KR102625373B1 - 생체조직 모델 장치, 혈관벽 모델, 혈관벽 모델 장치 및 피검물질의 평가방법 - Google Patents
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Abstract
생체조직 모델 장치는 액체 조성물을 저장하는 제1 액체 구획; 액체 조성물을 저장하는 제2 액체 구획; 및 두 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 세포 적층체를 포함한다. 혈관벽 모델은 허니콤 구조를 갖는 다공성 막; 다공성 막의 일면에 배치된 혈관내피세포층; 및 다공성 막의 타면에 배치된 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층을 포함한다. 혈관벽 모델 장치는 액체 조성물을 저장하는 제1 액체 구획; 액체 조성물을 저장하는 제2 액체 구획; 및 두 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 혈관벽 모델을 포함한다. 이들 모델 또는 모델 장치의 적용이 또한 제공된다.
Description
본 개시는 생체조직 모델 장치, 혈관벽 모델, 혈관벽 모델 장치 및 피검물질의 평가방법에 관한 것이다.
일본 특허 제5,113,332호에는 혈액-뇌 장벽 시험관내 모델 및 당해 모델을 사용하는 약물의 평가방법이 개시되어 있다. 혈액-뇌 장벽 시험관내 모델은 "세포배양 인서트"로 호칭되는 필터 장치가 배양판에 삽입되어 있는 구조를 취하며, 뇌 모세혈관내피세포층이 세포배양 인서트의 필터의 상면에 배치되어 있고, 뇌 주피세포층이 세포배양 인서트의 필터의 하면에 배치되어 있으며, 성상세포층이 배양판의 바닥면에 배치되어 있는 구조를 취한다.
혈액-뇌 장벽 시험관내 모델에 있어서, 세포배양 인서트의 필터부는 뇌 모세혈관내피세포층, 트랙-에칭 (TE) 멤브레인 및 뇌 주피세포층의 적층체이다. 당해 적층체는 뇌 주피세포를 TE 막의 일면에 배양한 다음, 뇌 모세혈관내피세포를 TE 막의 타면에 배양함으로써 수득된다.
상기 혈액-뇌 장벽 시험관내 모델은 배양판 내측의 공간이 세포배양 인서트에 의하여 2개의 액체 구획으로 분할되어 있는 구조를 취하고 있다. 일본 특허 제5,113,332호에는 세포배양 인서트의 내측 (뇌 모세혈관내피세포층이 배치되는 측의 액체 구획)에 약물을 첨가하고, 세포배양 인서트의 외측 (뇌 주피세포층이 배치되는 측의 액체 구획)으로 누출된 약물의 양을 측정하며, 약물의 혈액-뇌 장벽 통과능을 평가하는 것을 포함하는, 혈액-뇌 장벽 시험관내 모델을 사용하는 방법이 개시되어 있다.
동물 실험을 대체할 수 있는 약물 또는 병태 평가용 생체조직 모델 장치를 얻기 위해서는, 생체 내의 조직의 것들과 유사한 구조와 기능을 갖는 세포 조직의 구축이 필요하다. 생체 내의 조직의 것들과 유사한 구조와 기능을 갖는 세포 조직을 구축하는 관점에서, 세포배양을 위한 스캐폴드로서 작용하는, TE 막 (일반적으로 약 2% 내지 약 20%의 개구율을 갖는 TE 필름)보다 높은 개구율을 갖는 다공성 막의 양면에 세포를 배양하여 세포 적층체를 수득하고, 그 세포 적층체를 생체조직 모델 장치에 적용하는 것이 바람직하다.
세포배양을 위한 스캐폴드로서, 일본 특허 공개공보 (JP-A) 제2002-335949호에 개시된 허니콤 구조 필름, 및 일본 특허 공개공보 (JP-A) 제2007-6987호에 개시된 허니콤 박막이 알려져 있다. JP-A 제2002-335949호에는 허니콤 구조 필름의 양면에 동일 타입의 세포 (간세포 또는 심근세포)를 배양함으로써 수득한 세포 적층체가 개시되어 있다. JP-A 제2007-6987호에는 허니콤 박막의 일면에 섬유아세포를 배양한 다음, 허니콤 박막의 타면에 상피 케라틴생성세포를 배양함으로써 수득한 피부 재생용 이식을 위한 세포 시트가 개시되어 있다. 이들 두 특허 문헌에 있어서, 예를 들면 약물 평가에 사용될 수 있는 장치의 구축은 달성되지 않고 있다.
본 개시에 따른 실시양태는 상기한 상황을 고려하여 고안되었다.
본 개시는 본 개시가 해결하고자 하는 과제인, 신규 생체조직 모델 장치, 신규 혈관벽 모델, 신규 혈관벽 모델 장치 및 이들의 적용을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 구체적인 수단은 하기 양태를 포함한다.
[A1] 액체 조성물이 저장되는 제1 액체 구획;
액체 조성물이 저장되는 제2 액체 구획; 및
제1 및 제2 액체 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 세포 적층체를 포함하고,
세포 적층체는 허니콤 구조를 갖는 다공성 막, 제1 타입의 세포를 함유하고 다공성 막의 일면에 배치되는 세포층, 및 제1 타입과는 상이한 제2 타입의 세포를 함유하고 다공성 막의 타면에 배치되는 세포층을 포함하는 생체조직 모델 장치.
[A2] [A1]에 있어서, 제1 타입의 세포 및 제2 타입의 세포는 실질세포, 간질세포, 근세포, 섬유아세포, 신경세포, 교세포, 내피세포 및 상피세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 두 가지 타입의 세포인 생체조직 모델 장치.
[A3] [A1] 또는 [A2]에 있어서, 다공성 막의 재료는 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아민, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리실록산 유도체 및 트리아세틸셀룰로스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 생체조직 모델 장치.
[A4] [A1] 내지 [A3] 중 어느 하나에 있어서, 다공성 막의 각 표면은 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 펠리칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 재조합 펩타이드 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나에 의하여 피복되는 생체조직 모델 장치.
[A5] [A1] 내지 [A4] 중 어느 하나에 있어서, 다공성 막에서의 관통홀의 개구의 평균 직경은 1 μm 내지 20 μm이고, 다공성 막의 개구율은 30% 내지 70%인 생체조직 모델 장치.
[A6] 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 피검물질을 첨가하는 것; 및 (i) 제1 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제1 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하거나, 또는 (ii) 제2 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제2 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하는 적어도 하나의 공정을 포함하는, [A1] 내지 [A5] 중 어느 하나에 따른 생체조직 모델 장치를 사용하는 피검물질의 평가방법.
[A7] [A6]에 있어서, 공정 (i)는 제1 액체 구획에 함유된 miRNA, 제1 액체 구획에 함유된 단백질 또는 제1 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하고, 공정 (ii)는 제2 액체 구획에 함유된 miRNA, 제2 액체 구획에 함유된 단백질 또는 제2 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하는 피검물질의 평가방법.
[A8] [A6]에 있어서, 피검물질이 첨가된 액체 구획에 트레이서를 첨가하는 것을 추가로 포함하고, 트레이서가 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 트레이서의 양을 측정하는 것이 공정 (i) 또는 (ii)를 구성하는 피검물질의 평가방법.
[B1] 허니콤 구조를 갖는 다공성 막;
다공성 막의 일면에 배치된 혈관내피세포층; 및
다공성 막의 타면에 배치된 평활근세포층을 포함하는 혈관벽 모델.
[B2] [B1]에 있어서, 혈관벽 모델에서 혈관내피세포층 측으로부터 평활근세포층 측으로의 FITC-덱스트란 70 투과성이 다공성 막의 일면으로부터 다공성 막의 타면으로의 FITC-덱스트란 70 투과성의 0% 내지 10%인 혈관벽 모델.
[B3] 허니콤 구조를 갖는 다공성 막; 다공성 막의 일면에 배치된 혈관내피세포층; 및 다공성 막의 타면에 배치된 간엽 줄기세포층을 포함하는 혈관벽 모델.
[B4] [B3]에 있어서, 혈관벽 모델에서 혈관내피세포층 측으로부터 간엽 줄기세포층 측으로의 FITC-덱스트란 70 투과성이 다공성 막의 일면으로부터 다공성 막의 타면으로의 FITC-덱스트란 70 투과성의 0% 내지 10%인 혈관벽 모델.
[B5] [B1] 내지 [B4] 중 어느 하나에 있어서, 다공성 막의 재료는 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리(글리세롤 세바케이트), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아민, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리실록산 유도체 및 트리아세틸셀룰로스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 혈관벽 모델.
[B6] [B1] 내지 [B5] 중 어느 하나에 있어서, 다공성 막의 각 표면은 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 펠리칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 재조합 펩타이드 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나에 의하여 피복되는 혈관벽 모델.
[B7] [B1] 내지 [B6] 중 어느 하나에 있어서, 다공성 막에서의 관통홀의 개구의 평균 직경은 1 μm 내지 20 μm이고, 다공성 막의 개구율은 30% 내지 70%인 혈관벽 모델.
[C1] 액체 조성물이 저장되는 제1 액체 구획; 액체 조성물이 저장되는 제2 액체 구획; 및 제1 및 제2 액체 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 [B1] 내지 [B7] 중 어느 하나의 혈관벽 모델을 포함하는 혈관벽 모델 장치.
[C2] 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 피검물질을 첨가하는 것; 및
(i) 제1 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제1 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하거나, 또는 (ii) 제2 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제2 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하는 적어도 하나의 공정을 포함하는,
[C1]의 혈관벽 모델 장치를 사용하는 피검물질의 평가방법.
[C3] [C2]에 있어서, 공정 (i)는 제1 액체 구획에 함유된 miRNA, 제1 액체 구획에 함유된 단백질 또는 제1 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하고, 공정 (ii)는 제2 액체 구획에 함유된 miRNA, 제2 액체 구획에 함유된 단백질 또는 제2 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하는 피검물질의 평가방법.
[C4] [C2]에 있어서, 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 하나는 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 혈액을 모방하고 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하는 액체 조성물이 저장되는 액체 구획이고, 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에로의 피검물질의 첨가는 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 혈액을 모방하고 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하는 액체 조성물이 저장되는 액체 구획에 피검물질을 첨가하는 것을 포함하며, 피검물질이 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 적혈구의 양, 피검물질이 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 헤모글로빈의 양 또는 피검물질이 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 양 중 적어도 하나를 측정하는 것이 공정 (i) 또는 (ii)를 구성하는 피검물질의 평가방법.
[D1] 바닥부와 바닥부의 외연으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기, 다공성 막, 및 다공성 막이 용기의 내부 바닥면에 대향하고 그 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지되도록 다공성 막을 보지하도록 구성된 보지 부재를 이용하는, 다공성 막의 양면에 세포층을 포함하는 세포 적층체의 제조방법에 있어서,
제1 세포를 용기의 내부 바닥면 및 다공성 막의 표면과 접촉하는 액체 배양배지에서, 다공성 막이 내부 바닥면에 대향하도록 용기의 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지 부재에 의하여 보지되고, 및 다공성 막이 중력 방향으로 하부측에 위치되면서 용기의 바닥부는 상부측에 위치되는 상태에서 배양하는 것; 및
제1 세포를 다공성 막의 하부면에서 배양하고, 제2 세포를 다공성 막의 상부면에서, 다공성 막이 내부 바닥면에 대향하도록 용기의 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지 부재에 의하여 보지되고, 및 다공성 막이 중력 방향으로 상부측에 위치되면서 용기의 바닥부는 하부측에 위치되는 상태에서 배양하는 것을 포함하는 방법.
본 개시에 따르면, 신규 생체조직 모델 장치, 신규 혈관벽 모델, 신규 혈관벽 모델 장치 및 이들의 적용이 제공된다.
도 1은 생체조직 모델 장치의 일례를 설명하는 개략적인 단면도이다.
도 2는 생체조직 모델 장치내 세포 적층체의 일례를 설명하는 개략적인 부분 단면도이다.
도 3a는 허니콤 구조를 갖는 다공성 막의 일례를 설명하는 사시도이다.
도 3b는 상부측에서 본 도 3a에 도시한 다공성 막의 평면도이다.
도 3c는 도 3b에서 라인 c-c를 따라 취한 다공성 막의 단면도이다.
도 4a는 보지 부재의 일례를 설명하는 투시도이다.
도 4b는 도 4a에 도시한 보지 부재가 배양용기에 배치되는 상태를 설명하는 투시도이다.
도 5는 세포 적층체의 제조방법의 일례를 설명하는 개략도이다.
도 6은 세포 적층체의 제조방법의 일례를 설명하는 개략도이다.
도 7은 실시예 1에서 사용된 다공성 막의 현미경사진이다.
도 8은 실시예 1에서 다공성 막의 어느 한 면에 형성된 각 세포층의 면역형광 이미지이다.
도 9는 FITC-덱스트란 70의 상대 형광 강도를 보여주는 그래프이다.
도 10은 FITC-덱스트란 70의 상대 형광 강도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 실시예 2에서 다공성 막의 어느 한 면에 형성된 각 세포층의 면역형광 이미지이다.
도 12는 실시예 2에서 세포 적층체의 면역형광 이미지이다.
도 2는 생체조직 모델 장치내 세포 적층체의 일례를 설명하는 개략적인 부분 단면도이다.
도 3a는 허니콤 구조를 갖는 다공성 막의 일례를 설명하는 사시도이다.
도 3b는 상부측에서 본 도 3a에 도시한 다공성 막의 평면도이다.
도 3c는 도 3b에서 라인 c-c를 따라 취한 다공성 막의 단면도이다.
도 4a는 보지 부재의 일례를 설명하는 투시도이다.
도 4b는 도 4a에 도시한 보지 부재가 배양용기에 배치되는 상태를 설명하는 투시도이다.
도 5는 세포 적층체의 제조방법의 일례를 설명하는 개략도이다.
도 6은 세포 적층체의 제조방법의 일례를 설명하는 개략도이다.
도 7은 실시예 1에서 사용된 다공성 막의 현미경사진이다.
도 8은 실시예 1에서 다공성 막의 어느 한 면에 형성된 각 세포층의 면역형광 이미지이다.
도 9는 FITC-덱스트란 70의 상대 형광 강도를 보여주는 그래프이다.
도 10은 FITC-덱스트란 70의 상대 형광 강도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 실시예 2에서 다공성 막의 어느 한 면에 형성된 각 세포층의 면역형광 이미지이다.
도 12는 실시예 2에서 세포 적층체의 면역형광 이미지이다.
본 발명의 실시양태를 이하에 기재한다. 이하의 기재와 실시예는 예시적인 실시양태를 설명하며, 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 개시에 기재된 작용 메커니즘은 추정을 포함하며, 그 추정이 올바른지 여부는 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 개시에 있어서, "~ 내지 ~"를 사용하여 표시한 각각의 수치 범위는"~ 내지 ~" 전후 기재의 수치를 각각 하한치 및 상한치로 포함하는 범위를 언급한다.
각각이 조성물 중의 특정 성분에 상응하는 둘 이상의 물질이 존재하는 경우, 특별한 규정이 없는 한, 본 개시에 기재된 조성물 중의 특정 성분의 양은 조성물에 존재하는 둘 이상의 물질의 총량을 의미한다.
<생체조직 모델 장치 및 혈관벽 모델 장치>
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치는
액체 조성물이 저장되는 제1 액체 구획;
액체 조성물이 저장되는 제2 액체 구획; 및
제1 및 제2 액체 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 세포 적층체를 포함한다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에서의 세포 적층체는
허니콤 구조를 갖는 다공성 막;
제1 타입의 세포를 함유하고 허니콤 구조를 갖는 다공성 막의 일면에 배치되는 세포층; 및
제1 타입과는 상이한 제2 타입의 세포를 함유하고 허니콤 구조를 갖는 다공성 막의 타면에 배치되는 세포층을 포함한다.
허니콤 구조를 갖는 다공성 막은 이하에서 "허니콤 멤브레인"으로도 호칭된다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에 있어서, 세포 적층체는 하나의 세포층이 제1 액체 구획에 대향하고, 다른 하나의 세포층이 제2 액체 구획에 대향하도록 배치된다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에 있어서, 제1 액체 구획에 저장된 액체 조성물 및 제2 액체 구획에 저장된 액체 조성물은 동일한 조성을 또는 서로 다른 조성을 가져도 된다. 이들 액체 조성물의 각각은 바람직하게는 세포를 세포 적층체내 세포층에 살아있는 상태로 유지하도록 구성된 조성을 갖는다. 액체 조성물의 예는 인산 완충 생리식염수, 생리식염수, 포유동물 세포용 기본 배지, 및 혈액을 포함한다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치의 일례인 생체조직 모델 장치( 500)가 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 생체조직 모델 장치(500)의 개략적인 단면도이다. 당해 도면에 있어서, 각 부재의 사이즈는 개념적인 사이즈이며, 부재들의 사이즈간 상대적인 관계는 이에 한정되지 않는다. 생체조직 모델 장치(500)는 제1 액체 구획(410), 제2 액체 구획(420) 및 세포 적층체(300)를 포함한다. 제1 액체 구획(410) 및 제2 액체 구획(420)의 각각은 액체 조성물을 저장한다. 제1 액체 구획(410)에 저장된 액체 조성물과 제2 액체 구획(420)에 저장된 액체 조성물은 동일한 조성을 또는 서로 다른 조성을 가져도 된다. 세포 적층체(300)는 제1 액체 구획(410)과 제2 액체 구획(420) 사이의 분배구획의 부분이다.
도 1에 도시된 생체조직 모델 장치(500)의 구성의 일례는 세포배양 인서트가 배양용기에 배치되는 구성이다. 당해 구성의 생체조직 모델 장치는 바닥부와 바닥부의 외연으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기, 및 용기에 배치되는 세포배양 인서트를 포함하고, 세포배양 인서트는 세포 적층체를 포함한다. 당해 구성은 배양용기 및 세포배양 인서트가 일체화되어 있는 배양장치를 이용한 후술하는 제조방법에 따라 세포 적층체가 제조된 후에 수득된 세포배양 인서트와 배양용기로 구성된다 (예를 들면, 도 4b에 도시되어 있는 후술하는 구성). 당해 구성은 이하에서 "세포배양 인서트 타입 장치"로 호칭한다. 세포배양 인서트 타입 장치의 구성이 일례로서 도 4b를 참조하여 기재되는 경우, 보지 부재(40)의 중공 원통형부(42)와 허니콤 멤브레인(20)에 의하여 규정된 공간은 도 1에 도시된 제1 액체 구획(410)에 대응하고, 배양용기(60)의 바닥부(62), 배양용기(60)의 측벽부(64), 보지 부재(40)의 중공 원통형부(42), 및 허니콤 멤브레인(20)에 의하여 규정된 공간은 도 1에 도시된 제2 액체 구획(420)에 대응한다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치의 일례는 혈관벽 모델 장치이다.
본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치는
액체 조성물이 저장되는 제1 액체 구획;
액체 조성물이 저장되는 제2 액체 구획; 및
제1 및 제2 액체 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 혈관벽 모델을 포함한다.
본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치에서의 혈관벽 모델은 허니콤 멤브레인, 허니콤 멤브레인의 일면에 배치되는 혈관내피세포층, 및 허니콤 멤브레인의 타면에 배치되는 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층을 포함한다. 본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치에 있어서, 혈관벽 모델에서의 혈관내피세포층 및 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층은 혈관내피세포층 및 평활근세포층/간엽 줄기세포층의 각각이 그의 대응하는 액체 구획에 대향하도록 배치된다.
본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치에 있어서, 제1 액체 구획에 저장된 액체 조성물 및 제2 액체 구획에 저장된 액체 조성물은 동일한 조성을 또는 서로 다른 조성을 가져도 된다. 액체 조성물은 바람직하게는 혈관내피세포 및 평활근세포/간엽줄기세포를 살아있는 상태로 유지하도록 구성된 조성을 갖는다. 액체 조성물의 예는 인산 완충 생리식염수, 생리식염수, 포유동물 세포용 기본 배지, 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물, 및 혈액을 모방하고 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하는 액체 조성물을 포함한다. 본 개시에 있어서, 혈액의 범위는 생리식염수로 희석한 혈액; 혈액에 글루코스 및 항응고제 등의 첨가제를 첨가하여 수득된 저장가능한 혈액; 및 이들의 분획 등과 같은 혈액 샘플을 포함한다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치의 구성의 일례는 세포 적층체(300)가 도 1에 도시한 생체조직 모델 장치(500)에서의 혈관벽 모델인 구성이다. 본 개시에 따른 생체조직 모델 장치의 구성의 예는 전술한 세포배양 인서트 타입 장치를 포함한다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에서의 세포 적층체, 및 본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치에서의 혈관벽 모델을 이하에 기재한다.
[세포 적층체 및 혈관벽 모델]
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에서의 세포 적층체는 허니콤 멤브레인, 제1 타입의 세포를 함유하고 허니콤 멤브레인의 일면에 배치되는 세포층, 및 제1 타입과는 상이한 제2 타입의 세포를 함유하고 허니콤 멤브레인의 타면에 배치되는 세포층을 포함한다. 허니콤 멤브레인의 각각의 면에 배치되는 세포층의 개수는 1개 또는 2개 이상일 수 있다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에서의 세포 적층체의 일례인, 세포 적층체(300)가 도 2에 도시되어 있다. 도 2는 세포 적층체(300)의 개략적인 부분 단면도이다. 당해 도면에 있어서, 각 부재의 사이즈는 개념적인 사이즈이며, 부재들의 사이즈간 상대적인 관계는 이에 한정되지 않는다.
세포 적층체(300)는 허니콤 멤브레인(200), 제1 타입의 세포를 함유하는 세포층(110), 및 제2 타입의 세포를 함유하는 세포층(120)을 포함한다. 제1 타입의 세포를 포함하는 세포층(110)이 허니콤 멤브레인(200)의 일 주면에 배치되고, 제2 타입의 세포를 포함하는 세포층(120)이 허니콤 멤브레인(200)의 타 주면에 배치된다.
[허니콤 멤브레인]
본 개시에 따른 세포 적층체에서의 허니콤 멤브레인은 세포 적층체의 제조시에 세포가 부착하여 증식하는 스캐폴드로서 작용한다. 보다 구체적으로는, 세포는 허니콤 멤브레인의 양면에서 증식하여 양면에 세포층을 형성하며, 그리하여 본 개시에 따른 세포 적층체가 제공된다.
본 개시에서의 허니콤 구조는 분배구획 벽에 의한 구획화에 의하여 다수의 관통홀이 형성되는 구조를 말한다. 본 개시에 따른 세포 적층체에서의 허니콤 멤브레인에 있어서, 허니콤 구조의 관통홀은 허니콤 멤브레인의 주면에 개구를 형성한다. 본 개시에 따른 세포 적층체에서의 허니콤 멤브레인은 복수의 허니콤 구조가 층상으로 적층되어 있는 구조를 갖는 막일 수 있다.
본 개시에 따른 세포 적층체에서의 허니콤 멤브레인에 있어서, 허니콤 구조의 관통홀의 형상은 제한되지 않는다. 관통홀의 형상은 예를 들면, 구의 일부가 결여된 잘린 구 형상, 배럴 형상, 원기둥 형상, 또는 다각기둥 형상이며, 복수 타입 형상의 관통홀이 함께 존재할 수도 있다. 관통홀의 개구의 형상은 예를 들면, 원 형상, 타원 형상 또는 다각형 형상이고, 복수 타입 형상의 개구가 함께 존재할 수도 있다. 허니콤 구조에 있어서, 인접하는 관통홀은 부분적으로 서로 연통될 수 있다.
허니콤 멤브레인에 있어서, 허니콤 멤브레인에 배치된 세포층의 균질성을 증가시키는 관점에서, 관통홀은 바람직하게는 규칙적으로 배열된다. 규칙적 배열은 브레이크 또는 시프트를 포함할 수 있다. 그러나, 규칙적 배열은 바람직하게는 모든 방향으로 브레이크 없는 연속적인 반복을 포함한다.
허니콤 멤브레인의 일례를 도면을 참조하여 이하에 기재한다. 각각의 도면에 있어서, 동일 또는 등가 요소 또는 부분에는 동일 참조문자가 부여된다. 이하의 기재에서, 좀더 긴 직경은 윤곽선 상의 임의의 두 지점 간의 최장 거리를 의미하거나, 또는 방향이 특정되어 있는 경우에는, 특정된 방향에서의 임의의 두 지점 간의 최장 거리를 의미한다.
허니콤 멤브레인의 일례인, 허니콤 멤브레인(20)이 도 3a 내지 3c에 도시되어 있다. 도 3a는 허니콤 멤브레인(20)의 투시도이고, 도 3b는 상부측에서 본 도 3a에 도시되어 있는 허니콤 멤브레인(20)의 평면도이며, 도 3c는 도 3b에서 라인 c-c를 따라 취한 허니콤 멤브레인(20)의 단면도이다.
관통홀(22)은 허니콤 멤브레인(20)의 주면상의 전역에 걸쳐 배열된다. 그러나, 세포가 접촉할 수 없는 허니콤 멤브레인(20)상의 영역이 존재할 경우, 그 영역에는 관통홀(22)이 제공될 필요가 없다. 허니콤 멤브레인(20)에 있어서, 인접하는 관통홀(22)은 분배구획 벽(24)에 의하여 서로 분리되어 있다.
관통홀(22)의 배열은 반대쪽 면이 평행한 육각형 (바람직하게는 정육각형) 또는 유사 형상이 단위로서 작용하고, 개구의 중심이 형상의 꼭짓점 및 대각선의 교차점에 위치하는 배열이다. 개구의 중심이란 주면의 평면에서 개구의 2차원 형상의 무게 중심을 말한다.
관통홀(22)의 형상은 예를 들면, 구의 일부가 결여된 잘린 구 형상, 배럴 형상, 원기둥 형상, 또는 다각기둥 형상이다. 관통홀(22)의 개구의 형상은 예를 들면, 원 형상, 타원 형상 또는 다각형 형상이다. 허니콤 구조에 있어서, 인접하는 관통홀(22)은 허니콤 멤브레인(20) 내부의 연통홀에 의하여 서로 연통될 수 있다.
허니콤 멤브레인(20)의 사이즈를 이하에 기재한다.
관통홀(22)의 피치 P1은 인접하는 개구의 중심간 거리이다. 피치 P1은 바람직하게는 허니콤 멤브레인(20)에 배치된 세포층에 함유된 세포의 사이즈에 따라 조정된다. 피치 P1은 예를 들면, 1 μm 내지 50 μm이다.
개구 직경 Da는 관통홀(22)의 개구의 보다 긴 직경이다. 개구 직경 Da는 바람직하게는 세포층에 함유된 세포가 허니콤 멤브레인(20)에 잔류하도록 허용하는 사이즈이다. 개구 직경 Da는 예를 들면, 세포층에 함유된 세포의 보다 긴 직경의 10% 내지 150% (예를 들면, 10 μm 내지 50 μm)이다. 혈관벽 모델이 적혈구 누출 시험을 수행하기 위하여 구축되는 경우, 개구 직경 Da는 바람직하게는 적혈구가 통과하도록 허용하는 사이즈이다. 일면의 세포와 타면의 세포 사이의 세포간 접촉을 허용하는 관점에서, 개구 직경 Da는 바람직하게는 과도하게 작지 않다. 한편, 세포층에 함유된 세포가 허니콤 멤브레인(20)에 잔류하도록 허용하는 관점에서, 개구 직경 Da는 바람직하게는 과도하게 크지 않다. 이들 관점에서, 개구 직경 Da는 바람직하게는 1 μm 내지 20 μm, 더 바람직하게는 2 μm 내지 10 μm, 한층 더 바람직하게는 3 μm 내지 5 μm이다. 마찬가지로, 개구의 개구 직경 Da의 평균치는 바람직하게는 1 μm 내지 20 μm, 더 바람직하게는 2 μm 내지 10 μm, 한층 더 바람직하게는 3 μm 내지 5 μm이다.
개구 직경 Da의 변동 계수는 바람직하게는 20% 이하이고, 보다 작은 변동 계수가 보다 바람직하다. 개구 직경 Da의 보다 작은 변동 계수는 허니콤 멤브레인(20)에 배치된 세포층의 보다 높은 균질성을 제공한다. 변동 계수는 그룹의 표준 편차를 그룹의 산술 평균치로 나눔으로써 구해진 값이고, 변동 계수는 그룹내 변동 정도의 지표이다. 본 개시에 있어서, 변동 계수는 백분율로 나타낸다.
분배구획 벽(24)의 폭 W는 인접하는 개구들간의 최소 거리로서 측정되는 분배구획 벽(24)의 폭을 말한다. 폭 W는 바람직하게는 세포층에 함유된 세포가 허니콤 멤브레인(20)에 잔류하도록 허용하는 폭이다.
허니콤 멤브레인의 물질 투과성 및 강도의 관점에서, 허니콤 멤브레인(20)의 개구율은 바람직하게는 30% 내지 70%, 더 바람직하게는 35% 내지 65%, 한층 더 바람직하게는 40% 내지 60%이다. 허니콤 멤브레인(20)의 개구율은 평면도에서 주면의 면적 (개구를 포함한 면적)에 대한 개구의 총 면적의 비율이다. 개구율은 일면과 타면에 대해 개별적으로 산정된다.
일면의 세포와 타면의 세포 사이의 세포간 접촉을 허용하는 관점에서, 허니콤 멤브레인(20)의 두께는 바람직하게는 과도하게 크지 않다. 허니콤 멤브레인(20)의 강도의 관점에서, 허니콤 멤브레인(20)의 두께는 바람직하게는 과도하게 작지 않다. 이들 관점에서, 허니콤 멤브레인(20)의 두께는 바람직하게는 0.5 μm 내지 40 μm, 더 바람직하게는 1 μm 내지 20 μm, 한층 더 바람직하게는 2 μm 내지 8 μm이다.
허니콤 멤브레인의 제조에 사용되는 방법은 제한되지 않는다. 허니콤 멤브레인의 제조방법의 예는 일본 특허 제4,734,157호, 제4,945,281호, 제5,405,374호 및 제5,422,230호, 및 일본 특허 공개공보 (JP-A) 제2011-74140호에 개시되어 있는, 중합체와 용매를 함유하는 코팅 필름에서 수적이 성장하도록 함으로써 관통홀이 형성되는 제조방법; 및 수지 재질의 막에 에칭 처리 또는 펀칭 처리를 수행하여 관통홀을 형성함으로써 허니콤 멤브레인이 형성되는 제조방법을 포함한다.
허니콤 멤브레인의 재료의 예는 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리에스테르 (예를 들면, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리글리콜산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 및 폴리-3-히드록시부티레이트), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리헥사플루오로프로펜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐카바졸, 폴리비닐 아세테이트, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리우레탄, 폴리우레아, 다환 방향족 화합물, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리실록산 유도체, 및 셀룰로스 아실레이트 (예를 들면, 트리아세틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트 프로피오네이트, 및 셀룰로스 아세테이트 부티레이트), 폴리(글리세롤 세바케이트) 및 폴리아크릴아민과 같은 중합체를 포함한다. 예를 들면 일본 특허 제4,734,157호에 개시된 제조방법을 이용하여 허니콤 멤브레인을 제조하는 관점에서, 소수성 유기용매에 용해되는 중합체가 바람직하다. 예를 들면, 용매에 대한 용해도, 광학 특성, 전기적 특성, 막 강도, 및 탄성의 관점에서, 이들 중합체는 필요에 따라 단독중합체, 공중합체, 중합체 블렌드 또는 중합체 알로이의 형태를 취할 수 있다. 이들 중합체는 단독으로 또는 둘 이상 조합하여 사용될 수 있다.
허니콤 멤브레인의 재료로서, 폴리부타디엔, 폴리우레탄, 폴리카보네이트 또는 폴리락트산이 자립성의 관점에서 바람직하고, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체 또는 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체가 세포층의 생착을 유지하는 관점에서 바람직하다.
세포 부착성의 관점에서, 허니콤 멤브레인의 각각의 면은 바람직하게는 피브로넥틴, 콜라겐 (예를 들면, 타입 I 콜라겐, 타입 IV 콜라겐 또는 타입 V 콜라겐), 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 펠리칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 재조합 펩타이드 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나로 피복되며, 적어도 세포층이 배치되는 영역 위에 피복된다. 기저막 매트릭스에 관해서는, 시판 제품 (예를 들면, 매트리젤(MATRIGEL) (등록상표), 젤트렉스(GELTREX) (등록상표))이 이용 가능하다. 재조합 펩타이드에 관해서는, 시판 제품 (예를 들면, 셀네스트(CELLNEST) (등록상표))이 이용 가능하다. 허니콤 멤브레인에 있어서, 홀의 내부도 또한 바람직하게는 이들 물질 중 적어도 하나로 피복된다.
[제1 타입의 세포 및 제2 타입의 세포]
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에서의 세포 적층체에 있어서, 제1 타입의 세포 및 제2 타입의 세포는 상이한 타입의 세포이다. 제1 타입의 세포 및 제2 타입의 세포인 두 타입의 세포는 예를 들면, 실질세포 (예를 들면, 간 실질세포 또는 췌장 실질세포), 간질세포 (예를 들면, 주피세포), 근세포 (예를 들면, 평활근세포, 심근세포, 또는 골격근세포), 섬유아세포, 신경세포, 교세포, 내피세포 (예를 들면, 혈관내피세포 또는 림프내피세포), 상피세포 (예를 들면, 폐포상피세포, 구강상피세포, 담관상피세포, 장상피세포, 췌관상피세포, 신장상피세포, 신세뇨관상피세포 또는 태반상피세포) 및 줄기세포 (예를 들면, 간엽줄기세포)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 두 타입의 세포이다.
본 개시에 따른 세포 적층체에 있어서, 복수 타입의 세포가 하나의 세포층에 함유될 수 있다. 본 개시에 따른 세포 적층체에 있어서, 제1 타입의 세포 및 제2 타입의 세포 이외의 하나 이상 타입의 세포 (제3 타입의 세포로 호칭)가 한쪽 세포층에 또는 양쪽 세포층 모두에 함유될 수 있다. 일례로, 제1 타입의 세포는 실질세포이고, 제2 타입의 세포는 간질세포이며, 제3 타입의 세포는 신경세포이며, 신경세포는 세포층의 한쪽 또는 양쪽 모두에 포함될 수 있다.
제1 타입의 세포를 함유하는 한쪽 세포층이 타 세포층에 함유된 것들과 동일한 타입의 세포인 제2 타입의 세포를 또한 포함하는 경우에도, 당해 구성은 한쪽 세포층에 함유된 세포 및 타 세포층에 함유된 세포가 예를 들면, 세포 타입간의 함유비율에 기반하여 구별될 수 있는 한 여전히 본 개시 안에 들어온다. 예를 들면, 본 개시는 한쪽 세포층에 함유된 세포가 실질세포 및 간질세포 (9:1의 함유비율)이고, 타 세포층에 함유된 세포가 실질세포 및 간질세포 (1:9의 함유비율)인 구성을 포함한다.
본 개시에 따른 세포 적층체는 생체 내의 조직을 모방하고 본 개시에 따른 생체조직 모델 장치에 포함되는 조직 모델이다. 따라서, 모방하고자 하는 생체 내의 조직에 따라 제1 타입의 세포와 제2 타입의 세포가 선택되고, 필요에 따라 제3 타입의 세포가 선택된다. 동물 조직에 있어서, 기저막은 일반적으로 하나의 세포층과 또 다른 세포층 사이에 존재한다. (조직 모델로서 작용하는) 본 개시에 따른 세포 적층체에 있어서, 허니콤 멤브레인은 기저막에 대응한다.
생체 내의 조직을 모방하는 조직 모델의 일례는 혈관벽 모델이다. 본 개시에 따른 혈관벽 모델은 허니콤 멤브레인, 허니콤 멤브레인의 일면에 배치되는 혈관내피세포층, 및 허니콤 멤브레인의 타면에 배치되는 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층을 포함한다.
혈관벽 모델은 바람직하게는 화학물질이 혈관내피세포층의 세포들 사이를 자유롭게 통과하는 것을 방지하고, 환언하면, 바람직하게는 배리어 기능을 갖는다. 혈관벽 모델의 배리어 기능은 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 70 (FITC-덱스트란 70) 투과성을 지표로 이용하여 표현될 수 있다. 본 개시에 따른 혈관벽 모델은 바람직하게는 혈관내피세포층 측으로부터 평활근세포층 측 또는 간엽 줄기세포층 측으로의 FITC-덱스트란 70 투과성이 허니콤 멤브레인 자체의 FITC-덱스트란 70 투과성의 0% 내지 10%, 더 바람직하게는 허니콤 멤브레인 자체의 FITC-덱스트란 70 투과성의 0% 내지 5%, 한층 더 바람직하게는 허니콤 멤브레인 자체의 FITC-덱스트란 70 투과성의 0% 내지 2%가 되도록 구성된다. 그러한 구성을 갖는 혈관벽 모델에 있어서, 혈관내피세포들 사이의 세포간 부착이 아마도 생체 내의 혈관벽에 가까운 상태로 발달하였다. 혈관벽 모델을 이용하여 약물을 정확하게 평가하기 위하여, 혈관벽 모델은 바람직하게는 생체 내의 혈관벽과 유사한 구조와 기능을 갖는다. 따라서, 상기 구성을 갖는 혈관벽 모델은 우수한 약물 평가 수단으로서 작용할 수 있다.
혈관벽 모델에서의 FITC-덱스트란 70 투과성의 검정에 사용되는 방법을 추후에 설명하기로 한다.
생체 내의 조직을 모방하는 조직 모델의 또 다른 예는 병태 재현 모델이다. 당해 모델에 있어서, 유전자 변이가 있는 세포 또는 환자로부터의 세포가 제1 타입의 세포 또는 제2 타입의 세포 중 적어도 하나로서 사용된다.
전술한 세포 적층체를 포함하는 생체조직 모델 장치는 약물 평가 또는 병태 평가용 장치로서, 또는 동물 실험을 대체할 수 있는 테스트용 장치로서 유용하다. 이어서, 생체조직 모델 장치를 이용한 피검물질의 평가방법을 본 개시에 따른 생체조직 모델 장치의 적용으로서 설명하기로 한다.
<피검물질의 평가방법>
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치는 피검물질에 의하여 발휘되는 세포 조직에 미치는 영향을 평가하는 수단으로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 피검물질에 의하여 발휘되는 세포 조직에 미치는 영향은
피검물질을 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 첨가하는 것; 및
(i) 제1 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제1 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하거나, 또는 (ii) 제2 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제2 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하는 적어도 하나의 공정에 의하여,
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치를 사용하여 평가된다.
예를 들면, 피검물질은 하기 모드 (a) 및 (b)에 따라 평가된다.
(a) 세포 적층체의 세포로부터 분비된 화학물질이 정량화되는 모드
피검물질이 첨가된 액체 구획에 대향하는 측에 위치한 세포층의 세포는 피검물질에 반응하여 화학물질을 분비한다 (세포 손상에 기인한 세포내 성분의 누출을 포함함). 그 결과, 피검물질이 첨가된 액체 구획은 세포로부터 분비된 물질을 포함하게 된다. 추가로, 피검물질이 첨가된 액체 구획에 대향하는 세포층과 반대 측의 세포층에 있는 세포는 일면의 세포층과 타면의 세포층 사이의 세포간 상호작용 (즉, 가용성 인자에 기인한 신호 전달) 또는 일면의 세포층과 타면의 세포층 사이의 세포간 접촉 중 적어도 하나에 기인하여 화학물질을 분비한다. 피검물질이 첨가된 액체 구획에 함유된 세포로부터 분비된 물질 또는 타 액체 구획에 함유된 세포로부터 분비된 물질 중 적어도 하나를 정량화하고, 수득량을 이용하여 피검물질이 세포 조직에 영향을 초래하였는지 여부 및 그 영향의 정도를 측정한다. 세포로부터 분비된 물질의 예는 microRNA (miRNA), 단백질 및 전사인자를 포함한다.
(b) 세포 적층체의 일측에서 세포 적층체의 타측으로 누출되는 화학물질 또는 세포가 정량화되는 모드
피검물질이 첨가된 액체 구획에 대향하는 측에 위치한 세포층의 세포는 피검물질에 반응하여 그들의 형태를 변화시키며 (세포 손상을 포함함), 세포층에 갭이 발생한다. 그 결과, 피검물질이 첨가된 액체 구획에 저장된 액체 조성물에 함유된 화학물질 또는 세포가 타 액체 구획으로 누출된다. 타 액체 구획으로 누출된 화학물질 또는 세포를 정량화하고, 수득량을 이용하여 피검물질이 세포 조직에 영향을 초래하였는지 여부 및 그 영향의 정도를 측정한다.
모드 (b)의 일례는 트레이서가 사용되는 모드이다. 구체적으로, 피검물질을 일 액체 구획에 첨가한 후, 피검물질이 첨가된 액체 구획에 트레이서를 첨가하고, 타 액체 구획으로 누출된 트레이서의 양을 정량화한다. 당해 모드에 있어서, 피검물질을 일 액체 구획에 첨가한 후, 예를 들면, 37°C에서 30분 내지 24시간의 지속기간 동안 인큐베이션을 수행하고, 트레이서를 첨가한다. 당해 모드에 있어서, 트레이서의 예는 형광-표지 화학물질, 방사성 동위원소를 함유하는 화학물질, 및 착색제 화합물을 포함한다. 트레이서는 트레이서의 타입에 따라 형광강도, 방사선 또는 색도를 측정함으로써 정량화된다. 타 액체 구획으로 누출된 트레이서의 양에 기초하여 피검물질이 세포 조직에 영향을 초래하였는지 여부 및 그 영향의 정도를 측정한다.
모드 (a) 및 (b)에 있어서, 본 개시에 따른 생체조직 모델 장치는 다음과 같은 면에서 종래의 생체조직 모델 장치에 비하여 유리하다.
종래의 생체조직 모델 장치는 TE 막의 양면에 세포층을 갖는 세포 적층체를 포함한다. TE 막은 일반적으로 개구율이 약 2%에서 약 20%까지 낮다. TE 막의 양면에 세포층을 갖는 세포 적층체에 있어서, 일면의 세포층과 타면의 세포층 사이의 세포간 상호작용은 상대적으로 불활성이다. 따라서, 피검물질이 첨가된 액체 구획에 대향하는 측에 위치한 세포층과 반대 측에 있는 세포층은 기대반응을 수행하지 않으며, 목적하는 화학물질을 분비하지 않을 가능성이 있다. 또, TE 막의 양면에 세포층을 갖는 세포 적층체에 있어서, 세포층의 세포의 형태가 변하여 세포층에 갭을 생성하는 경우에도, 세포층에 의하여 폐쇄된 TE 막의 홀이 관통하게 되는 낮은 가능성만이 존재한다. 세포층의 배리어 기능이 피검물질에 의하여 소거되는 경우에도, TE 막 자체의 배리어 기능은 작동할 수 있으며, 트레이서의 누출을 방지할 수 있다. 따라서, 종래의 생체조직 모델 장치는 피검물질에 의하여 발휘되는 세포 조직에 미치는 영향을 정확하게 평가하지 못할 수도 있다. 특히, 피검물질에 의하여 발휘되는 영향이 미약한 경우 또는 피검물질의 농도가 낮은 경우, 피검물질에 의하여 발휘되는 세포 조직에 미치는 영향을 평가하기가 곤란하다.
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치는 허니콤 멤브레인의 양면에 세포층을 포함하는 세포 적층체를 포함한다. 허니콤 멤브레인은 높은 개구율을 갖는다. 허니콤 멤브레인의 양면에 세포층을 포함하는 세포 적층체에 있어서, 일면의 세포층과 타면의 세포층 사이의 세포간 상호작용은 상대적으로 활성이다. 활성적인 세포간 상호작용이 피검물질이 첨가된 액체 구획에 대향하는 측에 위치한 세포층과 반대 측에 있는 세포층으로 하여금 기대반응을 수행하고 목적하는 화학물질을 분비하게 하는 것으로 추정된다. 또한, 허니콤 멤브레인의 양면에 세포층을 포함하는 세포 적층체에 있어서, 세포층의 세포의 형태가 변하여 세포층에 갭을 생성하는 경우에, 세포층에 의하여 폐쇄된 허니콤 멤브레인의 홀이 높은 확률로 관통하게 된다. 따라서, 일단 세포층의 배리어 기능이 피검물질에 의하여 소거되면, 트레이서의 누출이 높은 확률로 일어난다. 따라서, 피검물질에 의하여 발휘되는 세포 조직에 미치는 영향이 본 개시에 따른 생체조직 모델 장치를 이용하여 높은 감도로 평가될 수 있다.
본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치는 피검물질에 의하여 발휘되는 혈관벽에 미치는 영향을 평가하는 수단으로서 사용될 수 있다. 구체적으로, 피검물질에 의하여 발휘되는 혈관벽에 미치는 영향은
피검물질을 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 첨가하는 것; 및
(i) 제1 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제1 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하거나, 또는 (ii) 제2 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제2 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하는 적어도 하나의 공정에 의하여,
본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치를 사용하여 평가된다. 피검물질의 평가는 예를 들면, 하기 모드 (a-1) 또는 (b-1)에 따라 수행된다.
(a-1) 혈관벽 모델의 세포로부터 분비된 화학물질이 정량화되는 모드
당해 모드는 전술한 모드 (a)에서의 것과 동일한 방법으로 수행된다.
(b-1) 혈관벽 모델 장치의 일측에서 혈관벽 모델 장치의 타측으로 누출되는 화학물질 또는 세포가 정량화되는 모드
당해 모드는 전술한 모드 (b)에서의 것과 동일한 방법으로 수행된다. 일례는 트레이서가 사용되는 전술한 모드이다. 하기의 모드가 또한 고려된다.
모드 (b-1)의 일례에서, 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하고 혈액을 모방하는 액체 조성물이 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 저장되는 혈관벽 모델 장치가 이용된다. 당해 모드에 있어서, 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하고 혈액을 모방하는 액체 조성물이 저장되는 액체 구획에 피검물질을 첨가하고, 타 액체 구획으로 누출된 적혈구의 양, 타 액체 구획으로 누출된 헤모글로빈의 양 또는 타 액체 구획으로 누출된 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 양의 적어도 하나를 정량화한다.
상기 모드의 일례에서, 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하고 혈액을 모방하는 액체 조성물이 혈관내피세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획에 저장되는 혈관벽 모델 장치를 사용하고, 혈관내피세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획에 피검물질을 첨가하고, 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된 적혈구의 양, 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된 헤모글로빈의 양 또는 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 양의 적어도 하나를 정량화한다. 보다 구체적으로, 피검물질의 평가는 하기의 방법에 따라 수행된다.
혈관벽에 있어서, 혈관내피세포의 발달한 세포간 부착은 화학물질의 혈관벽 통과를 제한한다. 피검물질이 혈관내피세포에 영향을 주는 경우, 혈관내피세포는 피검물질에 반응하며 (혈관내피세포의 손상을 포함함), 화학물질에 대한 혈관벽의 투과성이 증가한다. 그 결과, 혈관내피세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획의 액체 조성물에 함유된 적혈구 또는 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나가 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된다. 피검물질이 또한 용혈 독성을 띠는 경우, 헤모글로빈이 적혈구에서 빠져 나오고, 그 헤모글로빈은 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된다. 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된 적혈구의 양, 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된 헤모글로빈의 양 또는 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층에 대향하는 측에 위치한 액체 구획으로 누출된 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 양의 적어도 하나를 측정하고, 수득량에 기초하여 피검물질이 혈관벽 및 적혈구에 영향을 초래하였는지 여부 및 그 영향의 정도를 측정한다.
본 개시에 따른 혈관벽 모델 장치는 혈관벽 모델의 배리어 기능을 평가하는 수단으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 혈관벽 모델의 배리어 기능은 예를 들면, 필터부가 혈관벽 모델인 세포배양 인서트 타입 장치를 사용하여, FITC-덱스트란 70 투과성을 하기 방법으로 검정함으로써 평가된다.
필터부가 혈관벽 모델 (즉, 혈관내피세포층이 허니콤 멤브레인의 일면에 배치되고, 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층이 허니콤 멤브레인의 타면에 배치되는 세포 적층체)이고, 혈관내피세포층이 세포배양 인서트의 내측에 대향하는 세포배양 인서트 타입 장치가 준비된다. FITC-덱스트란 70을 세포배양 인서트의 내측에 첨가하여 37°C에서 인큐베이션하고, 10분내 세포배양 인서트의 외측으로 누출된 FITC-덱스트란 70의 양을 측정한다 (즉, 세포배양 인서트의 외측에서의 FITC의 형광강도를 측정한다). 이와는 별도로, 필터부가 허니콤 멤브레인 자체인 세포배양 인서트 타입 장치를 사용하여 전술한 바와 동일한 절차에 따라 세포배양 인서트의 외측으로 누출되는 FITC-덱스트란 70의 양을 측정한다 (즉, 세포배양 인서트의 외측에서의 FITC의 형광강도를 측정한다). 상대적 형광강도 (RFI)인, 백분율로 나타내는 후자의 측정에서 수득된 형광강도에 대한 전자의 측정에서 수득된 형광강도의 비율을 산정한다. 보다 작은 RFI 값은 혈관벽 모델의 보다 높은 배리어 기능을 표시하는 것으로 간주된다. RFI는 바람직하게는 0% 내지 10%, 더 바람직하게는 0% 내지 5%, 한층 더 바람직하게는 0% 내지 2%이다.
<세포 적층체 및 생체조직 모델 장치의 제조방법>
본 개시에 따른 생체조직 모델 장치는 예를 들면, 생체조직 모델 장치에 분배구획으로서 허니콤 멤브레인의 각각의 면에 상이한 타입의 세포를 배양하여 수득한 세포 적층체를 설치하는 것을 포함하는 방법; 또는 허니콤 멤브레인이 되는 생체조직 모델 장치에 분배구획의 일부를 구성하고, 허니콤 멤브레인의 각각의 면에 상이한 타입의 세포를 배양하여 세포 적층체를 형성하는 것을 포함하는 방법에 의하여 제조된다. 허니콤 멤브레인의 각각의 면에 상이한 타입의 세포를 배양하여 세포 적층체를 수득하는 데 사용되는 방법은 후술하는 세포 적층체의 제조방법일 수 있다. 세포 적층체의 제조방법의 후술하는 모드는 또한 본 개시에 따른 혈관벽 모델의 제조방법이다. 세포 적층체의 제조방법의 후술하는 모드는 또한, 본 개시에 따른 생체조직 모델 장치의 일례인 세포배양 인서트 타입 장치의 제조방법이다.
본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 바닥부와 바닥부의 외연으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기, 허니콤 멤브레인, 및 허니콤 멤브레인이 용기의 내부 바닥면에 대향하고 그 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지되도록 허니콤 멤브레인을 보지하도록 구성된 보지 부재가 사용된다. 용기는 이하에서 "배양용기"로 호칭한다.
본 개시에 따른 제조방법은 배양용기, 허니콤 멤브레인 및 보지 부재를 사용하여 허니콤 멤브레인의 양면에 세포를 배양하고, 그리하여 허니콤 멤브레인의 양면에 세포층을 갖는 세포 적층체를 제조하는 것을 포함한다.
본 개시에 따른 제조방법에 사용되는 배양용기, 허니콤 멤브레인 및 보지 부재를 먼저 설명하기로 한다. 배양용기, 허니콤 멤브레인 및 보지 부재의 후술하는 예는 세포배양 인서트 타입 장치에서의 바람직한 예에 대응한다.
배양용기는 예를 들면, 디쉬, 멀티-디쉬 또는 멀티-웰 플레이트이다. 배양용기의 바닥부의 형상은 예를 들면, 원형, 직사각형 또는 정사각형이다. 배양용기의 재료는 예를 들면, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리에스테르 또는 유리이다. 배양용기는 바람직하게는 높은 투명도를 갖는다.
배양용기의 내부 바닥면은 바람직하게는 편평하다. 배양용기의 내부 바닥면은 바람직하게는 세포가 그 내부 바닥면에 부착하지 않도록 하는 성질을 지닌다. 따라서, 배양용기의 내부 바닥면은 코로나 방전 처리 또는 단백질 코팅 처리를 하지 않는 것이 바람직하다. 세포의 부착을 줄이기 위하여 배양용기의 내부 바닥면은 예를 들면, 포스포릴콜린기 또는 폴리에틸렌 글리콜을 갖는 중합체로 피복될 수 있다. 내부 바닥면과 마찬가지로, 배양용기의 내측면은 바람직하게는 세포가 그 내측면에 부착하지 않도록 하는 성질을 지닌다.
본 개시에 따른 제조방법에 사용되는 허니콤 멤브레인에는 세포 적층체에 포함되는 허니콤 멤브레인의 것과 동일한 정의가 부여되며, 그의 바람직한 예도 동일하다. 본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 허니콤 멤브레인은 세포가 부착하여 증식하는 스캐폴드이다.
본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 허니콤 멤브레인은 세포가 부착하여 증식하는 스캐폴드이다. 허니콤 멤브레인의 보다 높은 개구율 및 허니콤 멤브레인의 보다 작은 두께 각각은 일면의 세포와 타면의 세포 사이의 보다 활성적인 세포간 상호작용 (즉, 가용성 인자에 의한 신호 전달) 또는 일면의 세포와 타면의 세포 사이의 보다 활성적인 세포간 접촉 중 적어도 하나를 제공한다. 세포배양 동안의 보다 활성적인 세포간 상호작용은 생체 내의 조직의 것에 보다 근접한 기능을 갖는 세포 적층체의 제조를 가능케 한다. 본 개시에 따른 제조방법은 예를 들면, 혈관내피세포의 세포간 부착이 생체 내의 혈관벽에서의 것에 근접한 상태로 발달한 혈관벽 모델의 제조를 가능케 한다.
보지 부재는 허니콤 멤브레인이 배양용기의 내부 바닥면에 대향하고 그 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지되도록 허니콤 멤브레인을 보지하도록 구성된 부재이다.
높은 투명도, 액체 배양배지에서의 화학적 안정성 및 경량성을 고려하면 보지 부재의 재료로는 폴리카보네이트, 폴리스티렌 및 폴리에스테르와 같은 수지가 바람직하다.
보지 부재의 형상은 제한되지 않는다. 보지 부재는 예를 들면, 허니콤 멤브레인을 보지하도록 구성된 부분 및 배양용기와 접촉하도록 구성된 부분을 포함한다. 보지 부재는 예를 들면, 배양용기의 측벽부의 엣지에 걸치는 돌출부를 갖는 와이어형 부재, 막대형 부재 또는 중공 원통형 부재이다.
보지 부재의 형태와 관련하여, 보지 부재는 예를 들면,
중공 원통형부의 하나의 축 방향 단부에 다공성 막을 보지하도록 구성된 중공 원통형부 (원통형부는 배양용기의 내경보다 작은 외경을 갖고, 축 방향으로 중공 원통형부의 길이는 배양용기의 측벽부의 높이보다 짧다); 및
중공 원통형부의 다른 하나의 축 방향 단부로부터 반경 방향으로 외향으로 돌출하는 돌출부 (돌출부는 배양용기의 측벽부의 엣지에 걸치도록 구성된다)를 포함하는 부재이다. 이러한 형태는 도면을 참조하여 이하에서 설명하기로 한다.
도 4a에 있어서, 보지 부재의 일례인 보지 부재(40)가 허니콤 멤브레인(20) (허니콤 멤브레인의 일례)과 조합되는 상태로 도시되어 있다. 도 4a는 보지 부재(40)의 투시도이다. 도 4b는 허니콤 멤브레인(20)과 조합된 보지 부재(40)가 배양용기(60) (배양용기의 일례)에 설치되는 상태를 설명하는 투시도이다.
보지 부재(40)는 중공 원통형부(42) 및 돌출부(44)를 포함한다. 허니콤 멤브레인(20)은 중공 원통형부(42)의 하나의 축 방향 단부에 배치된다. 허니콤 멤브레인(20)은 중공 원통형부(42)의 일단에 위치한 개구를 적어도 폐쇄하는 사이즈를 갖는다. 허니콤 멤브레인(20)은 열압착, 초음파 용착, 레이저 용착, 접착제 또는 양면 접착 테이프에 의하여 중공 원통형부(42)의 일단에 부착된다. 이와 달리, 허니콤 멤브레인(20)은 중공 원통형부(42)의 외면에 부착된 고리형 고정 부재에 의하여 중공 원통형부(42)의 일단에 고정시킬 수도 있다.
중공 원통형부(42)는 배양용기(60)의 내경보다 작은 외경을 가지며, 배양용기(60)의 내측(즉, 바닥부(62) 및 측벽부(64)에 의하여 규정되는 공간)에 삽입가능하다. 축 방향으로 중공 원통형부(42)의 길이는 배양용기(60)의 측벽부(64)의 높이보다 짧다. 따라서, 허니콤 멤브레인(20)은 배양용기(60)의 바닥부(62)와 접촉하지 않는다.
중공 원통형부(42)는 원주 방향 및 축 방향으로 연속적인 벽을 갖는다. 이러한 구성은 허니콤 멤브레인(20) 및 중공 원통형부(42)에 의하여 규정된 공간에 액체를 저장하게 해준다. 그러나, 돌출부(44) 부근의 위치에 있는 중공 원통형부(42)의 벽에는 슬릿이 구비될 수도 있다. 중공 원통형부(42)의 내면의 형상은 예를 들면, 원기둥 형상, 다각기둥 형상, 원형의 잘린 원뿔 형상 또는 다각형의 잘린 원뿔 형상이다.
돌출부(44)는 허니콤 멤브레인(20)이 배치되는 단부와는 반대측 중공 원통형부(42)의 축 방향 단부에서 중공 원통형부(42)의 반경 방향으로 외향으로 돌출한다. 예를 들면, 중공 원통형부(42)의 원주 방향으로 약 120°의 간격으로 3개의 돌출부(44)가 구비될 수 있다. 그러나, 돌출부(44)의 개수 및 형상은 그에 한정되지 않는다. 돌출부(44)는 중공 원통형부(42)의 원주 방향으로 연속적인 고리의 형상을 취할 수 있다.
돌출부(44)는 보지 부재(40)가 배양용기(60)의 내측에 삽입될 때 돌출부(44)가 배양용기(60)의 측벽부(64)의 엣지에 걸치도록 하는 돌출 길이를 갖는다. 보지 부재(40)는 돌출부(44)에 기인하여 배양용기(60)의 측벽부(64)의 엣지에서 고정된다.
도 4a에 도시된 바와 같은 형상을 갖는 배양장치는 일반적으로 세포배양 인서트로 불린다.
이어서 본 개시에 따른 제조방법에 있어서의 공정을 설명하기로 한다. 본 개시에 있어서, 용어 "공정"의 범위는 독립적인 공정 및 다른 공정과 명확하게 구별될 수 없지만 여전히 해당 공정의 원하는 목적을 달성하는 공정을 포함한다.
본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 배양용기, 허니콤 멤브레인 및 보지 부재가 사용되고, 제조공정은 하기 공정 (A) 및 (B)를 포함한다. 도 5는 본 개시에 따른 제조방법의 일례를 설명하는 개략도이고, 공정 (A) 및 (B)를 설명하기 위한 개략도이다. 도 5에 있어서, 화살표 G는 중력의 방향을 표시한다.
공정 (A): 배양용기(6)의 내부 바닥면 및 허니콤 멤브레인(2)의 표면과 접촉하는 액체 배양배지에서, 내부 바닥면에 대향하도록 배양용기(6)의 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지 부재(4)에 의하여 허니콤 멤브레인(2)이 보지되고, 허니콤 멤브레인(2)은 중력의 방향 G으로 하부측에 위치되면서 배양용기(6)의 바닥부는 상부측에 위치되는 상태에서 제1 세포(11)를 배양하는 것.
공정 (B): 내부 바닥면에 대향하도록 배양용기(6)의 내부 바닥면과 접촉하지 않는 위치에서 보지 부재(4)에 의하여 허니콤 멤브레인(2)이 보지되고, 허니콤 멤브레인(2)은 중력 G의 방향으로 상부측에 위치되면서 배양용기(6)의 바닥부는 하부측에 위치되는 상태에서 제1 세포(11)를 허니콤 멤브레인(2)의 하면에서 배양하고 제2 세포(12)를 허니콤 멤브레인(2)의 상면에서 배양하는 것.
본 개시에서의 "배양"은 반드시 세포의 증식을 수반하는 것은 아니며, 증식의 유무에 관계 없이 세포를 살아있는 상태로 유지하는 것이 당해 용어의 범위에 포함된다.
공정 (A)에서 채용되는 상태에 있어서, 허니콤 멤브레인(2)은 중력 G의 방향으로 하부측에 위치되면서 배양용기(6)의 바닥부는 상부측에 위치된다. 공정 (A)에 있어서, 세포 현탁액이 배양용기(6)의 내부 바닥면 및 허니콤 멤브레인(2)의 표면과 접촉하도록 배양용기(6)와 허니콤 멤브레인(2) 사이에 제1 세포(11)를 함유하는 세포 현탁액을 제공하고, 제1 세포(11)를 이 상태에서 배양한다. 배양용기(6)의 내부 바닥면과 세포 현탁액에 함유된 액체 배양배지 사이에 작용하는 표면장력에 기인하여, 액체 배양배지는 허니콤 멤브레인(2)에 잔류되고, 허니콤 멤브레인(2)의 홀을 통한 액체배지의 낙하가 감소된다. 따라서, 높은 개구율을 갖는 허니콤 멤브레인은 세포 적층체의 제조에 사용될 수 있다. 허니콤 멤브레인(2)은 바람직하게는, 배양용기(6)의 내부 바닥면 부근의 위치에서, 허니콤 멤브레인(2)이 배양용기(6)의 내부 바닥면에 대향하고 배양용기(6)의 내부 바닥면에 평행하게 또는 실질적으로 평행하게 배향되는 상태에서, 보지 부재(4)에 의하여 보지된다. 허니콤 멤브레인(2)과 배양용기(6)의 내부 바닥면 사이의 거리는 예를 들면, 0.5 mm 내지 10 mm이다.
공정 (A)에 있어서, 액체 배양배지의 제1 세포(11)는 그들 자신의 중량에 기인하여 중력 G의 방향으로 이동하여, 허니콤 멤브레인(2)에 부착한다. 공정 (A)는 허니콤 멤브레인(2)에 제1 세포(11)를 부착 배양하는 공정이다.
공정 (A)에서의 세포배양에 있어서의 조건은 일반적인 세포배양 조건일 수 있다. 예를 들면, 인큐베이터에서 37°C의 온도 및 5% (v/v)의 CO2 농도에서의 배양 (예를 들면, CO2 인큐베이터, 파나소닉사 제조)이 이용될 수 있다. 배양기간은 바람직하게는 허니콤 멤브레인(2)으로의 제1 세포(11)의 부착이 안정화될 때까지의 기간이다.
공정 (B)에 채용되는 상태에 있어서, 허니콤 멤브레인(2)은 중력 G의 방향으로 상부측에 위치되면서 배양용기(6)의 바닥부는 하부측에 위치된다. 공정 (B)에 있어서, 제1 세포(11)는 허니콤 멤브레인(2)의 하면에서 배양되고, 제2 세포(12)는 허니콤 멤브레인(2)의 상면에서 배양된다. 허니콤 멤브레인(2)의 하면에서 배양될 제1 세포(11)는 배양용기(6)의 내부 바닥면에 대향하는 측에 위치한 허니콤 멤브레인(2)의 면에서 배양한 제1 세포(11)이고, 그 세포들은 공정 (B)에서 계속 배양된다.
공정 (B)에서의 세포배양에 있어서의 조건은 일반적인 세포배양 조건일 수 있다. 예를 들면, 인큐베이터에서 37°C의 온도 및 5% (v/v)의 CO2 농도에서의 배양이 이용될 수 있다. 배양기간은 바람직하게는 허니콤 멤브레인(2)의 양면에서 세포가 포화(confluence)에 도달할 때까지의 기간이다. 세포가 포화에 도달하였음은 예를 들면, 광학현미경하에서의 관찰에 의하여 검출될 수 있다. 배양배지는 배양기간 동안 또 다른 배양배지로 교체할 수 있다.
공정 (A) 및 (B)를 포함하는 제조방법의 일례를 도 6을 참조로 하여 기재하기로 한다. 도 6에 도시된 예시 방법은 도 4b에 도시된 형상을 갖는 배양장치를 이용한 제조방법이다. 도 6에서의 표제 (1) 내지 (5)는 각각 하기 공정 (1) 내지 (5)에 대응한다. 도 6에서, 화살표 G는 중력의 방향을 표시한다. 공정 (1) 내지 (5)를 포함하는 예시 방법에 따르면, 공정 (A) 및 (B)를 포함하는 제조방법이 용이하게 실현될 수 있다. 공정 (1) 내지 (5)를 포함하는 예시 방법은 세포 적층체의 제조방법이며, 동시에 생체조직 모델 장치의 일례인 세포배양 인서트 타입 장치의 제조방법이다.
공정 (1): 배양용기(6)의 내부 바닥면에 제1 세포(11)를 함유하는 세포 현탁액을 제공하는 것.
공정 (1)에 있어서, 세포 현탁액은 배양용기(6)의 내측면과 접촉하지 않도록 내부 바닥면에 제공되는 것이 바람직하다. 이는 공정 (3)에서 배양용기(6)의 내측벽을 따라 세포 현탁액이 떨어지는 것을 방지하기 위해서이다. 배양용기(6)의 내측벽을 따라 세포 현탁액이 떨어지는 것을 방지하기 위한 또 다른 수단은 예를 들면, 허니콤 멤브레인(2)의 그의 주면에서의 사이즈를 배양용기(6)의 내측면과 전체 외주에 걸쳐서 접촉하는 사이즈로 세팅하는 것이다.
공정 (1)에 있어서, 배양용기(6)의 내부 바닥면에 제공된 세포 현탁액의 양은 바람직하게는 배양용기(6)의 내부 바닥면과 허니콤 멤브레인(2) 사이에 샌드위치된 공간의 부피와 동등한 양이다. 제1 세포(11) 의 파종밀도는 예를 들면, 허니콤 멤브레인(2)의 면적을 기준으로 1.0Х103 내지 1.0Х106 세포/cm2이다.
공정 (2): 허니콤 멤브레인(2)이 장착된 보지 부재(4)를 배양용기(6)에 배치하고, 허니콤 멤브레인(2)을 배양용기(6)의 내부 바닥면에 제공된 세포 현탁액과 접촉시키는 것.
공정 (2)의 수행 결과, 제1 세포(11)를 함유하는 세포 현탁액은 배양용기(6)의 내부 바닥면 및 허니콤 멤브레인(2)의 표면과 접촉하게 된다 (환언하면, 세포 현탁액은 배양용기(6)의 내부 바닥면과 허니콤 멤브레인(2)의 표면 사이에 샌드위치된다). 이하에서의 제조방법의 설명에 있어서, 허니콤 멤브레인(2)이 장착된 보지 부재(4)와 배양용기(6)가 일체화되어 있는 장치를 "배양장치"로서 호칭한다.
공정 (3): 허니콤 멤브레인(2)은 중력 G의 방향으로 하부측에 위치되면서 배양용기(6)의 바닥부는 상부측에 위치되는 상태에서, 배양용기(6)의 내부 바닥면과 허니콤 멤브레인(2) 사이에서 제1 세포(11)를 배양하는 것.
공정 (3)은 허니콤 멤브레인(2)이 장착된 보지 부재(4)가 여전히 배양용기(6)에 부착된 채로 배양장치를 거꾸로 뒤집은 다음, 배양장치를 인큐베이터에 정치시킴으로써 실현된다. 세포 현탁액에 함유된 제1 세포(11)는 그들 자신의 중량에 기인하여 중력 G의 방향으로 이동하여, 허니콤 멤브레인(2)에 부착한다.
공정 (4): 허니콤 멤브레인(2)은 중력 G의 방향으로 상부측에 위치되면서 배양용기(6)의 바닥부는 하부측에 위치되는 상태에서, 제2 세포(12)를 허니콤 멤브레인(2)의 상면에 접종하는 것.
공정 (4)는 배양장치를 인큐베이터에서 꺼내어 배양장치를 거꾸로 뒤집은 다음, 제2 세포(12)를 함유하는 세포 현탁액을 허니콤 멤브레인(2)에 접종함으로써 실현된다. 제2 세포(12)의 접종밀도는 예를 들면, 1.0Х103 내지 1.0Х106 세포/cm2이다. 액체 배양배지는 제2 세포(12)를 접종하기 전이나 후에 바람직하게는 제1 세포(11) 측에 첨가된다.
공정 (5): 중력 G의 방향으로 배양용기(6)의 바닥부는 하부측에 위치되고 허니콤 멤브레인(2)은 상부측에 위치되는 상태에서, 제1 세포(11)를 허니콤 멤브레인(2)의 하면에 배양하고 제2 세포(12)를 허니콤 멤브레인(2)의 상면에 배양하는 것.
공정 (5)는 공정 (4)에 후속하여, 배양장치를 인큐베이터에 정치시킴으로써 실현된다. 배양배지는 공정 (5)의 기간 동안 또 다른 배양배지로 교체할 수 있다. 제1 세포(11) 또는 제2 세포(12) 중 적어도 하나가 줄기세포인 경우, 목적하는 체세포로의 분화를 유도하는 분화유도인자를 배양배지에 첨가한다.
공정 (1) 내지 (5)를 통해서, 허니콤 멤브레인(2), 제1 세포(11)를 함유하고 허니콤 멤브레인(2)의 일면에 배치되는 세포층, 및 제2 세포(12)를 함유하고 허니콤 멤브레인(2)의 타면에 배치되는 세포층을 포함하는 세포 적층체가 수득된다.
본 개시에 따른 제조방법에 사용하기 위한 세포가 이하에서 설명된다.
본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 제1 세포 및 제2 세포는 상이한 타입의 세포이고, 세포 타입의 조합은 본 개시에 따른 세포 적층체에 의하여 모방하고자 하는 생체조직에 따라 선택된다. 제1 세포 및 제2 세포의 두 타입의 세포는 예를 들면, 실질세포 (예를 들면, 간 실질세포 또는 췌장 실질세포), 간질세포 (예를 들면, 주피세포), 근세포 (예를 들면, 평활근세포, 심근세포, 또는 골격근세포), 섬유아세포, 신경세포, 교세포, 내피세포 (예를 들면, 혈관내피세포 또는 림프내피세포) 및 상피세포 (예를 들면, 폐포상피세포, 구강상피세포, 담관상피세포, 장상피세포, 췌관상피세포, 신장상피세포, 신세뇨관상피세포 또는 태반상피세포), 및 임의의 이들 세포로 분화할 수 있는 세포 (예를 들면, 전구세포, 간엽줄기세포 또는 다능성 줄기세포)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 두 타입의 세포이다.
제1 세포 또는 제2 세포로 사용될 수 있는 다능성 줄기세포의 예는 배아 줄기 (ES) 세포, 유도 만능 줄기 (iPS) 세포, 배아 생식 (EG) 세포, 배아 암종 (EC) 세포, 성체 다능성 전구 (MAP) 세포, 성체 다능성 줄기 (APS) 세포, 및 다중 계통 분화 스트레스 내성 (Muse) 세포를 포함한다. 본 개시에 따른 제조방법의 공정 (B)에 있어서, 목적하는 체세포로의 분화를 유도하는 분화유도인자가 배양배지에 첨가되며, 그리하여 다능성 줄기세포가 체세포로 분화된다.
본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 제1 세포 및 제2 세포와는 상이한 타입의 세포 ("제3 세포"로도 호칭되며, 하나의 타입 또는 복수 타입일 수 있다)가 제1 세포 또는 제2 세포 중 적어도 하나와 공-배양될 수 있다. 공-배양의 결과, 제1 또는 제2 세포뿐만 아니라 제3 세포를 함유하는 세포층이 허니콤 멤브레인의 일면 또는 양면에 형성된다. 예시적인 조합에 있어서, 제1 세포는 실질세포이고, 제2 세포는 간질세포이며, 제3 세포는 신경세포이다.
본 개시에 따른 제조방법에 있어서, 모방하고자 하는 생체 내의 조직에 따라 제1 세포와 제2 세포의 조합이 선택될 수 있고, 필요에 따라 제3 세포가 선택되며, 이로써 생체 내의 조직을 모방하는 조직 모델이 수득된다. 본 개시에 따른 제조방법의 일례에서, 제1 세포는 평활근세포 또는 평활근세포로 분화하는 세포이고, 제2 세포는 혈관내피세포 또는 혈관내피세포로 분화하는 세포이다. 본 개시에 따른 제조방법의 또 다른 예에서, 제1 세포는 간엽줄기세포이고, 제2 세포는 혈관내피세포 또는 혈관내피세포로 분화하는 세포이다. 본 개시에 따른 제조방법은 혈관내피세포층이 허니콤 멤브레인의 일면에 배치되고, 평활근세포층 또는 간엽 줄기세포층이 허니콤 멤브레인의 타면에 배치되는 세포 적층체를 제공, 즉 혈관벽 모델을 제공한다.
병태 재현의 목적으로, 유전자 변이가 있는 세포 또는 환자로부터의 세포가 제1 세포 또는 제2 세포 중 적어도 하나로서 사용될 수 있다.
세포 현탁액의 조제 또는 세포 배양에 사용될 액체 배양배지는 대상이 되는 세포의 타입에 따라 선택된다. 특정 배양배지의 예는 포유동물 세포용 기본 배지에 세포성장인자를 첨가하여 세포 타입에 최적화한 배양배지, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 둘베코 변형 이글 배지: 영양소 혼합물 F-12 (DMEM: F-12), 이글 최소 필수 배지 (EMEM), 최소 필수 배지 알파 (MEMα), 또는 기본 배지 이글 (BME)을 포함한다. 이들 배양배지는 시판된다. 액체 배양배지는 공-배양하고자 하는 세포 타입에 따라 두 종 이상의 배양배지를 혼합하여 수득한 배양배지일 수 있다. 액체 배양배지의 pH는 예를 들면, 7.0 내지 8.0이다. 액체 배양배지는 바람직하게는 세포로 하여금 그들 자신의 중량에 기인하여 중력의 방향으로 이동하게 하는 비중 및 점도를 갖는다.
실시예
본 개시의 실시양태를 실시예를 참조로 하여 이하에서 설명한다. 그러나, 본 개시의 실시양태는 이들 실시예에 의하여 한정되지 않는다.
하기의 설명에서, 물질의 농도에 관련하여 사용되는 "M"은 몰 농도를 의미하며, 1 M은 1 mol/L에 해당한다.
하기 실시예에서 사용되고 약어로 표시되는 화학물질의 아이덴티티는 다음과 같다.
EGM: 내피세포 성장배지
FITC: 플루오레세인 이소티오시아네이트
HBSS: 행크 밸런스 염 용액
HCM: 허니콤 멤브레인
HUASMC: 인간 제대동맥 평활근세포
HUVEC: 인간 제대정맥 내피세포
PBS: 인산 완충 생리식염수
TEM: 트랙-에칭 멤브레인
실시예 1
[재료]
· 24-웰 플레이트: 현탁배양 품질 (#662-102, 그라이너)
· TEM 인서트: 24-웰 행잉(hanging) 인서트, 트랙-에칭 멤브레인 (포어 사이즈: 5.7 μm, 두께: 10.6 μm, 및 개구율: 12.4%, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 도 7) (#MCMP24H48, 밀리포어)
· HCM 인서트: 24-웰 행잉 인서트, 허니콤 멤브레인 (포어 사이즈: 5.0 μm, 두께: 2.2 μm, 및 개구율: 55%, 폴리부타디엔, 도 7)
· 코팅 단백질: 피브로넥틴 (#33016-015, 인비트로젠)
[세포]
· 혈관내피세포: HUVEC (#C2517AS, 론자)
· 평활근세포: HUASMC (#C-12500, 프로모셀)
[세포 배양배지 및 박리 시약]
· HUVEC용 EGM-2 (#CC-3162, 론자)
· HUASMC용 평활근세포 성장배지 2 키트 (#C-22162, 프로모셀)
· 아큐타제 (AT104-500, 이노베이티브 셀 테크놀로지스)
[HCM의 멸균]
(1) 70% (v/v) 에탄올을 하나의 24-웰 플레이트의 웰 중으로 500 μl/웰의 양으로 첨가하고, PBS를 두 개의 다른 24-웰 플레이트의 웰 중으로 500 μl/웰의 양으로 첨가하였다. 이와는 별도로, 70% (v/v)를 첨가한 컵을 준비하였다.
(2) HCM 인서트를 컵 중의 에탄올에 침지시킨 다음, HCM 인서트를 그들의 HCM이 에탄올에 침지되도록 에탄올을 함유하는 웰에 넣고, HCM 인서트를 5분간 정치시켰다.
(3) HCM 인서트를 에탄올에서 꺼내고, 흡인기를 사용하여 각각의 HCM 인서트의 내측으로부터 에탄올을 제거하였다. HCM 인서트를 즉시 PBS를 함유하는 웰로 이송하여 그들의 HCM이 PBS에 침지되도록 두었다. 여기에 1 ml의 PBS를 첨가하였다.
(4) HCM 인서트를 PBS에서 꺼내고, 흡인기를 사용하여 각각의 HCM 인서트의 내측으로부터 PBS를 제거하였다. HCM 인서트를 즉시 PBS를 함유하는 웰로 이송하여 그들의 HCM이 PBS에 침지되도록 두었다. 여기에 1 ml의 PBS를 첨가하였다.
(5) PBS에 침지되는 HCM 인서트를 진공 건조기에 넣었고, 그리하여 HCM을 탈기시켰다.
(6) HCM 인서트를 현미경하에서 관찰하여 HCM 인서트에 파손, 부착물 및 HCM 주름이 없음을 확인하였다.
[HCM의 피브로넥틴 코팅]
(1) 피브로넥틴을 PBS에 용해시켜 30 μg/ml 피브로넥틴 용액을 조제하였다.
(2) 70 μl의 피브로넥틴 용액을 24-웰 플레이트의 웰의 중심부에 스포팅하였다.
(3) HCM 인서트를 PBS에서 꺼내어, 흡인기를 사용하여 각각의 HCM 인서트의 내측으로부터 PBS를 제거하고, HCM 인서트를 즉시 웰의 피브로넥틴 용액 스폿에 올려 놓아 그들의 HCM을 피브로넥틴 용액에 침지시켰다.
(4) 100 μl의 피브로넥틴 용액을 각각의 HCM 인서트의 내측에 첨가하여, 실온에서 1시간 동안 정치시켰다 (또는 4°C에서 밤새 정치시켰다).
[HCM 인서트를 이용한 세포배양]
(1) HUASMC의 세포 현탁액 80 μl를 24-웰 플레이트의 웰의 중심부에 돔 형상으로 놓았다.
(2) 코팅된 HCM 인서트를 각각 HUASMC의 세포 현탁액 위에 놓았으며, 그리하여 세포 현탁액이 웰의 바닥면과 HCM 사이에 샌드위치된다.
(3) 세포 현탁액을 웰의 바닥면과 HCM 사이에 샌드위치시킨 상태에서 플레이트와 HCM 인서트를 거꾸로 뒤집었다. 거꾸로 뒤집은 상태의 플레이트와 HCM 인서트를 인큐베이터에 넣고 (37°C, 5% (v/v) CO2), 16시간 동안 배양을 수행하였다.
(4) 1200 μl의 평활근세포 성장배지 2 키트를 각각의 HCM 인서트의 외측에 첨가하였다. 플레이트와 HCM 인서트를 인큐베이터에서 꺼내어, 플레이트와 HCM 인서트의 배향을 초기 배향으로 복귀시키고, HCM 인서트를 배양배지를 함유한 웰로 이송하였다. 그 후에, HUVEC의 세포 현탁액 300 μl를 각각의 HCM 인서트의 내측에 접종하였다.
(5) 플레이트와 HCM 인서트를 인큐베이터에 넣고 (37°C, 5% (v/v) CO2), 80시간 동안 배양하였다.
각 타입의 세포에 대한 접종 조건은 다음과 같았다.
HUASMC: 배양면적은 0.785 cm2이고, 접종밀도는 1.0Х104 세포/cm2이며, 세포 현탁액의 부피는 80 μl였다.
HUVEC: 배양면적은 0.32 cm2이고, 접종밀도는 5.0Х104 세포/cm2이며, 세포 현탁액의 부피는 300 μl였다.
상기 배양의 결과로, 혈관내피세포층이 필터의 상면에 제공되고, 평활근세포층이 필터의 하면에 제공된 HCM 인서트 (또한 "VEC/SMC-HCM 인서트"로도 호칭)가 수득되었다. CD31에 대하여 면역형광 염색한 상면의 세포층, 및 α-평활근 액틴에 대하여 면역형광 염색한 하면의 세포층을 도 8에 나타내었다.
상기 절차와 유사한 방식으로, 혈관내피세포층이 필터의 상면에 제공되고 세포층이 필터의 하면에는 제공되지 않은 HCM 인서트 (또한 "VEC-HCM 인서트"로도 호칭), 및 평활근세포층이 필터의 하면에 제공되고 세포층이 필터의 상면에는 제공되지 않은 HCM 인서트 (또한 "SMC-HCM 인서트"로도 호칭)가 조제되었다.
[TEM 인서트를 이용한 세포배양]
TEM 인서트를 거꾸로 뒤집어 놓아둔 상태에서, HUASMC를 그들의 필터에 접종하고, TEM 인서트를 인큐베이터에 넣고 (37°C, 5% (v/v) CO2), 16시간 동안 배양을 수행하였다. 이어서, TEM 인서트를 24-웰 플레이트의 웰에 넣고, HUVEC를 각각의 TEM 인서트의 내측에 접종하고, 1200 μl의 평활근세포 성장배지 2 키트를 각각의 TEM 인서트의 외측에 첨가하였다. 이어서, TEM 인서트를 인큐베이터에 넣고 (37°C, 5% (v/v) CO2), 80시간 동안 배양을 수행하였다.
TEM 인서트에 세포를 접종하기 위한 조건은 HCM 인서트에로의 세포 접종조건과 동일하였다.
상기 배양의 결과로, 혈관내피세포층이 필터의 상면에 제공되고 평활근세포층이 필터의 하면에 제공된 TEM 인서트 (또한 "VEC/SMC-TEM 인서트"로도 호칭)가 수득되었다.
상기 절차와 유사한 방식으로, 혈관내피세포층이 필터의 상면에 제공되고 세포층이 필터의 하면에는 제공되지 않은 TEM 인서트 (또한 "VEC-TEM 인서트"로도 호칭), 및 평활근세포층이 필터의 하면에 제공되고 세포층이 필터의 상면에는 제공되지 않은 TEM 인서트 (또한 "SMC-TEM 인서트"로도 호칭)가 조제되었다.
[투과성 검정]
(1) 2 mg의 FITC-덱스트란 70 (70kDa, 시그마)을 8 ml의 HBSS(+) (084-08965, 와코)에 용해시켜 250 μg/ml FITC-덱스트란 70 용액을 제조하였다. FITC-덱스트란 70 용액을 차광조건하에 보관하였다.
(2) 900 μl/웰의 HBSS(+)를 24-웰 플레이트의 제1 내지 제3 칼럼의 각각의 웰에 첨가하였다.
(3) 세포 적층체를 갖는 인서트를 배양배지에서 꺼내어, 흡인기를 사용하여 각각의 인서트의 내측으로부터 배양배지를 제거하였다. 인서트를 제1 칼럼의 웰에 넣었다.
(4) 200 μl의 FITC-덱스트란 70 용액을 제1 칼럼의 웰에 있는 각각의 인서트의 내측에 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 인큐베이트하였다.
(5) 인서트를 제2 칼럼의 웰로 이송하고, 37°C 에서 10분 동안 인큐베이트하였다.
(6) 인서트를 제3 칼럼의 웰로 이송하고, 플레이트를 알루미늄 시트로 덮어 차광하였다.
(7) 제1 및 제2 칼럼의 웰에서의 샘플액 각각을 피펫을 사용하여 혼합하고, 100 μl의 샘플액을 각각의 웰로부터 샘플링하여 96-웰 블랙 플레이트로 이송하였다. 96-웰 블랙 플레이트를 알루미늄 시트로 덮어 차광하였다.
(8) 각각의 샘플액에서의 FITC의 형광강도를 플레이트 리더 (ENSPIRE, 퍼킨 엘머)를 사용하여 여기파장 (Ex): 485 nm, 방출파장 (Em): 530 nm 및 섬광횟수: 60회로 하여 측정하였다.
제1 칼럼의 웰에서의 샘플액에서의 FITC의 상대 형광 강도 (즉, FITC-덱스트란 70 용액의 첨가로부터 10분 안에 누출된 FITC-덱스트란 70의 상대량)를 도 9에 나타내었다. 도 9에서의 그래프는 필터의 어느 한 면에 세포층이 없는 인서트에서의 형광강도를 표준으로 취한 상대 형광 강도를 보여준다.
TEM 인서트의 경우에, VEC-TEM 인서트는 3.0±0.5% (n=5)의 상대 강도를 보였고, SMC-TEM 인서트는 8.2±2.9% (n=5)의 상대 강도를 보였고, VEC/SMC-TEM 인서트는 0.4±0.2% (n=5)의 상대 강도를 보였다. 평활근세포층은 일반적으로 매우 타이트한 세포간 결합을 갖지 않음에도 불구하고, SMC-TEM 인서트의 상대 형광 강도는 상기 언급된 값이었다. 따라서, 당해 결과는 추측하건대 TEM 자체가 TEM 인서트에서 FITC-덱스트란 70에 대하여 배리어 기능을 수행한다는 것을 표시한다.
HCM 인서트의 경우에, VEC-HCM 인서트는 19.3±10.2% (n=5)의 상대 강도를 보였고, SMC-HCM 인서트는 67.4±6.1% (n=5)의 상대 강도를 보였고, VEC/SMC-HCM 인서트는 0.4±0.3% (n=5)의 상대 강도를 보였다. FITC-덱스트란 70에 대한 배리어 기능은 HCM의 일면에 혈관내피세포층을 형성하고, HCM의 타면에 평활근세포층을 형성함으로써 획득되었다.
[히스타민에 의한 투과성 검정]
(1) 2 mg의 FITC-덱스트란 70 (70kDa, 시그마)을 8 ml의 HBSS(+) (084-08965, 와코)에 용해시켜 250 μg/ml FITC-덱스트란 70 용액을 조제하였다. FITC-덱스트란 70 용액을 차광조건하에 저장하였다. 히스타민을 HBSS(+)에 용해시켜 히스타민 용액을 조제하였다.
(2) 900 μl/웰의 HBSS(+)를 24-웰 플레이트의 제1 내지 제3 칼럼의 각각의 웰에 첨가하였다.
(3) 세포 적층체를 갖는 인서트를 배양배지에서 꺼내어, 흡인기를 사용하여 각각의 인서트의 내측으로부터 배양배지를 제거하였다. 인서트를 제1 칼럼의 웰에 넣었다.
(4) 히스타민 용액을 10 μM 또는 100 μM의 최종농도로 웰에 첨가하고, 120분 동안 인큐베이트하였다.
(5) 200 μl의 FITC-덱스트란 70 용액을 제1 칼럼의 웰에 있는 각각의 인서트의 내측에 첨가하고, 37°C에서 10분 동안 인큐베이트하였다.
(6) 인서트를 제2 칼럼의 웰로 이송하고, 37°C 에서 10분 동안 인큐베이트하였다.
(7) 인서트를 제3 칼럼의 웰로 이송하고, 플레이트를 알루미늄 시트로 덮어 차광하였다.
(8) 제1 및 제2 칼럼의 웰에서의 샘플액 각각을 피펫을 사용하여 혼합하고, 100 μl의 샘플액을 각각의 웰로부터 샘플링하여 96-웰 블랙 플레이트로 이송하였다. 96-웰 블랙 플레이트를 알루미늄 시트로 덮어 차광하였다.
(9) 각각의 샘플액에서의 FITC의 형광강도를 플레이트 리더 (ENSPIRE, 퍼킨 엘머)를 사용하여 여기파장 (Ex): 485 nm, 및 방출파장 (Em): 530 nm로 하여 측정하였다.
제1 칼럼의 웰에서의 샘플액에서의 FITC의 상대 형광 강도 (즉, FITC-덱스트란 70 용액의 첨가로부터 10분 안에 누출된 FITC-덱스트란 70의 상대량)를 도 10에 나타내었다. 도 10에서의 그래프는 필터의 어느 한 면에 세포층이 없는 인서트에서의 형광강도를 표준으로 취한 상대 형광 강도를 보여준다.
히스타민은 혈관내피세포의 물질 투과성을 증진시키는 활성을 갖는다. VEC/SMC-HCM 인서트는 히스타민의 농도에 의존하는 FITC-덱스트란 70 투과성의 증가를 보였다. 또한, 결과는 VEC/SMC-HCM 인서트가 생체 내의 혈관벽과 유사한 기능을 갖는다는 것을 증명해 보여주었다. 또한, 결과는 피검물질에 의하여 발휘되는 혈관벽에 미치는 영향을 VEC/SMC-HCM 인서트를 사용하여 높은 감도로 평가할 수 있다는 것을 증명해 보여주었다.
실시예 2
[재료]
· 24-웰 플레이트: 현탁배양 품질 (#662-102, 그라이너)
· HCM 인서트: 허니콤 구조를 갖는 다공성 막이 필터부에 제공되는 24-웰 행잉 인서트 (다공성 막은 포어 사이즈: 3.0 μm, 두께: 1.2 μm, 및 개구율: 55%를 가지며, 행잉 인서트는 폴리카보네이트 재질임).
· HCM용 코팅 물질: 래트 꼬리부터의 콜라겐 I (#354236, 코닝)
[세포]
· 혈관내피세포: 래트 혈관내피세포 (#cAP-r0001, 앤지오 프로테오미)
· 평활근세포: 래트 평활근세포 (#R-ASM-580, 론자)
[액체 배양배지 및 세포 박리 시약]
· 래트 혈관 내피세포용 래트 내피세포 성장배지 (#cAP-03, cAP-04, 앤지오 프로테오미)
· DEMEM: 래트 평활근세포용 F-12 (1:1) 배양배지 (#BE04-687Q, 론자)
· 아큐타제 (AT104-500, 이노베이티브 셀 테크놀로지스)
[HCM의 멸균]
HCM의 멸균은 실시예 1에서의 것과 동일한 방법으로 수행하였다.
[HCM의 콜라겐 코팅]
(1) 콜라겐 I을 0.2 N 아세트산 용액에 용해시켜 50 μg/ml 콜라겐 I 용액을 조제하였다.
(2) 70 μl의 콜라겐 I 용액을 24-웰 플레이트의 웰의 중심부에 스포팅하였다.
(3) HCM 인서트를 PBS에서 꺼내어, 흡인기를 사용하여 각각의 HCM 인서트의 내측으로부터 PBS를 제거하고, HCM 인서트를 즉시 웰의 콜라겐 I 용액 스폿에 올려 놓아 그들의 HCM을 콜라겐 I 용액에 침지시켰다.
(4) 100 μl의 콜라겐 I 용액을 각각의 HCM 인서트의 내측에 첨가하여, 실온에서 4시간 동안 정치시켰다 (또는 4°C에서 밤새 정치시켰다).
(5) 500 μl의 PBS를 첨가하여 HCM을 중화시켰다.
[HCM 인서트를 이용한 세포배양 (세포 적층체의 조제)]
(1) 래트 평활근세포의 세포 현탁액 80 μl를 24-웰 플레이트의 웰의 중심부에 돔 형상으로 놓았다.
(2) 코팅된 HCM 인서트를 각각 래트 평활근세포의 세포 현탁액 위에 놓았으며, 그리하여 세포 현탁액이 웰의 바닥면과 HCM 사이에 샌드위치된다.
(3) 세포 현탁액을 웰의 바닥면과 HCM 사이에 샌드위치시킨 상태에서 플레이트와 HCM 인서트를 거꾸로 뒤집었다. 거꾸로 뒤집은 상태의 플레이트와 HCM 인서트를 인큐베이터에 넣고 (37°C, 5% (v/v) CO2), 16시간 동안 배양하였다.
(4) 1200 μl의 래트 내피세포 성장배지를 각각의 HCM 인서트의 외측에 첨가하였다. 플레이트와 HCM 인서트를 인큐베이터에서 꺼내어, 플레이트와 HCM 인서트의 배향을 초기 배향으로 복귀시키고, HCM 인서트를 배양배지를 함유한 웰로 이송하였다. 그 후에, 래트 혈관내피세포의 세포 현탁액 300 μl를 각각의 HCM 인서트의 내측에 접종하였다.
(5) 플레이트와 HCM 인서트를 인큐베이터에 넣고 (37°C, 5% (v/v) CO2), 80시간 동안 배양하였다.
각 타입의 세포에 대한 접종 조건은 다음과 같았다.
래트 평활근세포: 배양면적은 0.785 cm2이고, 접종밀도는 1.0Х104 세포/cm2이며, 세포 현탁액의 부피는 80 μl였다.
래트 혈관내피세포: 배양면적은 0.32 cm2이고, 접종밀도는 5.0Х104 세포/cm2이며, 세포 현탁액의 부피는 300 μl였다.
상기 배양의 결과로, 혈관내피세포층이 필터의 상면에 제공되고, 평활근세포층이 필터의 하면에 제공된 HCM 인서트 (또한 "VEC/SMC-HCM 인서트"로도 호칭)가 수득되었다. VE-캐드헤린에 대하여 면역형광 염색한 상면의 세포층, 및 캘포닌에 대하여 면역형광 염색한 하면의 세포층을 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 융합성(confluent) 세포층의 형성 및 혈관 내피 캐드헤린의 국소화가 명확하게 관찰되었다. 혈관 내피 캐드헤린의 국소화는 혈관내피세포들간의 강력한 접착력 (세포간 결합의 형성)을 나타내며, 실제 혈관에 특징적인 특징이다. 따라서, HCM의 일측에 혈관내피세포층을 형성하고 HCM의 타측에 평활근세포층을 형성함으로써 생체조직과 유사한 구조를 갖는 세포 적층체가 조제되었다.
[생리활성물질에 대한 반응의 평가]
(1) 0.1 mg (100 단위)의 트롬빈 (#T7009-100UN, 시그마)을 100 μl의 생리식염수에 용해시켜 트롬빈 용액을 1000 U/mL의 농도로 조제하였다. 트롬빈 용액을 HBSS(+)로 희석하여 25 U/mL 트롬빈 용액 및 100 U/mL 트롬빈 용액을 조제하였다.
(2) 900 μl의 HBSS(+)를 24-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다.
(3) 세포 적층체가 제공된 인서트를 배양배지에서 꺼내어, 흡인기를 사용하여 각각의 인서트의 내측으로부터 배양배지를 제거하고, 인서트를 웰에 배치하였다.
(4) HBSS(+) (대조군), 25 U/mL 트롬빈 용액, 또는 100 U/mL 트롬빈 용액을 200 μL의 양으로, 웰에 배치한 인서트의 각각의 내측에 첨가하고, 인서트를 37°C에서 30분 동안 인큐베이트하였다.
(5) 세포 적층체를 현미경하에서 관찰하였다. 세포 적층체의 현미경사진을 도 12에 나타내었으며, 이는 VE-캐드헤린으로부터의 적색 형광과 α-평활근 액틴으로부터의 녹색 형광의 중첩 이미지이다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 트롬빈의 첨가에 의하여 초래된 액틴 스트레스 섬유의 활성화에 기인한 세포 수축이 관찰되었다. 도 12의 상부측에서 화살표로 표시한 방향으로 세포 수축이 발생한 것으로 관찰되었다. 보다 높은 트롬빈 농도는 보다 강한 세포 수축을 초래하였다. 따라서 HCM의 일측에 혈관내피세포층 및 HCM의 타측에 평활근세포층을 갖는 세포 적층체는 생체조직에서 보이는 것과 유사한 방식으로 생리활성물질에 반응한다는 것이 확인되었다.
2017년 6월 9일 출원한 미국특허출원 제15/618,150호의 개시내용이 전부 참조로 본원에 원용된다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 및 기술 규격은, 각각의 개별 간행물, 특허 출원, 또는 기술 규격이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 원용되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 원용된다.
Claims (17)
- 액체 조성물이 저장되는 제1 액체 구획;
액체 조성물이 저장되는 제2 액체 구획; 및
제1 및 제2 액체 구획 사이의 분배구획으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 세포 적층체를 포함하고,
세포 적층체는, 허니콤 구조를 갖는 다공성 막, 제1 타입의 세포를 함유하고 다공성 막의 일면에 배치되는 세포층, 및 제1 타입과는 상이한 제2 타입의 세포를 함유하고 다공성 막의 타면에 배치되는 세포층을 포함하는 생체조직 모델 장치로서,
다공성 막에서의 관통홀의 개구의 평균 직경은 1 μｍ 내지 20 μｍ이고, 다공성 막의 개구율은 55％ 내지 70％이고,
다공성 막에서의 인접하는 관통홀은 연통홀에 의해 서로 연통되어 있고,
상기 생체조직 모델은 혈관벽 모델이고,
상기 제1 타입의 세포는 혈관내피세포이고, 상기 제2 타입의 세포는 평활근세포 또는 간엽 줄기세포인, 생체조직 모델 장치. - 제1항에 있어서, 다공성 막의 재료는, 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리(세바스산글리세롤), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아민, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리실록산 유도체 및 트리아세틸셀룰로스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 생체조직 모델 장치.
- 제1항에 있어서, 다공성 막의 각 표면은, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 퍼레칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 재조합 펩타이드 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나에 의하여 피복되는 생체조직 모델 장치.
- 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 피검물질을 첨가하는 것; 및
(i) 제1 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제1 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하거나, 또는 (ii) 제2 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제2 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하는 적어도 하나의 공정을 포함하는, 제1항에 기재된 생체조직 모델 장치를 사용하는 피검물질의 평가방법. - 제4항에 있어서, 공정 (i)은, 제1 액체 구획에 함유된 miRNA, 제1 액체 구획에 함유된 단백질 또는 제1 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하고, 공정 (ii)는, 제2 액체 구획에 함유된 miRNA, 제2 액체 구획에 함유된 단백질 또는 제2 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하는 피검물질의 평가방법.
- 제4항에 있어서, 피검물질이 첨가된 액체 구획에 트레이서를 첨가하는 것을 추가로 포함하고, 트레이서가 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 트레이서의 양을 측정하는 것이 공정 (i) 또는 (ii)를 구성하는 피검물질의 평가방법.
- 허니콤 구조를 갖는 다공성 막;
다공성 막의 일방의 면에 배치된 혈관내피세포층; 및
다공성 막의 타방의 면에 배치된 평활근세포층 혹은 간엽계 줄기세포층을 포함하고,
다공성 막에서의 관통홀의 개구의 평균 직경은 1 μｍ 내지 20 μｍ이고, 다공성 막의 개구율은 55％ 내지 70％이고,
다공성 막에서의 인접하는 관통홀은 연통공에 의해 서로 연통되어 있는, 혈관벽 모델. - 제7항에 있어서, 혈관벽 모델에서의 혈관내피세포층 측으로부터 평활근세포층 측 또는 간엽계 줄기세포층 측으로의 FITC-덱스트란 70 투과성이, 다공성 막의 일방의 면으로부터 다공성 막의 타방의 면으로의 FITC-덱스트란 70 투과성의 0 ％ 내지 10 ％인 혈관벽 모델.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 다공성 막의 재료는, 폴리부타디엔, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리우레탄, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리글리콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 폴리(세바스산글리세롤), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아민, 폴리에틸렌 나프탈레이트, 폴리에틸렌 석시네이트, 폴리부틸렌 석시네이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리이미드, 폴리실록산 유도체 및 트리아세틸셀룰로스로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 혈관벽 모델.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 다공성 막의 각 표면은, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 펠리칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스, 재조합 펩타이드 및 폴리라이신으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나에 의하여 피복되는 혈관벽 모델.
- 액체 조성물이 저장되는 제1 액체 구획; 액체 조성물이 저장되는 제2 액체 구획; 및 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이의 격벽으로서, 제1 액체 구획과 제2 액체 구획 사이에 배치되는 제7항 또는 제8항에 기재된 혈관벽 모델을 포함하는 혈관벽 모델 장치.
- 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 피검물질을 첨가하는 것; 및
(i) 제1 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제1 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하거나, 또는 (ii) 제2 액체 구획에 함유된 화학물질 또는 제2 액체 구획에 함유된 세포 중 적어도 하나를 정량하는 적어도 하나의 공정을 포함하는 제11항에 기재된 혈관벽 모델 장치를 사용한 피검물질의 평가방법. - 제12항에 있어서, 공정 (i)은, 제1 액체 구획에 함유된 miRNA, 제1 액체 구획에 함유된 단백질, 또는 제1 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하고, 공정 (ii)는, 제2 액체 구획에 함유된 miRNA, 제2 액체 구획에 함유된 단백질, 또는 제2 액체 구획에 함유된 전사인자 중 적어도 하나를 정량하는 것을 포함하는 피검물질의 평가방법.
- 제12항에 있어서, 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 하나는, 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 혈액을 모방하고 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하는 액체 조성물이 저장되는 액체 구획이고, 제1 액체 구획 또는 제2 액체 구획 중 적어도 하나에 피검물질을 첨가하는 것은, 혈액, 적혈구를 함유하는 액체 조성물 또는 혈액을 모방하고 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나를 함유하는 액체 조성물이 저장되는 액체 구획에 피검물질을 첨가하는 것을 포함하며, 피검물질이 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 적혈구의 양, 피검물질이 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구 획으로 누출된 헤모글로빈의 양 또는 피검물질이 첨가된 액체 구획으로부터 타 액체 구획으로 누출된 덱스트란, 에반스 블루, 플루오레세인 나트륨 염 및 FITC-마이크로비드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 양 중 적어도 하나를 측정하는 것이 공정 (i) 또는 (ii)를 구성하는 피검물질의 평가방법.
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