WO2023248620A1 - 細胞培養容器、及びそれの製造方法 - Google Patents

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WO2023248620A1
WO2023248620A1 PCT/JP2023/016867 JP2023016867W WO2023248620A1 WO 2023248620 A1 WO2023248620 A1 WO 2023248620A1 JP 2023016867 W JP2023016867 W JP 2023016867W WO 2023248620 A1 WO2023248620 A1 WO 2023248620A1
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WO
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cell culture
thin film
film sheet
cell
plate
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/016867
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English (en)
French (fr)
Inventor
将 三原
真司 武岡
采芸 李
Original Assignee
株式会社朝日Ｆｒ研究所
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Publication date
Application filed by 株式会社朝日Ｆｒ研究所 filed Critical 株式会社朝日Ｆｒ研究所
Publication of WO2023248620A1 publication Critical patent/WO2023248620A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L83/00—Compositions of macromolecular compounds obtained by reactions forming in the main chain of the macromolecule a linkage containing silicon with or without sulfur, nitrogen, oxygen or carbon only; Compositions of derivatives of such polymers
    • C08L83/04—Polysiloxanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C12M3/04—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus with means providing thin layers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture vessel in which oxygen is sufficiently distributed to cells when culturing cells such as floating cells, spheroids, monolayer or multilayer cell aggregates, organoids, etc., and a method for manufacturing the same.
  • a flat resin cell culture container like a petri dish has a flat culture surface, so cells can only be cultured on a flat surface, creating a culture environment that is far different from that of a living body.
  • resin cell culture containers such as multi-well cell culture plates.
  • Spheroids which are simple clusters of various cells such as tumor tissue, embryoid bodies, hepatocytes, nerve tissue, or cells derived from mammary glands, are aggregates, so it is difficult for oxygen to circulate between the surface and the inside.
  • the culture condition is not uniform due to the cells.
  • Non-Patent Document 1 describes a gas-permeable cell culture container made of silicone rubber, 10 mm x 10 mm, 400 microwells, made of transparent silicone rubber material (PDMS), and capable of culturing a large amount of cells in a single seeding operation.
  • PDMS transparent silicone rubber material
  • a floating three-dimensional culture device that can produce cell clusters of almost uniform shape and size from human hepatoma Hep G2 cells (HepG2), adipose-derived stem cells (ASCs), etc. It is disclosed that a large number of cell clusters could be cultured.
  • Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3 state that when culturing cells with extremely high oxygen consumption ability, such as primary cultured hepatocytes, oxygen deficiency occurs in existing polystyrene cell culture vessels (dishes). , developed a culture vessel using a 1.5 mm thick silicone rubber bottom, cultivated HepG2, and disclosed that multilayering, which is not seen in general polystyrene cell culture vessels, was observed. However, in such polystyrene cell culture vessels, there is no mention of improving gas permeability by making the silicone rubber thinner, and further improvements have been required.
  • Non-Patent Document 4 states that spheroids, which are cells aggregated into clumps, can maintain high functional expression over a long period of time, have functions and structures similar to those of living organisms, and are used in drug screening tests.
  • spheroids which are cells aggregated into clumps, can maintain high functional expression over a long period of time, have functions and structures similar to those of living organisms, and are used in drug screening tests.
  • a silicone rubber cell culture container called Sylgard 184 (manufactured by The Dow Chemical Company) with a minimum thickness of 8 ⁇ m, and when culturing spheroids, It is disclosed that the survival rate improved and the degeneration rate decreased as the thickness decreased.
  • Patent Document 1 discloses a cell culture section having a surface provided with a plurality of concave wells in which cells are cultured, and at least one side and the other side of the cell culture section in a direction perpendicular to the surface.
  • a gas flow section provided on either one and including a gas flow path for circulating gas, the cell culture section separating the plurality of wells of the cell culture section from the gas flow section;
  • a cell culture device is described that includes a gas permeable portion that is permeable to oxygen and impermeable to liquid.
  • Patent Document 2 cells containing at least one of adherent cells selected from stem cells, progenitor cells, somatic cells, and reproductive cells, and floating cells selected from blood cells, T cells, and B cells are retained.
  • Patent Documents 1 and 2 merely state that the gas permeable portion that is oxygen permeable and liquid impermeable is not a thin film sheet, and that the thickness t is about several tens of ⁇ m.
  • the present inventors have discovered that the above-mentioned problems can be solved by studying the formulation of silicone, and have completed the present invention.
  • the present invention was made to solve the above-mentioned problems, and the thickness can be set to 5 ⁇ m at the maximum, and the survival rate can be further improved by improving oxygen permeability even at a thickness of several 100 nm, which is less than 1 ⁇ m, and precise molding is not required.
  • a cell culture container that can be easily and conveniently prepared by simply attaching a silicone sheet that inherently has adhesive properties to a plate with through-holes for cell culture wells, and that can stand on its own without leaking even when filled with culture solution; The purpose is to provide a method for producing the same.
  • a cell culture container made to achieve the above object is a cell culture plate in which a thin film sheet containing silicone cross-linked with polydimethylsiloxane having a vinyl group in the end unit and/or middle unit of all the units is repeatedly used.
  • a cell culture vessel is provided so as to close the bottom side of a through-hole to form a cell culture well, wherein the total number of moles of the vinyl groups in the polydimethylsiloxane is equal to or greater than that of all the repeating units.
  • the oxygen permeability of the thin film sheet is 0.03 to 5.00 mol% based on the total number of moles, and the thickness of the thin film sheet is at most 5 ⁇ m, so that the thin film sheet has oxygen permeability. .
  • this cell culture container has a spacer on which the cell culture plate is mounted together with the thin film sheet so that the bottom side of the thin film sheet is in contact with the outside air.
  • the polydimethylsiloxane has the following chemical formulas (1-1) to (1-3). (However, in chemical formulas (1-1) to (1-3), m1 to m3 are 5676 to 10809, and n1 to n3 are 2 to 405). It is.
  • the silicone may be crosslinked with the vinyl group in the polydimethylsiloxane and the hydrosilyl group in the crosslinking agent added thereto.
  • the crosslinking agent has the following chemical formulas (2-1) to (2-3). (However, in chemical formulas (2-1) to (2-3), p is 1 to 28 and q is 0 to 83) It is at least one of the polydimethylsiloxane crosslinking agent polymers shown below.
  • This cell culture container may contain a platinum catalyst in the silicone that adds the hydrosilyl group to the vinyl group.
  • the elongation rate of the thin film sheet is at least 150%.
  • the thin film sheet is bonded to the cell culture plate using molecular adhesion molecules, an adhesive, or directly.
  • the thin film sheet may have a cell adhesion treated surface or a cell non-adhesion treated surface.
  • the thin film sheet may be made hydrophilic by being blended with a hydrophilic agent or having a hydrophilic treated surface.
  • the cell culture wells are arranged in a plurality of rows.
  • the cell culture well has a hole diameter of 0.02 to 1.00 mm and a depth of 0.02 to 1.00 mm.
  • the cell culture plate is made of silicone resin, silicone rubber, glass, polystyrene resin, polycarbonate resin, polyurethane resin, polyethylene resin, polypropylene resin, polyether ether ketone resin, and polyphenylsulfone resin. It is made of at least one of the materials.
  • the thin film sheet has an oxygen permeability of at least 15 mg/L ⁇ h.
  • This cell culture container is preferably for culturing at least any cell selected from floating cells, spheroids, monolayer or multilayer cell clusters, and organoids.
  • a method for manufacturing a cell culture container includes forming a terminal unit and/or an intermediate unit so as to close the through hole penetrating the cell culture plate at the bottom side to form a cell culture well. repeat to produce an oxygen-permeable thin film sheet containing silicone cross-linked with polydimethylsiloxane having vinyl groups in an amount of 0.03 to 5.00 mol% based on the total number of moles of all units, and having a thickness of at most 5 ⁇ m. Additionally, if necessary, a spacer is provided so that the bottom side of the thin film sheet comes into contact with the outside air.
  • the method for producing this cell culture container includes, for example, forming the composition containing polydimethylsiloxane into a film by gravure coating, screen printing, bar coating, dipping, or spin coating, crosslinking and hardening it, and forming the thin film sheet. That is what it is.
  • the method for producing this cell culture container is to pour a cell culture plate raw material into a transfer plate having well-forming protrusions corresponding to the cell culture wells, harden it, and then release the mold to form the cell culture plate. It may be. Alternatively, a hole may be made in a resin plate using a drill, a laser beam, etc., and a silicone thin film may be attached to the hole.
  • This method for producing a cell culture container includes, for example, placing a weight on the well-forming protrusion, and pouring and hardening the cell culture plate raw material until it exceeds the well-forming protrusion, so that the cell culture well is penetrated by the weight.
  • the purpose is to form a cell culture plate.
  • This method for producing a cell culture container includes adding at least one mold release agent selected from polyvinyl alcohol, starch, vinyl acetate, fluorine surfactants, alkyl surfactants, and olefin surfactants to the transfer plate. It is preferable to apply .
  • the cell culture container of the present invention by using a thin film sheet composed of a specific composition, it is possible to make the film extremely thin, with a maximum thickness of 5 ⁇ m, and also to have a thickness of several 100 nm, which is less than 1 ⁇ m. is also possible, thereby dramatically improving oxygen permeability. Therefore, not only floating cells but also at least one selected from spheroids, monolayer or multilayer cell clusters, and organoids can be sufficiently oxygenated to the internal cells, so that the survival rate can be further improved. Moreover, since it has excellent oxygen permeability, it is possible to homogeneously culture surface cells and internal cells even in spheroids and cell clusters.
  • this cell culture container has a simple structure, it has excellent culture performance.
  • this cell culture container can stand on its own without peeling, leaking, or being damaged even when the cell culture well is filled with a medium such as a culture solution.
  • the method for producing a cell culture container of the present invention does not require precise molding in order to develop sufficient oxygen permeability, and in addition, silicone, which inherently has adhesive properties, can be used to form a plate with holes that will become cell culture wells. Since it can be easily and conveniently prepared by simply attaching a sheet, high-quality products can be mass-produced with good yield.
  • FIG. 1 is a perspective view and a schematic cross-sectional view of a cell culture container to which the present invention is applied.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of a method for preparing a thin film sheet in a cell culture container to which the present invention is applied.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for producing a cell culture container to which the present invention is applied. It is a photograph of a transfer plate used when producing a cell culture container to which the present invention is applied. 1 is an electron micrograph showing through-holes in a cell culture plate in a cell culture container to which the present invention is applied. 1 is a schematic diagram of an oxygen permeability tester for evaluating oxygen permeability of a cell culture container to which the present invention is applied.
  • 1 is a graph showing oxygen permeability results for cell culture vessels to which the present invention is applied and cell culture vessels to which the present invention is not applied.
  • 1 is a micrograph showing the results of a cell culture test using a cell culture container to which the present invention is applied. It is a micrograph showing the results of a cell culture test using a polystyrene 24-well plate to which the present invention is not applicable. This is a photograph showing the coloring of survival/death of cell culture using a cell culture container to which the present invention is applied, a cell culture container to which the present invention is not applied, and a polystyrene 24-well plate to which the present invention is not applicable. be.
  • an example of the cell culture container of the present invention includes a cell culture plate 5 in which a plurality of through holes 4 arranged vertically and horizontally pass through the bottom of a depression 2 having a large depression at the center;
  • a thin film sheet 6 covers the lower surface side and closes the bottom side of the through hole 4 to form the cell culture well 3.
  • two spacers 7 are provided to float the cell culture plate 5 together with the thin film sheet 6 in order to form a gap 8 so that the bottom side of the thin film sheet 6 comes into contact with external air.
  • the cell culture well 3 may be singular, but preferably plural, and may be arranged in a linear, spiral, or concentric manner, or may be arranged in multiple rows vertically and horizontally, or randomly. You can stand in line.
  • the cell culture well 3 has, for example, a hole diameter of 0.02 to 1.00 mm, which is the size of a single cell, preferably 0.05 to 0.60 mm, more preferably 0.10 to 0.40 mm, and a depth of By setting the diameter to 0.02 to 1.00 mm, preferably 0.05 to 0.60 mm, and more preferably 0.10 to 0.40 mm, oxygen can be distributed within the cells.
  • the aspect ratio between the hole diameter and the depth is, for example, 0.5 to 1.5, and preferably 1.0. If the spheroids become too large, the oxygen transfer rate within the colony will decrease, so it is preferable to fall within this range.
  • the thin film sheet 6 contains silicone crosslinked with polydimethylsiloxane having a vinyl group in the terminal unit and/or the intermediate unit among all the repeating units.
  • polydimethylpolysiloxane the following chemical formulas (1-1) to (1-3) are used. (However, in the chemical formulas (1-1) to (1-3), m1 to m3 are 5676 to 10809, and n1 to n3 are 2 to 405).
  • the dimethylsiloxy unit and the vinylmethylsiloxy unit may be block copolymerized and/or random copolymerized.
  • the dimethylsiloxane polymer of chemical formula (1) includes silicone gum materials 110S-7, 110-7S, 110-8, 110-2, 110-2S, 110-3, and 110- manufactured by Dongiue Silicone. Examples include 3S, 110-4, 110-4S, 110-5, 110-5S, 110-6, and 110-6S.
  • dimethylsiloxane polymer molecules may be crosslinked with each other through their respective vinyl groups, but the silicone may be crosslinked with the vinyl groups in the polydimethylsiloxane molecules and the hydrosilyl groups in the crosslinking agent added thereto. It may be something that is currently in use.
  • crosslinking agent As this crosslinking agent, the following chemical formulas (2-1) to (2-3) are used. (However, in chemical formulas (2-1) to (2-3), p1 to p3 are 1 to 28, and q1 to p3 are 0 to 83).
  • the monomethylsiloxy unit and the dimethylsiloxy unit may be block copolymerized and/or random copolymerized.
  • Specific examples of the crosslinking agent of chemical formula (2) include HMS-301 and HMS-H271 manufactured by Gelest.
  • the total number of moles of the vinyl group is preferably 0.03 to 5.00 mol% based on the total number of moles of all the repeating units. More preferably, the molar ratio of hydrosilyl groups to vinyl groups is in excess of 1:1 or more.
  • the thin film sheet 6 is formed from a composition containing a polydimethylsiloxane polymer of chemical formula (1), but when the composition further contains a polydimethylsiloxane crosslinker polymer of chemical formula (2), hydrosilyl to vinyl groups is added to the composition.
  • the platinum catalyst may be contained in the silicone.
  • the number of repeating units between the crosslinking points of the vinyl group is 20 to 3333, preferably 500 to 3000, more preferably 1000 to 3000.
  • the thin film sheet 6 is formed from a composition having such a composition, so that the thickness is at most 5 ⁇ m, preferably 0.05 to 1.00 ⁇ m, more preferably 0.1 to 0.80 ⁇ m, and even more preferably can be set to 0.20 to 0.60 ⁇ m, which provides a good balance between physical properties and adhesion, thereby allowing cells, such as floating cells, spheroids, monolayer or multilayer cell aggregates, and It exhibits sufficient oxygen permeability to culture at least one cell selected from organoids, especially spheroids whose interiors tend to become oxygen-deficient and multilayered cell clusters with more than 2 to 3 layers.
  • the thin film sheet 6 is formed from a composition having such a composition and has such a thickness, so that it has excellent oxygen permeability of at least 15 mg/L ⁇ h, preferably 20 mg/L ⁇ h. have.
  • the thin film sheet 6 By forming the thin film sheet 6 from a composition having such a composition and having such a thickness, the thin film sheet 6 has excellent elongation properties such as an elongation rate of at least 150%, preferably 200%, and more preferably 300%, e.g. It has elongation of 200 to 300% even below 500 nm, which provides excellent handling and yield during assembly.
  • an elongation rate of at least 150%, preferably 200%, and more preferably 300%, e.g. It has elongation of 200 to 300% even below 500 nm, which provides excellent handling and yield during assembly.
  • the bonding site between the cell culture well 3 and the cell culture plate 5 is formed by a single layer or multiple layers of a molecular adhesive selected from silane coupling agents, preferably a single layer of molecular adhesive molecules, or The bonding may be performed using an adhesive selected from silicone adhesives.
  • the thin film sheet 6 is difficult for cells to adhere to even without surface treatment.
  • the thin film sheet 6 may be subjected to a cell adhesion treatment selected from collagen, fibronectin, laminin, proteoglycan, etc. on the surface facing the cell culture well 3, at least at the exposed portion within the cell culture well 3, and may be treated with ethylene oxide.
  • a cell non-adhesion treatment selected from nonionic surfactants containing Zvitter ions and ionic surfactants containing Zvitter ions such as phosphorylcholine groups may be applied.
  • the thin film sheet 6 may be blended with a hydrophilic agent selected from nonionic and ionic surfactants, and at least on the surface facing the cell culture well 3, at least in the exposed area in the cell culture well 3, UV rays can be removed.
  • the surface may be subjected to a hydrophilic treatment selected from irradiation treatment, excimer irradiation treatment, corona discharge treatment, vacuum plasma treatment, and ozone water treatment.
  • the cell culture plate 5 is made of silicone resin, silicone rubber, glass, polystyrene, polycarbonate, polyurethane, polyethylene, polypropylene, polyetheretherketone, or polyphenylsulfone resin, and can be made by punching, molding, transfer molding, etc. It can be formed by cutting or etching.
  • this cell culture container 1 can be used to hold cells in the culture medium or in culture in the cell culture well 3, such as floating cells, spheroids, monolayer or multilayer cell clusters, and organoids. It is possible to culture at least one of the cells selected from the following with a sufficient amount of oxygen, and especially for spheroids, multilayered cell clusters, and organoids, it is possible to cultivate not only the surface cells but also the internal cells. This ensures homogeneous culture, and in particular does not cause death or weakening of internal cells.
  • the cell culture container 1 can be used especially for culturing cells useful for medicine.
  • This cell culture container 1 is used to culture the various cells described above in a medium, such as a culture solution, in a cell culture well 3.
  • a medium such as a culture solution
  • individual cell aggregates such as spheroids, multilayered cell masses, and organoids can be cultured in each cell culture well 3.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells can be cultured.
  • Transplantation of adipose-derived mesenchymal stem cells is an attractive treatment for refractory skin ulcers, such as diabetic wounds, critical limb ischemia, radiation ulcers, and ulcers caused by extravasation of cytotoxic drugs.
  • the therapeutic function of adipose-derived mesenchymal stem cells will be lost within 72 hours after transplantation if they are transplanted after two-dimensional culture, but if they are cultured using this cell culture container 1 and turned into spheroids, they will function for a long time.
  • this cell culture container 1 can be manufactured as follows.
  • the thin film sheet 6 is prepared. Film formation on the thin film sheet 6 can be performed continuously by using a microgravure coater as shown in FIG.
  • the microgravure coater shown in FIG. 2 includes a rotationally driven gravure roll 10, a transfer roller 12 provided above the gravure roll 10 and supplied with a base material 16, and a silicone polymer and a crosslinking agent dissolved in a solvent.
  • a sacrificial layer 16b made of polyvinyl alcohol is laminated on one side of a base film 16a made of polyethylene terephthalate.
  • Film formation using the micro gravure coater shown in FIG. 2 involves rotating a part of the gravure roll 10 at a predetermined rotational speed while immersing it in the silicone solution S in a container P, so that excess silicone solution S adheres to the surface of the gravure roll 10.
  • the silicone solution S is applied onto the sacrificial layer 16b on the base film 16 of the substrate 16 supplied to the transfer roller 12 while scraping off the silicone solution S with the blade 14.
  • a continuous thin film sheet 6 made of a crosslinked silicone polymer is laminated on the sacrificial layer 16b of the base material 16.
  • Such a continuous thin film sheet 6 contains a solvent, and the base material 16 to which the thin film sheet 6 is attached is conveyed to a heating drying process at a temperature of 100 to 130°C, preferably 110 to 120°C. The thin film sheet 6 is dried and cured. Next, by cutting the continuous base material 16 into a size corresponding to the cell culture plate 5 of the cell culture container 1, the continuous thin film sheet 6 is attached to the base film 16a via the adhesive sacrificial layer 16b. , and then peeled off to obtain individual thin film sheets 6.
  • a transfer plate 20 having a plurality of rows and columns of well-forming protrusions 21 corresponding to desired cell culture wells 3 is prepared.
  • a well-forming protrusion with an outer diameter of 0.20 to 1.00 mm ⁇ , preferably 0.5 mm ⁇ , and a height of 0.20 to 1.00 mm, preferably 0.5 mm, is formed to fit the desired cell culture well 3.
  • a material made of silicone rubber with a thickness of 5 mm is used.
  • a specific example is KDS005 (trade name, manufactured by Kyowa Kogyo Co., Ltd.) made of silicone rubber with a total thickness of 1.0 to 5.0 mm and a rubber hardness of 30 to 70°.
  • This transfer plate is washed with water if necessary and dried.
  • the transfer plate 20 is subjected to plasma treatment, corona treatment, UV treatment, and/or excimer treatment to develop hydroxyl groups and active groups on the transfer plate rubber surface. Modify from hydrophobic to hydrophilic.
  • a mold release agent is applied to this transfer plate as necessary so that it can be easily released after the subsequent formation of the cell culture plate 5.
  • the mold release agent include at least one selected from polyvinyl alcohol, starch, vinyl acetate, fluorine surfactants, alkyl surfactants, and olefin surfactants.
  • a release agent is dropped and applied by spin coating to form a uniform coating film.
  • a formwork 40 having a bottom plate and four side plates is made so that the transfer plate 20 fits therein, and the transfer plate 20 is fitted into the formwork 40.
  • a cylindrical weight 30 corresponding to the recess 2 of the cell culture plate 5 is placed on the center of the transfer plate 20, and the bottom surface of the weight 30 and the top surface of the well-forming protrusion 21 are brought into close contact.
  • the raw material for the cell culture plate 5 is poured into the mold 40 to a height halfway up the weight 30 while soaking the well-forming projections 21, and then heated and/or activated energy rays are applied.
  • the cell culture plate 5 is cured by irradiation to form a cured product. Since the raw material of the cell culture plate 5 does not penetrate into the well-forming protrusions 21 in the area on which the weight 30 is placed, the well-forming protrusions 21 serve as a template to form the cell culture wells 3.
  • a cell culture plate 5 is obtained in which a plurality of through holes 4 arranged vertically and horizontally pass through the bottom of the recess 2.
  • a thin film sheet 6 is applied directly or via a molecular adhesive or an adhesive to cover the lower surface side of the cell culture plate 5 and close the bottom side of the through hole 4 to form the cell culture well 3, A cell culture container 1 is obtained. If necessary, spacers 7 may be used to raise the bottom.
  • the main polymer is one shown by formula (1), molecular weight: 45 to 80 x 10 4 , polymerization degree of 6081 to 10811 when the polymerized unit is a dimethylsiloxy unit with a unit molecular weight of 74, total mole of all repeating units.
  • Silicone gum material 110-8 (trade name, manufactured by Dongiue Silicone), which is a vinyl group-containing dimethylpolydimethylsiloxane polymer designated as 1667 to 3333, was used. Hexane/ethyl acetate was dissolved in a mixed solvent at a volume ratio of 4:1 to give 8% by mass, 9% by mass, and 10% by mass of this silicone gum material 110-8.
  • the crosslinking material is represented by the chemical formula (2), has a molecular weight of 1900 to 2000, a polymerization degree of 26 to 27 when the polymerized unit is a dimethylsiloxy unit with a unit molecular weight of 74, and the above-mentioned relative to the total number of moles of all repeating units.
  • Hydrosilyl group-containing dimethylpolydimethylsiloxane polymer HMS-301 (trade name manufactured by Gelest) with a total mole number of hydrosilyl groups of 25 to 35 mol% and 6 to 9 hydrosilyl groups in one molecule from 0.07 to After adding 0.09% by mass and 0.002 to 0.003% by mass of cyclovinylmethylsiloxane platinum complex (SIP6832.3; trade name manufactured by Gelest) as a platinum catalyst, a silicone solution S was prepared. As shown in , a film was formed using a microgravure coater (trade name, manufactured by Yasui Seiki Co., Ltd.).
  • the film formation is performed on the base material, and the base material 16 used is a base film 16a that is a polyethylene terephthalate (PET) film, which is coated with polyvinyl alcohol (PVA) in advance to form an adhesive sacrificial layer 16b. there was.
  • Film formation is carried out by rotating a part of the gravure roll 10 at 30 rpm while immersing it in the silicone solution S in the container P, and supplying the silicone solution S to the transfer roller 12 while scraping off the excess silicone solution S with the blade 14.
  • the adhesive sacrificial layer 16b on the base film 16a of the base material 16 was coated.
  • the base material 16 to which the continuous thin film sheet 6 was attached was heated at 120° C. to dry and harden the continuous thin film sheet 6.
  • the film thickness obtained with 8% by mass will be abbreviated as 275 nm
  • the film thickness obtained with 9% by mass will be abbreviated as 390 nm
  • the film thickness obtained with 10% by mass will be abbreviated as 5 ⁇ m.
  • the film thickness could be adjusted according to the concentration.
  • this transfer plate 20 was subjected to plasma treatment for 30 seconds at a discharge current of 35 to 45 mA and a pressure of 40 to 60 kPa to modify the rubber surface of the transfer plate to be hydrophilic.
  • 0.5 mL of a 1% polyvinyl alcohol aqueous solution was dropped as a release agent onto the transfer plate 20, and the coating was applied by spin coating at 4000 rpm for 20 seconds to form an even coating film. .
  • FIG. 3(d) As shown in Figure 3(d), four acrylic resin side plates with a thickness of 1 mm and dimensions of approximately 10 mm x 30 mm and one acrylic resin bottom plate with a thickness of 1 mm and dimensions of approximately 30 mm in length and width are fixed with adhesive tape.
  • a bottom formwork 40 was prepared so that the transfer plate 20 would fit therein. After the transfer plate 20 is fitted into the formwork 40, a cylindrical brass weight 30 with a diameter of 12 mm ⁇ and a height of 20 mm corresponding to the recess 2 of the cell culture plate 5 is placed on the center of the transfer plate 20. The bottom surface of the well-forming projection 21 was brought into close contact with the top surface of the well-forming projection 21. As shown in FIG.
  • liquid silicone rubber KE-104-Gel & CAT-104 (trade name manufactured by Shin-Etsu Silicone Co., Ltd.) as a raw material for the cell culture plate 5 begins to be poured into the mold 40, and well-forming protrusions 21 was poured to a thickness of about 10 mm up to the middle of the weight 30. Thereafter, it was cured by heating at 60° C. for 3 hours, and a cured product of the cell culture plate 5 was molded. As shown in FIG. 3(f), when the weight 30 and the formwork 40 are released from this cured product, a plurality of through holes 4 with a diameter of approximately 0.5 mm ⁇ are formed in rows in rows and columns at the bottom of the recess 2.
  • a cell culture plate 5 was obtained. This was confirmed by observing the top side (weight side) and bottom side (bottom side) of this cell culture plate 5 with a scanning electron microscope ( Figure 5; (a) and (c) are the top side, (b) and (d) ) is the bottom side, (e) is the cross section). As shown in FIG. 5, the through holes 4 (porous structure) penetrated uniformly. Thin film sheets 6 of various thicknesses were simply attached directly to cover the bottom side of the cell culture plate 5 and close the bottom side of the through hole 4 to form the cell culture well 3, thereby firmly adhering to the cell culture plate 5. When this cell culture plate 5, together with the thin film sheet 6, was placed on spacers, which are two acrylic rods, so as not to block the through holes 4 of the recesses 2 and to leave a gap 8, a cell culture container 1 was obtained. .
  • Performance test 2 oxygen permeability test
  • an oxygen permeability tester 50 was prepared, which was slightly smaller than the cell culture container 1 and had a hole 52 with a diameter opened on the upper surface of the lower tank 53 and an exhaust port 55 for exhausting oxygen.
  • culture medium DMEM/F12 product name manufactured by Gibco
  • Oxygen is supplied from the air supply port 51 to fill the lower tank 53, and the oxygen concentration permeated into the culture solution in the cell culture well 3 through the thin film sheet 5 of each layer thickness is set to 0, 2, 5, 15, 30. And 60 minutes later, it was measured using Oxygraph+ (manufactured by Hansatech). As a negative control, a glass plate of the same shape was placed under the thin film sheet 6. The results are shown in FIG.
  • the oxygen concentration in the culture solution gradually increased as the thin film sheet 6 became thinner, such as 5 ⁇ m, 390 nm, and 275 nm. Further, according to the change over time, the thin film sheet 6 became thinner, the time to reach the saturation concentration became earlier. Therefore, it was shown that the cell culture container 1 to which the present invention is applied has excellent oxygen permeability. In addition, in the negative control to which the present invention was not applied, the oxygen concentration in the culture solution remained almost unchanged, indicating that almost no oxygen entered from above the culture solution.
  • a 24-well plate made of polystyrene and subjected to cell non-adhesion treatment polystyrene 24-well cell culture plate manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.
  • Adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) (Cyagen Biosciences, 2 ⁇ 10 4 cells/cm 2 ) were cultured in each well for 5 days using DMEM/F12 (trade name manufactured by Gibco) as a culture medium. .
  • FIG. 8 and 9 show microscopic observation results of adipose-derived mesenchymal stem cell culture in the cell culture container 1 using thin film sheets 6 of various thicknesses (indicated as Nanosheet in the figure).
  • FIG. 8 when the cell culture vessel 1 to which the present invention is applied was used, 1 to 2 spheroids were formed per well, and the variation in the size of the spheroids was relatively small.
  • FIG. 9 in the polystyrene 24-well plate to which the present invention was not applied (control), the spheroids did not become approximately spherical, and the variation in the size of the spheroids was extremely large.
  • sufficient oxygen is supplied to the culture medium to culture cells such as floating cells, spheroids, monolayer or multilayer cell clusters, and organoids. Useful.
  • 1 is a cell culture container
  • 2 is a recess
  • 3 is a cell culture well
  • 4 is a through hole
  • 5 is a cell culture plate
  • 6 is a thin film sheet
  • 7 is a spacer
  • 8 is a gap
  • 10 is a gravure roll
  • 12 is a transfer roller
  • 14 is a blade
  • 16 is a base material
  • 16a is a base film
  • 16b is an adhesive sacrificial layer
  • 18 is a cutter
  • 20 is a transfer plate
  • 21 is a well forming projection
  • 30 is a weight
  • 40 is a formwork
  • 50 is an oxygen permeability test
  • 51 is an air supply port
  • 52 is a hole
  • 53 is a lower tank
  • 54 is a partition plate
  • 55 is an exhaust port
  • S is a silicone solution
  • P is a container.

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Abstract

厚さを最大でも５μｍとし、数１００ｎｍでも酸素透過性の改善により一層生存率を向上でき、精密な成型が不要で、細胞培養ウェルの貫通穴が空いたプレートに、密着性を元来有するシリコーン製シートを付すだけで簡易かつ簡便に調製でき、培養液を充填しても液漏れせず自立できる細胞培養容器を提供する。 細胞培養容器１は、繰り返し全ユニット中の末端ユニット及び／又は中間ユニットにビニル基を有するポリジメチルシロキサンで架橋したシリコーンを含有する薄膜シート６が、細胞培養プレート５を貫通している貫通穴４の底側を塞いで細胞培養ウェル３を成すように付されている細胞培養容器１であって、ポリジメチルシロキサン中、ビニル基の総モル数が、繰り返し全ユニットの総モル数に対して、０．０３～５．００モル％であり、薄膜シートの厚さが最大でも５μｍであることによって薄膜シート６が酸素透過性を有している。

Description

細胞培養容器、及びそれの製造方法
　本発明は、浮遊細胞、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、オルガノイドなどのような細胞を培養する際に細胞に酸素が十分に行き渡る細胞培養容器、及びそれの製造方法に関するものである。
　シャーレのような平面形状の樹脂製細胞培養容器は、培養面が平面であることから、細胞を平面状にしか培養できず、生体とかけ離れた培養環境である。多数穴のウェル細胞培養プレートのような樹脂製細胞培養容器も同様である。このような培養容器の底面から空気とりわけ酸素の透過性が殆ど無く、細胞が分厚くなるほど底に近い細胞は酸欠状態となってしまう。そのため、高生存率で培養できる細胞は、二次元的に単層乃至二・三層になる細胞に限定される。
　また、培養瓶のような樹脂製細胞培養容器は、培養液が多くなるほど内部に酸素が行き渡らなくなり、酸欠状態となってしまう。とりわけ腫瘍組織、胚様体、肝細胞、神経組織、又は乳腺に由来する細胞など様々な細胞の単純なクラスターであるスフェロイドは、集合体であるが故に、内部ほど酸素が行き渡り難く、表面と内部との細胞で培養状態が均一とならない。
　非特許文献１には、シリコーンゴム製の気体透過性細胞培養容器が記載されており、１０ｍｍ×１０ｍｍ，４００マイクロウェルで、透明なシリコーンゴム材料（ＰＤＭＳ）から成り、一度の播種操作で大量の細胞塊を作製できる浮遊型三次元培養デバイスで、ヒト肝癌由来細胞株（human hepatoma Hep G2 cells：ＨｅｐＧ２）や脂肪組織由来幹細胞（adipose-derived stem cells：ＡＳＣｓ）などからほぼ均質な形状・大きさの細胞塊を大量培養できた旨、開示されている。組織・臓器の構造、細胞間相互作用、細胞の分化能、薬物に対する毒性や代謝、刺激応答など、二次元培養と比較しin vivoに近い結果が得られ、優れていることが示されている。しかし、この浮遊型三次元培養デバイスは、平面形状の樹脂製細胞培養容器に貼付された状態で使用されており、底面からの気体透過による細胞生存率の向上については言及されておらず、更なる改良が求められていた。
　非特許文献２及び非特許文献３には、初代培養の肝細胞のような酸素消費能が極めて高い細胞を培養する場合、既存のポリスチレン製細胞培養容器（ディッシュ）では酸欠が起こるのであるが、厚さ１．５ｍｍシリコーンゴムを底部に使用した培養容器を開発し、ＨｅｐＧ２を培養し、一般的なポリスチレン製細胞培養容器で見られない多層化が認められることを開示している。しかし、このようなポリスチレン製細胞培養容器は、シリコーンゴムの薄膜化による気体透過性向上には言及されておらず、更なる改良が求められていた。
　非特許文献４には、細胞同士が凝集して塊になったスフェロイドは長期間にわたり高い機能発現を維持でき、機能・構造が生体に近く、薬物のスクリーニング試験に用いられるが、スフェロイドは内部が酸欠になりやすく、細胞の死滅や変性が見られるところ、最低厚さ８μｍのシルガード１８４（ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー社製）であるシリコーンゴム製細胞培養容器を開発し、スフェロイド培養すると、厚さが薄くなるほど生存率が向上し、変性率が減少したことを、開示している。このようなシリコーンゴム細胞培養容器は、８μｍ未満の薄膜化が試行されておらず、更なる薄膜化による気体透過性向上について言及されていなかった。高分子薄膜材料は薄膜化されるほど基材に対する密着性が増加することが知られている。このようなシリコーンゴム細胞培養容器はソフトリソグラフィー法を利用した鋳型成形で作成されるが、底部が薄膜化するほど鋳型への吸着が強くなり、離型時の歩留まりが低くなる。また、シルガード１８４が低粘度であり物性が低く、一層の薄膜化が困難であることから、更なる改良が求められていた。
　また、特許文献１には、細胞が培養される複数の凹状のウェルが設けられている表面を有する細胞培養部と、前記表面に直交する方向において前記細胞培養部の一方側および他方側の少なくともいずれか一方に設けられ、気体を流通させるための気体流路を含む気体流通部と、を備え、前記細胞培養部は、前記細胞培養部の前記複数のウェルと前記気体流通部とを隔て、酸素透過性で、かつ、液体不透過性を有する気体透過部を含む、細胞培養装置が記載されている。
　さらに、特許文献２には、幹細胞、前駆細胞、体細胞及び生殖細胞から選ばれる接着細胞と、血球系細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞から選ばれる浮遊細胞との少なくとも何れかを含む細胞を保持する弾性体を有する細胞保持容器であって、前記弾性体が、付加架橋型シリコーンゴムを含有するゴム成分を含み前記細胞を保持できるゴム材料で、形成されていることを特徴とする細胞保持容器が記載されている。
　特許文献１及び２は、酸素透過性で、かつ、液体不透過性を有する気体透過部が薄膜シートものでなく、厚さｔが約数十μｍである旨記載されているに過ぎない。
宮本義孝、池内真志、河野菜摘子、『二次元培養から三次元培養への潮流　～細胞培養技術の変遷～』、Organ Biology, Vol.27, No.1, p37-52 (2020): https://www.jstage.jst.go.jp/article/organbio/27/1/27_37/_pdf Evenou, F., Fujii, T., Sakai, Y., "Spontaneous Formation of Highly Functional Three-Dimensional Multilayer from Human Hepatoma Hep G2 Cells Cultured on an Oxygen-Permeable Polydimethylsiloxane Membrane(酸素透過性ポリジメチルシロキサン膜上で培養されたヒト肝細胞癌HepG2細胞からの高機能性三次元多層の自発的形成)", Tssue. Eng. Part C Methods, Vol.16, No.2, p311-318 (2010). 酒井康行、藤井輝夫、『高酸素透過性シリコーン膜上での重層化細胞シート構築』、膜（MEMBRANE）、第３７巻第３号、p.119-124 (2012):https://www.jstage.jst.go.jp/article/membrane/37/3/37_119/_pdf Lee, G., et al., "Enhanced oxygen permeability in membrane-bottomed concave microwells for the formation of pancreatic islet spheroids, Acta Biomaterialia(膵島スフェロイドの形成のための膜底凹型マイクロウェルにおける向上された酸素透過性)", Vol.65, p.185-196(2018).
特開２０１９－２０８４７４ 再表２０１７－６９４２
　本発明者らは、シリコーンの配合を検討することにより、前記問題点を解決することを見出し、本発明を完成させた。本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、厚さを最大でも５μｍとし、１μｍ未満である数１００ｎｍでも酸素透過性の改善により一層生存率を向上でき、精密な成型が不要で、細胞培養ウェルの貫通穴が空いたプレートに、密着性を元来有するシリコーン製シートを付すだけで簡易かつ簡便に調製でき、培養液を充填しても液漏れせず自立できる細胞培養容器、及びその製造方法を提供することを目的とする。
　前記の目的を達成するためになされた細胞培養容器は、繰り返し全ユニット中の末端ユニット及び／又は中間ユニットにビニル基を有するポリジメチルシロキサンで架橋したシリコーンを含有する薄膜シートが、細胞培養プレートを貫通している貫通穴の底側を塞いで細胞培養ウェルを成すように付されている細胞培養容器であって、前記ポリジメチルシロキサン中、前記ビニル基の総モル数が、前記繰り返し全ユニットの総モル数に対して、０．０３～５．００モル％であり、前記薄膜シートの厚さが最大でも５μｍであることによって、前記薄膜シートが酸素透過性を有しているというものである。
　この細胞培養容器は、前記薄膜シートの底面側が外界空気と接触するように、前記薄膜シートごと前記細胞培養プレートを搭載するスペーサーを有することが好ましい。
　この細胞培養容器は、例えば前記ポリジメチルシロキサンが、下記化学式（1-1）～（1-3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （但し、化学式（1-1）～（1-3）中、ｍ１～ｍ３は５６７６～１０８０９、ｎ１～ｎ３は２～４０５である）で示される少なくとも何れかのポリジメチルシロキサンポリマーであるというものである。
　この細胞培養容器は、前記シリコーンが、前記ポリジメチルシロキサン中の前記ビニル基とそれへ付加する架橋剤中のヒドロシリル基とで架橋しているものであってもよい。
　この細胞培養容器は、例えば前記架橋剤が、下記化学式（2-1）～（2-3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （但し、化学式（2-1）～（2-3）中、ｐは１～２８であり、ｑは０～８３である）
で示される少なくとも何れかのポリジメチルシロキサン架橋剤ポリマーであるというものである。
　この細胞培養容器は、前記シリコーン中に、前記ビニル基へ前記ヒドロシリル基を付加させるプラチナ触媒を含有していてもよい。
　この細胞培養容器は、前記薄膜シートの伸長率が少なくとも１５０％であることが好ましい。
　この細胞培養容器は、前記薄膜シートが、分子接着分子により又は接着剤により、若しくは直接、前記細胞培養プレートに接合していることが好ましい。
　この細胞培養容器は、記薄膜シートが、細胞接着処理表面を有し、又は細胞非接着処理表面を有しているものであってもよい。
　この細胞培養容器は、前記薄膜シートが、親水化剤を配合され、又は親水化処理表面を有していることにより、親水化されているものであってもよい。
　この細胞培養容器は、前記細胞培養ウェルが、複数列並んでいることが好ましい。
　この細胞培養容器は、例えば前記細胞培養ウェルが、穴径０．０２～１．００ｍｍであり、深さ０．０２～１．００ｍｍであるというものである。
　この細胞培養容器は、例えば前記細胞培養プレートが、シリコーン樹脂、シリコーンゴム、ガラス、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、及びポリフェニルスルホン樹脂から選ばれる少なくとも何れかの材質であるというものである。
　この細胞培養容器は、例えば前記薄膜シートが、少なくとも１５ｍｇ／Ｌ・ｈの酸素透過性を有しているというものである。
　この細胞培養容器は、浮遊細胞、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、及びオルガノイドから選ばれる少なくとも何れかの細胞を培養するためのものであることが好ましい。
　前記の目的を達成するためになされた細胞培養容器の作製方法は、細胞培養プレートを貫通している貫通穴を底側で塞いで細胞培養ウェルを形成するように、末端ユニット及び／又は中間ユニットへ繰り返し全ユニットの総モル数に対して０．０３～５．００モル％のビニル基を有するポリジメチルシロキサンで架橋したシリコーンを含有し厚さが最大でも５μｍである酸素透過性の薄膜シートを付し、必要に応じ、前記薄膜シートの底面側が外界空気と接触するように、スペーサーを設けるというものである。
　この細胞培養容器の作製方法は、例えば前記ポリジメチルシロキサンを含有する組成物をグラビアコーティング、スクリーン印刷、バーコーティング、ディップ法、又はスピンコーティングによって膜化し、架橋させて硬化させ、前記薄膜シートにするというものである。
　この細胞培養容器の作製方法は、前記細胞培養ウェルに対応するウェル形成突起を有する転写板に、細胞培養プレート原材料を流し込んで硬化させてから、離型し、前記細胞培養プレートを形成するというものであってもよい。又は、樹脂板に対してドリル、レーザー光等で穴あけし、それにシリコーン薄膜を貼付して作成してもよい。
　この細胞培養容器の作製方法は、例えば前記ウェル形成突起に重石を載せ、前記ウェル形成突起を越えるまで前記細胞培養プレート原材料を流し込んで硬化させることによって、前記重石によって前記細胞培養ウェルが貫通した前記細胞培養プレートを形成するというものである。
　この細胞培養容器の作製方法は、前記転写板に、ポリビニルアルコール、でんぷん、酢酸ビニル、フッ素系界面活性剤、アルキル系界面活性剤、及びオレフィン系界面活性剤から選ばれる少なくとも何れかの離型剤を塗布しておくことが好ましい。
　本発明の細胞培養容器によれば、特定の組成で構成された薄膜シートを用いることにより、厚さを最大でも５μｍという非常に薄膜化することができるうえ、１μｍ未満である数１００ｎｍにすることも可能で、それによって、酸素透過性を劇的に向上させることができる。そのため、浮遊細胞のみならず、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、及びオルガノイドから選ばれる少なくとも何れかであっても、内部細胞にまで酸素を十分に行き渡らせるので、一層生存率を向上できる。しかも、酸素透過性が優れているので、スフェロイドや細胞塊であっても、表層細胞や内部細胞を均質に培養することができる。
　この細胞培養容器は、構造が簡素であるが、培養性能に優れている。
　この細胞培養容器は、薄膜シートが極めて薄いにも拘わらず、細胞培養ウェルに培養液のような培地を充填しても、剥がれたり液漏れしたり破損したりしないように自立できる。
　本発明の細胞培養容器の作製方法は、十分な酸素透過性を発現させるのに、精密な成型が不要であり、しかも細胞培養ウェルになる穴が空いたプレートに、密着性を元来有するシリコーン製シートを付すだけで簡易かつ簡便に調製できるから、高品質のものを歩留まり良く大量生産が可能である。
本発明を適用する細胞培養容器の斜視図、及び模式断面図である。 本発明を適用する細胞培養容器中の薄膜シートを調製する方法の概要図である。 本発明を適用する細胞培養容器を作製する方法の概要図である。 本発明を適用する細胞培養容器を作製する際に用いる転写板の写真である。 本発明を適用する細胞培養容器中の細胞培養プレートの貫通穴を示す電子顕微鏡写真である。 本発明を適用する細胞培養容器の酸素透過性を評価するための酸素透過性試験器の概要図である。 本発明を適用する細胞培養容器と本発明を適用外細胞培養容器による酸素透過性の結果を示すグラフである。 本発明を適用する細胞培養容器を用いた細胞培養試験の結果を示す顕微鏡写真である。 本発明を適用外のポリスチレン製２４欠ウェルプレートを用いた細胞培養試験の結果を示す顕微鏡写真である。 本発明を適用する発細胞培養容器と、本発明を適用外の細胞培養容器と、本発明を適用外のポリスチレン製２４欠ウェルプレートとを用いた細胞培養の生存／死滅の着色を示す写真である。
　以下、本発明を実施するための形態を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの形態に限定されるものではない。
　本発明の細胞培養容器の一例は、図１に示すように、中央で大きく窪んだ凹み２の底で縦横に複数並ぶ貫通穴４が貫通している細胞培養プレート５と、細胞培養プレート５の下面側を覆って貫通穴４の底側を塞いで細胞培養ウェル３を形成している薄膜シート６とを備えている。さらに、薄膜シート６の底面側を外界空気と接触させるように空隙８を形成させるために薄膜シート６ごと細胞培養プレート５を浮かせる二本のスペーサー７とを有している。
　細胞培養ウェル３は、単数であってもよいが、複数であることが好ましく、直線状・渦巻き状・又は同心円状に複数並んでいてもよく、縦横に複数列並んでいてもよく、ランダムに並んでいてもよい。細胞培養ウェル３は、例えば穴径が、単細胞のサイズである０．０２～１．００ｍｍ、好ましくは０．０５～０．６０ｍｍ、一層好ましくは０．１０～０．４０ｍｍであり、深さが０．０２～１．００ｍｍ好ましくは０．０５～０．６０ｍｍ、一層好ましくは０．１０～０．４０ｍｍであることにより、細胞内に酸素を行き渡らせることができる。穴径と深さのアスペクト比は、例えば０．５～１．５であるが中でも１．０である。スフェロイドが大きくなりすぎると群体内で酸素移動速度が低下するので当該範囲となることが好ましい。
　薄膜シート６は、繰り返し全ユニット中の末端ユニット及び／又は中間ユニットにビニル基を有するポリジメチルシロキサンで架橋したシリコーンを含有するものである。そのポリジメチルポリシロキサンとして、下記化学式（1-1）～（1-3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　（但し、化学式（1-1）～（1-3）中、ｍ１～ｍ３は５６７６～１０８０９、ｎ１～ｎ３は２～４０５である）で示されるポリジメチルシロキサンポリマーが挙げられる。このジメチルシロキサンポリマー中、ジメチルシロキシユニットとビニルメチルシロキシユニットとは、ブロック共重合及び／又はランダム共重合であってもよい。
　化学式（１）のジメチルシロキサンポリマーとしては、具体的には、Ｄｏｎｇｉｕｅ　Ｓｉｌｉｃｏｎｅ社製のシリコーンガム材１１０Ｓ－７、１１０－７Ｓ、１１０－８、１１０－２、１１０－２Ｓ、１１０－３、１１０－３Ｓ、１１０－４、１１０－４Ｓ、１１０－５、１１０－５Ｓ、１１０－６、１１０－６Ｓが挙げられる。
　このシリコーンは、ジメチルシロキサンポリマー分子同士が、夫々のビニル基同士で架橋するものであってもよいが、ポリジメチルシロキサン分子中のビニル基とそれへ付加する架橋剤中のヒドロシリル基とで架橋しているものであってもよい。
　この架橋剤として、下記化学式（2-1）～（2-3）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 （但し、化学式（2-1）～（2-3）中、ｐ１～ｐ３は１～２８であり、ｑ１～ｐ３は０～８３である）で示されるポリジメチルシロキサン架橋剤ポリマーが挙げられる。ポリジメチルシロキサン架橋剤ポリマー中、モノメチルシロキシユニットとジメチルシロキシユニットとは、ブロック共重合及び／又はランダム共重合であってもよい。化学式（２）の架橋剤としては、具体的には、Ｇｅｌｅｓｔ社製のＨＭＳ－３０１、ＨＭＳ－Ｈ２７１が挙げられる。
　化学式(１)のポリジメチルシロキサンポリマー中、前記ビニル基の総モル数が、前記繰り返し全ユニットの総モル数に対して、０．０３～５．００モル％であることが好ましい。ビニル基に対してヒドロシリル基のモル比が１：１以上となるように過剰であると一層好ましい。
　薄膜シート６は、化学式(１)のポリジメチルシロキサンポリマーを含有する組成物から製膜されるが、さらに化学式(２)のポリジメチルシロキサン架橋剤ポリマーを含有する場合、組成物にビニル基へヒドロシリル基を付加させるプラチナ触媒を含有していることによって、シリコーン中にこのプラチナ触媒が含有されていてもよい。
　架橋後の前記シリコーン中のメインポリマー中、前記ビニル基の架橋点間の繰り返しユニット数が、２０～３３３３、好ましくは５００～３０００、より好ましくは１０００～３０００である。
　薄膜シート６は、このような組成の組成物から製膜されることにより、厚さが最大でも５μｍ、好ましくは０．０５～１．００μｍ、更に好ましくは０．１～０．８０μｍ、一層好ましくは物性と密着性のバランスが良い０．２０～０．６０μｍにすることができ、それによって、細胞培養容器１の細胞培養ウェルで細胞、例えば浮遊細胞、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、及びオルガノイドから選ばれる少なくとも何れかの細胞、とりわけ内部ほど酸欠状態になり易いスフェロイドや２～３層よりも多く積層した多層細胞塊を培養するのに十分な酸素透過性を発現する。
　薄膜シート６は、このような組成の組成物から製膜されこのような厚さを有することにより、少なくとも１５ｍｇ／Ｌ・ｈ、好ましくは２０ｍｇ／Ｌ・ｈであると、優れた酸素透過性を有している。
　薄膜シート６は、このような組成の組成物から製膜されこのような厚さを有することにより、伸長率が少なくとも１５０％、好ましくは２００％、更に好ましくは３００％という優れた伸長性、例えば５００ｎｍ以下でも２００～３００％の伸長性を有し、それにより組立時のハンドリング性と歩留まりが優れている。
　薄膜シート６は、細胞培養ウェル３側の表面が、特に表面処理しなくとも密着可能となっていることから、直接、細胞培養プレート５に接合しても、培養液を細胞培養ウェル３に充填したときに剥がれたり遺漏したりしない十分な自立性を発現する。接合性を高めるために、細胞培養ウェル３と細胞培養プレート５との接合部位が、シランカップリング剤から選ばれる分子接着剤の単層又は複数層好ましくは分子単層の分子接着分子により、又はシリコーン系接着剤から選ばれる接着剤により、接合していてもよい。
　薄膜シート６は、表面処理を施さなくとも細胞接着し難い。
　薄膜シート６は、細胞培養ウェル３側の面で、少なくとも細胞培養ウェル３内の露出部位にて、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、プロテオグリカン等から選ばれる細胞接着処理が施されていてもよく、エチレンオキシドを含む非イオン性界面活性剤やホスホリルコリン基等のツビッターイオンを含むイオン性界面活性剤から選ばれる細胞非接着処理が施されていてもよい。
　薄膜シート６は、非イオン性・イオン性界面活性剤から選ばれる親水化剤を配合されていてもよく、細胞培養ウェル３側の面で、少なくとも細胞培養ウェル３内の露出部位にて、ＵＶ照射処理、エキシマ照射処理、コロナ放電処理、真空プラズマ処理、オゾン水処理から選ばれる親水化処理表面が施されていてもよい。
　一方、細胞培養プレート５は、シリコーン樹脂、シリコーンゴム、ガラス、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエーテルエーテルケトン、又はポリフェニルスルホン樹脂製であって、打ち抜き、金型成型、転写成型、切削加工、又はエッチング加工で形成することができる。
　この細胞培養容器１は、薄膜シート６が優れた酸素透過性を有することにより、細胞培養ウェル３中の培養液ないし培養中の細胞、例えば浮遊細胞、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、及びオルガノイドから選ばれる少なくとも何れかの細胞であっても十分な酸素量を確保して培養でき、特にスフェロイドや多層細胞塊やオルガノイドであってもそれらの表面細胞のみならず内部細胞へも十分な酸素量を確保して均質な培養ができ、とりわけ内部細胞の死滅や弱体化を惹き起こさない。
　細胞培養容器１は、とりわけ医薬に有用な細胞を培養するのに用いることができる。
　この細胞培養容器１は、細胞培養ウェル３内にて、培地例えば培養液中で、前記各種細胞を培養するのに用いられる。とりわけ、スフェロイド、多層細胞塊、オルガノイドのような細胞の集合体の一個体ずつを細胞培養ウェル３毎で培養することができる。
　この細胞培養容器１によれば、とりわけ脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣｓ）を培養することができる。この脂肪由来間葉系幹細胞の移植は、糖尿病性創傷、重症下肢虚血、放射線潰瘍、細胞毒性薬の血管外漏出によって引き起こされる潰瘍などの難治性皮膚潰瘍の魅力的な治療法である。脂肪由来間葉系幹細胞の治療に対する機能は、二次元培養後に移植すると移植後７２時間以内に失われるが、この細胞培養容器１を用いて培養してスフェロイド化すると長時間機能するようになる。
　この細胞培養容器１は、例えば、図２及び図３を参照すると以下のようにして製造することができる。
　先ず、薄膜シート６を調製する。薄膜シート６への製膜は、図２に示すようにマイクログラビアコーターを用いることにより連続的に行うことができる。図２に示すマイクログラビアコーターは、回動駆動されるグラビアロール１０と、グラビアロール１０の上方に設けられ、基材１６が供給される転写ローラ１２と、溶媒に溶解したシリコーンポリマー及び架橋剤と触媒を含むシリコーン溶液Ｓが貯留されている容器Ｐと、容器Ｐのシリコーン溶液Ｓの浸漬部分からグラビアロール１０の表面に付着されたシリコーン溶液Ｓの付着層から過剰分を掻き落とすブレード１４とから構成される。図１に示す基材１６は、その部分拡大図に示すように、ポリエチレンテレフタレートから成るベースフィルム１６ａの一面側にポリビニルアルコールから成る犠牲層１６ｂが積層されている。
　図２に示すマイクログラビアコーターを用いた製膜は、グラビアロール１０の一部を、容器Ｐのシリコーン溶液Ｓに浸漬しながら所定の回転速度で回転し、その表面に付着したシリコーン溶液Ｓの過剰分をブレード１４で掻き落としつつシリコーン溶液Ｓを、転写ローラ１２に供給された基材１６のベースフィルム１６上の犠牲層１６ｂ上に塗工する。薄膜シートが塗工された基材１６は、その部分拡大図に示すように基材１６の犠牲層１６ｂ上に架橋シリコーンポリマーから成る連続状の薄膜シート６が積層されている。このような連続状の薄膜シート６には溶媒が含有されており、薄膜シート６が付着された基材１６は加熱乾燥工程に搬送し、温度１００～１３０℃、好ましくは１１０～１２０℃にて薄膜シート６を乾燥・硬化させる。次いで、細胞培養容器１の細胞培養プレート５に対応するサイズに切断することにより、連続状の薄膜シート６が粘着犠牲層１６ｂを介してベースフィルム１６ａに付着している連続状の基材１６を、剥離し、個別の薄膜シート６を得ることができる。
　次いで、図３(a)のように、所望の細胞培養ウェル３に対応するウェル形成突起２１を縦横複数列有する転写板２０を用意する。このような転写板として、例えば所望の細胞培養ウェル３に合わせ外径０．２０～１．００ｍｍφ好ましくは０．５ｍｍφで高さ０．２０～１．００ｍｍ好ましくは０．５ｍｍのウェル形成突起を有する厚さ５ｍｍのシリコーンゴムゴム製のものが用いられる。具体的には、総厚み１．０～５．０ｍｍでゴム硬度３０～７０°のシリコーンゴム製のＫＤＳ００５（共和工業株式会社製の商品名）が挙げられる。この転写板を、必要に応じ水洗し、乾燥する。
　必要に応じ、図３(b)のように、この転写板２０に対し、プラズマ処理、コロナ処理、ＵＶ処理、及び／又はエキシマ処理を施し、転写板ゴム表面に水酸基や活性基を発現させて疎水性から親水性に改質する。
　図３(c)のように、引き続く細胞培養プレート５形成後に離型し易いように、必要に応じ、この転写板に対し、離型剤を塗布する。離型剤は、ポリビニルアルコール、でんぷん、酢酸ビニル、フッ素系界面活性剤、アルキル系界面活性剤及びオレフィン系界面活性剤から選ばれる少なくとも何れかが挙げられる。例えば、離型剤を滴下し、均等な塗工膜となるようにスピンコートによって塗布する。
　図３(d)のように、転写板２０が嵌るように底板と４枚の側板とを有する型枠４０を作製し、転写板２０を型枠４０に嵌め込む。細胞培養プレート５の凹み２に対応する円柱状の重石３０を転写板２０の中央部に載せ、重石３０の底面とウェル形成突起２１の上面とを密着させる。
　図３(e)のように、型枠４０内部へ細胞培養プレート５の原料材料を、ウェル形成突起２１を浸しつつ重石３０の途中の高さまで、流し込んだ後、加熱、及び／又は活性エネルギー線照射により、硬化させて、細胞培養プレート５の硬化物を成型する。重石３０が載せられた部位でのウェル形成突起２１には、細胞培養プレート５の原料材料が浸透しないので、ウェル形成突起２１が鋳型となって細胞培養ウェル３を形成できるようになっている。
　図３(f)のように、この硬化物から、重石３０と型枠４０とを離型すると、凹み２の底で縦横に複数並ぶ貫通穴４が貫通している細胞培養プレート５が得られる。この細胞培養プレート５の下面側を覆って貫通穴４の底側を塞いで細胞培養ウェル３を形成するように、薄膜シート６を直接、若しくは分子接着剤又は接着剤を介して、付すと、細胞培養容器１が得られる。必要に応じて、底上げするためにスペーサー７を用いてもよい。
　以下に本発明を適用する実施例、及び本発明を適用外の比較例について、詳細に説明する。
（調製実施例１：薄膜シートの調製）
　メインのポリマーとして、式（１）で示されるもので、分子量：４５～８０×１０４、重合単位がユニット分子量７４のジメチルシロキシユニットとしたときの重合度６０８１～１０８１１、繰り返し全ユニットの総モル数に対して前記ビニル基の総モル数が０．０３～５．００モル％、ビニル基が１分子中に２～６基のビニル基が全て架橋反応したとして架橋点間の繰り返しユニット数が１６６７～３３３３とするビニル基含有ジメチルポリジメチルシロキサンポリマーであるシリコーンガム材１１０－８（Ｄｏｎｇｉｕｅ　Ｓｉｌｉｃｏｎｅ社製の商品名）を用いた。このシリコーンガム材１１０－８の８質量％、９質量％及び１０質量％となるようにヘキサン／酢酸エチルを４：１体積比の混合溶媒に溶解した。架橋材として化学式（２）で示されるもので、分子量：１９００～２０００、重合単位がユニット分子量７４のジメチルシロキシユニットとしたときの重合度２６～２７、繰り返し全ユニットの総モル数に対して前記ヒドロシリル基の総モル数が２５～３５モル％、ヒドロシリル基が１分子中に６～９基とするヒドロシリル基含有ジメチルポリジメチルシロキサンポリマーＨＭＳ－３０１（Ｇｅｌｅｓｔ社製の商品名）の０．０７～０．０９質量％と、プラチナ触媒としてシクロビニルメチルシロキサン白金錯体（ＳＩＰ６８３２．３；Ｇｅｌｅｓｔ社製の商品名）の０．００２～０．００３質量％とを加えシリコーン溶液Ｓとした後、図２に示すように、マイクログラビアコーター（株式会社康井精機製の商品名）で成膜した。成膜は基材上で行うこととし基材１６としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムであるベースフィルム１６ａ上に、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）をあらかじめ塗工して粘着犠牲層１６ｂとしたものを用いた。製膜は、グラビアロール１０の一部を、容器Ｐのシリコーン溶液Ｓに浸漬しながら３０ｒｐｍで回転し、過剰のシリコン溶液Ｓをブレード１４で掻き落としつつシリコーン溶液Ｓを、転写ローラ１２に供給された基材１６のベースフィルム１６ａ上の粘着犠牲層１６ｂ上に塗工した。連続状の薄膜シート６が付着された基材１６を１２０℃で加熱し、連続状の薄膜シート６を乾燥・硬化させた。次いで、細胞培養容器１の細胞培養プレート５に対応するサイズ２０ｍｍ四方にカッター１８で切断し、基材１６に付された個別の薄膜シート６にした。基材１６から、粘着テープでＰＶＡ層と薄膜シートとを剥離させ、これを温水に浸漬し、ＰＶＡの粘着犠牲層を溶解させ、薄膜シート６を単離した。それをシリコーンウエハに貼り付け、触針式段差計ＤｅｋｔａｋＸＴ（Ｂｒｕｋｅｒ社製の商品名）を用いて、膜厚を測定した。その結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　以下、８質量％で得られた膜厚を２７５ｎｍと略記し、９質量％で得られた膜厚を３９０ｎｍと略記し、１０質量％で得られた膜厚を５μｍと略記する。濃度に応じて膜厚を調整することができた。
（作製実施例２：細胞培養容器の作製）
　図３(a)のように、細胞培養ウェル３に対応する０．５ｍｍφのウェル形成突起２１を縦横複数列有する転写板２０として、外径０．５ｍｍφで高さ０．５ｍｍのウェル形成突起を有する縦１５０ｍｍ×横２４０ｍｍで総厚さ２ｍｍのシリコーンゴム製のＫＤＳ００５（共和工業株式会社製の商品名）（同社ホームページより転載した顕微鏡拡大図である図４を参照）を、水洗し、８０℃で乾燥し、３０ｍｍ四方に切断した。図３(b)のように、この転写板２０に対し、放電電流３５～４５ｍＡで圧力４０～６０ｋＰａにて３０秒間プラズマ処置を施し、転写板ゴム表面を親水性に改質した。図３(c)のように、この転写板２０に対し、離型剤として１％ポリビニルアルコール水溶液を０．５ｍＬ滴下し、均等な塗工膜となるように４０００ｒｐｍで２０秒間スピンコートによって塗布した。図３(d)のように、厚さ１ｍｍで縦横約１０ｍｍ×３０ｍｍのアクリル樹脂製側板４枚と厚さ１ｍｍで縦横約３０ｍｍのアクリル樹脂製底板１枚とを、粘着テープで固定して、転写板２０が嵌るように底型枠４０を作製した。転写板２０を型枠４０に嵌め込んでから、細胞培養プレート５の凹み２に対応する直径１２ｍｍφで高さ２０ｍｍの円柱状の真鍮製の重石３０を転写板２０の中央部に載せ、重石３０の底面とウェル形成突起２１の上面とを密着させた。図３(e)のように、細胞培養プレート５の原料材料として液状シリコーンゴムＫＥ－１０４－Ｇｅｌ＆ＣＡＴ－１０４（信越シリコーン株式会社製の商品名）を、型枠４０内部へ流し込み始め、ウェル形成突起２１を浸しつつ重石３０の途中の高さまで約１０ｍｍ厚となるように流し込んだ。その後、６０℃で３時間加熱することにより硬化させて、細胞培養プレート５の硬化物を成型した。図３(f)のように、この硬化物から、重石３０と型枠４０とを離型すると、凹み２の底で縦横に複数並ぶ約０．５ｍｍφの径の貫通穴４が貫通している細胞培養プレート５が得られた。この細胞培養プレート５の上面側（重石側）と下面側（底側）との走査型電子顕微鏡で観察して確認した（図５；(a)(c)は上面側、(b)(d)は下面側、(e)は断面）。図５の通り、貫通穴４（ポーラス構造）は均一に貫通していた。この細胞培養プレート５の下面側を覆って貫通穴４の底側を塞いで細胞培養ウェル３を形成するように、各層厚の薄膜シート６を直接付すだけで、強固に密着した。凹み２の貫通穴４を塞がないようにしつつ空隙８が空くように、この細胞培養プレート５を薄膜シート６ごと２本のアクリル棒であるスペーサーへ載せると、細胞培養容器１が得られた。
（性能試験１：密着性試験）
　調製実施例２で得た細胞培養容器１の細胞培養ウェル３に、液体培地としてＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）及び細胞由来組織幹細胞（ＡＳＣｓ）を加えたところ、何れの厚さでも、薄膜シート６が破断・剥離・液漏れを生じなかった。
（性能試験２：酸素透過性試験）
　細胞培養容器１の酸素透過性を評価するために、図６に示すように、下槽５３に酸素を送り込む送気口５１と、下槽５３の上で仕切り板５４で分画された区画毎に、細胞培養容器１よりもやや小さめで下槽５３の上面に開いた口径の穴５２と、酸素を排気する排気口５５とを有する酸素透過性試験器５０を作製した。細胞培養容器１の凹み２が穴５２を覆うように各区画へ、培養液であるＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製の製品名）が細胞培養ウェル３に充填されている細胞培養容器１を載置した。送気口５１から下槽５３を充満するように酸素を送気し、各層厚の薄膜シート５を経て細胞培養ウェル３の培養液に透過した酸素濃度を、０、２、５、１５、３０及び６０分後に、Ｏｘｙｇｒａｐｈ＋（Ｈａｎｓａｔｅｃｈ社製）により計測した。なお、ネガティブコントロールとして、薄膜シート６の下に同形のガラスプレートを配置したものを用いた。その結果を図７に示す。
　図７から明らかな通り、本発明を適用する細胞培養容器１によれば、薄膜シート６は、厚さ５μｍ、３９０ｎｍ、２７５ｎｍと薄くなるにつれ培養液中の酸素濃度が少しずつ高まった。また経時変化によれば、薄膜シート６は、薄くなるにつれ飽和濃度に達する時間が早まった。従って、本発明を適用する細胞培養容器１は、酸素透過性が優れていることが示された。なお、本発明を適用外のネガティブコントロールでは、培養液中の酸素濃度が殆ど変わらなかったことから、培養液上方からの入ってくる酸素は殆ど無いことが示された。
（性能試験３：細胞培養試験）
　調製実施例２で作製した細胞培養容器１に代えて、細胞培養プレート５形成後に、細胞接着しないように非イオン性界面活性剤であるＰｌｕｒｏｎｉｃＦ１２７（ＢＡＳＦ社の登録商標）の３％水溶液に浸漬した後、取り出して乾燥させて、細胞非接着表面処理したこと以外は、調製実施例２と同様にして、薄膜シート６が各膜厚の細胞培養容器１を得た。薄膜シート６は、細胞非接着表面処理を施す必要がない。なお、コントロールとして、ポリスチレン製で細胞非接着処理した２４欠ウェルプレート（ＡＧＣテクノガラス株式会社製ポリスチレン２４ウェル細胞培養プレート）を用いた。脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣｓ）（Ｃｙａｇｅｎ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、２×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２）を、培養液としてＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製の商品名）を用い、夫々のウェル上で５日間培養した。
　（顕微鏡観察）
　図８及び図９に、各膜厚の薄膜シート６（図中、Nanosheetと表す）を用いた細胞培養容器１による脂肪由来間葉系幹細胞培養の顕微鏡観察結果を示す。図８から明らかな通り、本発明を適用する細胞培養容器１を用いたとき、１ウェルごとに１～２個のスフェロイドが形成され、スフェロイドのサイズのばらつきは比較的小さかった。一方、図９から明らかな通り、本発明を適用外のポリスチレン製２４欠ウェルプレート（コントロール）では、スフェロイドは略球体とならず、スフェロイドのサイズのばらつきが極めて大きかった。
　（サイズ測定試験）
　本発明を適用する各膜厚の薄膜シート６を用いた細胞培養容器１と、本発明を適用外であってその薄膜シート６の下にガラスプレートを備えた細胞培養容器１（ネガティブコントロール）と、本発明を適用外のポリスチレン製２４欠ウェルプレート（コントロール）による脂肪由来間葉系幹細胞培養によるスフェロイドの大きさを５日後に、倒立顕微鏡（ＩＸ－７１，Ｏｌｙｍｐｕｓ）で観察し、ＩｍａｇｅＪ（Ｗａｙｎｅ　Ｒａｓｂａｎｄ）により粒径を測定した。その結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　表２から明らかな通り、本発明を適用する各膜厚の薄膜シート６を用いた細胞培養容器１では膜厚が薄くなるほど酸素透過性が向上することに伴いスフェロイドのサイズが大きくなった。ネガティブコントロールである薄膜シート６の下にガラスプレートを備えた細胞培養容器１と比較してもサイズの点では然程差が認められなかった。しかし、コントロールであるポリスチレン製２４欠ウェルプレートでは、スフェロイドのサイズは有意に小さかった。
　（生存試験）
　５日後に、夫々のスフェロイドに対し、生存細胞をカルセインＡＭ染色（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により緑色に着色し、死滅細胞を　エチジウムホモダイマー１（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により赤色に着色して、染色したスフェロイドを共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＦＶ１０００，Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）で観察し、得られた蛍光データをＩｍａｇｅＪで解析することで生存率・死滅率を算出した。その顕微鏡観察結果を、図１０に示す。また、生存率・死滅率を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　図１０及び表３から明らかな通り、本発明を適用する各膜厚の薄膜シート６を用いた細胞培養容器１では膜厚が薄くなるほど酸素透過性が向上することに伴いスフェロイドの生存率が向上した。ネガティブコントロールである薄膜シート６の下にガラスプレートを備えた細胞培養容器１と比較しても生存率の点では然程差が認められなかった。しかし、コントロールであるポリスチレン製２４欠ウェルプレートでは、スフェロイドの生存率は有意に低かった。
　本発明の細胞培養容器、及びそれの製造方法によれば、培養液に十分に酸素を供給して、浮遊細胞、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、及びオルガノイドのような細胞を培養するのに有用である。
　１は細胞培養容器、２は凹み、３は細胞培養ウェル、４は貫通穴、５は細胞培養プレート、６は薄膜シート、７はスペーサー、８は空隙、１０はグラビアロール、１２は転写ローラー、１４はブレード、１６は基材、１６ａはベースフィルム、１６ｂは粘着犠牲層、１８はカッター、２０は転写板、２１はウェル形成突起、３０は重石、４０は型枠、５０は酸素透過性試験器、５１は送気口、５２は穴、５３は下槽、５４は仕切り板、５５は排気口、Ｓはシリコーン溶液、Ｐは容器である。

Claims (21)

  1. 　繰り返し全ユニット中の末端ユニット及び／又は中間ユニットにビニル基を有するポリジメチルシロキサンで架橋したシリコーンを含有する薄膜シートが、細胞培養プレートを貫通している貫通穴の底側を塞いで細胞培養ウェルを成すように付されている細胞培養容器であって、
    　前記ポリジメチルシロキサン中、前記ビニル基の総モル数が、前記繰り返し全ユニットの総モル数に対して、０．０３～５．００モル％であり、前記薄膜シートの厚さが最大でも５μｍであることによって、前記薄膜シートが酸素透過性を有していることを特徴とする細胞培養容器。
  2. 　前記薄膜シートの底面側が外界空気と接触するように、前記薄膜シートごと前記細胞培養プレートを搭載するスペーサーを有することを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記ポリジメチルシロキサン中、前記ビニル基の架橋点間の繰り返しユニット数が、３４８～３３３３であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記ポリジメチルシロキサンが、下記化学式（1-1）～（1-3）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　（但し、化学式（1-1）～（1-3）中、ｍ１～ｍ３は５６７６～１０８０９、ｎ１～ｎ３は２～４０５である）で示される少なくとも何れかのポリジメチルシロキサンポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記シリコーンが、前記ポリジメチルシロキサン中の前記ビニル基とそれへ付加する架橋剤中のヒドロシリル基とで架橋しているものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記架橋剤が、下記化学式（2-1）～（2-3）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （但し、化学式（2-1）～（2-3）中、ｐは１～２８であり、ｑは０～８３である）
    で示される少なくとも何れかのポリジメチルシロキサン架橋剤ポリマーであることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養容器。
  7. 　前記シリコーン中に、前記ビニル基へ前記ヒドロシリル基を付加させるプラチナ触媒を含有していることを特徴とする請求項５に記載の細胞培養容器。
  8. 　前記薄膜シートの伸長率が少なくとも１５０％であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  9. 　前記薄膜シートが、分子接着分子により又は接着剤により、若しくは直接、前記細胞培養プレートに接合していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  10. 　前記薄膜シートが、細胞接着処理表面を有し、又は細胞非接着処理表面を有していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  11. 　前記薄膜シートが、親水化剤を配合され、又は親水化処理表面を有していることにより、親水化されていることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  12. 　前記細胞培養ウェルが、複数列並んでいることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  13. 　前記細胞培養ウェルが、穴径０．０２～１．００ｍｍであり、深さ０．０２～１．００ｍｍであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  14. 　前記細胞培養プレートが、シリコーン樹脂、シリコーンゴム、ガラス、ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ポリエーテルエーテルケトン樹脂、及びポリフェニルスルホン樹脂から選ばれる少なくとも何れかの材質であることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  15. 　前記薄膜シートが、少なくとも１５ｍｇ／Ｌ・ｈの酸素透過性を有していることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  16. 　浮遊細胞、スフェロイド、単層又は多層細胞塊、及びオルガノイドから選ばれる少なくとも何れかの細胞を培養するためのものであることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養容器。
  17. 　細胞培養プレートを貫通している貫通穴を底側で塞いで細胞培養ウェルを形成するように、末端ユニット及び／又は中間ユニットへ繰り返し全ユニットの総モル数に対して０．０３～５．００モル％のビニル基を有するポリジメチルシロキサンで架橋したシリコーンを含有し厚さが最大でも５μｍである酸素透過性の薄膜シートを付し、
    　必要に応じ、前記薄膜シートの底面側が外界空気と接触するように、スペーサーを設けることを特徴とする細胞培養容器の作製方法。
  18. 　前記ポリジメチルシロキサンを含有する組成物をグラビアコーティング、スクリーン印刷、バーコーティング、ディップ法、又はスピンコーティングによって膜化し、架橋させて硬化させ、前記薄膜シートにすることを特徴とする請求項１７に記載の細胞容器の製造方法。
  19. 　前記細胞培養ウェルに対応するウェル形成突起を有する転写板に、細胞培養プレート原材料を流し込んで硬化させてから、離型し、前記細胞培養プレートを形成することを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養容器の作製方法。
  20. 　前記ウェル形成突起に重石を載せ、前記ウェル形成突起を越えるまで前記細胞培養プレート原材料を流し込んで硬化させることによって、前記重石によって前記細胞培養ウェルが貫通した前記細胞培養プレートを形成することを特徴とする請求項１７に記載の細胞培養容器の作製方法。
  21. 　前記転写板に、ポリビニルアルコール、でんぷん、酢酸ビニル、フッ素系界面活性剤、アルキル系界面活性剤、及びオレフィン系界面活性剤から選ばれる少なくとも何れかの離型剤を塗布しておくことを特徴とする請求項１９に記載の細胞概要容器の製造方法。
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MIHARA SHO, TAKEOKA SHINJI: "Preparation and characterization of highly elongated polydimethylsiloxane nanosheets", POLYMERS FOR ADVANCED TECHNOLOGIES, WILEY & SONS , BOGNOR REGIS, GB, vol. 33, no. 4, 1 April 2022 (2022-04-01), GB , pages 1180 - 1189, XP093119854, ISSN: 1042-7147, DOI: 10.1002/pat.5591 *

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