CN108342318A - 成型模具板、成型基板、细胞聚球培养模具及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种成型模具板、成型基板、细胞聚球培养模具及其制造方法。其中，细胞聚球培养模具顶端的中部设有向内凹陷的培养面板，所述培养面板的外侧形成围合所述培养面板的围板；所述培养面板的表面设有若干用于盛放组织培养液的培养孔，所述培养孔包括位于培养孔底端呈球缺形的球状部以及连接所述球状部并向培养面板的表面延伸呈圆柱体状的柱状部。本发明使得肝细胞不会贴壁生长，而是聚集成球体，容易形成三维立体结构的肝组织。
Description
技术领域
本发明涉及细胞工程领域，尤其涉及一种成型模具板、成型基板、细胞聚球培养模具及其制造方法。
背景技术
肝脏是人体最重要的器官之一，具有复杂的结构和多种生理功能。肝替代疗法是肝功能失代偿或肝衰竭时的主要治疗策略。肝移植是目前效果最佳的治疗手段，受供体短缺等因素制约，只有极少数人能有机会接受肝移植治疗。因而，人工肝替代疗法是替代疗法的理想出路。
采用仿生法构建人工肝组织是一种被肯定的研究策略，但肝脏的结构及组成十分复杂，采用人工法构建难度极高。为了实现这一目标，研究者们设计出各种支架材料以及微模具，来使单细胞状态的肝细胞，形成具有三维仿生结构的人工肝组织。
现有技术中，肝细胞三维生长的方法主要有胶原三明治法、细胞片层堆叠法等。上述人工肝组织培养方法，本质上仍然是单层细胞培养方式，肝细胞会贴合培养基质表面生长，肝细胞之间的物质交换和胞间通信不畅通，难以模拟体内的三维立体结构下的情况，导致最终模拟成型的肝小叶在功能上不尽理想。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提出了一种成型模具板、成型基板、细胞聚球培养模具及其制造方法，解决现有肝组织培养过程中肝细胞贴壁生长，难以形成三维立体结构的问题。
根据本发明的第一方面，本发明实施例提供一种细胞聚球培养模具，所述细胞聚球培养模具顶端的中部设有向内凹陷的培养面板，所述培养面板的外侧形成围合所述培养面板的围板；所述培养面板的表面设有若干用于盛放培养细胞的培养孔，所述培养孔包括位于培养孔底端呈球缺形的球状部以及连接所述球状部并并延伸至平齐培养面板表面呈圆柱体状的柱状部。
优选的，所述球状部为半球形。
优选的，所述柱状部的直径与所述球状部的直径相同。
优选的，所述培养孔的直径为200～400um，所述培养孔的深度为300～400um。
优选的，所述培养孔在所述培养面板的表面呈点阵状均匀分布。
优选的，所述细胞聚球培养模具由1～3％琼脂糖制成。
优选的，所述培养面板和围板一体化成型。
根据本发明的第二方面，本发明实施例提供一种用于制作上述细胞聚球培养模具的成型模具板，所述成型模具板的顶端设有凹槽，所述凹槽的底面设有凸台，所述凸台的高度低于所述成型模具板表面的高度，所述凸台的侧面与所述凹槽的侧壁之间设有周向环绕所述凸台的挡板槽；所述凸台的表面设有若干突起，所述突起包括从凸台表面向上突出的呈圆柱体状的柱状体以及位于突起顶端并连接所述柱状体的呈球缺形的球状体。
优选的，所述成型模具板由聚二甲基硅氧烷PDMS制成。
根据本发明的第三方面，本发明实施例提供一种用于制作上述成型模具板的成型基板，所述成型基板的顶端具有第一容置槽，所述第一容置槽槽底的中部设有第二容置槽，所述第二容置槽槽底的中部设有培养台，所述培养台的高度低于所述第一容置槽槽底的高度；所述培养台的侧壁与所述第二容置槽的侧壁之间设有周向环绕培养台的围合槽；所述培养台顶端的中部设有第三容置槽，所述第三容置槽的底面设有若干注塑孔，所述注塑孔包括位于注塑孔底端呈球缺形的注塑球部以及连接所述注塑球部并向第三容置槽底面延伸呈圆柱体状的注塑柱部。
根据本发明的第四方面，本发明实施例提供一种细胞聚球培养模具的制造方法，包括如下步骤：使用预制掩膜对硅片进行光刻处理，制成上述的成型基板；向所述成型基板内注入热熔的注塑料，冷却成型后制得上述的成型模具板；向所述成型模具板内注入热熔的凝胶材料，经冷却成型后制得细胞聚球培养模具。
优选的，制作成型基板的步骤中，所述注塑孔的成型过程如下：使用预制的一次掩膜对硅片表面进行第一次光刻处理，使第三容置槽的底面形成若干圆柱体状的注塑孔，加热驱使柱体状的注塑孔变圆滑，使注塑孔的孔底呈球缺形。
优选的，所述注塑料为聚二甲基硅氧烷PDMS。
优选的，所述凝胶材料为琼脂糖。
相比现有技术，本发明在培养面板设置多个培养孔，培养孔包括位于培养孔底端呈球缺形的球状部以及连接所述球状部并向培养面板的表面延伸呈圆柱体状的柱状部，此种结构的培养孔，其内壁更加光滑，肝细胞不会贴壁生长，而是聚集成球体，容易形成三维立体结构的肝组织。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一种实施例的细胞聚球培养模具的结构示意图；
图2为本发明一种实施例的细胞聚球培养模具的剖视图；
图3为本发明一种实施例的成型模具板的结构示意图；
图4为本发明一种实施例的成型模具板的剖视图；
图5为本发明一种实施例的成型基板的结构示意图；
图6为本发明一种实施例的成型基板的剖视图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种细胞聚球培养模具，如图1所示，包括模具本体1，所述模具本体1顶端的中部设有向内凹陷的培养面板2，所述培养面板2的外侧形成围合所述培养面板2的围板3，培养面板2的端面低于围板3上边缘的高度。
模具本体1整体呈板状，图中示例为方形板状，其也可以是圆形板状、菱形板状、六角形板状或其他形状，模具本体1可以由琼脂糖或其他凝胶状材料制成。围板3整体围合在培养面板2的外周，因此所述围板3的横截面形状即为该模具本体1的横截面形状，例如该围板3的横截面形状可以是图1中的方形，也可以呈环状、菱形、六角形或其他形状。对应于所述围板3的形状，培养面板2的上表面可以是图中的方形，也可以呈环状、菱形、六角形或其他形状。如图中的示例，优选地，模具本体1的总高度是3mm，培养面板2的边长为21mm，围板3的厚度约为其边长的1/10，围板3上边缘相对于培养面板2高2mm。
当然，本领域技术人员可以根据实际需要确定上述培养面板和围板的具体形状和尺寸，在此不做赘述。
如图2所示，所述培养面板2的表面凹陷设有若干用于盛放组织培养液的培养孔4，所述培养孔4包括位于培养孔4底端呈球缺形的球状部41，还包括与所述球状部41相连接并延伸至平齐培养面板2表面的呈圆柱体状的柱状部42。
上述培养孔4可以分布于培养面板2的整个表面，也可以仅在培养面板2表面的部分区域分布。其分布方式可以是均匀规律的分布，也可以是不均匀的无序分布。当然，为了便于对肝细胞取用，其分布方式优选为均匀规律分布，具体可以呈点阵状分布。球状部41的开口宽度可以大于、等于或小于柱状部42的直径。
在一种优选的实施例中，上述球状部41为半球形，上述柱状部42的直径与球状部41的直径相同。因而柱状部42与球状部41之间的过渡更加圆滑，培养孔4的内壁更加光滑，肝细胞更加不容易附着，更有利于形成三维立体结构的肝细胞聚球。
更进一步的，较优地，所述培养孔4的直径为400um，所述培养孔4的最大深度为400um。该尺寸的培养孔限制了单个肝细胞聚球的大小，以便于后续对肝细胞聚球的移植培养。
使用上述细胞聚球培养模具培养肝细胞聚球的方法如下：
1.常规培养瓶分别培养肝细胞、内皮细胞与星状细胞；
2.待上述细胞达到80％融合状态时，将上述三种细胞制成2*106cell/ml的细胞悬液，并将三种细胞以6：2：0.5的比例进行均匀混合；
3.将制成的琼脂糖模具放入细胞培养孔板中，并且用完全培养基浸泡所述琼脂糖模具1h以上，然后在细胞接种前吸尽孔板和模具凹槽中的培养基；
4.将细胞混悬液接种至上述细胞聚球培养模具中，细胞接种量约为1000cells/well；接种后静置10min，待细胞落入凹槽中后，给孔板中加入一定量完全培养基，使液面高于所述模具的围板3的上边缘1-2mm，完全浸没所述模具；
5.将上述细胞聚球培养模具放置于5％CO2的孵箱中培养，直至细胞聚球生长形成直径约250um的细胞球。
6.使用吸管吹打培养孔，使细胞聚球与细胞聚球培养模具分离，静止后获得细胞聚球沉淀；
6.将上述细胞球沉淀移植到其他培养器皿中继续培养，或者直接用于组织工程研究，如进行活体移植、用生物相容性材料进行包裹，或进行药物研究等。
本发明实施例还提供一种用于制作细胞聚球培养模具的成型模具板，如图3所示，其包括模具板本体5，所述模具板本体5包括底板51以及设置在底板51上的固定台52，固定台52的顶端设有凹槽6，所述凹槽6的底面设有凸台7，所述凸台7的高度低于所述固定台52上边缘的高度，所述凸台7的侧壁与所述凹槽6的侧壁之间设有周向环绕所述凸台7的挡板槽8。
模具板本体5可以由聚二甲基硅氧烷PDMS或其他材料制成。固定台52为长方体形，底板51为圆形板状，其也可以是方形板状、菱形板状、六角形板状或其他形状。凹槽6可以是方形、圆形、菱形或其他形状，对应的，凸台7也可以是方形、圆形、菱形或其他形状。凸台7的侧面与所述凹槽6的侧壁之间间隔一定距离，且凸台7的每个侧面与凹槽6的侧壁之间的间隔距离可以相等，也可以不相等，从而在凸台的侧面形成环绕所述凸台7的挡板槽8。
如图4所示，所述凸台7的表面设有若干突起9，所述突起9包括从凸台7表面向上突出的呈圆柱体状的柱状体91以及位于突起9顶端并连接所述柱状体91的呈球缺形的球状体92。
上述突起9可以分布于凸台7的整个表面，也可以仅在凸台7表面的部分区域分布。其分布方式可以是均匀规律的分布，也可以是不均匀的无序分布。当然，为了便于其所制作模具对肝细胞的取用，其分布方式优选为均匀规律分布，具体可以呈点阵状分布。球状体92的宽度可以大于、等于或小于柱状体91的直径。
在使用上述成型模具板时，可以向成型模具板内注入热熔的注塑料，例如聚二甲基硅氧烷PDMS，使得注塑料填充成型模具板的凹槽6，注塑料冷却后，即可成型为上述实施例的细胞聚球培养模具。其中，凸台7的侧面与所述凹槽6侧壁之间的挡板槽8所填充的注塑料形成模具本体1的围板3，凸台7上方填充的注塑料形成模具本体1的培养面板2，突起9使得培养面板2形成培养孔4，相应的，柱状体91使得培养孔4具有柱状部42，球状体92使得培养孔4具有球状部41。当然，上述成型模具板的各部件与细胞聚球培养模具的各部件具有相吻合的形状和尺寸，在此不做赘述。
在一种优选的实施例中，所述球状体92为半球形，所述柱状体91的直径与所述球状体92的直径相同。因而，球状体92与柱状体91之间的过渡加圆滑，所制造的细胞聚球培养模具的培养孔4的内壁更加光滑，肝细胞更加不容易附着，更有利于形成三维立体结构的肝细胞聚球。
更进一步的，所述突起9的直径为400um，所述突起9的最大高度为400um。该尺寸的培养孔限制了单个肝细胞聚球的大小，以便于后续对肝细胞聚球的移植培养。
本发明实施例还提供一种用于制作上述成型模具板的成型基板，如图5和图6所示，所述成型基板的顶端具有第一容置槽101，所述第一容置槽101槽底的中部设有第二容置槽102，所述第二容置槽102槽底的中部设有培养台103，所述培养台103的高度低于所述第一容置槽101槽底的高度。所述培养台103的侧壁与所述第二容置槽102的侧壁之间设有环绕培养台103的围合槽104；所述培养台103顶端的中部设有第三容置槽105，所述第三容置槽105的底面设有若干注塑孔106，所述注塑孔106包括位于注塑孔106底端呈球缺形的注塑球部108以及连接所述注塑球部108并向第三容置槽105底面延伸呈圆柱体状的注塑柱部107。
在一种优选的实施例中，所述注塑球部108为半球形，所述注塑柱部107的直径与所述注塑球部108的直径相同。因而，注塑球部108与注塑柱部107之间的过渡加圆滑，所制造的细胞聚球培养模具的培养孔的内壁更加光滑，肝细胞更加不容易附着，更有利于形成三维立体结构的肝细胞聚球。
更进一步的，所述注塑孔106的直径为400um，所述注塑孔106的最大高度为400um。该尺寸的培养孔限制了单个肝细胞聚球的大小，以便于后续对肝细胞聚球的移植培养。
本发明实施例还提供一种细胞聚球培养模具的制造方法，其包括如下步骤：
1.制作成型基板：使用制图软件绘制成型基板的结构图，进而确定掩膜表面的图案，制作具有相应图案的菲林掩膜；在硅片上旋涂光刻胶，使用已制备好的掩膜对硅片进行光刻处理，制成上述的成型基板。
其中，上述成型基板的注塑孔的成型需要经过两次掩膜处理，其具体过程如下：
使用预定的一次掩膜对硅片表面进行第一次光刻处理，使第三容置槽的底面形成若干圆柱体状的注塑孔，采用温控SU-8热熔的方法使柱状凹陷依靠表面张力自动圆滑变为球柱状凹陷，使注塑孔的孔底呈球缺形。在调整注塑孔的位置的温度时，可以通过调节光线照射量，使光刻胶变软，其厚度从注塑孔轴心位置沿径向依次加厚，因而，光线照射量从注塑孔轴心位置沿径向依次减少，从而使得注塑孔的孔底呈球缺形。
2.制作成型模具板：向步骤1制得的成型基板内注入热熔的注塑料，使注塑料填充成型基板的第一容置槽，经冷却成型后制得上述成型模具板。
该成型模具板可以参照图3和图4，其包括模具板本体5，所述模具板本体5包括底板51以及设置在底板51上的固定台52，固定台52的顶端设有凹槽6，所述凹槽6的底面设有凸台7，所述凸台7的高度低于所述模具板本体5表面的高度，所述凸台7的侧壁与所述凹槽6的侧壁之间设有围合所述凸台7的挡板槽8；所述凸台7的表面设有若干突起9，所述突起9包括从凸台7表面向上突出的呈圆柱体状的柱状体91以及位于突起9顶端并连接所述柱状体91的呈球缺形的球状体92。
第一容置槽101上部填充的注塑料形成底板51，第二容置槽102内填充的注塑料形成固定台52，第三容置槽105内填充的注塑料形成凸台7，第三容置槽105的外围形成相应的挡板槽8，注塑孔106内填充的注塑料形成突起9，注塑球部形成相应的球状体92，注塑柱部形成相应的柱状体91。
其中，注塑料聚可以选用聚二甲基硅氧烷PDMS，聚二甲基硅氧烷与硅具有良好的粘附性，因而经注塑成型的成型模具板与成型基板的形状和尺寸更加吻合，所制得的成型模具板的精度更高。
3.制作细胞聚球培养模具：向所述成型模具板内注入热熔的凝胶材料，经冷却成型后，从所述成型模具板中取出所制得的肝细胞培养模具。肝细胞培养模具的具体结构见图1所示。其中，所述凝胶材料可以选用琼脂糖。
以上对本发明所做出的详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (14)
1.一种细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述细胞聚球培养模具顶端的中部设有向内凹陷的培养面板，所述培养面板的外侧形成围合所述培养面板的围板；所述培养面板的表面设有若干用于盛放培养细胞的培养孔，所述培养孔包括位于培养孔底端呈球缺形的球状部以及连接所述球状部并并延伸至平齐培养面板表面呈圆柱体状的柱状部。
2.根据权利要求1所述的细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述球状部为半球形。
3.根据权利要求2所述的细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述柱状部的直径与所述球状部的直径相同。
4.根据权利要求3所述的细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述培养孔的直径为200～400um，所述培养孔的深度为300～400um。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述培养孔在所述培养面板的表面呈点阵状均匀分布。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述细胞聚球培养模具由1～3％琼脂糖制成。
7.根据权利要求1-4任意一项所述的细胞聚球培养模具，其特征在于：
所述培养面板和围板一体化成型。
8.一种用于制作如权利要求1-7任意一项所述细胞聚球培养模具的成型模具板，其特征在于：
所述成型模具板的顶端设有凹槽，所述凹槽的底面设有凸台，所述凸台的高度低于所述成型模具板表面的高度，所述凸台的侧面与所述凹槽的侧壁之间设有周向环绕所述凸台的挡板槽；所述凸台的表面设有若干突起，所述突起包括从凸台表面向上突出的呈圆柱体状的柱状体以及位于突起顶端并连接所述柱状体的呈球缺形的球状体。
9.根据权利要求8所述的成型模具板，其特征在于：
所述成型模具板由聚二甲基硅氧烷PDMS制成。
10.一种用于制作如权利要求8或9所述成型模具板的成型基板，其特征在于：
所述成型基板的顶端具有第一容置槽，所述第一容置槽槽底的中部设有第二容置槽，所述第二容置槽槽底的中部设有培养台，所述培养台的高度低于所述第一容置槽槽底的高度；所述培养台的侧壁与所述第二容置槽的侧壁之间设有周向环绕培养台的围合槽；所述培养台顶端的中部设有第三容置槽，所述第三容置槽的底面设有若干注塑孔，所述注塑孔包括位于注塑孔底端呈球缺形的注塑球部以及连接所述注塑球部并向第三容置槽底面延伸呈圆柱体状的注塑柱部。
11.一种细胞聚球培养模具的制造方法，其特征在于，包括如下步骤：
使用预制掩膜对硅片进行光刻处理，制成如权利要求10所述的成型基板；
向所述成型基板内注入热熔的注塑料，冷却成型后制得如权利要求8所述的成型模具板；
向所述成型模具板内注入热熔的凝胶材料，经冷却成型后制得细胞聚球培养模具。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，制作成型基板的步骤中，所述注塑孔的成型过程如下：
使用预制的一次掩膜对硅片表面进行第一次光刻处理，使第三容置槽的底面形成若干圆柱体状的注塑孔，加热驱使柱体状的注塑孔变圆滑，使注塑孔的孔底呈球缺形。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述注塑料为聚二甲基硅氧烷PDMS。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：
所述凝胶材料为琼脂糖。
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