WO2019219605A1 - Verfahren zur herstellung eines zellkultureinsatzes mit mindestens einer membran - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines zellkultureinsatzes mit mindestens einer membran Download PDF

Info

Publication number
WO2019219605A1
WO2019219605A1 PCT/EP2019/062204 EP2019062204W WO2019219605A1 WO 2019219605 A1 WO2019219605 A1 WO 2019219605A1 EP 2019062204 W EP2019062204 W EP 2019062204W WO 2019219605 A1 WO2019219605 A1 WO 2019219605A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
membrane
insert
insert blank
blank
spacer
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/062204
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lutz KLOKE
Alexander Thomas
Tobias GRIX
Benjamin NOICHL
Anna KREUDER
Original Assignee
Cellbricks Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellbricks Gmbh filed Critical Cellbricks Gmbh
Priority to CN201980032647.3A priority Critical patent/CN112424331A/zh
Priority to EP19728879.8A priority patent/EP3794101A1/de
Priority to US17/054,810 priority patent/US20210107212A1/en
Publication of WO2019219605A1 publication Critical patent/WO2019219605A1/de

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • B29C64/124—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material using layers of liquid which are selectively solidified
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C12M25/04—Membranes; Filters in combination with well or multiwell plates, i.e. culture inserts
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y80/00—Products made by additive manufacturing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29C—SHAPING OR JOINING OF PLASTICS; SHAPING OF MATERIAL IN A PLASTIC STATE, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; AFTER-TREATMENT OF THE SHAPED PRODUCTS, e.g. REPAIRING
    • B29C64/00—Additive manufacturing, i.e. manufacturing of three-dimensional [3D] objects by additive deposition, additive agglomeration or additive layering, e.g. by 3D printing, stereolithography or selective laser sintering
    • B29C64/10—Processes of additive manufacturing
    • B29C64/106—Processes of additive manufacturing using only liquids or viscous materials, e.g. depositing a continuous bead of viscous material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B29—WORKING OF PLASTICS; WORKING OF SUBSTANCES IN A PLASTIC STATE IN GENERAL
    • B29K—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES B29B, B29C OR B29D, RELATING TO MOULDING MATERIALS OR TO MATERIALS FOR MOULDS, REINFORCEMENTS, FILLERS OR PREFORMED PARTS, e.g. INSERTS
    • B29K2995/00—Properties of moulding materials, reinforcements, fillers, preformed parts or moulds
    • B29K2995/0037—Other properties
    • B29K2995/0056—Biocompatible, e.g. biopolymers or bioelastomers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B33—ADDITIVE MANUFACTURING TECHNOLOGY
    • B33Y—ADDITIVE MANUFACTURING, i.e. MANUFACTURING OF THREE-DIMENSIONAL [3-D] OBJECTS BY ADDITIVE DEPOSITION, ADDITIVE AGGLOMERATION OR ADDITIVE LAYERING, e.g. BY 3-D PRINTING, STEREOLITHOGRAPHY OR SELECTIVE LASER SINTERING
    • B33Y10/00—Processes of additive manufacturing

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell culture insert with at least one membrane, in particular a biological membrane, and a cell culture insert produced by this method.
  • Cell culture inserts are practical, well-drained, or semipermeable support devices with ease of use for examining both anchorage-dependent (anchored) and anchorage-independent (non-adherent) cell lines. They are designed to create a cell culture environment that is more physiological than alternative two-dimensional culture systems.
  • the diameters of the cell culture inserts are adjusted accordingly so that they are positioned in a multiwell in a suspended position.
  • the crucial part of the cell culture insert is a membrane on the bottom / bottom of the cell culture insert.
  • This membrane can have a different porosity and consists of an inert plastic. On this membrane, cells are sown in everyday laboratory life. The seeded cells normally grow to a confluent monolayer. Following this, barrier or penetration assays can be performed.
  • a cell culture insert In a conventional cell culture insert, when the plastic membrane is removed and a biopolymer is introduced, a meniscus is formed due to interfacial tension. When the polymer is cured, a cell culture insert with a concave membrane is formed. This membrane can not or only poorly colonize with cells, as they are pulled by the combination of gravity / meniscus in the middle of the cell culture insert. In this way, a cell agglomeration arises in the middle of the cell culture insert and no confluent monolayer. It is an object of the present invention to provide a cell culture insert which has a substantially flat and flat biological membrane without cone.
  • a method for producing a cell culture insert with at least one membrane, in particular at least one biological membrane comprising the following steps:
  • the method comprises the following steps:
  • the introduction of the starting materials for membrane production in the insert blank can be done in various ways.
  • the insert blank can be introduced into a container containing the starting materials for membrane production.
  • the insert blank is immersed in the starting material-containing liquid.
  • it is also possible to introduce the starting material-containing liquid in the insert blank eg dropping). In this case, it is necessary to prevent the liquid from flowing out of the interior of the insert blank by suitable covering or sealing of the openings of the insert blank.
  • the method according to a further variant of the invention comprises the following steps:
  • the present method comprises the following steps:
  • the insert blank used in this process is available in this variant as a separate, already prefabricated blank.
  • the insert blank is preferably formed circular with a lower and an upper opening.
  • the method comprises the following steps:
  • the insert blank e.g. by immersing the insert blank provided with at least one spacer into a container containing the starting materials for producing the membrane, or by introducing (dropping) the starting materials directly into the insert blank provided with at least one spacer;
  • a cone-free, planar biological membrane can be created in a culture insert using printer technology.
  • This membrane is printed in an "empty" cell culture insert.
  • cell culture insert blanks are provided, which can be finished ready by pressing the membrane after the biological membrane carrier.
  • the culture insert is completed in place of a plastic membrane with a biopolymer membrane.
  • biopolymer is better growth and customization of the membrane to the cells to be sown, as not every cell type is on a plastic membrane cultivates and requires a very precise coordination of its extracellular environment.
  • biopolymers of the so-called extracellular matrix are used as polymers, including collagen, hyaluronic acid, gelatin, etc.
  • the culture inserts that can be produced by the present method have a number of improvements over conventional cell culture inserts:
  • a biological membrane consisting of one or more biopolymers. This provides the cells with a more physiological culture environment. Results obtained from biological experiments are much more meaningful than those that can be generated with conventional petri dishes or cell culture inserts.
  • the membrane can be modified because the physicochemical properties can be influenced by the composition of the matrix.
  • the membrane may e.g. be generated optically transparent, allowing a non-invasive control of the cell population in real time.
  • Detection substances can be coupled to the matrix to detect different phenomena during the experiment.
  • conductive elements are printed in the membrane to give electrical stimuli or record electrical signals from cells.
  • the membrane can consist of several printing layers, so that a different membrane composition can be produced not only in the X-Y plane but also in the Z plane.
  • the height of the membrane can be determined by the method.
  • the insert blank used is designed in the shape of a hollow cylinder or a truncated cone.
  • the truncated cone has a diameter decreasing in the direction of the lower opening (conical taper), a base area G (upper opening) with radius R, a cover area D (lower opening) with radius r and a height h k on.
  • the material of the insert blank is a cell and biocompatible polymer, but especially PP, PE, PLA, PS, PC, PTFE, PVC, PMMA, PAA, PAN, PEG, PET, PU, silicones, etc. Orient the typical dimensions of the insert blank the height and width of normal multiwell plates. Table 1 gives the typical dimensions for conventionally used multiwell plates.
  • the dimensions of the present cell culture insert are as follows (see Table 2):
  • the dimensions of the present cultural inserts are not subject to exact classification, since the dimensions of individual multiwell plates vary from manufacturer to manufacturer. Therefore, in the present case, a mean value for the cultural inserts is given. Standard blanks or individually manufactured blanks can be used. The individual production allows an adaptation of the insert to its function. Its size and shape can be varied. This can be z. B. affect the suspension on the cell culture insert or the shape of the foot.
  • the cell culture insert may be provided at its upper side or at its upper end with an outwardly directed projection, so that the cell culture insert can be cultivated hanging.
  • the cell culture insert at its lower side or at its lower end may be provided with outwardly directed and angled projections (feet). This allows an automatic standing of the cell culture insert in the multiwell plate.
  • recesses or grooves in the plane of the biomatrix can also be generated in order to achieve a better adhesion to the cell culture insert.
  • conductive elements can also be introduced into the cell culture insert in order to obtain a signal derivation or a sensor system.
  • edge of the insert blank may be formed continuously, so that a media exchange is only possible via the membrane itself.
  • the cutout thus formed may have an arbitrarily adjustable height, e.g. the section may be below the filling level of the cell medium present in the multiwell plate. Accordingly, a supply of the interior of the culture insert and a flow through the membrane carrier is possible over the neckline. In the latter case, there is correspondingly no barrier function of the blank between the outer multiwell plate and the interior of the blank.
  • a carrier serves pure culture and not a barrier function.
  • the spacer to be arranged in the insert blank is provided with at least one opening which allows a discharge of gas bubbles from the subsequently produced membrane and thus avoids accumulation of air bubbles in the membrane.
  • the opening should be provided as possible at the edge of the spacer.
  • the Bubble Trap is a cutout in the spacer or a released spot in the below described Auxiliary membrane, which ensures an outflow of air.
  • the air bubble which arises during insertion of the insert blank into the membrane polymer solution between spacers (or auxiliary membrane) can escape in this way. If the air remains under the spacer or the auxiliary membrane, this would be incorporated as air inclusion in the matrix, or the matrix would not have a flat surface at this point. In order to ensure a flat settlement area, inclusion of air must be prevented.
  • the bubble trap should ideally be easily filled with membrane polymer solution to ensure that all air is displaced below the spacer or auxiliary membrane.
  • the at least one spacer is designed in the form of a stamp.
  • a stamp is suitable for frustoconical or hollow cylindrical insert blanks.
  • the height or length of the punch indicates the desired distance h m to the lower opening of the insert blank and thus the thickness of the later membrane. It is advantageous if the stamp is coated on the outer surface in order to prevent adhesion of the membrane, in particular the biomembrane, during removal of the stamp.
  • the material of the stamp is made of a non-stick polymer.
  • Non-adhesion in this case means adhesion between the placeholder / stamp and biomembrane during and after printing.
  • the material of the stamp may in particular be PTFE, PEG or silicone.
  • punches allows batch production of cell culture inserts with membranes.
  • the method comprises the following steps:
  • stamp or stamps being vertically oriented
  • a non-stick film eg PDMS, FEP, PTFE
  • irradiation preferably from above through the film
  • the insert blank When assigning insert blank and punch, the insert blank may be e.g. put over the stamp or the stamp is inserted into the insert blank.
  • the attachment mechanism for connecting the insert blank to the respective punch may be a clamping mechanism (eg made of springs) which effects a leak-tight seal from one of the openings of the insert blank, so that the subsequently introduced (liquid) starting materials for membrane production remain in the insert blank and do not leak ,
  • a backing in particular a film (e.g., PDMS film);
  • a film e.g., PDMS film
  • the at least one spacer is formed as a disc.
  • the material of the disc is according to the material of the stamp.
  • the disc is made of PTFE, PEG or silicone.
  • the diameter of the disc corresponds to the usual cell culture insert dimensions.
  • the thickness of the disc corresponds to the desired membrane thickness between 10 gm and 1000 gm, preferably between 50 pm and 1000 pm, more preferably between 200 and 800 pm, even more preferably between 300 and 500 pm.
  • Such a disc is particularly suitable for frusto-conical insert blanks with decreasing diameter to the lower opening.
  • the disc bears against the inner wall of the insert blank.
  • the diameter of the disc is individually adjustable so that the distance of the disc from the lower opening of the insert blank is determined by the diameter of the disc; that is, the closer the disk diameter is to the radius r of the lower opening, the smaller the distance h m between the disk and the open top surface, wherein the distance h m defines the thickness (or height) of the membrane to be produced.
  • the spacer in particular a disk-shaped spacer, is used in combination with an auxiliary membrane.
  • the auxiliary membrane is preferably on the top of the spacer (ie the pointing in the direction of the upper opening side of the spacer), in particular the disc-shaped spacer, by entries of a liquid composition containing starting materials suitable for forming the auxiliary membrane and subsequent curing (eg by irradiation with Light or a similar physicochemical process).
  • the auxiliary membrane is made of a material which can be dissolved by a physico-chemical or enzymatic process, in particular PEG, poloxamer, hyaluronic acid, chitosan, chitin, collagen etc.
  • the auxiliary membrane is produced by means of a printer in the insert blank.
  • the insert blank is introduced into a printer, for example the Bioprinter from Cellbricks, and the auxiliary membrane is produced by stereolithography. Ie. the blank is placed in a liquid polymer and cured by irradiation from above and below the bed.
  • the auxiliary membrane can be generated by means of a disk as a spacer.
  • the insert blank is immersed in a carrier with a liquid auxiliary matrix, in the bottom of the spacer, eg disc is located. The diameter of the disc fills the interior of the blank flush.
  • auxiliary membrane After the curing of the auxiliary membrane, the spacer, in particular the disc-shaped spacer, is removed so that a stable auxiliary membrane / auxiliary layer remains in the insert blank.
  • This auxiliary membrane contains an opening for the discharge of gas bubbles (see also "Bubble Trap" as described above).
  • the insert blank provided with the at least one auxiliary membrane can be introduced into a container which contains the starting materials for producing the membrane.
  • the membrane is e.g. by irradiation (see also below), and after formation of the membrane, the auxiliary membrane is removed from the insert blank by suitable physicochemical methods (e.g., dissolution), leaving the formed (flat) membrane in the insert blank.
  • the auxiliary membrane is completely flat, since this layer was previously prepared by means of the spacer.
  • the auxiliary membrane contains an incision that acts as a bubble trap. Potential air bubbles that form upon introduction of the biopolymer may flow out through this vent and will not be captured and incorporated into the biopolymer upon cure. After filling the biopolymer this is cured.
  • Following the auxiliary membrane can be resolved by means of a physicochemical reaction, z. As temperature increase / decrease, pH change, resolution, etc., so that after completion of the resolution only a planar biopolymer membrane (apart from a small web due to the bubble trap) remains.
  • the membrane and here preferably the biological membrane after immersion of the culture insert with spacers in a container containing the starting materials for the production of the membrane is formed.
  • the starting materials are in particular photopolymerizable substances.
  • the formation of the membrane is carried out using a bio-pressure method, e.g. in WO 2016/075103 A1.
  • a light radiation is focused on a first focal plane lying within a region of the reaction vessel filled with the liquid.
  • a polymerized structure is then produced in the reaction vessel.
  • the polymerized structure is in a first layer.
  • any additional layers can be applied to this first layer.
  • a further photopolymerizable liquid is introduced into the reaction vessel, wherein the previously produced polymerized structure is at least partially covered with the further photopolymerizable liquid.
  • the previously produced polymerized structure is completely covered with the further photopolymerizable liquid.
  • a further light irradiation is carried out in a further focal plane, which lies within a region of the reaction vessel filled with the further liquid. This further focal plane thus differs from the first focal plane at least with respect to the already produced polymerized structure or with respect to the layer of this polymerized structure.
  • the layer thickness of the membrane to be produced can be set as desired and adapted to the corresponding requirements.
  • the layer thickness of the membrane between 10 gm and 1000 gm, preferably between 50 and 1000 pm, particularly preferred between 200 and 800 gm, more preferably between 300 and 500 gm, eg between 310 and 325 gm.
  • the photopolymerizable liquid may also contain biological cells or other substances.
  • biological cells When polymerisation occurs as a result of the light irradiation, the cells contained in the liquid are embedded in a corresponding polymer.
  • membranes of any polymers preferably biopolymers, can be produced.
  • the membrane may be constructed of the following materials: engineering biopolymers such as gelatin; Alpha and beta polysaccharides such as pectins, chitin, callose and cellulose; Lipids, in particular membrane-forming lipids, such as phospholipids, sphingolipids, glycolipids and ether lipids; polyhydroxyalkanoates; bio-based polymers such as polylactide, polyhydroxybutyrate; petroleum-based polymers, such as polyesters, in particular polyethylene glycol, polyvinyl alcohol, polybutylene adipate terephthalate (PBAT, polybutylene succinate (PBS), polycaprolactones (PCL), polyglycolide (PGA), synthetic peptides, such as recombinantly produced amino acids, amides, components of the extracellular matrix, such as collagens, Fibrillin, elastin, glycosaminoglycans, especially hyaluronic acids, heparan sulfate
  • the membrane consists of gelatin and collagen as an additive.
  • the starting materials are a suitable photoinitiator, e.g. Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) used.
  • LAP Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate
  • a securing means for holding the membrane in use is provided. It is preferred if the at least one securing means in the form of a carrier consisting of different structures, which are adapted to the membrane material, in particular of lattice-shaped or spoke-like structures, is formed.
  • the cell culture insert is made of insert blank and membrane in one piece using the printing method described above trained (one-pot synthesis).
  • the one-pot synthesis takes place additively with photopolymerizable materials.
  • the base of the scaffold is printed from a first (cell repellent) biomaterial.
  • a biocompatible layer of a second biomaterial is fabricated.
  • the scaffold is completed by the edges. Both materials are processed in a single printing process.
  • the insert blank formed thereby comprises an (upper) opening and may comprise a bottom.
  • the insert blank is preferably made of a first cell repellent biomaterial or biopolymer, e.g. Polyethylene glycol (PEG) or one of the other possible for the insert blank above possible polymer materials prepared.
  • a first cell repellent biomaterial or biopolymer e.g. Polyethylene glycol (PEG) or one of the other possible for the insert blank above possible polymer materials prepared.
  • PEG Polyethylene glycol
  • At the bottom of the insert blank is another biocompatible and biofunctional biopolymer as a membrane, e.g. made of gelatin on which cell materials can grow. The combination of the two different materials creates a scaffold that can be selectively populated with cells on the biocompatible material.
  • the securing means e.g. Grid
  • the securing means may be applied to the underside of the cell culture insert, i. the side carrying the membrane can be placed.
  • the mounting of the securing means e.g. a grid, based on a simple press fit.
  • the press fit can be removed, for example. be removed again with a kind of bottle opener.
  • the press fit is simply levered.
  • a biological membrane in a blank of two or more polymeric materials, preferably biopolymers.
  • the materials can be arranged in different architectures.
  • the different polymer materials can be arranged one above the other, in layers, wherein the number of layers is freely selectable.
  • a layer of a first polymer and a layer of a second polymer are provided in each case.
  • the polymer materials are arranged in a layer next to each other.
  • a membrane section made of a first polymer material may be provided, wherein the membrane section is integrated into the second polymer material (in the middle), ie Membrane portion of the first polymer material is surrounded by the second polymer material.
  • a three-dimensional architecture of the membrane is provided.
  • the membrane can be printed using a geometric shape.
  • villi, canals, hills, valleys, etc., - can be introduced - also from different materials.
  • the membrane surface to be populated can be formed with regular or irregular structures (hills, valleys).
  • At least one channel can be introduced into the membrane.
  • the channel may e.g. be used to supply the inner compartment of the blank.
  • the channel acts as a medium carrier with nutrient medium, which is flushed through the channel.
  • Cells that are located inside the compartment on the membrane can be supplied from the channels through the membrane.
  • an additional detector, dye, enzyme, chemokine, nanoparticles or the like can be integrated into the membrane during the printing process. Over time, this material can be used to monitor the cell culture online. For example, cell death can be detected by a fluorescent dye, or the current oxygen saturation or pH.
  • the functional material may or may not be in contact with the inner and outer boundary layers.
  • the functionalization can be observed by a color change, irradiation or other measurement to be detected.
  • the functional material can be inserted point by point into the membrane material, or can also be provided in the membrane in a layered or layered manner.
  • the membrane surface e.g. divide into segments, imprint cell arrays, or introduce gradients. This makes it possible to structure the membrane in its thickness and surface exactly.
  • the optical transparency can be influenced by the formulation of the biomatrix. It can, for. As a transparent matrix can be generated, which allows an optical control of the cell population. Thus, the transparency allows a non-invasive control of the cell population, which is not possible with a conventional cell culture insert.
  • a (non-polymeric) further material defined in the membrane and / or the blank can be introduced. In this way, for example, even more functions can be realized by introducing, for example, sensors, detection, conductive materials, chemicals, nanoparticles, etc.
  • the blank is provided with at least one probe.
  • the at least one probe preferably two probes, can each be provided on the inside and the outside of the blank.
  • the electrical resistance can be determined, whereby conclusions can be made about the density of the membrane and the cell lawn.
  • a cell culture insert can be produced, which consists of a blank insert with at least one membrane arranged therein, in particular at least one biomembrane, wherein the at least one membrane is flat and has no cone; i.e.
  • a cell culture insert with a confluent monolayer can be provided by this method.
  • the present cell culture insert can be used for culturing various cell lines and then performing barrier or penetration assays.
  • all cells and cell lines are suitable, which represent a barrier function, eg. Endothelial cells, trophoblasts, astrocytes, enterocytes, etc., or cells and cell lines representing metabolic function, e.g. As hepatocytes, cardiomyocytes, myocytes, etc. In general, all cell types are adherent.
  • a barrier function eg. Endothelial cells, trophoblasts, astrocytes, enterocytes, etc.
  • metabolic function e.g. As hepatocytes, cardiomyocytes, myocytes, etc. In general, all cell types are adherent.
  • FIG. 1 shows a comparison of a conventional culture insert with pores with a culture cell insert produced according to the invention
  • Figure 2a shows a first embodiment of the method according to the invention
  • FIG. 2b shows a second embodiment of the method according to the invention
  • FIG. 3 shows a fourth embodiment of the method according to the invention
  • Figure 4A is a schematic representation of the fuse of the membrane produced in
  • Figure 4B is a schematic representation of various embodiments of the
  • Figure 5 shows a first embodiment of the invention produced
  • FIG. 6A cell-cultivated membrane of a cell culture insert according to the invention
  • FIG. 6B is a cross-sectional view of a cell-populated membrane in a cell culture insert according to the invention.
  • FIG. 6C micrographs of a cell-populated membrane in a cell culture insert according to the invention.
  • FIG. 8 shows a further embodiment of the invention produced
  • FIG. 1 shows on the left side a) a conventional cell culture insert with pores.
  • the membrane formed at the bottom of the cell culture insert consists of an inert one
  • Plastic with adjustable porosity On this membrane in the laboratory everyday cells are seeded, which normally grow to a monolayer and with which barrier or
  • Penetration assays can be performed.
  • FIG. 1 On the right side b) of FIG. 1, a culture insert with a biological membrane produced according to the method according to the invention is shown.
  • the formed biological membrane is flat and has no cone.
  • the cone-free membrane allows a good colonization with cells.
  • a first embodiment of the method according to the invention is shown schematically, wherein a spacer, here in the form of a punch, is introduced into a frusto-conical cultural use.
  • the punch is individually adjustable in height, so that after insertion of the punch in the culture insert, the distance between the punch and the lower opening of the culture insert is arbitrarily adjustable.
  • the distance between the punch and the lower opening of the culture insert indicates the desired height or thickness of the biomembrane to be formed later.
  • the stamper must also be coated with a suitable material to prevent adhesion of the formed biomembrane upon removal of the stamper from the culture insert.
  • the culture insert with the stamp introduced therein is introduced into a reaction vessel with a polymerisable liquid, wherein the polymerisable liquid contains the starting components for the preparation of the desired biomembrane.
  • the stamp should contain a "bubble trap" to avoid accumulation of air bubbles in the biomembrane
  • the formation of the biomembrane takes place in a printing process, wherein light is irradiated in a focal plane onto the polymerisable liquid, resulting in a polymerization to the biomembrane in the focal plane.
  • the stamp After hardening of the biomembrane, the stamp can be easily removed from the culture insert due to its material coating (step 4), leaving behind a planar biomembrane in culture use.
  • FIGS. 2 b and 2 c enable batch-wise membrane production.
  • the following steps are performed: 1) providing a single stamp or an array of several stamps, the stamp or stamps being oriented vertically; 2) associating at least one insert blank with each stamp, the stamp being centered in the respective insert blank; in the assignment of insert blank and stamp the insert blank can be put over the stamp, for example, or the stamp is in the Insert blank introduced; 3) placing a fastening mechanism (clamping mechanism eg with springs) to connect the insert blank with the respective punch; 4) introducing a quantity of pressure fluid (with the starting materials for membrane production) via the free opening in the insert blank (eg with a pipette); 5) covering the free openings of the insert blanks, preferably with a film (PDMS film), 6) forming a polymer membrane by irradiation (irradiation preferably from above through the film); 7) removing the PDMS film; 8) removing the attachment mechanism, and 9) removing the punch or stamping arrays.
  • a fastening mechanism clamping mechanism eg with springs
  • the order of process steps in the batch process is changed: 1) providing a film (e.g., PDMS film); 2) providing an aliquot of membrane production precursors at the location on the film, each one for a blank insert (using a pipette or multipipette); 3.) placing a blank insert around the respective aliquot of starting materials for membrane production on the foil; 4) placing a fastening mechanism to secure the insert blank to the foil; 5) inserting a single punch or an array of multiple punches into the respective insert blank, the punch or punches being vertically oriented; 6) forming a polymer membrane by irradiation (preferably from below through the film); 7) removing the punch or punching arrays from the insert blank; and 8) removing the insert blank with the polymer membrane formed therein.
  • a film e.g., PDMS film
  • an aliquot of membrane production precursors at the location on the film, each one for a blank insert (using a pipette or multipipette);
  • the insert blanks provided with the polymer membrane may then be e.g. be stored in multiwell plates.
  • the fourth embodiment of the method according to the invention shown in FIG. 3 uses a disk instead of a stamp as a spacer.
  • the disk is introduced into the culture insert in a first step and defines the thickness of the membrane to be formed via the distance to the lower opening of the culture insert.
  • a polymerizable liquid is introduced in a second step within the culture insert, which is then cured by light irradiation or a similar physico-chemical process to form an auxiliary membrane.
  • the disc After the curing of the auxiliary membrane, the disc is removed as a spacer in a third step and leaves behind a stable auxiliary membrane having an opening as a "bubble trap".
  • the culture insert is introduced with the auxiliary membrane in a reaction vessel with the liquid biopolymer and then cured by irradiation in a printing process.
  • a double layer of biomembrane and auxiliary membrane remains in the culture insert.
  • the auxiliary membrane is removed in a final step by a physico-chemical process or simple dissolution leaving behind a flat biomembrane.
  • a plastic grid can be placed underneath the culture insert after the biomembrane has been fabricated (see FIG. 4A).
  • the biomembrane is secured or secured by means of a grid, which is secured with a press fit at the foot of the culture insert. This safeguard of the biomembrane can be easily removed with a capsule lifter to ensure access to the biomembrane or their removal.
  • the securing means may be lattice-shaped or spoke-shaped (see FIG. 4B).
  • FIG. 1 An embodiment of a cell culture insert produced according to the invention is shown in FIG.
  • the cell culture insert is cylindrical.
  • support webs are provided, which allow insertion and removal of the cell culture insert from a nutrient solution in a multiwell plate.
  • a grid can be seen as securing means for holding the biomembrane in the cylindrical housing.
  • the images of Figure 6A show microscopic transmitted light images of the top and bottom of a populated carrier. On the left, the underside is shown with a holder for the membrane, on the right the top of the carrier with populated surface. Caco-2 cells were used as cells.
  • FIG. 6B shows a lateral cross section through a HUVEC cell-populated gelatin membrane, performed with a 2-photon microscope.
  • the individual colors show the different markers investigated in this experiment: DAPI (cell nucleus), vWF and CD31 (vascular cell marker). It can be a polarization and thus a natural behavior of the cells are detected.
  • the micrographs shown in FIG. 6C show a lateral section through the membrane. The upper side of the image represents the top of the membrane, the membrane populated with cells divides the image, and the lower half of the image represents the underside of the substrate.
  • the individual colors indicate a polarization of the cells towards the membrane. In the case of a microscopic image, an increased collagen production of the cells towards the membrane can be shown.
  • the cells are Vero cells.
  • the nuclei were also stained with DAPI. With the help of the experiment a polarization and interaction of the cells should be shown. In comparison, this effect is less pronounced or not pronounced in a Petri dish
  • the present cell culture insert can be formed with a continuous edge (FIG. 7, a) for a barrier function or a cutout (FIG. 7, b).
  • the cutout can be below the media level in the multiwell, so that a nutrient supply of the cells located on the membrane can take place.
  • the cell culture insert may be provided with two or more different materials as a membrane in a blank, which materials may be arranged in different architectures, e.g. B. side by side ( Figure 7, c) or one above the other ( Figure 7, d) or in other architectures.
  • This architecture can be introduced in blanks for hanging or feet.
  • the membrane is printed with a geometric shape.
  • the membrane must not only be inserted straight into the blank, but may also have an architectural shape.
  • villi, canals, hills, valleys (FIG. 7, e) can be introduced, also from different materials (FIG. 7, f).
  • This architecture can be placed in blanks for hanging or feet.
  • a channel can be introduced, which can be rinsed from outside the blank ( Figure 7, g, h).
  • the channel can be used to supply the inner compartment of the blank.
  • the channel acts as a medium carrier with nutrient medium, which is flushed through the channel.
  • Cells that are located on the membrane inside the compartment can be supplied by the membrane
  • Functional material can also be introduced into the membrane of the cell culture insert.
  • an additional detector, dye, enzyme, chemokine, nanoparticles or the like can be integrated into the membrane during the printing process. Over time, this material can be used to monitor the cell culture online. For example, cell death can be detected by a fluorescent dye, or the current oxygen saturation or pH.
  • the functional material may or may not be in contact with the inner and outer boundary layers.
  • the functionalization can be observed by a color change, irradiation or other measurement to be detected.
  • the functional material can be introduced pointwise in the membrane (FIG. 7, i) or flat (FIG. 7, j).
  • the cell culture insert can also allow the measurement of the membrane density by the electrical resistance.
  • a special blank can be used in which a probe is attached to the blank in each case inside and outside, in order to be able to determine the electrical resistance and thus conclusions about the density of the membrane and the cell lawn (FIG. 7, k).
  • Figure 8 shows a cell culture insert provided with outwardly directed and angled protrusions (feet) at its lower side and at its lower end (i.e., the part of the cell culture insert contacting the bottom of the multiwell plate). This allows an automatic standing of the cell culture insert in the multiwell plate.
  • FIG. 9 shows a further variant of the cell culture insert.
  • the cell culture insert consists of a bottomed cylinder (see Figure Biopolymer 2, blue). Another biopolymer (see Figure Biopolymer 1, green) is incorporated on the bottom.
  • Material b (see figure) forms the framework that gives the construct stability.
  • the biopolymer is based on polyethylene glycol (PEG), a biocompatible but cell repellent polymer.
  • PEG polyethylene glycol
  • material a is incorporated, which in the example is based on gelatine. In contrast to PEG, gelatin is not only biocompatible, but biofunctional, so that cells grow on this material.
  • the combination of the two materials creates a scaffold that is aligned with cells can be colonized.
  • the area comprising biopolymer 1 (a) sets the maximum area at which cells can grow. In a colonization, the cells grow to the edge. Since the edge consists of the cell-repelling polymer 2 (b), they can not colonize the edge. Growth stops at this limit.
  • Cell culture inserts with a diameter of 12 mm were produced by means of the stamping process.
  • a gelatin matrix with a concentration of 10% (w / v) was added, which was mixed with LAP as an initiator in a concentration of 0.1% (w / v).
  • collagen I was used as an additive.
  • the blank was filled with a silicone stamp and placed in a basin in the printer containing the liquid gelatin matrix described above, so that the blank sits on the bottom of the basin in the printer.
  • the distance was adjusted accordingly with the stamp before.
  • the gelatin matrix was cured by irradiation with a wavelength of 385 nm.
  • the carrier was removed from the basin and the printer.
  • the stamp was removed and left behind a cell culture insert with the previously defined height and with a flat surface for colonization.
  • Vero cells This is a kidney cell line of the green monkey. This cell line is often used for infection experiments. After colonization, the Vero cells formed a confluent monolayer over the entire area of the cell culture insert.
  • a GFP-tagged cowpox strain was used to infect the Vero cells with the strain.
  • the spread of infection could be due to the fluorescent viruses and the transparent cell culture insert are studied and observed over the course of the experiment of 28 days.
  • the membrane was punched out and deep-frozen.
  • the membrane could be cut and stained with the usual histological methods so that histological follow-up was possible.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran, insbesondere mindestens einer biologischen Membran, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen von mindestens einem Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung; und Ausbilden der Membran im Einsatzrohling mittels eines Biodruckverfahrens.

Description

Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran, insbesondere einer biologischen Membran, und ein nach diesem Verfahren hergestellten Zellkultureinsatz.
Beschreibung
Untersuchungen und Tests von Zellkulturen im großen Maßstab werden standardmäßig in Multiwellplatten durchgeführt. Für die Kultivierung von einschichtigen Zellrasen (sog. Monolayer) in solchen Multiwellplatten wurden geeignete Einsätze entwickelt, die generell als Zellkultureinsatz bezeichnet werden.
Zellkultureinsätze sind praktische, durchlässige oder semipermeable Auflagevorrichtungen mit leichter Anwendbarkeit zur Untersuchung sowohl von verankerungsabhängigen (adhärenten) als auch verankerungsunabhängigen (nicht adhärenten) Zelllinien. Sie sind konzipiert, um eine Zellkulturumgebung zu schaffen, die physiologischer ist als alternative zweidimensionale Kultursysteme.
Entsprechend den standardisierten Größen für Multiwellplatten sind auch die Durchmesser der Zellkultureinsätze entsprechend angepasst, so dass diese hängend im Multiwell positioniert sind.
Den entscheidenden Teil des Zellkultureinsatzes bildet eine Membran am Boden/ Fuß des Zellkultureinsatzes. Diese Membran kann eine unterschiedliche Porosität aufweisen und besteht aus einem inerten Kunststoff. Auf dieser Membran werden im Laboralltag Zellen ausgesät. Die ausgesäten Zellen wachsen im Normalfall zu einem konfluenten Monolayer. Im Anschluss können Barriere- oder Penetrationsassays durchgeführt werden.
Wird bei einem herkömmlichen Zellkultureinsatz die Plastikmembran entfernt und ein Biopolymer eingebracht, bildet sich aufgrund der Grenzflächenspannung ein Meniskus aus. Wird das Polymer ausgehärtet, entsteht ein Zellkultureinsatz mit einer konkaven Membran. Diese Membran lässt sich nicht oder nur schlecht mit Zellen besiedeln, da diese durch die Kombination Schwerkraft/Meniskus in die Mitte des Zellkultureinsatzes gezogen werden. Auf diesem Weg entsteht eine Zell-Agglomeration in der Mitte des Zellkultureinsatzes und kein konfluenter Monolayer. Der vorliegenden Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde einen Zellkultureinsatz bereitzustellen, der eine weitgehend flache und ebene biologische Membran ohne Konus aufweist.
Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 und eines mit diesem Verfahren hergestellten Zelllkultureinsatzes mit den Merkmalen des Anspruchs 16 gelöst.
Entsprechend wird ein Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran, insbesondere mindestens einer biologischen Membran, bereitgestellt, welches die folgenden Schritte umfasst:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung; und
- Ausbilden der Membran im Einsatzrohling mittels eines Biodruckverfahrens.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Variante umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung,
- Einbringen der Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran in den Einsatzrohling,
- Ausbilden der Membran in einem Biodruckverfahren (z.B. durch Bestrahlung), und
- Entfernen des Einsatzrohlings, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
Das Einbringen der Ausgangsstoffe zur Membranerzeugung in den Einsatzrohling, kann in verschiedener Weise erfolgen. So kann der Einsatzrohling in einen Behälter eingebracht werden, der die Ausgangsstoffe zur Membranerzeugung enthält. In diesem Fall wird der Einsatzrohling in die Ausgangsstoffe enthaltende Flüssigkeit eingetaucht. Es ist aber auch möglich, die Ausgangsstoffe enthaltende Flüssigkeit in den Einsatzrohling einzubringen (z.B. einzutropfen). In diesem Fall ist es erforderlich, dass ein Abfließen der Flüssigkeit aus dem Inneren des Einsatzrohlings durch geeignete Bedeckungen oder Abdichtungen der Öffnungen des Einsatzrohlings vermieden wird.
Entsprechend umfasst das Verfahren gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Variante die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung,
- Einbringen des Einsatzrohlings in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält,
- Ausbilden der Membran in einem Biodruckverfahren (z.B. durch Bestrahlung), und
- Entfernen des Einsatzrohlings aus dem Behälter, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Variante umfasst das vorliegende Verfahren die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling,
- Abdecken einer Öffnung des Einsatzrohlings und Einbringen der Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran in den Einsatzrohling durch die andere Öffnung des Einsatzrohlings,
- Ausbilden der Membran in einem Biodruckverfahren (z.B. durch Bestrahlung), und
- Entfernen der Abdeckung von der einen Öffnung, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt. Der in diesem Verfahren verwendete Einsatzrohling liegt in dieser Variante als separater, bereits vorgefertigter Rohling vor. Der Einsatzrohling ist bevorzugt kreisförmig mit einer unteren und einer oberen Öffnung ausgebildet.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren folgende Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem kreisförmigen, hohlen Einsatzrohling mit einer unteren und einer oberen Öffnung;
- Einfuhren und Anordnen von mindestens einem kreisförmigen Abstandshalter in den Einsatzrohling in einem vorbestimmten Abstand hm zu der unteren Öffnung des Einsatzrohlings, wobei der Abstand hm des kreisförmigen Abstandshalters von der unteren Öffnung des Einsatzrohlings durch die Dicke der im (Innenraum des) Einsatzrohling(es) zu erzeugenden Membran bestimmt wird;
- Einbringen der Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran in den Einsatzrohling; z.B. durch Eintauchen des mit mindestens einem Abstandshalter versehenen Einsatzrohlings in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält, oder durch Einbringen (Eintropfen) der Ausgangsstoffe direkt in den mit mindestens einem Abstandshalter versehenen Einsatzrohling;
- Ausbilden der Membran (z.B. durch Bestrahlung), und
- Entfernen des Abstandshalters aus dem Einsatzrohling, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
Es wird somit ein Verfahren bereitgestellt, mit welchem unter Verwendung einer Druckertechnologie eine konusfreie, ebene biologische Membran in einem Kultureinsatz erzeugt werden kann. Diese Membran wird in einen„leeren“ Zellkultureinsatz gedruckt. Hierzu werden Zellkultureinsatzrohlinge bereitgestellt, die im Anschluss zum biologischen Membranträger durch Eindrücken der Membran fertig konfektioniert werden können. Nach Fertigstellung ist der Kultureinsatz anstelle einer Plastikmembran mit einer Biopolymermembran abgeschlossen.
Der Vorteil eines Biopolymers ist ein besseres Wachstum und eine individuelle Anpassung der Membran an die auszusäenden Zellen, da sich nicht jeder Zelltyp auf einer Plastikmembran kultivieren lässt und eine sehr genaue Abstimmung seiner extrazellulären Umgebung benötigt. Als Polymere kommen unter anderem alle Biopolymere der sogenannten Extrazellulären Matrix zur Anwendung, u. a. Kollagen, Hyaluronsäure, Gelatine, etc.
Die mit dem vorliegenden Verfahren herstellbaren Kultureinsätze weisen eine Vielzahl von Verbesserungen gegenüber den herkömmlichen Zellkultureinsätzen auf:
Es wird eine biologische Membran bestehend aus einem oder mehreren Biopolymeren bereitgestellt. Diese liefert den Zellen eine physiologischere Kulturumgebung. Erzielte Ergebnisse biologischer Experimente sind deutlich aussagekräftiger als solche, die mit konventionellen Petrischalen oder Zellkultureinsätzen generiert werden können.
Die Membran kann modifiziert werden, da durch die Komposition der Matrix die physikochemischen Eigenschaften beeinflusst werden können.
Die Membran kann z.B. optisch transparent erzeugt werden, was eine nicht-invasive Kontrolle der Zellpopulation in Echtzeit ermöglicht.
Detektionssubstanzen können an die Matrix gekoppelt werden, um unterschiedliche Phänomene während des Versuchs zu detektieren.
Darüber hinaus können unterschiedliche Architekturen auf der Matrix erzeugt werden. Neben einer komplett planen Fläche können auch unterschiedliche Kompartimente, Kanäle etc. erzeugt werden. Ferner können z. B. leitende Elemente in die Membran eingedruckt werden, um elektrische Reize zu geben oder elektrische Signale von Zellen aufzuzeichnen.
Es können bereits Zellen, Bakterien, Viren und Pflanzenkeime in die Biomembran mit eingebracht werden.
Es kann mit mehr als einem Materialtyp in einer Ebene gearbeitet werden, um z. B, Bereiche mit einer veränderten Matrixkomposition zu erzeugen.
Die Membran kann aus mehreren Druckschichten bestehen, so dass nicht nur in X-Y- Ebene, sondern auch in der Z-Ebene eine unterschiedliche Membrankomposition erzeugt werden kann.
Die Höhe der Membran kann durch das Verfahren bestimmt werden.
In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der zum Einsatz kommende Einsatzrohling hohlzylindrisch oder kegelstumpfförmig ausgebildet.
Im Falle eines hohlen, kegelstumpfförmigen Einsatzes weist der Kegelstumpf einen sich in Richtung der unteren Öffnung verringernden Durchmesser (konische Verjüngung), eine Grundfläche G (obere Öffnung) mit Radius R, eine Deckfläche D (untere Öffnung) mit Radius r und eine Höhe hk auf. Das Material des Einsatzrohlings ist ein zell- und biokompatibles Polymer, insbesondere aber PP, PE, PLA, PS, PC, PTFE, PVC, PMMA, PAA, PAN, PEG, PET, PU, Silikone, etc. Die typischen Abmessungen des Einsatzrohlings orientieren sich an der Höhe und der Breite normaler Multiwellplatten. Aus Tabelle 1 sind die typischen Abmessungen für konventionell verwendete Multiwellplatten angeführt.
Figure imgf000008_0001
Tabelle 1
Die Abmessungen des vorliegenden Zellkultureinsatzes sind entsprechend wie folgt (siehe Tabelle 2):
Figure imgf000008_0002
Tabelle 2
Die Abmessungen der vorliegenden Kultureinsätze unterliegen keiner exakten Einteilung, da die Maße einzelner Multiwellplatten von Hersteller zu Hersteller variieren. Daher wird vorliegend ein Mittelwert für die Kultureinsätze gegeben. Es können Standardrohlinge oder individuell gefertigte Einsatzrohlinge zum Einsatz kommen. Die individuelle Fertigung ermöglicht eine Anpassung des Einsatzes an seine Funktion. Dabei kann seine Größe und seine Form variiert werden. Dies kann z. B. die Aufhängung am Zellkultureinsatz oder die Form des Fußes betreffen. So kann der Zellkultureinsatz an seiner oberen Seite bzw. an seinem oberen Ende mit einem nach außen gerichtetem Vorsprung versehen sein, so dass der Zellkultureinsatz hängend kultiviert werden kann. Darüber hinaus kann der Zellkultureinsatz an seiner unteren Seite bzw. an seinem unteren Ende (d.h. der Teil des Zellkultureinsatzes, der den Boden der Multiwellplatte berührt) mit nach außen gerichteten und abgewinkelten Vorsprüngen (Fü ßen) versehen sein. Dies ermöglicht ein selbsttätiges Stehen des Zellkultureinsatzes in der Multiwellplatte.
Darüber hinaus können bspw. auch Aussparungen oder Rillen in der Ebene der Biomatrix erzeugt werden, um eine bessere Anhaftung am Zellkultureinsatz zu erreichen. Ferner können auch in den Zellkultureinsatz leitende Elemente eingebracht werden, um eine Signalableitung oder eine Sensorik zu erhalten.
Des Weiteren kann der Rand des Einsatzrohlings durchgängig ausgebildet sein, so dass ein Medienaustausch nur über die Membran selbst möglich ist.
Es ist aber auch möglich, den Rand einzuschneiden. Der so gebildete Ausschnitt kann eine beliebig anpassbare Höhe aufweisen, z.B. kann der Ausschnitt unterhalb der Füllhöhe des in der Multiwellplatte vorhandenen Zellmediums sein. Entsprechend ist über den Ausschnitt eine Versorgung des Innenraums des Kultureinsatzes und ein Durchströmen des Membranträgers möglich. Im letzteren Fall existiert entsprechend keine Barrierefunktion des Rohlings zwischen äußerer Multiwellplatte und Innenraum des Rohlings. Ein solcher Träger dient der reinen Kultur und nicht einer Barrierefunktion.
In einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der in den Einsatzrohling anzuordnende Abstandshalter mit mindestens einer Öffnung versehen, der ein Ableiten von Gasblasen aus der nachfolgend hergestellten Membran ermöglicht und somit ein Ansammeln von Luftblasen in der Membran vermeidet. Die Öffnung sollte möglichst am Rand des Abstandshalters vorgesehen sein.
Diese Öffnung kann auch als "Bubble Trap" beschrieben werden. Die Bubble Trap ist ein Ausschnitt im Abstandhalter oder eine freigelassene Stelle in der weiter unten beschriebenen Hilfsmembran, die ein Ausströmen von Luft gewährleistet. Die Luftblase, die beim Einsetzen des Einsatzrohlings in die Membranpolymerlösung zwischen Abstandshalter (oder Hilfsmembran) entsteht, kann auf diesem Weg entweichen. Sollte die Luft unter dem Abstandshalter bzw. der Hilfsmembran bleiben, würde diese als Lufteinschluss in die Matrix eingebaut, bzw. die Matrix hätte an dieser Stelle keine plane Fläche. Um eine plane Siedlungsfläche zu gewährleisten, muss ein Einschluss von Luft verhindert werden. Die Bubble Trap sollte im Idealfall leicht mit Membranpolymerlösung gefüllt sein, damit gesichert ist, dass alle Luft unterhalb des Abstandshalter bzw. der Hilfsmembran verdrängt wird.
In einer weiteren Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens ist der mindestens eine Abstandshalter in Form eines Stempels ausgebildet. Solch ein Stempel ist für kegelstumpfförmige oder hohlzylindrische Einsatzrohlinge geeignet. Die Höhe bzw. Länge des Stempels gibt dabei den gewünschten Abstand hm zur unteren Öffnung des Einsatzrohlings vor und somit die Dicke der späteren Membran. Es ist vorteilhaft, wenn der Stempel auf der Außenfläche beschichtet ist, um ein Anhaften der Membran, insbesondere der Biomembran, beim Entfernen des Stempels zu verhindern.
Das Material des Stempels besteht aus einem nicht-haftendem Polymer. Als Nicht-Anhaftung ist in diesem Fall ein Haften zwischen Platzhalter/Stempel und Biomembran während und nach dem Druckvorgang gemeint. Das Material des Stempels kann insbesondere PTFE, PEG oder Silikon betragen.
Die Verwendung von Stempeln ermöglicht die batchweise Herstellung von Zellkultureinsätzen mit Membranen.
In einer Ausführungsvariante umfasst das Verfahren folgende Schritte:
- Bereitstellen eines einzelnen Stempels oder eines Arrays von mehreren Stempeln, wobei der Stempel oder die Stempel vertikal orientiert sind;
- Zuordnen von mindestens einem Einsatzrohling zu jedem Stempel, wobei der Stempel mittig in dem jeweiligen Einsatzrohling angeordnet wird;
Anordnen eines Befestigungsmechanismus, um den Einsatzrohling mit dem jeweiligen Stempel zu verbinden;
- Einbringen der Ausgangsstoffe zur Membranerzeugung, bevorzugt einer die Ausgangsstoffe enthaltenden Flüssigkeit, über die freie Öffnung in den Einsatzrohling;
- Abdecken der freien Öffnungen der Einsatzrohlinge, bevorzugt mit einer Antihaft-Folie (z.B. PDMS, FEP, PTFE), - Ausbilden einer Polymermembran durch Bestrahlen (Bestrahlung bevorzugt von oben durch die Folie);
- Entfernen der Abdeckung und des Befestigungsmechanismus, und
- Entfernen des Stempels oder des Stempelarrays.
Bei der Zuordnung von Einsatzrohling und Stempel kann der Einsatzrohling z.B. über den Stempel gestülpt werden oder der Stempel wird in den Einsatzrohling eingeführt. Der Befestigungsmechanismus zur Verbindung des Einsatzrohlings mit dem jeweiligen Stempel kann ein Klemmmechanismus (z.B. aus Federn) sein, der einen auslaufdichten Abschluss von einer der Öffnungen des Einsatzrohling bewirkt, so dass die anschließend einzubringenden (flüssigen) Ausgangsstoffe zur Membranerzeugung in dem Einsatzrohling verbleiben und nicht auslaufen.
Es ist auch möglich die Reihenfolge der Verfahrensschritte im Batchverfahren zu verändern. So kann das Verfahren in der folgenden Reihenfolge durchgeführt werden:
- Bereitstellen einer Unterlage, insbesondere einer Folie (z.B. PDMS Folie);
- Bereitstellen eines Aliquot von Ausgangsstoffen zur Membranerzeugung an der Stelle auf der Unterlage, die jeweils für einen Einsatzrohling vorgesehen ist (Verwendung einer Pipette oder Multipipette)
- Anordnen eines Einsatzrohlings um das jeweilige Aliquot von Ausgangsstoffen zur Membranerzeugung auf der Unterlage;
- Anordnen eines Befestigungsmechanismus, um den Einsatzrohling auf der Unterlage zu befestigen;
- Einführen eines einzelnen Stempels oder eines Arrays von mehreren Stempeln in den jeweiligen Einsatzrohling, wobei der Stempel oder die Stempel vertikal orientiert sind;
- Ausbilden einer Polymermembran durch Bestrahlen (bevorzugt von unten durch die
Folie);
- Entfernen des Stempels oder des Stempelarrays aus dem Einsatzrohling; und
- Entfernen des Einsatzrohlings mit der darin ausgebildeten Polymermembran, wobei die ausgebildete Membran in den Einsatzrohlingen verbleibt. In einer anderen Ausführungsform ist der mindestens eine Abstandshalter als Scheibe ausgebildet.
Das Material der Scheibe ist entsprechend dem Material des Stempels. Die Scheibe besteht aus PTFE, PEG oder Silikon. Der Durchmesser der Scheibe entspricht den üblichen Zellkultureinsatzmaßen. Die Dicke der Scheibe entspricht der gewünschten Membrandicke zwischen 10 gm und 1000 gm, bevorzugt zwischen 50 pm und 1000 pm, insbesondere bevorzugt zwischen 200 und 800 pm, noch mehr bevorzugt zwischen 300 und 500 pm.
Eine derartige Scheibe ist insbesondere für kegelstumpfförmige Einsatzrohlinge mit sich zur unteren Öffnung verringernden Durchmesser geeignet. Bevorzugt liegt die Scheibe an der Innenwand des Einsatzrohlings an. Der Durchmesser der Scheibe ist individuell einstellbar, so dass der Abstand der Scheibe von der unteren Öffnung des Einsatzrohlings durch den Durchmesser der Scheibe bestimmt wird; d.h. je näher der Scheibendurchmesser dem Radius r der unteren Öffnung ist, desto geringer ist der Abstand hm zwischen Scheibe und offener Deckfläche, wobei der Abstand hm die Dicke (bzw. Höhe) der zu erzeugenden Membran definiert.
In einer weiteren Variante des vorliegenden Verfahrens wird der Abstandshalter, insbesondere ein scheibenförmiger Abstandshalter, in Kombination mit einer Hilfsmembran verwendet.
Hierbei wird die Hilfsmembran bevorzugt auf der Oberseite des Abstandshalters (d.h. der in Richtung der oberen Öffnung weisenden Seite des Abstandhalters), insbesondere des scheibenförmigen Abstandshalters, durch Einträgen einer flüssigen Zusammensetzung, enthaltend Ausgangsstoffe geeignet zur Ausbildung der Hilfsmembran und anschließender Aushärtung (z.B. durch Bestrahlen mit Licht oder einem ähnlichen physiko-chemischen Prozess), ausgebildet.
Die Hilfsmembran besteht aus einem Material, das sich durch einen physiko-chemischen oder enzymatischen Prozess auflösen lässt, insbesondere PEG, Poloxamer, Hyaluronsäure, Chitosan, Chitin, Kollagen etc.
Die Hilfsmembran wird mit Hilfe eines Druckers im Einsatzrohling erzeugt. Dabei wird der Einsatzrohling in einen Drucker, z.B. der Bioprinter der Firma Cellbricks, eingebracht, und die Hilfsmembran durch Stereolithographie erzeugt. D. h. der Rohling wird in ein flüssiges Polymer gestellt und durch Bestrahlung von oberhalb und unterhalb des Bettes ausgehärtet. Darüber hinaus kann die Hilfsmembran mit Hilfe einer Scheibe als Abstandshalter erzeugt werden. Dabei wird der Einsatzrohling in einen Träger mit flüssiger Hilfsmatrix getaucht, in dessen Boden sich der Abstandhalter, z.B. Scheibe, befindet. Der Durchmesser der Scheibe füllt dabei den Innenraum des Rohlings bündig aus. Wenn in diesem Zustand die flüssige Matrix innerhalb des Einsatzrohlings durch Bestrahlen von oberhalb oder unterhalb des Bettes ausgehärtet wird, entsteht eine feste Hilfsmembran im Einsatzrohling. Wird der Einsatzrohling mit Hilfsmembran aus dem Träger mit der flüssigen, nicht ausgehärteten Hilfsmatrix gezogen, verbleibt der Abstandshalter im Gefäß mit der flüssigen Hilfsmatrix. Im Einsatzrohling mit der Hilfsmembran entsteht hierdurch ein freier Raum zwischen Hilfsmatrix und Abschluss des Einsatzrohlings, der in einem nächsten Schritt mit einer weiteren Membran ausgekleidet werden kann. Die Hilfsmembran kann dabei so ausgehärtet werden, dass eine Struktur an der Unterseite der Hilfsmembran entsteht, die als Negativ für eine Formung der im Anschluss zu erstellenden Membran fungiert.
Nach der Aushärtung der Hilfsmembran wird der Abstandshalter, insbesondere der scheibenförmige Abstandshalter, entfernt, so dass eine stabile Hilfsmembran/Hilfsschicht im Einsatzrohling verbleibt. Diese Hilfsmembran enthält eine Öffnung zur Ableitung von Gasblasen (siehe auch "Bubble Trap" wie oben beschrieben).
Anschließend kann der mit der mindestens einen Hilfsmembran versehene Einsatzrohling in einen Behälter eingebracht werden, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält. Die Membran wird z.B. durch Bestrahlung (siehe auch weiter unten) ausgebildet, und nach Ausbildung der Membran wird die Hilfsmembran durch geeignete physiko-chemische Methoden (z.B. Auflösen) aus dem Einsatzrohling entfernt, wobei die ausgebildete (flache) Membran im Einsatzrohling verbleibt.
Die Hilfsmembran ist komplett plan, da diese Schicht mit Hilfe des Abstandshalters vorher hergestellt wurde. Darüber hinaus enthält die Hilfsmembran einen Einschnitt, der als Bubble Trap fungiert. Potentielle Luftblasen, die sich beim Einbringen des Biopolymers bilden, können über diesen Ablass ausströmen und werden nicht festgehalten und in das Biopolymer beim Aushärten inkorporiert. Nach Einfüllen des Biopolymers wird dieses ausgehärtet. Im Anschluss kann die Hilfsmembran mit Hilfe einer physikalisch-chemischen Reaktion aufgelöst werden, z. B. Temperaturerhöhung/ -erniedrigung, pH-Wertänderung, Auflösung etc., so dass nach Abschluss der Auflösung einzig eine plane Biopolymer-Membran (abgesehen von einem kleinen Steg bedingt durch die Bubble Trap) verbleibt. Wie bereits mehrmals angeführt, wird die Membran und hier bevorzugt die biologische Membran nach Eintauchen des Kultureinsatzes mit Abstandshalter in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält, ausgebildet. Bei den Ausgangsstoffen handelt es sich insbesondere um photopolymerisierbare Stoffe.
Die Ausbildung der Membran erfolgt unter Anwendung eines Biodruckverfahrens, wie z.B. in der WO 2016/075103 A1 beschrieben.
Hierbei wird nach Einbringen des Kultureinsatzes mit Abstandshalter in den Behälter bzw. das Reaktionsgefäß mit der photopolymerisierbaren Flüssigkeit eine Lichtstrahlung auf eine erste Fokusebene, die innerhalb eines mit der Flüssigkeit gefüllten Bereiches des Reaktionsgefäßes liegt, fokussiert. Durch diese Lichtstrahlung wird dann eine polymerisierte Struktur in dem Reaktionsgefäß erzeugt. Die polymerisierte Struktur befindet sich dabei in einer ersten Schicht.
Auf diese erste Schicht können beliebig weitere Schichten aufgebracht werden. Hierzu wird eine weitere photopolymerisierbare Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß eingebracht, wobei die zuvor erzeugte polymerisierte Struktur zumindest teilweise mit der weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeit bedeckt ist. Vorzugsweise ist die zuvor erzeugte polymerisierte Struktur vollständig mit der weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeit bedeckt. Nun wird eine weitere Lichtbestrahlung in einer weiteren Fokusebene durchgeführt, die innerhalb eines mit der weiteren Flüssigkeit befüllten Bereiches des Reaktionsgefäßes liegt. Diese weitere Fokusebene unterscheidet sich damit von der ersten Fokusebene zumindest in Bezug auf die bereits erzeugte polymerisierte Struktur bzw. in Bezug auf die Schicht dieser polymerisierten Struktur.
Die vorgenannten Schritte des Einbringens einer weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeit, des Fokussierens von Licht auf eine weitere Fokusebene und des Erzeugens einer weiteren polymerisierten Struktur in einer weiteren Schicht können nun mit jeweils weiteren photopolymerisierbaren Flüssigkeiten beliebig wiederholt werden, bis die gewünschte Membran erzeugt ist.
Die Schichtdicke der zu erzeugenden Membran kann beliebig eingestellt werden und an die entsprechenden Anforderungen angepasst werden. So kann die Schichtdicke der Membran zwischen 10 gm und 1000 gm, bevorzugt zwischen 50 und 1000 pm, insbesondere bevorzugt zwischen 200 und 800 gm, noch mehr bevorzugt zwischen 300 und 500 gm, z.B. zwischen 310 und 325 gm betragen.
Die photopolymerisierbare Flüssigkeit kann auch biologische Zellen oder andere Substanzen enthalten. Wenn es in Folge der Lichteinstrahlung zu einer Polymerisierung kommt, werden die in der Flüssigkeit enthaltenen Zellen mit in ein entsprechendes Polymer eingebettet.
Mit diesem Druckverfahren können Membranen aus beliebigen Polymeren, bevorzugt Biopolymeren, hergestellt werden.
Entsprechend kann die Membran aus folgenden Materialien aufgebaut sein bzw. umfassen: technische Biopolymere, wie Gelatine; Alpha- und Beta-Polysaccharide wie Pektine, Chitin, Callose und Cellulose; Lipide, insbesondere membranbildende Lipide, wie Phospholipide, Sphingolipide, Glycolipide und Etherlipide; Polyhydroxyalkanoate; biobasierte Polymere, wie Polylactid, Polyhydroxybutyrat; erdölbasierte Polymere, wie Polyester, insbesondere Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polybutylenadipat-terephthalat (PBAT, Polybutylensuccinat (PBS), Polycaprolactone (PCL), Polyglycolid (PGA); synthetische Peptide, wie rekombinant hergestellte Aminosäuren, Amide; Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Kollagene, Fibrillin, Elastin, Glykosaminoglykane, insbesondere Hyaluronsäuren, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat. Bevorzugte Membranmaterialien sind Kollagene, Hyaluronsäure, Chitosan, Gelatine, PLA, PEG und Kombinationen davon.
In einem Beispiel besteht die Membran aus Gelatine und Kollagen als Zusatz. Zur Herstellung wird den Ausgangsstoffen ein geeigneter Photoinitiator wie z.B. Lithium phenyl-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate (LAP) verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein Sicherungsmittel zur Haltung der Membran im Einsatz vorgesehen. Es ist dabei bevorzugt, wenn das mindestens eine Sicherungsmittel in Form eines Trägers bestehend aus unterschiedlichen Strukturen, die an das Membranmaterial angepasst sind, insbesondere aus gitterförmigen oder speichenförmigen Strukturen, ausgebildet ist.
In einer weiteren Verfahrensvariante wird der Zellkultureinsatz aus Einsatzrohling und Membran unter Anwendung des oben beschriebenen Druckverfahrens in einem Stück ausgebildet (one-pot Synthese). In Analogie zu dem in WO 2016/075103 A1 beschriebenen Verfahren erfolgt die one-pot Synthese additiv mit photopolymerisierbaren Materialien. Dabei wird zunächst die Basis des Scaffolds aus einem ersten (zellabweisenden) Biomaterial gedruckt. Im Anschluss wird eine biokompatible Schicht aus einem zweiten Biomaterial fabriziert. Im letzten Schritt wird das Scaffold durch die Ränder vervollständigt. Beide Materialien werden in einem einzigen Druckvorgang verarbeitet.
Der dabei gebildete Einsatzrohling umfasst eine (obere) Öffnung und kann einen Boden umfassen. Der Einsatzrohling ist bevorzugt aus einem ersten zellabweisenden Biomaterial bzw. Biopolymer, wie z.B. Polyethylenglykol (PEG) oder eines der anderen für den Einsatzrohling oben genannten möglichen Polymermaterialien, hergestellt. Auf dem Boden des Einsatzrohlings ist ein weiteres biokompatibles und biofunktionales Biopolymer als Membran, z.B. aus Gelatine eingearbeitet, auf welchem Zellmaterialien wachsen können. Durch die Kombination der zwei unterschiedlichen Materialien entsteht ein Scaffold, das auf dem biokompatiblen Material gezielt mit Zellen besiedelt werden kann.
Im Laufe einer längeren Kultivierungszeit kann es zu einer Veränderung der Biomembran kommen, z. B. Schrumpfung oder Veränderung durch Zellen. Das Sicherungsmittel, z.B. Gitter, verhindert in diesem Fall ein Hinausgleiten oder Herausfallen der Biomembran aus dem Kultureinsatz. In seiner einfachsten Ausführungsform kann das Sicherungsmittel auf die Unterseite des Zellkultureinsatzes, d.h. die Seite, die die Membran trägt, gesetzt werden. Die Halterung des Sicherungsmittel, z.B. eines Gitters, beruht auf einer simplen Presspassung. Um das Sicherungsmittel (und auch die Membran) aus dem Kultureinsatz im Nachgang wieder zu entfernen, kann die Presspassung z.B. mit einer Art Kapselheber wieder entfernt werden. Hierbei wird die Presspassung einfach abgehebelt.
Wie bereits oben angedeutet, ist es möglich eine biologische Membran in einem Rohling aus zwei oder mehreren polymeren Materialien, bevorzugt Biopolymeren, herzustellen. Die Materialien können dabei in unterschiedlichen Architekturen angeordnet sein. So können die unterschiedlichen Polymermaterialien übereinander, schichtförmig angeordnet sein, wobei die Anzahl der Schichten beliebig frei wählbar ist. In einer Variante ist jeweils eine Schicht eines ersten Polymers und eine Schicht eines zweiten Polymers vorgesehen. Es ist auch denkbar, dass die Polymermaterialien in einer Schicht nebeneinander angeordnet sind. So kann in einer Variante ein Membranabschnitt aus einem ersten Polymermaterial vorgesehen sein, wobei der Membranabschnitt in das zweite Polymermaterial (mittig) integriert ist, d.h. der Membranabschnitt aus dem ersten Polymermaterial ist von dem zweiten Polymermaterial umgeben.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine dreidimensionale Architektur der Membran vorgesehen. Hierfür kann die Membran unter Verwendung einer geometrischen Form gedruckt werden. So können bspw. Zotten, Kanäle, Hügel, Täler, etc., - auch aus unterschiedlichen Materialien - eingebracht werden. So kann die zu besiedelnde Membranoberfläche mit regelmäßigen oder unregelmäßigen Strukturen (Hügel, Täler) ausgebildet sein.
In einer Ausführungsform kann mindestens ein Kanal in die Membran eingebracht werden. Der Kanal kann z.B. zu einer Versorgung des inneren Kompartiments des Rohlings verwendet werden. Der Kanal fungiert dabei als Mediumträger mit Nährmedium, das durch den Kanal gespült wird. Zellen, die im Inneren des Kompartiments auf der Membran angesiedelt werden, können aus den Kanälen durch die Membran versorgt werden.
Es ist weiterhin möglich, funktionales Material in die Membran einzubringen. Es kann bspw. ein zusätzlicher Detektor, Farbstoff, ein Enzym, Chemokin, Nanopartikel oder ähnliches während des Druckprozesses in die Membran integriert werden. Dieses Materials kann im Laufe der Zeit zur online Überwachung der Zellkultur dienen. Es kann bspw. der Zelltod durch einen Fluoreszenzfarbstoff detektiert werden oder die aktuelle Sauerstoffsättigung oder der pH-Wert. Das funktionelle Material kann dabei Kontakt zu der inneren und äußeren Grenzschicht haben oder nicht. Die Funktionalisierung kann dabei durch einen Farbumschlag, Bestrahlung oder anders zu detektierende Messung observiert werden. Das funktionale Material kann punktweise in das Membranmaterial eingefügt werden, oder auch flächig bzw. schichtförmig in der Membran vorgesehen sein.
Es ist auch möglich und vorstellbar, die Membranoberfläche z.B. in Segmente einzuteilen, Zellarrays einzudrucken oder Gradienten einzubringen. Hiermit ist es möglich, die Membran in ihrer Dicke und Oberfläche exakt zu strukturieren.
Ferner kann die optische Transparenz durch die Formulierung der Biomatrix beeinflusst werden. Es kann z. B. eine transparente Matrix erzeugt werden, die eine optische Kontrolle der Zellpopulation erlaubt. So erlaubt die Transparenz eine nicht-invasive Kontrolle der Zellpopulation, die mit einem herkömmlichen Zellkultureinsatz nicht möglich ist. Darüber hinaus kann ein (nicht-polymeres) weiteres Material definiert in die Membran und/oder den Rohling eingebracht werden. Auf diesem Weg können bspw. noch weitere Funktionen realisiert werden durch ein Einbringen z.B. von Sensorik, Detektion, leitfähigen Materialien, Chemikalien, Nanopartikeln etc.
So ist in einer Ausführungsform der Rohling mit mindestens einer Sonde versehen. Die mindestens eine Sonde, bevorzugt zwei Sonden, können jeweils auf der Innenseite und der Außenseite des Rohlings vorgesehen sein. Durch die Verwendung von Sonden kann der elektrische Widerstand bestimmt werden, wodurch Rückschlüsse auf die Dichte der Membran und des Zellrasen getroffen werden können.
Mit dem vorliegenden Verfahren ist nunmehr ein Zellkultureinsatz herstellbar, der aus einem Einsatzrohling mit mindestens einer darin angeordneten Membran, insbesondere mindestens einer Biomembran, besteht, wobei die mindestens eine Membran eben ausgebildet ist und keinen Konus aufweist; d.h. ein Zellkultureinsatz mit einer konfluenten Monolayer kann mit diesem Verfahren bereitgestellt werden.
Der vorliegende Zellkultureinsatz kann zur Kultivierung von verschiedenen Zelllinien und anschließender Durchführung von Barriere- oder Penetrationsassays verwendet werden.
Als Ziellinien sind sämtliche Zellen und Zelllinien geeignet, die eine Barrierefunktion darstellen, z. B. Endothelzellen, Trophoblasten, Astrozyten, Enterozyten etc. oder Zellen und Zelllinien, die eine Stoffwechselfunktion darstellen, z. B. Hepatozyten, Kardiomyozyten, Myozyt etc. Generell eignen sich alle Zelltypen, die adhärent sind.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von mehreren Beispielen mit Bezug auf die Figuren erläutert. Es zeigen:
Figur 1 ein Vergleich eines herkömmlichen Kultureinsatzes mit Poren mit einem erfindungsgemäß hergestellten Kulturzelleinsatz;
Figur 2a eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Figur 2b eine zweite Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Figur 2c eine dritte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens; Figur 3 eine vierte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens;
Figur 4A eine schematische Darstellung der Sicherung der hergestellten Membran im
Kultureinsatz;
Figur 4B eine schematische Darstellung von verschiedenen Ausführungsformen des
Sicherungsmittels der Figur 4A;
Figur 5 eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten
Zellkultureinsatzes;
Figur 6A mit Zellen kultivierte Membrane eines erfindungsgemäßen Zellkultureinsatzes;
Figur 6B eine Querschnittsaufnahme einer mit Zellen besiedelten Membran in einem erfindungsgemäßen Zellkultureinsatz;
Figur 6C mikroskopische Aufnahmen einer mit Zellen besiedelten Membran in einem erfindungsgemäßen Zellkultureinsatz;
Figur 7 weitere Ausführungsformen des erfindungsgemäß hergestellten
Zellkultureinsatzes;
Figur 8 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten
Zellkultureinsatzes; und
Figur 9 eine noch weitere Ausführungsform des erfindungsgemäß hergestellten
Zellkultureinsatzes
In Figur 1 ist auf der linken Seite a) ein herkömmlicher Zellkultureinsatz mit Poren dargestellt.
Die am Boden des Zellkultureinsatzes ausgebildete Membran besteht aus einem inerten
Kunststoff mit einstellbarer Porosität. Auf dieser Membran werden im Laboralltag Zellen ausgesät, die im Normalfall zu einer Monolayer wachsen und mit denen Barriere- oder
Penetrationsassays durchgeführt werden können.
Auf der rechten Seite b) der Figur 1 ist ein Kultureinsatz mit einer gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten biologischen Membran dargestellt. Die ausgebildete biologische Membran ist eben und weist keinen Konus auf. Die konusfreie Membran ermöglicht eine gute Besiedelung mit Zellen.
In Figur 2a ist eine erste Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens schematisch dargestellt, wobei ein Abstandshalter, hier in Form eines Stempels, in einen kegelstumpfförmigen Kultureinsatz eingeführt ist. Der Stempel ist in seiner Höhe individuell anpassbar, sodass nach Einführen des Stempels in den Kultureinsatz der Abstand zwischen dem Stempel und der unteren Öffnung des Kultureinsatzes beliebig einstellbar ist. Der Abstand zwischen Stempel und unterer Öffnung des Kultureinsatzes gibt dabei die gewünschte Höhe bzw. Dicke der später auszubildenden Biomembran vor. Der Stempel muss des Weiteren mit einem geeigneten Material beschichtet sein, um ein Anhaften der ausgebildeten Biomembran beim Entfernen des Stempels aus dem Kultureinsatz zu verhindern.
In einem zweiten anschließenden Schritt wird der Kultureinsatz mit dem darin eingeführten Stempel in ein Reaktionsgefäß mit einer polymerisierbaren Flüssigkeit eingebracht, wobei die polymerisierbare Flüssigkeit die Ausgangskomponenten für die Herstellung der gewünschten Biomembran enthält. Der Stempel sollte eine Öffnung ("Bubble Trap") enthalten, um ein Ansammeln von Luftblasen in der Biomembran zu vermeiden
Im nächsten, dritten Schritt des Verfahrens erfolgt die Ausbildung der Biomembran in einem Druckverfahren, wobei Licht in einer Fokusebene auf die polymerisierbare Flüssigkeit gestrahlt wird, wodurch es zu einer Polymerisierung zur Biomembran in der Fokusebene kommt.
Nach Aushärtung der Biomembran kann der Stempel aufgrund seiner Materialbeschichtung leicht aus dem Kultureinsatz entfernt werden (Schritt 4) und zurück bleibt eine ebene Biomembran im Kultureinsatz.
Die in den Figuren 2b und 2c dargestellten Ausführungsformen des vorliegenden Verfahrens ermöglichen eine batchweise Membranproduktion.
In der in Figur 2b gezeigten Ausführungsform des Verfahrens werden folgende Schritte durchgeführt: 1 ) Bereitstellen eines einzelnen Stempels oder eines Arrays von mehreren Stempeln, wobei der Stempel oder die Stempel vertikal orientiert sind; 2) Zuordnen von mindestens einem Einsatzrohling zu jedem Stempel, wobei der Stempel mittig in dem jeweiligen Einsatzrohling angeordnet wird; bei der Zuordnung von Einsatzrohling und Stempel kann der Einsatzrohling z.B. über den Stempel gestülpt werden oder der Stempel wird in den Einsatzrohling eingeführt; 3) Anordnen eines Befestigungsmechanismus (Klemmmechanismus z.B. mit Federn), um den Einsatzrohling mit dem jeweiligen Stempel zu verbinden; 4) Einbringen einer Menge an Druckflüssigkeit (mit den Ausgangsstoffen zur Membranerzeugung) über die freie Öffnung in den Einsatzrohling (z.B. mit einer Pipette); 5) Abdecken der freien Öffnungen der Einsatzrohlinge, bevorzugt mit einer Folie (PDMS Folie), 6) Ausbilden einer Polymermembran durch Bestrahlen (Bestrahlung bevorzugt von oben durch die Folie); 7) Entfernen der PDMS-Folie; 8) Entfernen des Befestigungsmechanismus, und 9) Entfernen des Stempels oder des Stempelarrays.
In der in Figur 2c gezeigten Ausführungsform des Verfahrens ist die Reihenfolge der Verfahrensschritte im Batchverfahren verändert: 1 ) Bereitstellen einer Folie (z.B. PDMS Folie); 2) Bereitstellen eines Aliquot von Ausgangsstoffen zur Membranerzeugung an der Stelle auf der Folie, die jeweils für einen Einsatzrohling vorgesehen ist (unter Verwendung einer Pipette oder Multipipette); 3.) Anordnen eines Einsatzrohlings um das jeweilige Aliquot von Ausgangsstoffen zur Membranerzeugung auf der Folie; 4) Anordnen eines Befestigungsmechanismus, um den Einsatzrohling auf der Folie zu befestigen; 5) Einführen eines einzelnen Stempels oder eines Arrays von mehreren Stempeln in den jeweiligen Einsatzrohling, wobei der Stempel oder die Stempel vertikal orientiert sind; 6) Ausbilden einer Polymermembran durch Bestrahlen (bevorzugt von unten durch die Folie); 7) Entfernen des Stempels oder des Stempelarrays aus dem Einsatzrohling; und 8) Entfernen des Einsatzrohlings mit der darin ausgebildeten Polymermembran. Die mit der Polymermembran versehenen Einsatzrohlinge können anschließend z.B. in Multiwellplatten gelagert werden. Die in Figur 3 gezeigte vierte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet anstelle eines Stempels als Abstandshalter eine Scheibe. Die Scheibe wird in einem ersten Schritt in den Kultureinsatz eingeführt und definiert über den Abstand zur unteren Öffnung des Kultureinsatzes die Dicke der auszubildenden Membran. Nach der Festsetzung der gewünschten späteren Membranhöhe durch die Scheibe als Platzhalter bzw. Abstandshalter wird in einem zweiten Schritt innerhalb des Kultureinsatzes eine polymerisierbare Flüssigkeit eingebracht, die anschließend durch Lichteinstrahlung oder einem ähnlichen physiko-chemischen Prozess unter Ausbildung einer Hilfsmembran ausgehärtet wird.
Nach der Aushärtung der Hilfsmembran wird in einem dritten Schritt die Scheibe als Abstandshalter wieder entfernt und zurück bleibt eine stabile Hilfsmembran, die eine Öffnung als "Bubble Trap" aufweist. Im nächsten, vierten Schritt wird der Kultureinsatz mit der Hilfsmembran in ein Reaktionsgefäß mit dem flüssigen Biopolymer eingebracht und anschließend durch Bestrahlung in einem Druckverfahren ausgehärtet.
Nach Aushärten der Biomembran und Entfernen des Kultureinsatzes aus dem Reaktionsgefäß verbleibt eine Doppelschicht aus Biomembran und Hilfsmembran im Kultureinsatz. Die Hilfsmembran wird in einem abschließenden Schritt durch einen physiko-chemischen Prozess oder simples Auflösen entfernt und zurück bleibt eine flache Biomembran.
Um ein Herausfallen der gedruckten Membranschicht zu verhindern kann nach Fertigung der Biomembran ein Plastikgitter unter dem Kultureinsatz angebracht werden (siehe Figur 4A). Die Halterung bzw. Sicherung der Biomembran erfolgt mithilfe eines Gitters, das mit einer Presspassung am Fuß des Kultureinsatzes gesichert wird. Diese Sicherung der Biomembran kann mit einem Kapselheber einfach wieder entfernt werden, um einen Zugriff auf die Biomembran bzw. ihre Entfernung zu gewährleisten. Das Sicherungsmittel kann gitterförmig oder speichenförmig ausgebildet sein (siehe Figur 4B).
Eine Ausführungsform eines erfindungsgemäß hergestellten Zellkultureinsatzes ist in Figur 5 gezeigt. Hier ist der Zellkultureinsatz zylinderförmig ausgebildet. An der oberen Öffnung sind Halterungsstege vorgesehen, die ein Einsetzen in und Entfernen des Zellkultureinsatzes aus einer Nährlösung in einer Multiwellplate ermöglichen. An der unteren Öffnung ist ein Gitter als Sicherungsmittel zum Halten der Biomembran in dem zylindrischen Gehäuse zu erkennen.
Auf der Biomembran können je nach Membranmaterial verschiedene Zellen siedeln, die Monolayer ausbilden (siehe Figuren 6A, 6B).
Die Abbildungen der Figur 6A zeigen mikroskopische Durchlicht-Aufnahmen der Oberseite und Unterseite eines besiedelten Trägers. Links wird die Unterseite mit einer Halterung für die Membran gezeigt, rechts die Oberseite des Trägers mit besiedelter Oberfläche. Als Zellen wurden Caco-2 Zellen verwendet.
Das Bild der Figur 6B zeig einen lateralen Querschnitt durch eine mit HUVEC-Zellen besiedelte Gelatine-Membran, durchgeführt mit einem 2-Photonenmikroskop. Die einzelnen Farben zeigen die unterschiedlichen Marker, die bei diesem Versuch untersucht wurden: DAPI (Zellkern), vWF und CD31 (Gefäßzellmarker). Es kann eine Polarisation und damit ein natürliches Verhalten der Zellen nachgewiesen werden. Die in Figur 6C gezeigten mikroskopischen Aufnahmen zeigen einen lateralen Schnitt durch die Membran. Die obere Seite des Bildes stellt die Oberseite der Membran dar, die mit Zellen besiedelte Membran teilt das Bild und die untere Hälfte des Bildes stellt die Unterseite des T rägers dar. Die einzelnen Färbungen zeigen dabei eine Polarisierung der Zellen zur Membran hin an. Im Falle der mikroskopischen Aufnahme kann eine verstärkte Kollagen-Produktion der Zellen zur Membran hin gezeigt werden. Bei den Zellen handelt es sich um Vero-Zellen. Darüber hinaus wurden ebenfalls die Zellkerne mit DAPI angefärbt. Mit Hilfe des Versuchs sollte eine Polarisation und Interaktion der Zellen gezeigt werden. Im Vergleich dazu ist dieser Effekt in einer Petrischale weniger oder gar nicht ausgeprägt
In den nachfolgenden zwei Bildern wurden die Marker ITGB1 (rechts) und aPKC (links unten) untersucht, die ebenfalls eine Polarisation zur Membran hin oder von der Membran weg dokumentieren.
Der vorliegende Zellkultureinsatz kann mit einem durchgängigen Rand (Fig. 7, a) für eine Barrierefunktion oder einem Ausschnitt (Fig.7, b) ausgebildet sein. Der Ausschnitt kann dabei unterhalb des Medienspiegels im Multiwell liegen, so dass eine Nährstoffversorgung der auf der Membran angesiedelten Zellen erfolgen kann.
Der Zellkultureinsatz kann mit zwei oder mehreren unterschiedlichen Materialien als Membran in einem Rohling versehen sein, wobei die Materialien in unterschiedlichen Architekturen angeordnet sein können, z. B. nebeneinander (Figur 7, c) oder übereinander (Figur 7, d) oder in weiteren Architekturen. Diese Architektur kann jeweils in Rohlinge zum Hängen oder mit Fü ßen eingebracht werden.
In einer anderen Variante des Zellkultureinsatzes wird die Membran mit einer geometrischen Form gedruckt. Die Membran muss nicht nur gerade in den Rohling eingebracht werden, sondern kann auch eine architektonische Form aufweisen. So können bspw. Zotten, Kanäle, Hügel, Täler (Figur 7, e) eingebracht werden, auch aus unterschiedlichen Materialien (Figur 7, f). Diese Architektur kann jeweils in Rohlinge zum Hängen oder mit Füßen eingebracht werden.
In die Membran des Zellkultureinsatzes kann ein Kanal eingebracht sein, der von außerhalb des Rohlings angespült werden kann (Figur 7, g, h). Hierbei kann der Kanal zu einer Versorgung des inneren Kompartiments des Rohlings verwendet werden. Der Kanal fungiert dabei als Mediumträger mit Nährmedium, das durch den Kanal gespült wird. Zellen, die im inneren des Kompartiments auf der Membran angesiedelt werden, können durch die Membran versorgt werden
In die Membran des Zellkultureinsatzes kann auch funktionales Material eingebracht sein. Es kann bspw. ein zusätzlicher Detektor, Farbstoff, ein Enzym, Chemokin, Nanopartikel oder ähnliches während des Druckprozesses in die Membran integriert werden. Dieses Materials kann im Laufe der Zeit zur online Überwachung der Zellkultur dienen. Es kann bspw. der Zelltod durch einen Fluoreszenzfarbstoff detektiert werden oder die aktuelle Sauerstoffsättigung oder der pH-Wert. Das funktionelle Material kann dabei Kontakt zu der inneren und äußeren Grenzschicht haben oder nicht. Die Funktionalisierung kann dabei durch einen Farbumschlag, Bestrahlung oder anders zu detektierende Messung observiert werden. Das funktionelle Material kann punktweise in der Membran (Figur 7, i) oder flächig (Figur 7, j) eingebracht sein.
Der Zellkultureinsatz kann auch die Messung der Membrandichte durch den elektrischen Widerstand ermöglichen. Hierbei kann ein spezieller Rohling verwendet werden, bei dem am Rohling jeweils innen und au ßen eine Sonde angebracht wird, um den elektrischen Widerstand und damit Rückschlüsse auf die Dichte der Membran und des Zellrasen treffen zu können (Figur 7, k).
Figur 8 zeigt einen Zellkultureinsatz, der an seiner unteren Seite bzw. an seinem unteren Ende (d.h. der Teil des Zellkultureinsatzes, der den Boden der Multiwellplatte berührt) mit nach außen gerichteten und abgewinkelten Vorsprüngen (Fü ßen) versehen ist. Dies ermöglicht ein selbsttätiges Stehen des Zellkultureinsatzes in der Multiwellplatte.
Figur 9 zeigt eine weitere Variante des Zellkultureinsatzes. In dieser Variante des Zellkultureinsatzes werden zwei Biomaterialien verwendet, die sich in ihren Eigenschaften unterscheiden können. Der Zellkultureinsatz besteht aus einem Zylinder mit Boden (vgl. Abbildung Biopolymer 2, blau). Auf dem Boden ist ein weiteres Biopolymer (vgl. Abbildung Biopolymer 1 , grün) eingearbeitet. Material b (siehe Abbildung) bildet das Gerüst, das dem Konstrukt Stabilität gibt. Im Beispiel basiert das Biopolymer auf Polyethylenglycol (PEG), einem biokompatiblem, aber zellabweisendem Polymer. In Material b ist Material a eingearbeitet, welches im Beispiel auf Gelatine basiert. Im Gegensatz zu PEG ist Gelatine nicht nur biokompatibel, sondern biofunktional, sodass Zellen auf diesem Material anwachsen. Durch die Kombination beider Materialien entsteht ein Scaffold, das gerichtet mit Zellen besiedelt werden kann. Dabei legt die Fläche, die Biopolymer 1 (a) umfasst, den maximalen Bereich fest, auf dem Zellen wachsen können. Bei einer Besiedlung wachsen die Zellen bis zum Rand. Da der Rand aus dem zellabweisenden Polymer 2 (b) besteht, können diese nicht den Rand besiedeln. Das Wachstum stoppt an dieser Grenze.
Beispiel:
Es wurden mit Hilfe des Stempelverfahrens Zellkultureinsätze mit einem Durchmesser von 12 mm hergestellt. Hierbei wurde eine Gelatine-Matrix mit einer Konzentration von 10 %(W/V) verwendet, die mit LAP als Initiator in einer Konzentration von 0,1 % (W/V) versetzt war. Darüber hinaus wurde Kollagen I als Zusatz eingesetzt.
Der Rohling wurde mit einem Silikonstempel ausgefüllt und in ein Becken im Drucker, das die oben beschriebene, flüssige Gelatine-Matrix enthielt, eingebracht, so dass der Rohling auf dem Boden des Beckens im Drucker aufsitzt. Um eine Membran von 500 pm zu erzeugen, wurde der Abstand entsprechend mit dem Stempel vorher eingestellt.
Im Anschluss wurde die Gelatine-Matrix durch Bestrahlen mit einer Wellenlänge von 385 nm ausgehärtet. Nach dem Aushärten wurde der Träger aus dem Becken und dem Drucker entfernt. Darüber hinaus wurde der Stempel entfernt und zurück blieb ein Zellkultureinsatz mit der vorher definierten Höhe und mit einer planen Fläche zur Besiedlung.
Es wurden zwei unterschiedliche Zellkultureinsätze hergestellt. Ein erster Einsatz mit einer Membran mit Kollagen I als Zusatz und ein zweiter Einsatz mit einer Membran ohne diesen Zusatz. Die Gelatine-Membran wurde in diesem Fall transparent gestaltet und konnte optisch untersucht werden.
Nach Herstellung der Zellkultureinsätze mit biologischer Membran wurden diese mit Vero- Zellen besiedelt. Hierbei handelt es sich um eine Nierenzell-Linie der Grünen Meerkatze. Diese Zelllinie wird häufig für Infektionsversuche eingesetzt. Nach der Besiedlung bildeten die Vero-Zellen einen konfluenten Monolayer über die gesamte Fläche des Zellkultureinsatzes aus.
Nach der Besiedlung wurde ein GFP-getaggter Kuhpockenstamm eingesetzt, um die Vero- Zellen mit dem Stamm zu infizieren. Die Ausbreitung der Infektion konnte durch die fluoreszenten Viren und den transparente Zellkultureinsatz über den Verlauf des Experiments von 28 Tagen untersucht und beobachtet werden.
Im Anschluss an das Experiment wurde die Membran ausgestanzt und tiefgefroren. Darüber hinaus ließ sich die Membran mit den üblichen histologischen Methoden schneiden und anfärben, so dass eine histologische Nachuntersuchung möglich war.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran, insbesondere mindestens einer biologischen Membran, umfassend die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung; und
- Ausbilden der Membran im Einsatzrohling mittels eines Biodruckverfahrens.
2. Verfahren nach Anspruch 1 mit den folgenden Schritten:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung,
- Einbringen der Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran in den Einsatzrohling,
- Ausbilden der Membran in einem Biodruckverfahren, und
- Entfernen des Einsatzrohlings, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling,
- Abdecken einer Öffnung des Einsatzrohlings und Einbringen der Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran in den Einsatzrohling durch die andere Öffnung des Einsatzrohlings,
- Ausbilden der Membran in einem Biodruckverfahren und - Entfernen der Abdeckung von der einen Öffnung, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 2, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
- Bereitstellen von mindestens einem hohlen Einsatzrohling mit mindestens einer Öffnung;
- Einbringen des Einsatzrohlings in einen Behälter, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält,
- Ausbilden der Membran im Einsatzrohling mittels eines Biodruckverfahrens, und
- Entfernen des Einsatzrohlings aus dem Behälter, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit den folgenden Schritten:
- Bereitstellen von mindestens einem kreisförmigen, hohlen Einsatzrohling mit einer unteren und einer oberen Öffnung;
- Einführen und Anordnen von mindestens einem kreisförmigen Abstandshalter in den Einsatzrohling in einem vorbestimmten Abstand hm zu der unteren Öffnung des Einsatzrohlings, wobei der Abstand hm des kreisförmigen Abstandshalters von der unteren Öffnung des Einsatzrohlings durch die Dicke der im Einsatzrohlinges zu erzeugenden Membran bestimmt wird;
- Einbringen der Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran in den mit dem mindestens einen Abstandshalter versehenen Einsatzrohling ,
- Ausbilden der Membran mittels eines Biodruckverfahrens, und - Entfernen des Abstandshalters aus dem Einsatzrohling, wobei die ausgebildete Membran im Einsatzrohling verbleibt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandshalter mit mindestens einer Öffnung versehen ist, die ein Ableiten von Gasblasen aus der Membran ermöglicht.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Abstandshalter in Form eines Stempels ausgebildet ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Abstandshalter als Scheibe ausgebildet ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandshalter, insbesondere ein scheibenförmiger Abstandshalter, in Kombination mit einer Hilfsmembran verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Hilfsmembran auf der Oberseite des Abstandshalters, insbesondere des scheibenförmigen Abstandshalters, durch Einträgen einer flüssigen Zusammensetzung, enthaltend Ausgangsstoffe geeignet zur Ausbildung der Hilfsmembran und anschließender Aushärtung, ausgebildet wird.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-10, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstandshalter, insbesondere der scheibenförmige Abstandshalter, nach der Aushärtung der Hilfsmembran entfernt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9-1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der mit der mindestens einen Hilfsmembran versehene Einsatzrohling in einen Behälter eingebracht wird, der die Ausgangsstoffe zur Erzeugung der Membran enthält, die Membran ausgebildet wird, und die Hilfsmembran durch geeignete physiko-chemische Methoden aus dem Einsatzrohling entfernt wird, wobei die ausgebildete (flache) Membran im Einsatzrohling verbleibt.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus folgenden Materialien aufgebaut ist bzw. umfasst: technische Biopolymere, wie Gelatine; Alpha- und Beta- Polysaccharide wie Pektine, Chitin, Callose und Cellulose; Lipide, insbesondere membranbildende Lipide, wie Phospholipide, Sphingolipide, Glycolipide und Etherlipide; Polyhydroxyalkanoate; biobasierte Polymere, wie Polylactid, Polyhydroxybutyrat; erdölbasierte Polymere, wie Polyester, insbesondere Polyethylenglycol, Polyvinylalkohol, Polybutylenadipat- terephthalat (PBAT, Polybutylensuccinat (PBS), Polycaprolactone (PCL), Polyglycolid (PGA), synthetische Peptide, wie rekombinant hergestellte Aminosäuren, Amide; Bestandteile der extrazellulären Matrix, wie Kollagene, Fibrillin, Elastin, Glykosaminoglykane, insbesondere Hyaluronsäuren, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Sicherungsmittel zur Haltung der Membran im Einsatz vorgesehen ist.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Sicherungsmittel in Form eines Trägers, bestehend aus unterschiedlichen Strukturen und angepasst an das Membranmaterial, insbesondere aus gitterförmigen oder speichenförmigen Strukturen, ausgebildet ist.
16. Zellkultureinsatz herstellbar in einem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bestehend aus einem Einsatzrohling mit mindestens einer darin angeordneten Membran, insbesondere mindestens einer Biomembran, wobei die mindestens eine Membran keinen Konus aufweist.
17. Zellkultureinsatz nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran aus zwei oder mehreren polymeren Materialien, bevorzugt Biopolymeren, besteht.
18. Zellkultureinsatz nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran eine dreidimensionale Struktur, bevorzugt in Form von Zotten, Kanälen, Hügeln, Tälern, aufweist.
19. Zellkultureinsatz nach einem der Ansprüche 16-18, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran ein funktionelles Material, bevorzugt einen Detektor, Farbstoff, Enzyme, Chemokine oder Nanopartikel, aufweist.
20. Verwendung eines Zellkultureinsatzes nach einem der Ansprüche 16-18 zur Kultivierung von Zellen und Durchführung von Barriere- oder Penetrationsassays.
PCT/EP2019/062204 2018-05-16 2019-05-13 Verfahren zur herstellung eines zellkultureinsatzes mit mindestens einer membran WO2019219605A1 (de)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201980032647.3A CN112424331A (zh) 2018-05-16 2019-05-13 用于制造具有至少一个膜的细胞培养嵌入物的方法
EP19728879.8A EP3794101A1 (de) 2018-05-16 2019-05-13 Verfahren zur herstellung eines zellkultureinsatzes mit mindestens einer membran
US17/054,810 US20210107212A1 (en) 2018-05-16 2019-05-13 Method for the Preparation of a Cell Culture Insert with at Least One Membrane

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018111751.5A DE102018111751A1 (de) 2018-05-16 2018-05-16 Verfahren zur Herstellung eines Zellkultureinsatzes mit mindestens einer Membran
DE102018111751.5 2018-05-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019219605A1 true WO2019219605A1 (de) 2019-11-21

Family

ID=66776295

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/062204 WO2019219605A1 (de) 2018-05-16 2019-05-13 Verfahren zur herstellung eines zellkultureinsatzes mit mindestens einer membran

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20210107212A1 (de)
EP (1) EP3794101A1 (de)
CN (1) CN112424331A (de)
DE (1) DE102018111751A1 (de)
WO (1) WO2019219605A1 (de)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102019132214B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer und dessen Herstellung
DE102019132211B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer mit einem nach oben offenen Besiedlungsraum für biologische Zellen und mit einem den Besiedlungsraum umgebenden kanalförmigen Gefäß
DE102019132180B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer mit überdachtem Hohlraum zur Besiedlung mit biologischen Zellen
WO2022097150A3 (en) * 2020-11-09 2022-06-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. An insert chip and a system comprising same for cell culture

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2548943A1 (de) * 2011-07-21 2013-01-23 CSEM Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique SA - Recherche et Développement Klemmeinsatz für Zellkultur
WO2016075103A1 (de) 2014-11-10 2016-05-19 Technische Universität Berlin Verfahren und vorrichtung zur erzeugung eines dreidimensionalen mehrzelligen objektes
WO2017222065A1 (ja) * 2016-06-24 2017-12-28 株式会社資生堂 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112015031320B1 (pt) * 2013-06-13 2022-01-18 Aspect Biosystems Ltd Sistema para manufatura aditiva de estruturas tridimensionais e método de impressão de uma estrutura tridimensional
WO2016057571A1 (en) * 2014-10-06 2016-04-14 Organovo, Inc. Engineered renal tissues, arrays thereof, and methods of making the same
AU2016257427A1 (en) * 2015-05-05 2017-11-09 President And Fellows Of Harvard College Tubular tissue construct and a method of printing
WO2018064323A1 (en) * 2016-09-28 2018-04-05 Organovo, Inc. Use of engineered renal tissues in assays

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2548943A1 (de) * 2011-07-21 2013-01-23 CSEM Centre Suisse d'Electronique et de Microtechnique SA - Recherche et Développement Klemmeinsatz für Zellkultur
WO2016075103A1 (de) 2014-11-10 2016-05-19 Technische Universität Berlin Verfahren und vorrichtung zur erzeugung eines dreidimensionalen mehrzelligen objektes
WO2017222065A1 (ja) * 2016-06-24 2017-12-28 株式会社資生堂 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法
EP3476933A1 (de) * 2016-06-24 2019-05-01 Shiseido Company, Ltd. Dreidimensional gezüchteter hautlappen, zur herstellung davon verwendeter zellzüchtungsbehälter und verfahren zur herstellung eines dreidimensional gezüchteten hautlappens

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DÜREGGER K. ET AL.: "Additive-manufactured microporous polymer membranes for biomedical in vitro applications - Katharina Düregger, Sina Trik, Stefan Leonhardt, Markus Eblenkamp, 2018", 6 June 2018 (2018-06-06), XP055618102, Retrieved from the Internet <URL:https://journals.sagepub.com/doi/full/10.1177/0885328218780460> [retrieved on 20190903] *
LENKE HORVÁTH ET AL: "Engineering an in vitro air-blood barrier by 3D bioprinting", 22 January 2015 (2015-01-22), XP055618392, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4303938/> [retrieved on 20190904] *
LOW ZE-XIAN ET AL: "Perspective on 3D printing of separation membranes and comparison to related unconventional fabrication techniques", JOURNAL OF MEMBRANE SCIENCE, ELSEVIER BV, NL, vol. 523, 8 October 2016 (2016-10-08), pages 596 - 613, XP029823542, ISSN: 0376-7388, DOI: 10.1016/J.MEMSCI.2016.10.006 *
TIM FEMMER ET AL.: "Print your own membrane: direct rapid prototyping of polydimethylsiloxane - Lab on a Chip (RSC Publishing)", 7 August 2014 (2014-08-07), pages 2610 - 2613, XP055618114, Retrieved from the Internet <URL:https://pubs.rsc.org/en/content/articlepdf/2014/lc/c4lc00320a> [retrieved on 20190903] *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102019132214B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer und dessen Herstellung
DE102019132211B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer mit einem nach oben offenen Besiedlungsraum für biologische Zellen und mit einem den Besiedlungsraum umgebenden kanalförmigen Gefäß
DE102019132180B3 (de) * 2019-11-27 2021-04-29 Cellbricks Gmbh 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer mit überdachtem Hohlraum zur Besiedlung mit biologischen Zellen
US11993767B2 (en) 2019-11-27 2024-05-28 Cellbricks Gmbh Method for producing 3D, biocompatible polymer scaffold with a cell-filled cavity
WO2022097150A3 (en) * 2020-11-09 2022-06-30 Ramot At Tel Aviv University Ltd. An insert chip and a system comprising same for cell culture

Also Published As

Publication number Publication date
EP3794101A1 (de) 2021-03-24
DE102018111751A1 (de) 2019-11-21
US20210107212A1 (en) 2021-04-15
CN112424331A (zh) 2021-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019219605A1 (de) Verfahren zur herstellung eines zellkultureinsatzes mit mindestens einer membran
EP1718409B1 (de) Vorrichtung für mikrofluiduntersuchungen
EP2192984B1 (de) Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion
EP3018531B1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Erzeugung eines dreidimensionalen mehrzelligen Objektes
EP2269735B1 (de) Verfahren zur Erzeugung diffusiv aufgebauter Gradienten
US9133429B2 (en) High throughput multiwell system for culturing 3D tissue constructs in-vitro or in-vivo, method for producing said multiwell system and methods for preparing 3D tissue constructs from cells using said multiwell system
EP4065372A1 (de) 3D-GERÜST AUS BIOKOMPATIBLEM POLYMER MIT EINEM NACH OBEN OFFENEN BESIEDLUNGSRAUM FÜR BIOLOGISCHE ZELLEN UND MIT EINEM DEN BESIEDLUNGSRAUM UMGEBENDEN KANALFÖRMIGEN GEFÄß
EP2024744A1 (de) Mikrotiterplatte und deren verwendung
DE102009039956A1 (de) Mikrofluidisches System und Verfahren zu dessen Herstellung
DE102019132214B3 (de) Mit biologischen Zellen besiedeltes 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer und dessen Herstellung
EP2171036B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur kultivierung lebender zellen
EP2492012B1 (de) Abdeckvorrichtung für einen Probenträger
EP3024567B1 (de) Verkapselungseinrichtung und -verfahren zur verkapselung einer probe in einer polymerkapsel
DE102021204675A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Zellkultivierung
AT523906B1 (de) Inkubationskammer
DE102022123877B4 (de) Grundkörper eines Mehrkammer-Biochips, Herstellung des Mehrkammer-Biochips und dessen Verwendung für die Etablierung von Organ- und Krankheitsmodellen und Substanztestungen
DE102019132180B3 (de) 3D-Gerüst aus biokompatiblem Polymer mit überdachtem Hohlraum zur Besiedlung mit biologischen Zellen
EP2251668B1 (de) Verfahren zum Positionieren einer organischen, biologischen und/oder medizinischen Probe
DE10004135A1 (de) Kammer für Zellkulturen
EP4257670A1 (de) Verfahren zum dreidimensionalen nachbilden eines biologischen gewebes
WO2006077038A1 (de) Verfahren zum einkapseln von sensormolekülen mit einer semipermeablen membran

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19728879

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019728879

Country of ref document: EP

Effective date: 20201216