接触或不接触。功能化在此能够通过颜色转变、辐照或将以不同方式进行检测的测量来观察。功能材料能够逐点地嵌入膜材料中，或者也能够面状地或层状地设置在膜中。
也可行并且可设想的是，例如将膜表面分成区段，印入细胞阵列或引入梯度。就此可行的是，膜的厚度和表面精确地结构化。
此外，光学透明度能够受生物基质的配方影响。例如能够产生透明的基质，所述透明的基质允许对细胞群体的光学控制。因此，透明性允许无创地控制细胞群体，这借助于常规的细胞培养嵌入物是不可行的。
除此之外，能够以限定的方式将(非聚合物的)其他材料引入膜和/或坯件中。以该方式，例如还能够通过引入例如传感器装置、检测、能导电的材料、化学试剂、纳米颗粒等来实现其他功能。
因此，在一个实施方式中，坯件设有至少一个探针。所述至少一个探针，优选两个探针，能够分别设置在坯件的内侧和外侧上。通过使用探针，能够确定电阻，由此能够推断出膜和细胞层的密度。
借助于本方法，现在可制造细胞培养嵌入物，其由嵌入物坯件与至少一个设置在所述嵌入物坯件中的膜，尤其至少一个生物膜构成，其中所述至少一个膜平坦地构成并且不具有锥体；也就是说，能够借助于该方法提供具有汇合的单层的细胞培养嵌入物。
本细胞培养嵌入物能够用于培养不同的细胞系并且紧接着用于执行屏障或渗透实验。
适合作为目标系的是：显示出屏障功能的所有细胞和细胞系，例如内皮细胞、滋养细胞、星形胶质细胞、肠上皮细胞等；或者显示出代谢功能的细胞和细胞系，例如肝细胞、心肌细胞、肌细胞等。通常，所有粘附性的细胞类型均适用。
附图说明
下面根据多个实例参考附图阐述本发明。附图示出：
图1示出具有孔的常规的培养嵌入物与根据本发明制造的细胞培养嵌入物的比较；
图2a示出根据本发明的方法的第一实施方式；
图2b示出根据本发明的方法的第二实施方式；
图2c示出根据本发明的方法的第三实施方式；
图3示出根据本发明的方法的第四实施方式；
图4A示出所制造的膜在培养嵌入物中的固定部的示意图；
图4B示出图4A的固定机构的不同的实施方式的示意图；
图5示出根据本发明制造的细胞培养嵌入物的第一实施方式；
图6A示出根据本发明的细胞培养嵌入物的培养有细胞的膜。
图6B示出在根据本发明的细胞培养嵌入物中繁殖有细胞的膜的横截面照片；
图6C示出根据本发明的细胞培养嵌入物中繁殖有细胞的膜的显微照片；
图7示出根据本发明制造的细胞培养嵌入物的其他实施方式；
图8示出根据本发明制造的细胞培养嵌入物的另一实施方式，以及
图9示出根据本发明制造的细胞培养嵌入物的又一实施方式。
具体实施方式
在图1中，在左侧a)上示出具有孔的常规的细胞培养嵌入物。在细胞培养嵌入物的底部处形成的膜由孔隙率可设定的惰性塑料构成。在实验室日常工作中，细胞被播种在该膜上，所述细胞在正常情况下生长为单层，并且能够借助于所述细胞执行屏障或渗透实验。
在图1的右侧b)上，示出具有根据本发明的方法制造的生物膜的培养嵌入物。所构成的生物膜是平坦的并且不具有锥体。无锥体的膜实现细胞的良好繁殖。
在图2a中示意性地示出根据本发明的方法的第一实施方式，其中在此呈印模形式的间隔保持器被引入到截锥状的培养嵌入物中。印模的高度能够个性化地调整，使得在将印模引入培养嵌入物后，可任意地设定印模和培养嵌入物的下部的开口之间的距离。印模和培养嵌入物的下部的开口之间的距离在此预设随后待构成的生物膜的所期望的高度或厚度。此外，印模必须涂覆有合适的材料，以便防止在从培养嵌入物中移除印模时所构成的生物膜的粘附。
在随后的第二步骤中，将培养嵌入物与引入其中的印模引进具有可聚合的液体的反应皿中，其中可聚合的液体包含用于制造所期望的生物膜的起始成分。印模应包含开口(“气泡捕捉器”)，以便避免气泡聚集在生物膜中。
在所述方法的下一第三步骤中，以打印方法构成生物膜，其中光在焦平面中辐照到可聚合的液体上，由此引起在焦平面上聚合成生物膜。
在生物膜固化后，印模由于其材料覆层能够轻松地从培养嵌入物中移除(步骤4)而平坦的生物膜保留在培养嵌入物中。
在图2b和2c中示出的本方法的实施方式实现使批量产生膜。
在所述方法的在图2b中示出的实施方式中，执行以下步骤：1)提供单一的印模或多个印模的阵列，其中所述一个或多个印模竖直地取向；2)将至少一个嵌入物坯件与每个印模相关联，其中所述印模中心地设置在相应的嵌入物坯件中；在使嵌入物坯件和印模相关联时，嵌入物坯件例如能够套到印模上，或者印模被引入到嵌入物坯件中；3)设置固定机构(例如具有弹簧的夹紧机构)，以便将嵌入物坯件与相应的印模连接；4)经由自由的开口(例如借助于移液管)将一定量的压力液体(具有用于产生膜的起始材料)引入到嵌入物坯件中；5)优选用膜(PDMS膜)覆盖嵌入物坯件的自由的开口，6)通过辐照(优选从上方穿过膜的辐照)构成聚合物膜；7)移除PDMS膜；8)移除固定机构，并且9)移除印模或印模阵列。
在所述方法的在图2c中示出的实施方式中，改变批处理方法中的方法步骤的顺序：1)提供膜(例如PDMS膜)；2)在膜上的如下部位处提供用于产生膜的起始材料的等分试样，所述部位分别针对嵌入物坯件设置(利用移液器或多沟道移液器)；3)在膜上围绕用于产生膜的起始材料的相应的等分试样设置嵌入物坯件；4)设置固定机构，以便将嵌入物坯件固定在膜上；5)将单一的印模或多个印模的阵列引入相应的嵌入物坯件中，其中使一个或多个印模竖直地取向；6)通过辐照(优选从下方穿过膜)构成聚合物膜；7)从嵌入物坯件中移除印模或印模阵列；8)移除嵌入物坯件与在其中构成的聚合物膜。紧接着，例如能够将设有聚合物膜的嵌入物坯件支承在多孔板中。
根据本发明的方法的在图3中示出的第四实施方式使用盘代替印模来作为间隔保持器。在第一步骤中，将盘引入培养嵌入物中，并且经由到培养嵌入物的下部的开口的距离来限定待构成的膜的厚度。在通过作为占位器或间隔保持器的盘确定所期望的后续的膜高度之后，在第二步骤中将可聚合的液体引入培养嵌入物内部，所述液体然后通过光入射或类似的物理化学过程固化以构成辅助膜。
在辅助膜固化后，在第三步骤中再次移除作为间隔保持器的盘并且留下稳定的辅助膜，所述辅助膜具有作为“气泡捕捉器”的开口。
在下一第四步骤中，将具有辅助膜的培养嵌入物引入具有液态的生物聚合物的反应皿中并且紧接着在打印方法中通过辐照进行固化。
在生物膜固化并且将培养嵌入物从反应皿中移除之后，由生物膜和辅助膜构成的双层保留在培养嵌入物中。辅助膜在最后的步骤中通过物理化学过程或简单的溶解被移除并且留下平坦的生物膜。
为了防止打印的膜层脱落，在制成生物膜后，能够在培养嵌入物下方安置塑料栅格(参见图4A)。借助于栅格保持或锁住生物膜，所述栅格通过压配合锁在培养嵌入物的足部处。生物膜的这种闭锁能够通过开瓶器容易地再次移除，以便确保接近生物膜或移除生物膜。闭锁机构能够格栅状地或辐条状地构成(参见图4B)。
根据本发明制造的细胞培养嵌入物的一个实施方式在图5中示出。在此，细胞培养嵌入物柱状地构成。在上部的开口处设有保持接片，所述保持接片实现细胞培养嵌入物在多孔板中的营养液中嵌入或从营养液中移除。在下部的开口处可看到栅格，所述栅格作为用于将生物膜保持在柱状的壳体中的闭锁机构。
根据膜材料，在生物膜上能够繁殖不同的细胞，所述细胞构成单层(参见图6A，6B)。
图6A中的图示示出经繁殖的载体的上侧和下侧的显微透视照片。在左侧示出具有用于膜的保持装置的下侧，在右侧示出具有经繁殖的表面的载体的上侧。使用Caco-2细胞作为细胞。
图6B的图像以借助于2-光子显微镜执行的方式示出贯穿繁殖有HUVEC细胞的明胶膜的横截面。各个颜色示出在该试验中检查过的不同的标记：DAPI(细胞核)，vWF和CD31(血管细胞标记)。能够证实细胞的极化和从而证实其天然的表现。
在图6C中示出的显微照片示出贯穿膜的侧向截面。图像的上侧是膜的上侧，繁殖有细胞的膜对图像进行划分，并且图像的下半部是载体的下侧。各个颜色在此示出细胞朝向膜的极化。在显微照片的情况下，能够示出细胞朝向膜的增强的胶原质产生。所述细胞是Vero细胞。除此之外，细胞核同样用DAPI染色。借助所述试验，应示出细胞的极化和交互。相比之下，在皮氏培养皿中该效应较少地或根本没有表现出来。
在接下来的两个图像中，检查标记ITGB1(右)和aPKC(左下)，所述标记同样记录了朝向或远离膜的极化。
当前的细胞培养嵌入物针对屏障功能或切口(图7，b)能够构成有连续的边缘(图7，a)。切口在此能够位于多孔板中的介质液位以下，使得能够进行对在膜上繁殖的细胞的营养供给。
细胞培养嵌入物能够设有两种或更多种不同的材料作为坯件中的膜，其中所述材料能够设置在不同的体系结构中，例如并排地设置(图7，c)或一个接一个相叠地设置(图7，d)或设置在其他体系结构中。这种体系结构能够分别引入到用于悬挂或具有足部的坯件中。
在细胞培养嵌入物的另一变型形式中，打印具有几何形状的膜。膜并非必须仅直地引入到嵌入物坯件中，而是还能够具有建筑学的形状。例如能够引入绒毛、沟道、堆起部，凹处(图7，e)，其也由不同的材料制造(图7，f)构成。这种体系结构能够分别引入到用于悬挂或具有足部的坯件中。
能够将沟道引入细胞培养嵌入物的膜中，所述沟道能够从坯件外部冲洗(图7，g，h)。在这种情况下，沟道能够用于对坯件的内部的隔室进行供给。沟道在此作用为具有营养介质的介质载体，所述营养介质通过沟道冲走。在隔室的内部中在膜上繁殖的细胞能够通过膜进行供给。
也能够将功能性材料引入到细胞培养嵌入物的膜中。例如能够在打印过程期间将附加的检测器、染料、酶、趋化因子、纳米颗粒等集成到膜中。随着时间的推移，该材料能够用于细胞培养的在线监测。例如能够通过荧光染料或当前的氧饱和度或pH值检测细胞死亡。功能性材料在此能够与内部的边界层和外部的边界层接触或不接触。功能化在此能够通过颜色转变、辐照或将以不同方式进行检测的测量来观察。功能材料能够逐点地引入膜中(图7，i)，或者也能够面状地引进膜中(图7，j)。
细胞培养嵌入物还能够实现通过电阻测量膜密度。在这种情况下，能够使用专用的坯件，其中在坯件处分别在内部和外部安置探针，以便能够碰到电阻并从而推断出膜和细胞层的密度(图7，k)。
图8示出细胞培养嵌入物，所述细胞培养嵌入物在其下侧或在其下端(即，细胞培养嵌入物的与多孔板的底部接触的部分)处设有向外指向的并且成角度的突起部(足部)。这实现细胞培养嵌入物自主地立在多孔板中。
图9示出细胞培养嵌入物的另一变型形式。在细胞培养嵌入物的该变型形式中，使用两种生物材料，其性质可能不同。细胞培养嵌入物由具有底部的柱体构成(参见图示生物聚合物2，蓝色)。在底部处加入另一生物聚合物(参见图示生物聚合物1，绿色)。材料b(参见图示)形成框架，所述框架给予建造稳定性。在所述实例中，生物聚合物基于聚乙二醇(PEG)，即生物相容但具有排斥细胞的聚合物。将材料a加入材料b中，所述材料a在所述实例中基于明胶。与PEG相比，明胶不仅是生物相容的，而且具有生物功能性，使得细胞能够在该材料上生长。通过这两种材料的组合产生支架，所述支架能够有针对性地繁殖细胞。在此，包括生物聚合物1(a)的面确定细胞能够生长的最大区域。在繁殖时，细胞生长到直至边缘。因为边缘由排斥细胞的聚合物2(b)构成，所以所述细胞不能在边缘处繁殖。生长在该限界处停止。
实例：
借助于模压法制造直径为12mm的细胞培养嵌入物。在这种情况下，使用浓度为10％(W/V)的明胶基质，给所述明胶基质中掺入浓度为0.1％(W/V)的LAP作为引发剂。除此之外，胶原质I被用作为添加剂。
用硅酮印模填充坯件，并将其引入到打印机中的槽中，所述槽包含上述液态的明胶基质，使得坯件置于打印机中的槽的底部上。为了产生500μm的膜，相应地用印模预先设定距离。
然后通过波长为385nm的辐照使明胶基质固化。在固化后，将载体从槽和打印机中移除。除此之外，移除印模并且留下具有之前限定的高度并且具有用于进行繁殖的平坦的面的细胞培养嵌入物。
制造两种不同的细胞培养嵌入物。第一嵌入物具有胶原质I作为添加剂的膜，而第二嵌入物具有没有这种添加剂的膜。在这种情况下，明胶膜是透明的并且能够光学地检查。
在制造具有生物膜的细胞培养嵌入物后，所述细胞培养嵌入物繁殖Vero细胞。在这种情况下，其是草原猴的肾细胞系。该细胞系通常用于感染试验。在繁殖后，Vero细胞在细胞培养嵌入物的整个面上构成汇合的单层。
在繁殖后，使用标记有GFP的牛痘菌株，以便用所述菌株感染Vero细胞。在28天的实验过程中，能够通过荧光病毒和透明细胞培养嵌入物检查并且观察感染的扩散。
在实验之后，将膜冲出并且深度冷冻。除此之外，可使用常规的组织学方法对膜进行切割和染色，使得可以进行组织学复查。
Claims (20)
1.一种用于制造细胞培养嵌入物的方法，所述细胞培养嵌入物具有至少一个膜，尤其至少一个生物膜，所述方法包括以下步骤：
-提供具有至少一个开口的至少一个空心的嵌入物坯件；并且
-借助于生物打印法在嵌入物坯件中构成膜。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法具有以下步骤：
-提供具有至少一个开口的至少一个空心的嵌入物坯件，
-将用于产生所述膜的起始材料引入到所述嵌入物坯件中，
-以生物打印法构成所述膜，以及
-移除所述嵌入物坯件，其中所构成的膜保留在所述嵌入物坯件中。
3.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，设有以下步骤：
-提供至少一个空心的嵌入物坯件，
-覆盖所述嵌入物坯件的一个开口，并且通过所述嵌入物坯件的另一开口将用于产生所述膜的起始材料引入到所述嵌入物坯件中，
-以生物打印法构成所述膜，并且
-从所述一个开口上移除所述覆盖部，其中所构成的膜保留在所述嵌入物坯件中。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，设有以下步骤：
-提供具有至少一个开口的至少一个空心的嵌入物坯件；
-将所述嵌入物坯件引入到包含有用于产生膜的起始材料的容器中，
-借助于生物打印法在所述嵌入物坯件中构成所述膜，以及
-从所述容器中移除所述嵌入物坯件，其中所构成的膜保留在所述嵌入物坯件中。
5.根据上述权利要求中的任一项所述的方法，具有以下步骤：
-提供至少一个圆形的、空心的嵌入物坯件，所述嵌入物坯件具有下部的和上部的开口；
-以相对于所述嵌入物坯件的下部的开口相距预定的距离hm的方式将至少一个圆形的间隔保持器插入和设置到所述嵌入物坯件中，其中所述圆形的间隔保持器与所述嵌入物坯件的下部的开口的距离hm由在所述嵌入物坯件中要产生的膜的厚度来确定；
-将用于产生所述膜的起始材料引入设有所述至少一个间隔保持器的所述嵌入物坯件中；
-借助于生物打印法构成膜，以及
-从所述嵌入物坯件中移除所述间隔保持器，其中所构成的膜保留在所述嵌入物坯件中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述间隔保持器设有至少一个开口，所述开口实现气泡从所述膜中导出。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述至少一个间隔保持器以印模的形式构成。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少一个间隔保持器构成为盘。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述间隔保持器，尤其盘状的间隔保持器与辅助膜组合使用。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，通过加入包含适合于构成所述辅助膜和随后的固化的起始材料的液态组分，在所述间隔保持器，尤其盘状的间隔保持器的上侧上构成所述辅助膜。
11.根据权利要求9至10中任一项所述的方法，其特征在于，在所述辅助膜固化之后，移除所述间隔保持器，尤其盘状的间隔保持器。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其特征在于，将设有所述至少一个辅助膜的所述嵌入物坯件引入包含用于产生所述膜的起始材料的容器中，构成所述膜，并且通过适合的物理化学方法从所述嵌入物坯件中移除所述辅助膜，其中(平坦的)所构成的所述膜保留在所述嵌入物坯件中。
13.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述膜由以下材料构造或包括以下材料：工程生物聚合物，例如明胶；α和β多糖，如果胶、甲壳质、胼胝质和纤维素；脂质，尤其成膜的脂质，如磷脂、鞘脂、糖脂和醚脂；聚羟基链烷酸酯；生物基聚合物，如聚丙交酯、聚羟基丁酸酯；石油基聚合物，如聚酯，尤其聚乙二醇、聚乙烯醇、聚己二酸丁二酯(PBAT)、聚丁二酸丁二酸酯(PBS)、聚己内酯(PCL)、聚乙交酯(PGA)，合成肽，如重组地制造的氨基酸、酰胺；细胞外基质的组成部分，如胶原质、原纤蛋白、弹性蛋白、糖胺聚糖，尤其透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和硫酸角质素。
14.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，设有用于将所述膜保持在所述嵌入物中的闭锁机构。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述至少一个闭锁机构以载体的形式构成，所述载体由不同的结构构成并且匹配于所述膜材料，尤其由栅格状或辐条状的结构构成。
16.一种细胞培养嵌入物，所述细胞培养嵌入物能够根据上述权利要求中任一项所述的方法制造，所述细胞培养嵌入物由嵌入物坯件与至少一个设置在所述嵌入物坯件中的膜构成，所述至少一个膜尤其是至少一个生物膜，其中所述至少一个膜不具有锥体。
17.根据权利要求16所述的细胞培养嵌入物，其特征在于，所述膜由两种或更多种聚合物材料，优选生物聚合物构成。
18.根据权利要求16或17所述的细胞培养嵌入物，其特征在于，所述膜具有三维结构，优选呈绒毛、沟道、堆起部、凹处的形式。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的细胞培养嵌入物，其特征在于，所述膜具有功能性材料，优选检测器、染料、酶、趋化因子或纳米颗粒。
20.一种根据权利要求16至18中任一项所述的细胞培养嵌入物的应用，所述应用用于培养细胞和执行屏障或渗透实验。
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