KR20170003177A - 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법 - Google Patents

다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 마이크로 플레이트 및 이의 제조방법에 의하여 제조된 마이크로 플레이트는 인체의 환경과 유사한 환경 및 구조에서 3차원 세포 또는 세포 집합체 배양을 가능하게 한다. 또한 산소와 이산화탄소 등의 가스를 인체와 유사한 조건으로 공급함과 동시에, 적절한 농도를 구배하여 세포 또는 세포 집합체가 배양되는 공간에 공급함으로써, 보다 이상적인 환경에서 3차원 세포 또는 세포 집합체 배양하는 것이 가능하게 된다.

Description

다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법{Polygons microplate, preparation mehthod thereof and culture method of cell aggregation using the same}
본 발명은 다각형 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법에 관한 것이다.
인체 내에 있는 세포들은 주변에 있는 세포 및 세포 외 기질과의 상호작용을 통해 3차원 모양으로 집합체를 형성하고 있다. 이러한 3차원 모양은 생화학적으로, 기계적으로 세포 생리에 매우 중요한 역할을 담당하고 있다. 특히 3차원 모양으로 형성된 세포의 집합체(cell aggregation)는 일반적인 조직을 구성하는 세포나 장기를 이루는 세포, 암세포 및 줄기세포에 대한 연구에서 임상적으로 신약개발을 위해서 또는 줄기세포를 이용한 분화에 대한 연구에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있다.
그러나 일반적으로 세포를 3차원 모양으로 배양하는 것은 매우 어렵고, 특히 human primary cell을 3차원적으로 배양한다는 것은 더욱 어렵다는 문제점이 있다. 이러한 문제로 인해 일반적으로는 2차원(2D)적으로 배양하여 약물 스크리닝이나 각종 실험에 사용하고 있다. 그러나 2차원적 배양을 할 경우 실제 생체 내에서와는 매우 다른 환경에 처해지기 때문에, 실험에 쓰일 세포가 가지고 있는 세포 자체의 특성이나 세포의 조직 특이성을 잃어버리고, 결과적으로는 원하는 실험 결과를 제대로 얻기가 매우 어렵다는 문제점이 있다.
그러므로 in vitro 상에서 세포를 3차원(3D) 모양으로 배양하는 것이 매우 중요하고 이에 대한 많은 연구들이 현재 진행 중에 있다. 이러한 3차원 배양방법으로 haning-drop culture, nonadhesive surface, spinner flask, fotary system 등이 있으나, 이들은 인체의 환경과 유사한 3차원적 환경을 구현하는데 기술적인 한계가 있다. 그러므로 좀더 인체와 비슷한 구조의 3차원적 세포배양 환경을 구성할 수 있는 기술 개발이 필요한 실정이다.
또한 3차원 세포배양 방법에서 산소와 이산화탄소의 조절은 매우 중요하다. 이러한 3차원 세포배양에서 산소와 이산화탄소 조절의 중요성에 대해 보다 구체적으로 살펴보면, 인체내의 조직은 모세혈관이 조직의 내부에 그물처럼 분포되어 있으며 이를 통하여 산소 및 영향 분을 공급받고 노폐물을 수거하는 교환시스템을 기반으로 구성되어 있기 때문에, 인체를 구성하는 기본단위인 세포는 위와 같은 3차원적 환경에서 최적화 될 수 있다. 일반적인 체외 동물세포 배양의 경우는 이산화탄소 농도를 5 % 이하로 조절하는 환경에서 배양을 주로 하고 있으나 줄기세포의 경우는 산소의 농도 조절을 통해서 세포를 배양하는 하이폭시아(hypoxia) 배양환경을 필요로 한다. 따라서 인체와 유사한 최적의 3차원 세포배양 환경을 조성하기 위해서는 세포의 영양분을 고르게 전달할 수 있는 시스템은 기본이며, 산소와 이산화탄소의 농도를 조절할 수 있는 새로운 구조와 환경이 수반되어야만 최적의 3차원 세포배양환경을 구축할 수 있다. 따라서 3차원 세포 및 조직 배양에 필요한 산소와 영양분을 오로지 외부 환경으로부터 확산을 통해서만 공급되는 구조가 필요로 하며, 이러한 구조를 바탕으로 산소분포를 측정하고 시뮬레이션 할 수 있는 시스템이 절실히 필요한 상황이다. 하지만 기존의 하이폭시아 전용 인큐베이터는 굉장히 고가이기 때문에 관련 목적의 시스템을 구축하기 위해서는 많은 비용이 소요되는 문제점이 있다.
본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는 표면장력을 이용한 반구형 마이크로웰의 제조 및 이를 이용한 세포 집합체의 형성에 관한 대한민국 공개특허 제10-2013-0013537호(특허문헌 1)가 개시되어 있다.
특허문헌 1. 대한민국 공개특허 제10-2013-0013537호
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 세포 집합체가 보다 좋은 상태로 3차원적인 세포 집합체를 형성할 수 있게 하는 마이크로 플레이트 및 이의 제조방법을 제공하는 것이 목적이다. 특히 산소나 이산화탄소와 같은 가스를 세포 또는 세포 집합체가 배양되는 공간에 인체와 유사한 조건으로 공급함과 동시에, 농도를 적절하게 구배하면서 공급하는 것이 가능한 마이크로 플레이트 및 이의 제조방법을 제공하는 것이 목적이다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 ‘세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트’는
복수개의 다각형 기둥인 마이크로 웰을 포함한 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트에 있어서,
상기 다각형 기둥인 마이크로 웰은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간으로서 육각 기둥인 것을 특징으로 하고;
상기 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및
상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;
하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트이다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 ‘세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법’은
1) 복수개의 육각 기둥을 포함하는 마이크로 플레이트를 제작하기 위하여 복수개의 육각 기둥을 음각으로 포함하는 마이크로 플레이트 1차 주형체를 수득하는 단계;
2) 상기 마이크로 플레이트 1차 주형체를 이용하여 복수개의 육각 기둥을 양각으로 포함하는 마이크로 플레이트 2차 주형체를 수득하는 단계;
3) 상기 마이크로 플레이트 2차 주형체를 이용하여 마이크로 웰인 복수개의 육각 기둥을 음각으로 포함하는 마이크로 플레이트를 수득하는 단계; 및
4) 상기 수득한 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 종 또는 횡 방향으로 가스 유동 채널을 위치시키는 단계;
를 포함하며,
상기 단계를 수행하여 제조되는 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간이고;
상기 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및
상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;
하여 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법이다.
본 발명에 따른 마이크로 플레이트 및 이의 제조방법에 의하여 제조된 마이크로 플레이트는 인체의 환경과 유사한 환경 및 구조에서 3차원 세포 또는 세포 집합체 배양을 가능하게 한다. 또한 산소와 이산화탄소 등의 가스를 인체와 유사한 조건으로 공급함과 동시에, 적절한 농도를 구배하여 세포 또는 세포 집합체가 배양되는 공간에 공급함으로써, 보다 이상적인 환경에서 3차원 세포 또는 세포 집합체 배양하는 것이 가능하게 된다.
도 1은 실시예 1에 따라 제조한 마이크로 플레이트를 도시한 그림 및 사진이다.
도 2는 실시예 1에 따라 육각 기둥 형태로 제작한 마이크로 웰의 둘레를 원형인 경우와 비교한 그림이다.
도 3은 실시예 1에 따라 마이크로 웰의 하부를 반구형으로 제작한 경우의 가스 투과도를 평면으로 제작한 경우와 비교한 그림이다.
도 4는 실시예 1의 제작 과정에 대한 개략도이다.
도 5는 실시예 1에서 힘에 따른 반구형의 오목한 정도를 나타내는 사진이다.
도 6은 실시예 1에 따른 마이크로 플레이트의 SEM 사진이다.
도 7은 실시예 1에 따른 마이크로 플레이트의 배열 구조를 나타낸 그림이다.
도 8은 실시예 1에서 마이크로 웰의 깊이와 마이크로 웰의 바닥의 곡률 반경을 나타내는 그래프이다.
도 9는 가스 농도 구배 조절을 위해 바닥 두께를 결정하는 구조체의 모식도이다.
도 10은 가스 농도 구배 조절을 위해 바닥 두께를 조절한 마이크로 플레이트의 단면도이다.
도 11은 가스 유동 채널에 의해 가스가 마이크로 플레이트에 공급되는 양상을 표현한 그림이다.
도 12는 가스 유동 채널이 연장되어 복수의 마이크로 플레이크에 연결된 모습을 나타낸 그림이다.
도 13은 실시예에 따른 마이크로 플레이트를 활용하여 세포 집합체가 형성된 모습을 관찰한 사진이다.
도 14는 가스 유동 채널에 의해 이산화탄소가 마이크로 플레이트에 공급되는 모습의 단면도이다.
도 15는 실시예에 따른 마이크로 플레이트에 이산화탄소가 농도 구배를 형성하면서 투과된 양상을 관찰한 사진이다.
이에 본 발명자들은 보다 좋은 상태로 세포 또는 세포 집합체를 형성할 수 있으면서 인체와 유사한 환경으로 배양 조건을 제공할 수 있고, 산소나 이산화탄소 등과 같은 가스를 인체와 유사한 조건 아래에서 농도 구배를 이루면서 공급하는 것이 가능한 마이크로 플레이트 및 이의 제조방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 마이크로 마이크로 플레이트, 이의 제조방법 및 이를 이용한 세포 집합체의 배양방법을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
구체적으로 본 발명에 따른 ‘세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트’는
복수개의 다각형 기둥인 마이크로 웰을 포함한 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트에 있어서,
상기 다각형 기둥인 마이크로 웰은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간으로서 육각 기둥인 것을 특징으로 하고;
상기 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및
상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;
하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트이다.
또한 더욱 바람직하게는 상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에는 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 마이크로 플레이트는 인체와 유사한 조건에서 세포 또는 세포 집합체의 3차원 배양을 가능하게 한다. 또한 산소 또는 이산화탄소와 같은 가스를 세포 또는 세포 집합체 배양 공간인 육각 기둥에 공급하는 과정에서 원하는 농도로 농도 구배를 형성하면서 공급하는 것을 가능하게 한다.
한편, 상기 다각형 기둥은 육각 기둥인 것이 바람직한데, 이렇게 육각 기둥인 경우 최대한 많은 공간을 활용하여 세포 또는 세포 집합체를 배양할 수 있어 바람직하다. 또한 상기 육각 기둥은 세포 또는 세포 집합체의 배양이 이루어지는 공간으로서, 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 있다. 즉, 육각 기둥의 상부는 개방되어 배양에 사용되는 물질이나 세포 등을 투입할 수 있다. 그리고 하부는 반구형으로 폐쇄되는데, 하부의 폐쇄되는 구조는 반구형인 것이 육각 기둥에 공급되는 가스 또는 영양분을 보다 많은 양으로 공급할 수 있어 바람직하다. 또한 상기 반구형으로 육각 기둥을 폐쇄하는 것은 다른 재질을 이용하여 폐쇄하는 것이 아니라, 해당 부위의 마이크로 플레이트를 오목한 반구형의 구조로 이루어지게 하여 육각 기둥의 하부가 볼록한 반구형으로 폐쇄되게 하는 것이 바람직하다. 또한 상기 육각 기둥의 하부는 반구형인 것이 평면이거나 뿔 형인 것 등에 비해 세포 또는 세포 집합체 배양시 엉키거나 들러붙지 않고 보다 이상적인 3차원 구조의 세포 또는 세포 집합체 배양을 가능하게 하여 바람직하다.
이러한 육각 기둥의 구조를 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
상기 육각 기둥의 육각형 둘레는 0.15-17.35 mm인 것이 바람직한데, 상기 육각형 둘레가 0.15 mm 미만인 경우에는 세포 또는 세포 집합체 배양에 필요한 공간이 너무 좁게 되어 바람직하지 않으며, 육각형 둘레가 17.35 mm를 초과하는 경우에는 육각 기둥 내의 공간이 세포 또는 세포 집합체 배양에 사용되는 공간을 필요 이상으로 차지하게 되어 바람직하지 않다.
또한 상기 하부의 반구형을 포함한 육각 기둥의 깊이는 0.05-10 mm인 것이 바람직한데, 상기 육각 기둥의 깊이가 0.05 mm 미만인 경우에는 세포 또는 세포 집합체 배양에 필요한 깊이를 미달하게 되어 바람직하지 않으며, 상기 육각 기둥의 깊이가 10 mm를 초과하는 경우에는 세포 또는 세포 집합체 배양에 사용되는 공간을 필요 이상으로 차지하게 되어 바람직하지 않다.
또한 상기 복수개의 육각 기둥은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 육각형의 간격이 0.01-1.0 mm인 것이 마이크로 플레이트의 공간을 보다 효율적으로 활용하면서 세포 또는 세포 집합체 배양에 보다 효율적으로 기여하게 되어 바람직하다.
한편, 상기 육각 기둥 및 가스 유동 채널을 포함한 마이크로 플레이트의 전체 두께는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 0.05-15.0 mm인 것이 바람직하다.
또한 상기 가스 유동 채널은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 0.05-5 mm인 것이 바람직하다.
또한 상기 마이크로 플레이트의 재질은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 PDMS(Polydimethylsiloxane), Polycarbonate, PTMSP(poly(1-trimethylsilyl-1-propyne), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 우레탄, PET(Polyethylene terephthalate) 및 Agarose로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질인 것이 바람직하다.
또한 상기 마이크로 플레이트는 반구형으로 폐쇄된 육각 기둥의 하부와 마이크로 플레이트 하면과의 두께 조절을 통해 가스 유동 채널에서 육각 기둥에 공급되는 가스의 농도 구배를 조절하는 것이 가능하다. 즉, 상기 두께가 두꺼워지는 경우에는 보다 낮은 농도 구배로 가스를 공급하게 되며, 상기 두께가 얇아지는 경우에는 보다 높은 농도 구배로 가스를 공급하게 된다. 또한 농도 구배를 형성하는 두께는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 0.01-1.0 mm인 것이 바람직하며, 상기 두께가 1 mm를 초과하는 경우에는 확산에 의한 가스 주입에 적절한 두께를 초과하게 되어 바람직하지 않다.
한편, 상기 가스 유동 채널을 통해 주입되면서 마이크로 플레이트 및 육각 기둥에 공급되는 가스는 세포 또는 세포 집합체 배양에 필요한 가스라면 특별히 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 산소 또는 이산화탄소가 이에 해당할 수 있다.
또한 상기 가스는 마이크로 플레이트의 하면 기저부에서 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 통하여 마이크로 플레이트에 공급된 후, 육각 기둥에 공급되어 세포 또는 세포 집합체 배양에 사용될 수 있다.
또한 상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 위치하여 가스를 공급하는 가스 유동 채널은 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 지그재그로 연결하거나, 또는 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 좌우에서 연결하여 복수개의 마이크로 플레이트에 가스를 공급할 수 있다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 ‘세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법’은 상기 ‘세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트’의 제조방법에 관한 것으로서,
1) 복수개의 육각 기둥을 포함하는 마이크로 플레이트를 제작하기 위하여 복수개의 육각 기둥을 음각으로 포함하는 마이크로 플레이트 1차 주형체를 수득하는 단계;
2) 상기 마이크로 플레이트 1차 주형체를 이용하여 복수개의 육각 기둥을 양각으로 포함하는 마이크로 플레이트 2차 주형체를 수득하는 단계;
3) 상기 마이크로 플레이트 2차 주형체를 이용하여 마이크로 웰인 복수개의 육각 기둥을 음각으로 포함하는 마이크로 플레이트를 수득하는 단계; 및
4) 상기 수득한 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 종 또는 횡 방향으로 가스 유동 채널을 위치시키는 단계;
를 포함하며,
상기 단계를 수행하여 제조되는 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간이고;
상기 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및
상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;
하여 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법이다.
또한 더욱 바람직하게는 상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에는 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 더 포함하여 이루어지는 것일 수 있다.
상기 1)단계에서 수득되는 상기 마이크로 플레이트 1차 주형체는 실리콘, 고무 및 실록산 계열 고분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질인 것이 바람직하다.
또한 상기 상기 2)단계에서 수득되는 상기 마이크로 플레이트 2차 주형체는 에폭시(epoxy) 수지, 감광성 포토레지스트, PC(polycarbnonate), PMMA, PS(polystyrene) 및 COC(Cyclic Olefin Copolymer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질인 것이 바람직하다.
또한 상기 3)단계에서 수득되는 마이크로 플레이트는 PDMS(Polydimethylsiloxane), Polycarbonate, PTMSP(poly(1-trimethylsilyl-1-propyne), PTFE(Polytetrafluoroethylene), 우레탄, PET(Polyethylene terephthalate) 및 Agarose로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질인 것이 바람직하다.
또한 상기 육각 기둥의 육각형 둘레는 0.15-17.35 mm인 것이 바람직하다.
또한 상기 하부의 반구형을 포함한 육각 기둥의 깊이는 0.05-10 mm 인 것이 바람직하다.
또한 상기 복수개의 육각 기둥은 육각형의 간격이 0.01-1.0 mm 인 것이 바람직하다.
또한 상기 3)단계는 반구형으로 폐쇄된 육각 기둥의 하부와 최종 제조되는 마이크로 플레이트 하면과의 두께 조절을 통해 가스 유동 채널에서 육각 기둥에 공급되는 가스의 농도 구배를 조절할 수 있다. 이를 위해 상기 3)단계와 4)단계 사이에 반구형으로 폐쇄된 육각 기둥의 하부와 최종 제조되는 마이크로 플레이트 하면과의 두께를 조절하는 단계가 더 포함될 수 있다. 이러한 두께 조절 단계는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 원하는 방향으로 농도 구배를 조절할 수 있게 기울기가 형성된 틀을 활용하여 두께를 조절할 수 있다. 즉, 상기 틀에 3)단계에서 수득된 마이크로 플레이트의 하면(마이크로 플레이트의 최하부 바닥면)을 압착하여 틀에 형성된 기울기 방향으로 두께를 조절할 수 있다.
또한 상기 가스는 산소 또는 이산화탄소인 것이 바람직하다.
또한 상기 가스는 마이크로 플레이트의 하면 기저부에서 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 통하여 마이크로 플레이트에 공급된 후, 육각 기둥에 공급되는 것이 바람직하다.
또한 상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 위치하여 가스를 공급하는 가스 유동채널은 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 지그재그로 연결하거나, 또는 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 좌우에서 연결하여 복수개의 마이크로 플레이트에 가스를 공급하는 것이 바람직하다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
< 실시예 1: 육각 기둥 반구형 마이크로 플레이트의 제작>
50 μm-5.0 mm 이하 크기의 육각형 반구체 마이크로 플레이트 구현하기 위해서 기본 형틀(하기 도 4의 a 단계에서 ‘1’)에 감광성 포토레지스트(하기 도 4의 b 단계에서 ‘3’)를 이용하여 육각 기둥 구조의 마이크로 패턴이 구현되도록 하였다. 그 후 구현된 양각의 육각 기둥 패턴을 성형할 수 있는 성형소재(하기 도 4의 c 단계에서 ‘4’)를 이용해서 음각의 육각 기둥(하기 도 4의 d 단계에서 ‘5’)을 형성하였다(1차 주형체, 하기 도 4의 e 단계). 이 때 성형소재로 사용할 수 있는 재료로 실리콘, 고무, 실록산 계열 고분자 등을 이용할 수 있다. 또한 성형된 마이크로 사이즈의 육각 기둥에 액상의 폴리머(하기 도 4의 f 단계에서 ‘6’)를 도포하고 원하는 깊이에 따라 일정한 힘을 가해서 원하는 육각형 반구체 구조의 몰드(2차 주형체, 하기 도 4의 g 단계에서 ‘7’)를 구현하였다. 이 때 사용하는 액상의 폴리머는 일정한 점도를 가지고 열이나 빛에 의해서 경화될 수 있는 소재면 모두 가능하다. 그리고 구현된 육각형 반구체 몰드 표면을 소수성 처리하여 최종 성형될 육각 기둥을 포함하는 반구체 마이크로 플레이트 성형재료를 쉽게 때어낼 수 있도록 하였다. 그 후 육각형 반구체 몰드 위에 실리콘 성형소재(하기 도 4의 g 단계에서 ‘3’)를 올리고 다양한 두께를 가지는 구조체(하기 도 9는 이의 바람직한 예시, 하기 도 4의 h 단계 ‘8’)를 올린 후 일정한 압력을 가해서 복수개의 육각 기둥을 포함하는 반구체 마이크로 플레이트 바닥의 두께를 조절하였다. 이 때 사용하는 성형소재는 가스투과(gas permeability)가 가능한 실리콘 계열의 모든 소재가 가능하며, 두께를 조절하는 목적으로 사용하는 구조체는 금속, 플라스틱 등의 강도가 있는 소재면 가능하다.
하기 도 1a는 제조된 마이크로 플레이트를 위에서 투시한 그림과 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥의 단면도이며, 상기 단면도에서 확인할 수 있는 바와 같이 육각 기둥의 윗부분은 육각형이지만, 하부는 반구형이다. 또한, 하기 도 1b는 본 실시예에 의해 최종 제조되는 마이크로 플레이트를 위에서 찍은 사진이다.
한편, 하기 도 2는 입구가 원형인 경우와 육각형인 경우를 비교한 마이크로 플레이트인데, 이를 통해 입구가 육각형인 경우가 원형인 경우에 비해 둘레가 보다 길어져서 보다 많은 양의 세포 배양이 가능함을 알 수 있다.
또한 도 3은 육각 기둥의 하부가 반구형인 경우가 평면 웰을 가지는 일반적인 경우에 비해 표면적이 넓어 보다 많은 양의 기체 교환이 가능하며, 가스 투과도도 우수함을 알 수 있다.
또한 도 4는 본 실시예의 과정을 개략적으로 묘사한 모식도이다. 또한 도 5는 액상 폴리머를 원하는 압력으로 밀어서 하부가 반구형인 육각 기둥의 깊이를 조절할 수 있음을 보여주는 사진이며, 힘에 따라 형성되는 하부가 반구형인 육각 기둥의 오목한 정도를 SEM으로 분석한 사진이다(‘ON’은 아무것도 넣지 않은 상태임).
또한 도 6은 실시예에 의해 제조되는 마이크로 플레이트의 윗면(a) 및 측면(b)의 SEM 사진이다.
또한 하기 도 7은 실시예에 따라 제조된 마이크로 플레이트의 육각 기둥 배열 형태를 나타낸 그림이다.
또한 하기 도 8은 누르는 압력에 따라 제거되는 액상형 폴리머에 의해 형성되는 반구형 하부를 포함하는 육각 기둥의 깊이(b)와 마이크로 웰 바닥의 오목한 정도를 나타내는 곡률반경 그래프(c)이다.
한편, 상기 실시예 1에 의해 제조되는 마이크로 플레이트는 하기 도 9의 구조체에 의해 마이크로 웰 바닥면과 마이크로 플레이트 하면과의 두께 조절이 가능하며, 이러한 두께 조절에 의해 산소 또는 이산화탄소를 원하는 농도 구배로 공급하는 것이 가능하게 된다. 한편, 도 10은 이러한 바닥 두께가 조절된 마이크로 플레이트의 단면이다.
< 실시예 2: 마이크로 플레이트에 산소 또는 이산화탄소의 공급>
상기 실시예 1에 의해 제조된 마이크로 플레이트에 산소 또는 이산화탄소를 공급하기 위해 마이크로 플레이트 기저부(마이크로 플레이트의 하면 아래에 위치한 부위)에 가스 유동 채널을 연결시켰다. 이러한 가스 유동 채널을 연결함에 의해 산소 또는 이산화탄소를 세포 또는 세포 집합체가 배양되는 육각 기둥의 마이크로 웰에 공급하는 것이 가능하게 된다. 한편, 이렇게 산소 또는 이산화탄소가 마이크로 웰에 공급되는 방법은 마이크로 플레이트를 확산에 의해 통과한 후 마이크로 웰에 공급되게 된다. 또한 상기 가스 유동 채널에는 마이크로 플레이트에 가스를 공급하기 위해 마이크로 플레이트를 향하는 방향으로 가스 배출부위가 구멍이 형성되어 적절한 장소에 위치해 있다. 또한 이러한 가스 유동 채널은 마이크로 플레이트의 종 방향으로 위치한다.
한편, 하기 도 11은 가스 유동 채널이 마이크로 플레이트의 기저부에 위치하여 마이크로 플레이트에 가스를 공급하는 양상을 나타내는 그림이다.
또한 상기 가스 유동 채널은 하기 도 12 A 및 B와 같이 종 방향으로 연장한 후 지그재그로 복수개의 마이크로 플레이트를 연결하거나, 또는 복수개의 마이크로 플레이트 좌우에서 연결하여 복수개의 마이크로 플레이트에 가스를 공급할 수 있다.
실험예
< 실험예 1: 마이크로 플레이트를 이용한 세포 또는 세포 집합체 배양>
상기 실시예에 따른 것으로서 육각 기둥이면서 바닥면이 반구형으로 이루어진 마이크로 웰을 포함한 마이크로 플레이트를 이용하여 세포를 3차원 배양하였다. 이를 위해 2D 세포배양 dish에서 배양한 안정화된 MCF-7 세포 주를 사용하였다. 또한 세포들을 배양액과 섞어 육각형 반구체 마이크로 플레이트 seeding하였다. 이 때 사용된 육각형 반구체 마이크로 플레이트 지름은 600 um이며, 세포가 가라앉고 약 30분 후 대부분의 세포가 육각 기둥의 마이크로 웰 안에 위치하게 되었다.
하기 도 13은 육각형 반구체 마이크로 플레이트 내에서 세포 집합체가 형성된 사진이다.
< 실험예 2: 마이크로 플레이트에서 이산화탄소 투과도 실험>
상기 실시예에 따른 마이크로 플레이트의 이산화탄소의 투과도 및 농도 구배를 형성하여 투과하는 것이 가능한지를 측정하는 실험을 진행하였다. 이를 위해 bromothymol blue (BTB) 용액에 NaOH를 넣어 염기로 만들어 파란색을 띄게 한다. 그리고 바닥 두께 gradient가 있는 하나의 마이크로 웰 안에 BTB 용액을 채우고 웰 안에만 용액이 남을 만큼을 제외하고 나머지는 제거한다. 용기 아래에 이산화탄소를 주입하면 용기의 바닥을 통해 확산이 이루어지는데 시간에 따라 산성이 되면서 BTB 용액이 노란색으로 변한다. 즉, 염기에서는 파란색이었으나, CO2를 만나면 산성으로 바뀌며 노란색으로 변화하게 하였다. 여기서 이산화탄소를 육각형 반구체 마이크로웰 바닥을 통해서만 BTB 지시약에 전달하기 위해 용기 바닥의 이산화탄소 주입 사이에 구멍이 있는 플레이트를 이용하였다(하기 도 14 참조). 하기 도 15는 이러한 실험의 결과를 보여주는 사진으로서 실시예에 따른 마이크로 플레이트의 바닥 두께에 따라 농도별 이산화탄소의 확산을 측정한 사진이다. 이러한 도 15를 살펴보면 시간의 흐름에 따라 마이크로 플레이트의 두께 차이에 의해 색깔이 변화하는 순서도 다름을 확인하였다. 이를 통해 바닥 두께에 차이를 둔 실시예에 따른 마이크로 플레이트는 농도 구배를 형성하면서 육각 기둥에 이산화탄소를 공급할 수 있음을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (24)

  1. 복수개의 다각형 기둥인 마이크로 웰을 포함한 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트에 있어서,
    상기 다각형 기둥인 마이크로 웰은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간으로서 육각 기둥인 것을 특징으로 하고;
    상기 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및
    상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;
    하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에는 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 육각 기둥의 육각형 둘레는 0.15-17.35 mm인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 하부의 반구형을 포함한 육각 기둥의 깊이는 0.05-10 mm인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 복수개의 육각 기둥은 육각형의 간격이 0.01-1.0 mm인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 플레이트는 PDMS(Polydimethylsiloxane), Polycarbonate, PTMSP(poly(1-trimethylsilyl-1-propyne), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 우레탄, PET (Polyethylene terephthalate) 및 Agarose로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질로 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 마이크로 플레이트는 반구형으로 폐쇄된 육각 기둥의 하부와 마이크로 플레이트 하면과의 두께 조절을 통해 가스 유동 채널에서 육각 기둥에 공급되는 가스의 농도 구배를 조절하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 가스는 산소 또는 이산화탄소인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 가스는 마이크로 플레이트의 하면 기저부에서 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 통하여 마이크로 플레이트에 공급된 후, 육각 기둥에 공급되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 위치하여 가스를 공급하는 가스 유동 채널은 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 지그재그로 연결하거나, 또는 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 좌우에서 연결하여 복수개의 마이크로 플레이트에 가스를 공급하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트.
  11. 1) 복수개의 육각 기둥을 포함하는 마이크로 플레이트를 제작하기 위하여 복수개의 육각 기둥을 음각으로 포함하는 마이크로 플레이트 1차 주형체를 수득하는 단계;
    2) 상기 마이크로 플레이트 1차 주형체를 이용하여 복수개의 육각 기둥을 양각으로 포함하는 마이크로 플레이트 2차 주형체를 수득하는 단계;
    3) 상기 마이크로 플레이트 2차 주형체를 이용하여 마이크로 웰인 복수개의 육각 기둥을 음각으로 포함하는 마이크로 플레이트를 수득하는 단계; 및
    4) 상기 수득한 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 종 또는 횡 방향으로 가스 유동 채널을 위치시키는 단계;
    를 포함하며,
    상기 단계를 수행하여 제조되는 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥은 세포 또는 세포 집합체 배양이 이루어지는 공간이고;
    상기 마이크로 플레이트에 포함되는 육각 기둥의 상부는 개방되어 있음에 반하여, 하부는 반구형으로 폐쇄되어 이루어지며; 및
    상기 복수개의 육각 기둥은 수직으로 정렬하면서 일정한 간격으로 연속적으로 배열;
    하여 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에는 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 1)단계에서 수득되는 상기 마이크로 플레이트 1차 주형체는 실리콘, 고무 및 실록산 계열 고분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질로 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 2)단계에서 수득되는 상기 마이크로 플레이트 2차 주형체는 에폭시(epoxy) 수지, 감광성 포토레지스트, PC(polycarbnonate), PMMA, PS(polystyrene) 및 COC(Cyclic Olefin Copolymer)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질로 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 3)단계에서 수득되는 마이크로 플레이트는 PDMS(Polydimethylsiloxane), Polycarbonate, PTMSP(poly(1-trimethylsilyl-1-propyne), PTFE (Polytetrafluoroethylene), 우레탄, PET (Polyethylene terephthalate) 및 Agarose로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 물질로 이루어지는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 육각 기둥의 육각형 둘레는 0.15-17.35 mm인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 하부의 반구형을 포함한 육각 기둥의 깊이는 0.05-10 mm인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 복수개의 육각 기둥은 육각형의 간격이 0.01-1.0 mm인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 3)단계와 4)단계 사이에는 반구형으로 폐쇄된 육각 기둥의 하부와 최종 제조되는 마이크로 플레이트 하면과의 두께를 조절하는 단계가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 단계에 의해 조절된 두께를 통해 가스 유동 채널에서 육각 기둥에 공급되는 가스의 농도 구배를 조절하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 가스는 산소 또는 이산화탄소인 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 가스는 마이크로 플레이트의 하면 기저부에서 마이크로 플레이트의 종 또는 횡 방향으로 위치한 가스 유동 채널을 통하여 마이크로 플레이트에 공급된 후, 육각 기둥에 공급되는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 마이크로 플레이트의 하면 기저부에 위치하여 가스를 공급하는 가스 유동 채널은 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 지그재그로 연결하거나, 또는 종 또는 횡 방향으로 연장하여 복수개의 마이크로 플레이트를 좌우에서 연결하여 복수개의 마이크로 플레이트에 가스를 공급하는 것을 특징으로 하는 세포 또는 세포 집합체 배양용 마이크로 플레이트의 제조방법.
  24. 제1항에 따른 마이크로 플레이트 또는 제11항에 따른 제조방법에 의하여 제조된 마이크로 플레이트를 이용하여 배양된 세포 또는 세포 집합체의 배양방법.
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