KR20150047598A - 마이크로웰 플레이트 - Google Patents

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KR20150047598A
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료오헤이 츠카다
하루오 오쿠보
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스미또모 베이크라이트 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 세포 응집 덩어리의 형성을 양호하게 행할 수 있고, 또한 충분한 웰 용량을 확보한 마이크로웰 플레이트를 제공하는 것을 목적으로 하고, 한쪽의 면에 개방되는 개구를 갖는 웰을 구비하고, 상기 웰은, 상기 개구로부터 상기 마이크로웰 플레이트의 내부를 향해 형성된 공간을 구획하고, 상기 공간은 개구측 부분과, 상기 개구측 부분으로부터 상기 마이크로웰 플레이트의 내부를 향해 형성되는 저부측 부분과, 개구측 부분(41)과 저부측 부분(42)을 매끄럽게 접속하는 천이 부분(43)을 갖고, 상기 개구측 부분은 횡단면이 다각형 형상을 이루고 있고, 상기 저부측 부분은, 내부를 향해 횡단 면적이 점감하도록 형성되어 있는 마이크로웰 플레이트를 제공한다.

Description

마이크로웰 플레이트 {MICROWELL PLATE}
본 발명은 마이크로웰 플레이트에 관한 것이다.
최근, 약효 평가의 스크리닝이나 분화 유도 인자의 연구가 활발히 행해지고 있다. 이러한 연구에서는, 다양한 세포 응집 덩어리가 평가에 사용된다. 그로 인해, 세포 응집 덩어리를 효율적으로 형성하는 배양 방법이 요구되고 있다.
또한, 스크리닝 등의 평가에서는 다검체를 한번에, 또한 신속히 처리할 필요가 있다. 따라서, 대량의 세포 응집 덩어리의 형성 및 평가를 할 수 있는 배양 용기가 요구된다.
이러한 목적으로 다수의 웰이 형성된 마이크로웰 플레이트가 사용된다. 마이크로웰 플레이트에서는 예를 들어 96웰이나 384웰, 1,536웰의 것이 시판되고 있고, 다수의 검체를 취급하는 것이 가능하다.
그러나 다수의 웰이 형성된 마이크로웰 플레이트에는 이하와 같은 문제가 있다. 마이크로웰 플레이트의 형상·크기는 규격화(ANSI/SBS-1 2004, ANSI/SBS-2 2004, ANSI/SBS-3 2004, ANSI/SBS-4 2004)되어 있으므로, 웰의 수가 증가하면 웰의 용량은 감소할 수 밖에 없다. 따라서, 예를 들어 특허문헌 1에 개시되는 바와 같은 1,000을 초과하는 웰을 갖는 마이크로웰 플레이트에서는, 웰 1개당 용량이 수 μL 정도로 된다. 이러한 저용량의 웰로 배양을 행하는 경우, 영양 인자의 양의 확보나 배지의 증발의 영향으로부터 배양이 매우 어려워진다. 또한, 약효 평가 시에는 웰에 배양액의 절반으로부터 등량의 시약을 첨가하게 되지만, 저용량의 웰에서는 이러한 여유가 없다.
이러한 문제를 피하고, 웰의 용량을 늘리기 위해 웰의 종단면 형상을 사각형으로 하는 것이 생각된다. 그러나 이러한 웰의 형상에서는 웰의 저면이 평면이므로 균일한 세포 응집 덩어리의 형성이 곤란하다.
일본 특허 공표 제2001-509272호 공보
본 발명은 상기한 과제에 비추어 이루어진 것이며, 세포 응집 덩어리의 형성을 양호하게 행할 수 있고, 또한 충분한 웰 용량을 확보할 수 있는 마이크로웰 플레이트를 제공하는 것이다.
이러한 목적은, 하기 (1)∼(5)에 기재된 본 발명에 의해 달성된다.
(1) 한쪽의 면에 개방되는 개구를 갖는 웰을 구비하는 마이크로웰 플레이트이며,
상기 웰은, 상기 개구로부터 상기 마이크로웰 플레이트의 내부를 향해 형성된 공간을 구획하고, 상기 공간은 개구측 부분과, 상기 개구측 부분으로부터 상기 마이크로웰 플레이트의 내부를 향해 형성되는 저부측 부분과, 개구측 부분(41)과 저부측 부분(42)을 매끄럽게 접속하는 천이 부분(43)을 갖고,
상기 개구측 부분은, 횡단면이 다각 형상을 이루고 있고,
상기 저부측 부분은, 내부를 향해 횡단 면적이 점감하도록 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 플레이트.
(2) 상기 개구측 부분의 깊이와, 상기 저부측 부분과 천이 부분의 합계의 깊이의 깊이와의 비가 3:1∼4:1인 (1)에 기재된 마이크로웰 플레이트.
(3) 상기 개구측 부분의 상기 개구에 평행한 단면은 사각형, 오각형 또는 육각형 중 어느 하나인 (1) 또는 (2)에 기재된 마이크로웰 플레이트.
(4) 상기 저부측 부분의 상기 개구에 평행한 단면은 원형인 (1)∼(3) 중 어느 한 항에 기재된 마이크로웰 플레이트.
(5) 상기 웰의 수는 384개 이상인, (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 마이크로웰 플레이트.
본 발명의 마이크로웰 플레이트에 따르면, 웰의 형상을 적정화함으로써, 세포 응집 덩어리의 형성을 양호하게 행할 수 있고, 또한 충분한 웰 용량을 확보할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시 형태에 관한 마이크로웰 플레이트의 상면도이다.
도 2는 도 1의 Ⅱ부의 확대도이다.
도 3은 본 발명의 실시 형태에 관한 웰의 종단면도이다.
이하, 본 발명의 마이크로웰 플레이트의 적합한 실시 형태에 대해, 도면을 참조하면서 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 실시 형태에 관한 마이크로웰 플레이트(1)의 상면도이다. 도 2는 도 1의 Ⅱ부의 확대도이다. 도 3은 본 실시 형태에 관한 웰(2)의 종단면도이다. 또한, 이하의 설명에서는 도 3 중, 도면의 상방을 상측, 하방을 하측이라 하는 경우가 있다.
우선, 도 1을 사용하여, 본 실시 형태에 관한 마이크로웰 플레이트(1)에 대해 설명한다. 마이크로웰 플레이트(1)는, 통상 소 스케일의 세포 배양이나 생화학 실험 등에 사용된다. 또한, 본 실시 형태의 마이크로웰 플레이트(1)는 웰(2)의 깊이 이상의 두께를 갖는 평판에 웰(2)을 형성한 것이지만, 본 발명은 이에 한정하지 않고, 웰(2)의 깊이 미만의 두께를 갖는 평판의 일부를 오목하게 함몰시켜 웰(2)을 형성하도록 해도 된다.
마이크로웰 플레이트(1)는, 도 1 및 3에 도시하는 바와 같이, 수지제의 평판의 한쪽의 면(상측의 면)에 개방되는 웰(2)이 형성되어 있다. 웰(2)은 일반적으로 n행 m열로 배치되어 있고, 그 수는 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536 등의 것이 사용되어 있다. 이하에서는 384웰(16행 24열)의 마이크로웰 플레이트(1)를 예로서 설명한다. 또한, 본 실시 형태에 관한 마이크로웰 플레이트(1)는 이것에 한정되지 않고 여러 가지 형상, 치수, 웰수의 것을 사용해도 된다.
도 1에 도시되는 본 실시 형태의 마이크로웰 플레이트(1)는, 세로 125㎜ 정도, 가로 83㎜ 정도, 두께 14㎜ 정도의 평판 형상이다.
마이크로웰 플레이트(1)의 재료로서는, 예를 들어 폴리프로필렌 수지, 폴리에틸렌 수지, 에틸렌-프로필렌 공중합체 등의 폴리올레핀계 수지 또는 환상 폴리올레핀계 수지, 폴리스티렌, 아크릴로니트릴-부타디엔-스티렌계 수지 등의 폴리스티렌계 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리에틸렌테레프탈레이트 수지, 폴리메틸메타크릴레이트 수지 등의 메타크릴계 수지, 염화비닐 수지, 폴리부틸렌테레프탈레이트 수지, 폴리아릴레이트 수지, 폴리술폰 수지, 폴리에테르술폰 수지, 폴리에테르에테르케톤 수지, 폴리에테르이미드 수지, 폴리테트라플루오로에틸렌 등의 불소계 수지, 폴리메틸펜텐 수지, 폴리아크릴로니트릴 등의 아크릴계 수지, 프로피오네이트 수지 등의 섬유소계 수지 등을 들 수 있다.
이들 중에서도, 배양 용기에 요구되는 성형성, 방사선 멸균 내성의 점에 있어서 폴리스티렌 수지가 바람직하다.
또한, 세포 응집 덩어리의 형상 관찰이나 흡광도 측정을 행하는 경우에는 투명성의 수지를 선택하고, 웰마다의 발광 측정이나 형광 측정을 행하는 경우에는 차광성의 수지를 선택하는 것이 바람직하다.
웰(2)은 세포 응집 덩어리를 형성하기 위한 공간(4)을 구획하는 부분이다. 즉, 마이크로웰 플레이트(1)의 상면에는 오목부를 구획하는 웰(2)이 형성되어 있고, 이 오목부가 공간(4)으로 된다. 본 실시 형태에서는 도 3에 도시하는 바와 같이, 웰(2)에 구획되는 공간(4)은, 개구측 부분(41)과, 마이크로웰 플레이트(1)의 내부를 향해 형성되는 저부측 부분(42)과, 개구측 부분(41)과 저부측 부분(42)을 매끄럽게 접속하는 천이 부분(43)을 갖는다.
보다 구체적으로는, 개구측 부분(41)은, 웰 플레이트(1)의 상면을 그 상단부로 하고, 그 다각 형상의 횡단면이 원형을 향해 변형되기 시작하는 부분을 하단부로 하는 부분이다. 상기 원형을 향해 변형되기 시작하는 부분이라 함은, 즉, 다각 형상의 내각 중, 어느 하나의 각도가 증대되기 시작하는 부분을 말한다.
저부측 부분(42)은, 내부를 향해 횡단 면적이 점감하기 시작하는 상단부로부터 웰의 저부인 하단부까지를 의미한다.
그리고 천이 부분은, 개구부측 부분(41)의 하단부로부터 저부측 부분(42)의 상단부까지의 부분이다.
도 2에 도시하는 바와 같이, 본 실시 형태의 웰(2)의 개구(3)는 대략 정사각형 형상을 이루고 있다. 이와 같이 개구(3)를 원형이 아니라 다각 형상으로 함으로써 개구측 부분(41)의 용적을 크게 할 수 있다. 개구(3)의 형상은 다각 형상이면 용적을 증대시키는 효과는 있지만, 특히 사각형, 오각형 또는 육각형 중 어느 하나로 하면, 원형의 경우에 비해 용량이 커지므로 바람직하다. 특히 웰(2)의 수가 384 이상인 마이크로웰 플레이트(1)에서는, 개구(3)를 다각형으로 하는 것에 의한 용량의 증가의 효과가 크다.
또한, 본 실시 형태에서는 도 2에 도시하는 바와 같이 개구(3)의 형상은 완전한 다각 형상이 아니라, 각각의 코너가 둥글게 형성되어 있다. 이와 같이 하면, 웰(2)에의 표면 처리 등을 양호하게 행할 수 있으므로 바람직하다.
공간(4)의 개구측 부분(41)은 대략 다각 뿔대 형상을 이루고 있다. 즉, 도 3에 도시하는 바와 같이, 개구측 부분(41)의 종단면에 있어서 벽면이 저부측을 향해 경사져 있다. 경사 각도는 가능한 한 작은 것이 바람직하고, 예를 들어 1∼2° 정도이다. 이와 같이 다소의 경사를 형성함으로써 제조 시에 마이크로웰 플레이트(1)를 성형형으로부터 빼기 쉬워진다. 또한, 예를 들어 이형 처리로 고안을 하는 등에 의해 이형성이 양호하면 이 경사는 형성하지 않아도 된다.
공간(4)의 저부측 부분(42)은 내부를 향해 횡단 면적이 점감하도록 형성되어 있다. 본 실시 형태에서는, 횡단면 형상은 원형이다. 즉, 저부측 부분(42)은 소위 U 바닥 형상을 이루고 있다. 이러한 형상은 세포를 최고 심부에 모으기 쉽고, 세포 응집 덩어리의 형성에 유리하다. 또한, 저부측 부분(42)은 U 바닥에 한정되지 않고, 예를 들어 V 바닥으로 해도, 즉, 저부측 부분(42)의 종단면 형상은 U자 형상에 한정되지 않고, 예를 들어 V자 형상으로 해도 세포 응집 덩어리의 형성을 행할 수 있다.
개구측 부분(41)과 저부측 부분(42) 사이에는 천이 부분(43)이 위치하고 있다. 천이 부분(43)은 다각 형상의 횡단면을 갖는 개구측 부분(41)과 원형의 횡단면을 갖는 저부측 부분(42)을 매끄럽게 접속하도록 형성되어 있다.
여기서 웰(2)의 대표적인 치수예에 대해 설명한다.
개구(3)는 1변이 3.3㎜ 정도의 크기이다. 또한, 개구측 부분(41)의 깊이는 8.8㎜ 정도이며, 저부측 부분(42)과 천이 부분(43)을 합한 깊이는 3.2㎜ 정도이다. 따라서, 개구측 부분(41)과, 저부측 부분(42)과 천이 부분(43)의 합계의 깊이와의 비는, 3:1∼4:1 정도로 된다. 개구측 부분(41)과, 저부측 부분(42)과 천이 부분(43)의 합계 깊이와의 비를 상기 범위로 하면, 세포 응집 덩어리의 형성이 가능한 저부를 가진 후에 충분히 웰(2)의 용량을 확보할 수 있다.
또한, 본 실시 형태의 웰(2) 형상으로 하면, 웰(2)의 용량은 108.4μL로 된다. 한편, 대응하는 크기에서 개구가 원형인 경우에는 웰의 용량은 87.16μL로 된다. 세포 응집 덩어리의 형성에 있어서는 웰당 배지량으로서 50μL 정도가 바람직하지만, 본 실시 형태의 웰 형상으로 하면, 이후의 평가에서 배지와 등량의 시약을 첨가하는 것도 가능해진다.
다음으로 본 실시 형태의 마이크로웰 플레이트(1)의 사용 방법에 대해 설명한다.
일례로서 본 실시 형태에서는, 50μL/웰로 배양을 행한다. 따라서, 세포 응집 덩어리를 사용한 평가의 목적에 맞추어, 50μL 중에 필요한 세포수가 확보되도록 세포 현탁액의 조제를 행한다.
이와 같이 조정한 세포 현탁액을 384웰의 마이크로웰 플레이트(1)에 파종하고, 37℃, 5％ CO2 농도로 배양을 개시한다. 파종한 세포는 비접착의 상태에서 증식하고, 2일 정도로 웰(2)의 최고 심부에서 세포 응집 덩어리를 형성한다.
다음으로 세포 응집 덩어리를 사용하여 마이크로웰 플레이트(1) 상에서 약효 평가의 스크리닝을 행한다.
일례로서 본 실시 형태에서는, 배양액과 동량의 CellTitert-Glo (TM) Luminescent Cell Viability Assay(프로메가 가부시끼가이샤제)를, 제품 첨부의 프로토콜에 따라, 얻어진 세포 응집 덩어리에 첨가하고, 웰마다의 세포 내 ATP량에 비례한 발광량을 측정한다. 측정값을 세포수의 지표로 하고, 웰마다의 세포수의 변화율을 산출할 수 있고, 웰마다 다른 약제를 첨가한 경우에는, 약제의 세포 증식에 대한 영향을 평가할 수 있다.
이상과 같이 본 실시 형태의 마이크로웰 플레이트(1)에 따르면, 세포 응집 덩어리의 형성으로부터 약효 평가의 스크리닝까지 세포 응집 덩어리를 이동시키는 일 없이 행할 수 있다. 따라서, 대량의 검체를 사용하는 스크리닝이라도 평가를 신속히 행할 수 있다.
실시예
다음으로, 본 발명을 실시예를 사용하여 설명한다.
(실시예 1)
투명한 폴리스티렌 수지(PS재팬사제, HF77) 및 투명한 폴리스티렌 수지에, 백색 색소 티탄 화이트 안료[스미까(住化)컬러제]를 15％ 혼합한 착색 수지를 사용하여, 사출 성형에 의해 투명, 백색 2종의 384웰 마이크로웰 플레이트를 성형하였다.
얻어진 마이크로웰 플레이트의 형상은, 가로 127.7㎜, 세로 85.5㎜, 높이 14.4㎜였다.
또한, 각 웰의 형상은, 도 3에 도시한 바와 같고, 개구부는 1변 3.3㎜의 사각형, 깊이 12㎜, 저부의 곡률 반경은 1.5㎜, 웰 용량은 108.4μL였다.
또한, 개구측 부분(41)의 깊이는 8.8㎜, 저부측 부분(42)과, 천이 부분(43)의 합계의 깊이는 3.2㎜이며, 깊이의 비는 15:4였다.
얻어진 플레이트에 플라즈마 처리 장치(BRANSON/IPC사제 SERIES7000)를 사용하여 플라즈마 처리(산소 플라즈마 10분)를 행하고, 플레이트 표면에 습윤성을 부여하였다.
다음으로, 착색 수지에 의해 차광한 폴리프로필렌 용기 중에서, 수용성 수지인 BIOSURFINE(R)-AWP[도요 고세 고교사(東洋合成工業社)제]를, 25용량％ 에탄올 수용액에 용해하고, 0.3중량％의 수용성 수지 용액을 조정하였다. 자동 분주기(MolecularDevices사제, AquaMax 2000)에 의해, 상술한 수용성 수지 용액을, 상술한 플레이트에, 1웰에 대해 80μL 첨가하고, 3초간 침지하였다.
그 후, 동 자동 분주기로 용액을 흡인 제거하고, 25℃에서 17시간 1차 건조하였다.
이어서, UV 램프로 250㎚의 UV광을 1.0㎽/㎠×30초간 조사하여 수용성 수지를 경화하였다.
그 후, 초순수로 3회 반복해서 세정하고, 건조 후, γ선을 흡수선량 5.8kGy로 조사(라지에 고교 가부시끼가이샤)하여, 배양 용기(플레이트)를 얻었다.
(비교예 1)
성형품으로서, 시판품의 마이크로웰 플레이트를 사용한 것 이외는 실시예 1과 동일한 공정에서 배양 용기(플레이트)를 얻었다. 시판품의 마이크로웰 플레이트로서, Greiner사제 781101을 사용하였다. 형상은, 가로 127.7㎜, 세로 85.5㎜, 높이 14.4㎜이며, 웰의 개구부는 1변 3.7㎜의 사각형이었다. 웰의 형상은 개구측 부분(41)만으로 구성된 대략 다각 뿔대 형상이며, 깊이는 11.5㎜이며, 약 1°의 빼기 구배를 갖고, 저면은 천이 부분(43) 및 저부측 부분(42)을 갖지 않는, 1변 3.3㎜의 사각형의 평면이었다.
실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 배양 용기에 대해, 이하의 평가를 행하였다.
(1) HepG2 세포(인간 간암 유래 세포)를 사용한 세포 응집 덩어리 형성
세포 응집 덩어리 배양의 배양 기간에 있어서의 세포의 영양 요구 및, 배양 중의 배지의 증발의 영향으로부터 50μL/웰 이상의 배양액량이 필요하므로, 이하의 평가에서는 배양액량 50μL/웰로 행하였다.
미리 90㎜φ의 배양 샬레에서 배양하고 증식시킨 HepG2 세포를, 배양액(둘베코 개변 MEM＋10％ 소 태아혈청)에 2×103cells/mL의 농도로 분산시킨 세포 현탁액을 조제하였다.
상술한 세포 현탁액을, 투명 수지로 성형한 플레이트의 전체 웰에, 50μL/웰씩 분주하고, 37℃, 5％ CO2 분위기하에서 3일간 배양하였다.
3일 후, 각 웰의 세포 응집 덩어리의 상태를, 현미경 관찰에 의해 평가하였다.
그 결과, 실시예 1에 있어서는 플레이트 전체 웰에서 단일의 세포 응집 덩어리가 인정되었다. 한편, 비교예 1에 있어서는, 1웰 내에 복수의 세포 응집 덩어리가 관찰되었다.
단일의 세포 응집 덩어리가 얻어진 실시예 1에서 얻어진 배양 용기에 대해, 이하의 평가를 행하였다.
(2) HepG2 세포를 사용한 세포 응집 덩어리의 루시페라아제 활성 측정에 의한 세포수 계수
HepG2 세포를 배양액(둘베코 개변 MEM＋10％ 소 태아혈청)에 2×103cells/mL의 농도로 분산시킨 세포 현탁액을 조제하였다.
상술한 착색 수지로 성형한 백색의 플레이트에, 50μL/웰씩 분주하고, 37℃, 5％ CO2 분위기하에서 3일간 배양하였다.
3일 후, 프로메가사의 CellTitert-Glo (TM) Luminescent Cell Viability Assay(프로메가 가부시끼가이샤제)를, 제품 첨부의 프로토콜에 따라, 배양액과 등량 첨가하고, 웰마다의 세포 내 ATP량에 비례한 발광량을 측정하였다.
또한, 평가는 n＝384로 행하고, 미리 측정한 검량선으로부터 세포수를 구하였다.
실시예 1에 있어서는 초기 세포수 1,000개에 대해, 세포수 평균값 4,810개, CV값 9.5％와 균일한 세포의 증식이 확인되었다.
또한, 웰마다 다른 약제를 첨가한 경우에는, 약제의 세포 증식에 대한 영향을 평가할 수 있는 것이며, 본 실시 형태의 마이크로웰 플레이트에 따르면, 세포 응집 덩어리의 형성으로부터 약효 평가의 스크리닝까지 세포 응집 덩어리를 이동시키는 일 없이 행할 수 있다. 따라서, 대량의 검체를 사용하는 스크리닝이라도 평가를 신속히 행할 수 있다.
본 발명의 마이크로웰 플레이트는, 적정한 형상을 갖는 웰을 구비하므로, 세포 응집 덩어리의 형성을 양호하게 행할 수 있고, 또한 충분한 웰 용량을 확보할 수 있다.
1 : 마이크로웰 플레이트
2 : 웰
3 : 개구
4 : 공간
41 : 개구측 부분
42 : 저부측 부분
43 : 천이 부분

Claims (5)

  1. 한쪽의 면에 개방되는 개구를 갖는 웰을 구비하는 마이크로웰 플레이트이며,
    상기 웰은, 상기 개구로부터 상기 마이크로웰 플레이트의 내부를 향해 형성된 공간을 구획하고, 상기 공간은 개구측 부분과, 상기 개구측 부분으로부터 상기 마이크로웰 플레이트의 내부를 향해 형성되는 저부측 부분과, 개구측 부분(41)과 저부측 부분(42)을 매끄럽게 접속하는 천이 부분(43)을 갖고,
    상기 개구측 부분은, 횡단면이 다각 형상을 이루고 있고,
    상기 저부측 부분은, 내부를 향해 횡단 면적이 점감하도록 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 마이크로웰 플레이트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개구측 부분의 깊이와, 상기 저부측 부분과 천이 부분의 합계의 깊이와의 비가 3:1∼4:1인, 마이크로웰 플레이트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개구측 부분의 상기 개구에 평행한 단면은 사각형, 오각형 또는 육각형 중 어느 하나인, 마이크로웰 플레이트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저부측 부분의 상기 개구에 평행한 단면은 원형인, 마이크로웰 플레이트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 웰의 수는 384개 이상인, 마이크로웰 플레이트.
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