CN103119151B - 培养基材 - Google Patents

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Abstract

有效地进行球状体培养。培养基材是制作对细胞进行培养、使其三维凝集而成的球状体的培养容器。培养基材包含合成树脂材料。在培养基材的表面形成有成为细胞培养隔室的多个凹坑部(20)。多个凹坑部(20)通过对培养基材表面照射激光而形成。在凹坑部(20)的开口周边形成有合成树脂材料熔解、上升而成的堤坝部(22)。彼此接近的2个凹坑部(20)之间的培养基材表面为非平坦面。

Description

培养基材
技术领域
本发明涉及一种培养细胞、组织片等被培养物来制作球状体的培养基材。
背景技术
近年，代替二维培养细胞的单层培养，关注一种培养细胞并使其三维凝集的球状体培养。与单层培养相比，球状体培养能够构建接近生物体内的细胞的状态，能够诱发细胞在生物体内所具有的特异性功能。
作为进行球状体培养的现有培养基材101的一例，可以列举例如图11所示的容器。如图12所示，该容器的底面114形成有彼此空有间隔的多个凹坑部120。容器的底面114用细胞粘附抑制剂(省略图示)覆膜(参照专利文献1)。
球状体培养是使作为球状体前体的细胞经搅拌而成的培养液50流入培养容器内并在凹坑部120内培养细胞。这样，如图12所示，与凹坑部120的形状、大小对应地培养凹坑部120内的细胞，三维凝集，形成球状体60。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2007/055056号小册子
发明内容
发明要解决的问题
但是，使用上述现有培养基材101进行球状体培养时，发现存在如下问题：除了球状体60外，还形成众多的单层培养的细胞62、大小不均一的球状体。可以认为该原因在于，如图12所示，现有培养基材101的彼此接近的凹坑部120间的基板表面形成为平坦面130。像这样形成该平坦面130时，当使细胞经搅拌而成的培养液50流入培养容器内时，细胞也沉淀在平坦面130上。当培养容器内存在这样的细胞时，除了与凹坑部的大小对应的球状体60外，还可能二维地进行培养，或者形成不受凹坑大小影响的大小无规则的球状体。像这样，通过现有培养基材101无法有效地进行均一地形成期望大小的球状体的培养。这些单层培养的细胞、大小无规则的球状体和与凹坑大小对应的均一的球状体相比生理功能存在差异，在干细胞培养的情况下，培养容器内的细胞群的均一性降低，如分化的程度不同，等等，妨碍实验数据的评价等。
因此，本发明是为了解决上述课题而进行的，目的在于提供能够均一地形成期望大小的球状体、可以有效地进行培养的培养基材。
用于解决问题的方案
为了达成上述目的，本发明的培养基材的特征在于，在培养基材表面形成多个凹坑部，所述凹坑部形成用于培养被培养物的隔室，彼此接近的前述凹坑部之间的培养基材表面为非平坦面。
发明的效果
根据本发明，能够有效地进行球状体培养。
附图说明
图1是本发明的第1实施方式的培养基材的立体图。
图2是本发明的第1实施方式的培养基材的纵剖面图。
图3是本发明的第1实施方式的培养基材的孔形成区域的局部立体图。
图4是图3的IV-IV向视剖面图。
图5是图3的V-V向视剖面图。
图6是在本发明的第1实施方式的培养基材的表面上示意性表示激光的照射光斑的平面图。
图7是本发明的第2实施方式的培养基材的孔形成区域的局部剖面图。
图8是本发明的第3实施方式的培养基材设置在培养皿内的状态的纵剖面图。
图9是本发明的第4实施方式的培养基材的俯视图。
图10是本发明的第4实施方式的培养基材的纵剖面图。
图11是现有培养基材的纵剖面图。
图12是在现有培养基材的表面上示意性表示被培养物的剖面图。
具体实施方式
[第1实施方式]
使用图1～图6说明本发明的第1实施方式的培养基材。
图1是具有本发明的培养基材的培养容器的立体图。图2是培养容器的纵剖面图。图3是培养基材的孔形成区域的局部立体图。图4是图3的IV-IV向视剖面图。图5是图3的V-V向视剖面图。图6是在培养基材的表面上表示所照射的激光的照射光斑的平面图。
本实施方式的培养基材1是制作对细胞进行培养、使其三维凝集而成的球状体(细胞凝集块)的培养容器的主要部分。
首先，说明本实施方式的培养基材1的特征。
如图1和图2所示，培养容器具备容器主体10和盖12。该例中，容器主体10的内侧的底板部14为相当于培养基材1的部分。所述容器主体10的内侧的底板部14、即培养基材1由例如聚苯乙烯等合成树脂材料构成。本实施方式中，培养基材1通过使用了合成树脂材料的注射成型而得到。
容器主体10具有圆板状的底板部14和环状的侧壁部16。侧壁部16从底板部14的外周缘竖起。本实施方式中，设计成底板部14的直径为85mm、底板部14的厚度为1mm。此外，设计成侧壁部16的高度为20mm。
盖12形成为与容器主体10上方的开口部对应的形状。盖12用于盖住容器主体10，以维持细胞的培养环境。
如图2～图5所示，在底板部14的上表面(即相当于容器主体10的内侧面的培养基材的上表面)的孔形成区域24(即形成用于培养被培养物的隔室的区域)形成有多个凹坑部20。凹坑部20的内表面为光滑的凹面。凹坑部20形成用于培养被培养物的隔室(孔：well)。本实施方式中，直径85mm的圆形的孔形成区域24形成有14200个左右(约250个/cm2)的凹坑部20。
本实施方式中，凹坑部20通过对培养基材表面的孔形成区域24照射激光而形成。如图6所示，激光照射对设置于x-y面上的底板部14的上表面沿着z轴方向照射激光而进行。
首先，边使激光照射装置的照射部沿着x轴的正方向扫描边隔着一定的间隔(例如800μm)照射激光，形成沿着x轴方向排列的多个凹坑部20。接着，使照射部沿着y轴方向按照一定的距离(例如400μm)扫描后，边使照射部沿着x轴的负方向扫描边隔着一定的间隔(例如800μm)照射激光，形成沿着x轴方向排列的多个凹坑部20。同样地，使照射部沿着y轴方向按照一定的距离(例如400μm)扫描。重复上述操作，在底板部14的上表面形成规则地排列的多个凹坑部20。
本实施方式中，如图6所示，以照射光斑A的中心坐标(x，y)为原点(0，0)，接近照射光斑A的照射光斑B的中心位于(0.8，0)、照射光斑C的中心位于(0.4，0.4)、照射光斑D的中心位于(-0.4，0.4)。通过这样地使照射光斑A、B的x坐标和照射光斑C、D的x坐标错开，可以在孔形成区域24密集地形成多个凹坑部20。凹坑部20优选在培养基材1的孔形成区域24的单位面积形成10个/cm2～10000个/cm2。进而优选为20个/cm2～8000个/cm2，更优选为20个/cm2～3000个/cm2。
上述表示数值范围的“～”只要没有特别限定则以包含其前后记载的数值作为下限值和上限值的意思来使用，以下，本说明书中“～”以同样的意思来使用。
本实施方式中，激光源使用CO2激光，激光以10W的输出功率、6100mm/分钟的照射速度进行脉冲照射。照射光斑的形状为圆形，其直径为约400μm。球状体过小时，无法产生期望的生理功能，此外，当其过大时，球状体的中心部会发生坏死。考虑到上述情况，照射光斑的直径优选为20～1500μm。
予以说明，与照射光斑的形状为圆形相对地，凹坑部20的开口形状扁平且呈略椭圆形。该开口形状的扁平认为是在容器主体10成型时在模具中流入合成树脂材料的方向所导致的。
当对培养基材表面(底板部14的上表面)照射激光时，构成底板部14的合成树脂材料熔解，形成凹坑部20。进而，如图3～图5所示，在凹坑部20的开口周边，熔解的合成树脂材料上升而形成堤坝部22。
本实施方式中，彼此相邻的2个凹坑部20隔着1个或2个堤坝部22而形成，彼此接近的凹坑部20间的培养基材表面不残留平坦面。即，彼此接近的凹坑部20间的培养基材表面为非平坦面30。予以说明，图4所示的图3的IV-IV向视剖面中，夹在相邻的2个凹坑部20之间的2个堤坝部22彼此连接而形成非平坦面30。
通过调节激光的照射位置、输出功率量等照射条件，可以调节接近的凹坑部20间的距离、凹坑部20的径-深度、堤坝部22的宽度-高度等。本实施方式中，按照彼此接近的凹坑部20间的培养基材表面不残留平坦面的方式、即按照彼此接近的凹坑部20间的培养基材表面为非平坦面30的方式设定激光的照射条件并进行激光照射。
予以说明，凹坑部20的深度(即，如图4、5所示，以激光照射前的底板部14(即培养基材)的上表面为基准的深度)d期望设计为10～1500μm，本实施方式中，设计为200±20μm。予以说明，底板部14的厚度根据深度d适当设计使其不贯通。此外，略椭圆形的凹坑部20的开口的长径(激光照射前的底板部14的上表面中的长径)D期望设计为10～1500μm，本实施方式中，设计为500±20μm。进而，堤坝部22的高度(即，如图4、5所示，以激光照射前的底板部14的上表面为基准的高度)h期望设计为10～50μm，本实施方式中，设计为25±5μm。
底板部14的上表面、即相当于培养基材部分的表面优选通过细胞粘附抑制剂(省略图示)形成覆膜。培养基材细胞粘附抑制剂发挥抑制细胞粘附到底板部14的上表面、尤其是凹坑部20的内表面的作用。作为细胞粘附抑制剂，可以使用例如磷脂聚合物、聚甲基丙稀酸羟乙酯或聚乙二醇等。
下面，对使用了本实施方式的培养基材1的被培养物的培养方法进行说明。
将作为被培养物的作为球状体前体的细胞导入培养液50，并搅拌。搅拌后，使培养液50流入容器主体10内(参照图2)。从而，培养液50中的细胞发生沉淀，收纳在凹坑部20内。
然后，将盖12盖在容器主体10上，放置数天～数十天。凹坑部20内的细胞被培养、增殖。此时，由于凹坑部20的内表面通过细胞粘附抑制剂形成覆膜，因此细胞与凹坑部20的形状、大小对应地进行三维凝集。从而得到球状体。
接下来，对本实施方式的培养基材1的效果进行说明。
根据本实施方式，彼此接近的凹坑部20间的培养基材表面为非平坦面30。因此，发生沉淀的被培养物容易收纳在凹坑部20内。
在现有培养基材101中，相邻的凹坑部120间的培养基材表面形成为平坦面130。因此，在平坦面130中，细胞进行单层培养或者形成不受凹坑部120大小影响的大小无规则的球状体。另一方面，本实施方式的培养基材1中，相邻的凹坑部20间的培养基材表面为非平坦面30。因此，不易进行单层培养或形成不均一的球状体，形成均一的球状体的概率高，能够高效地进行球状体培养。
根据球状体的用途、所培养细胞的种类等，欲制作的球状体的大小各不相同。因此，在制作球状体时，需要准备具有与期望的球状体的大小对应的凹坑部20的培养基材1。其中，本实施方式中，通过激光照射形成凹坑部20和堤坝部22。因此，可以通过调节照射位置、输出功率量等照射条件，在培养基材1上容易地形成任意大小的凹坑部20和堤坝部22。
此外，在作为培养基材使用聚苯乙烯等透明合成树脂材料且对该合成树脂材料通过激光照射加工来形成凹坑部时，凹坑部20的剖面形状为开口向上且由于激光的热而使凹坑部20的内表面光滑，能够降低透射光发生漫反射，能够容易地利用显微镜观察在凹坑部20内培养的球状体。
[第2实施方式]
使用图7说明本发明的第1实施方式的培养基材。图7是培养基材的孔形成区域的局部剖面图。予以说明，本实施方式是第1实施方式的变形例，与第1实施方式相同的部分或类似的部分带有相同的附图标记，省略重复说明。
第1实施方式中，多个凹坑部20和堤坝部22通过对培养基材表面照射激光而形成。另一方面，本实施方式中，培养基材1使用具备用于形成多个凹坑部20的凸部和用于形成堤坝部22的凹部的模具将合成树脂材料注射成型而得到。多个凹坑部20和堤坝部22与培养基材1的成型同时形成。
如图7所示，本实施方式中，在培养基材1的培养基材表面形成有半球状的凹坑部20和剖面半圆状的堤坝部22。使用模具通过注射成型制造培养基材1，从而能够形成均一性更高的凹坑部20，能够提高所形成的球状体的均一性。
[第3实施方式]
使用图8说明本发明的第1实施方式的培养基材。图8是培养基材设置在培养皿内的状态的纵剖面图。予以说明，本实施方式是第1实施方式的变形例，与第1实施方式相同的部分或类似的部分带有相同的附图标记，省略重复说明。
第1实施方式的培养基材1在培养容器的内侧的底面(底板部14的上表面)形成有多个凹坑部20。另一方面，本实施方式的培养基材1由形成为圆板状的合成树脂材料形成。就培养基材1而言，在将合成树脂材料注射成型为圆板状的基板后对其一个表面照射激光，从而在培养基材1的一个表面形成多个凹坑部20。
如图8所示，本实施方式的培养基材1设置在例如玻璃制培养皿40内而使用。根据本实施方式，与第1实施方式相比，培养基材1的成型容易，能够降低制造成本。
[第4实施方式]
使用图9和图10说明本发明的第4实施方式的培养基材。图9是培养基材的俯视图。图10是具有具备培养基材的容器主体和盖的培养容器的纵剖面图。予以说明，本实施方式是第1实施方式的变形例，与第1实施方式相同的部分或类似的部分带有相同的附图标记，省略重复说明。
如图9所示，本实施方式的培养基材1相当于容器主体10的底板部14，在该底板部14的上表面具有4个圆形的孔形成区域24。4个孔形成区域24彼此空有间隔而配置。并且，培养基材1的各个孔形成区域24中，基材表面形成有多个形成用于培养被培养物的隔室的凹坑部，彼此接近的前述凹坑部之间的基材表面为非平坦面。
本实施方式中，在4个孔形成区域24上，使用移液管等滴加加入有作为球状体前体的细胞并搅拌而成的培养液50、含有受精卵的培养液50。然后，如图10所示，使矿物油52流入容器主体10内。此时，培养液50和矿物油52不混杂。以该状态放置数天～数十天，制作球状体或培养受精卵。
根据本实施方式，可以在1个培养基材1中制作数种球状体。
[其它实施方式]
上述各实施方式为代表性例示，本发明并非仅限于这些。例如，培养基材1的材料可以不是合成树脂材料而是玻璃。此外，培养基材1的形状、大小可以任意设计。进而，凹坑部20和堤坝部22的形状、大小也可以根据所培养的细胞、期望的球状体的形状、大小而任意设计。
此外，还可以将上述实施方式组合。例如，可以如第2实施方式说明的那样，通过注射成型来形成第3实施方式的圆板状的培养基材1的凹坑部20。
产业上的可利用性
根据本发明，彼此接近的凹坑部间的培养基材表面为非平坦面，因此发生沉淀的被培养物容易收纳于凹坑部，此外由于为非平坦面，不易二维地进行单层培养或形成不均一的球状体，三维地形成均一凝集的球状体的概率高，能够高效地进行球状体培养。
予以说明，在此将2010年9月14日提出的日本专利申请2010-205305号的说明书、权利要求书、附图和摘要的全部内容引入并作为本发明公开的内容。
附图标记说明
1…培养基材、10…容器主体、12…盖、14…底板部、16…侧壁部、20…凹坑部、22…堤坝部、24…孔形成区域、30…非平坦面、40…培养皿、50…培养液、52…矿物油。

Claims (11)

1.一种培养基材，其特征在于，在培养基材表面形成多个凹坑部，所述凹坑部形成用于培养被培养物的隔室，彼此接近的所述凹坑部之间的培养基材表面为非平坦面，
在平坦的底面部的上表面形成培养基材的凹坑、堤坝，
彼此接近的凹坑部之间的培养基材表面与凹坑部形成为连续的曲面。
2.根据权利要求1所述的培养基材，其特征在于，夹在彼此接近的所述凹坑部之间的所述非平坦面具有堤坝部。
3.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，至少所述凹坑部的内表面通过细胞粘附抑制剂形成覆膜。
4.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，所述凹坑部的开口的直径为20μm以上且1500μm以下。
5.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，所述凹坑部的深度为10μm以上且1500μm以下。
6.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，所述多个凹坑部密集地配置在所述培养基材表面。
7.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，在所述培养基材表面的孔形成区域的表面形成多个所述凹坑部。
8.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，在所述培养基材表面的孔形成区域的表面形成10个/cm2～10000个/cm2的所述多个凹坑部。
9.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，所述凹坑部是通过向所述培养基材表面照射激光而形成的。
10.根据权利要求1或2所述的培养基材，其特征在于，所述培养基材的材质包含合成树脂。
11.一种培养容器，其具备权利要求1～10中任一项所述的培养基材。
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