CN1875093A - 细胞培养器材和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞培养器材，其包括体部、围绕体部的外壁和在外壁周界以内的多个容器。各容器的顶部边缘在外壁边缘以下。一种在多孔格培养平皿中使一种物质与多种类型细胞相互作用的方法，该方法包括使不同类型的细胞沉积在该培养平皿的分开孔格中，用液体培养基连通这些孔格，将该物质加入液体培养基中。

Description

细胞培养器材和使用方法

                     相关申请的交叉参考

本申请要求2003年11月10日提交的美国临时申请号60/518331的优先权，纳入本文作为参考。

                            发明领域

本发明涉及组织培养容器，更具体说，涉及一种新的用于共培养多种类型细胞和组织的改进型组织培养容器，以及此细胞培养装置在生物研究中的应用，包括在药物发现和开发中的应用。

                            发明背景

培养器材，如培养皿、培养板、培养瓶和其它类型容器，已广泛在各种实验室中应用。在通常应用中，细胞和组织培养包括用琼脂和培养基覆盖孔底部。在研究实验室中，将常规培养的细胞用于基本生物化学和细胞生物学研究，以进一步了解天然生物过程。近年来，已将细胞培养系统用于药物发现和开发，来检测候选药物的药理和毒理作用。此项工作通常是一种单一培养测试过程，即在组织培养容器如孔、板或瓶中用合适的培养基培养一种类型的细胞。

普通的细胞培养板由可充满液体的垂直壁围绕的平底小室以及能保持湿度和保护不受污染的可移动的盖子组成。如图1A和1B所示，常用的多孔板100具有六个相同的孔110。虽然可通过，例如整体灌注和吹塑形成孔110，但是优选的制造方法是形成具有确定各孔中所含体积的上层托盘120和确定各孔底面的下层或底层托盘130组成的板100。孔110的深度以及孔110的直径决定了各孔110的液体容量。例如一般六孔板中各孔110的直径约为0.35厘米，深度约为2.0厘米，这些孔优选为规则的2×3矩形排列。

如图1B所示，细胞140沉积在各孔110的底部。然后加入液体150覆盖细胞140。

通常称为体外系统的细胞培养系统广泛用于药物发现和开发，用于评价药物特性。例如，将细胞培养系统用于评价药效、药物代谢或药物毒性。然而，也认识到体外系统不能准确预测体内效果，因为体外系统中缺少复杂和相互作用的生物过程。例如，可采用原代肝细胞培养来评价某物质对肝细胞的作用。然而，在体内该物质可能被其它器官如肾所代谢，而产生的代谢物可能对肝细胞具有不同的作用，故不能仅采用肝细胞来检测。因此，开发细胞共培养是令人感兴趣的。共培养涉及在一群细胞的存在下培养另一群细胞。细胞共培养已被应用于多种生物学研究。在药理学和毒理学中，共培养重要器官如肝脏的细胞与靶细胞如癌细胞，可以评价化学物质经过重要器官的细胞修饰后，如特定药物或候选药物经过肝脏代谢后对靶细胞的作用。采用普通的细胞培养板时，可将不同类型细胞混合或利用膜使两种类型细胞培养在膜两侧的方法来实现共培养方法。物理混合后或采用膜来评价各个类型细胞可能非常困难和烦琐。因此，需要新的有利于细胞共培养的细胞培养器材。

                            发明概述

在一个总的方面，细胞培养板包括体部、由体部延伸的外壁和由该体部构型确定的多个容器。各容器的顶部边缘在该外壁边缘以下。

实施方式可包括以下特征的一种或多种。例如，该体部可具有平的表面，各容器在该体部平表面中凹陷，此凹陷构型可容纳一定体积的液体。容器可具有圆柱形壁和圆形底，该体部的外表面可以是矩形板形状。外壁高度可约20毫米。

在一个实施方式中，各容器是与体部连接的杯形，各杯的顶部边缘在外壁边缘以下。在另一实施方式中，该容器包括具有容器壁和顶部边缘的容器，容器壁的高度约为4毫米。在又一实施方式中，各容器包括分隔外壁周界所确定的空间的隔板壁，该隔板壁具有一顶部边缘。

在另一个总的方面，多孔培养皿包括具有多个孔格的平表面的底座和围绕该底座的外壁。各孔格包括容器壁，其高度低于外壁高度。实施方式可包括上述特征的一种或多种，所述培养皿也可包括六个孔格。

在另一个总的方面，可用管道连接多个培养容器，装有或不装有使液体循环的装置(如泵)。

在另一个总的方面，在多孔培养皿中使一种物质与一种以上类型的细胞物质相互作用的方法包括：将不同类型的细胞沉积在培养皿的分隔孔中，用液体培养基连通这些孔，将该物质加入液体培养基中。在各种实施方式中，该物质可包括化学物质或药物。

在另一个总的方面，在多孔培养皿代谢一种药物的方法包括：将不同类型的细胞沉积在多孔培养皿的分隔孔中，用液体培养基连通这些分隔的孔，将药物加入到液体培养基中。

实施方式可包括以下特征的一种或多种，或任何上述特征。例如，所述细胞可包括肝细胞、肾细胞、脾细胞或肺细胞，任何可培养的细胞，和/或组织碎片或组分。

在另一个总的方面，在具有六孔体部和环绕六个孔的壁的细胞培养皿中代谢药物的方法包括：将肾细胞沉积在六个孔的第一孔中，肝细胞沉积在六个孔的第二孔中，心脏细胞沉积在六个孔的第三孔中，肺细胞沉积在六个孔的第四孔中，脾细胞沉积在六个孔的第五孔中，脑细胞沉积在六个孔的第六孔中，用液体培养基充满该培养皿，以使这六个孔液体相连，然后将药物加入到液体培养基中。

在另一个总的方面，在一个孔格中共培养不同细胞的方法包括让各孔的液体溢出以使这些孔格液体相连，因此各孔中的不同细胞通过共同液体培养基相联系。

该方法可包括各种实施方式。例如，各孔中的不同细胞包括第一孔中的肝细胞，第二孔中的肾细胞，第三孔中的心脏细胞，第四孔中的脾细胞，第五孔中的脑细胞，和第六孔中的肺细胞。在另一实施方式中，各孔中的不同细胞包括第一、第二和第三孔中为肝细胞，和第四、第五和第六孔中为心脏细胞。在又一实施方式中，该方法包括将一种物质加入到共同液体培养基中，以使各孔中不同细胞与该同一物质接触。

在另一个总的方面，在具有分隔孔的培养皿中测试某药物的安全性和药效的方法包括：将某生物体的不同细胞沉积在该培养皿的分隔孔中，将有害物质沉积在另一分隔孔中，用液体培养基使这些分隔孔相互连通，将一定剂量的该药物加入到液体培养基中。

该方法可包括以下特征的一种或多种，或任何上述特征。例如，该方法可包括确定该药物所用剂量是否对该生物体的不同细胞有害，确定该药物所用剂量是否能减少有害物质，和/或如果该药物所用剂量对该生物体的不同细胞无害且不能减少有害物质，则增加该药物剂量。

有害物质可包括肿瘤细胞，所述药物可包括抗肿瘤药。所述生物体的不同细胞可包括人体的肝细胞、肾细胞、心脏细胞、肺细胞、脾细胞和/或脑细胞。

该方法还可包括提高药物剂量，直到该药物损伤了生物体的不同细胞，将该生物体不同细胞受到损伤的此药物剂量指定为毒性水平剂量。该方法也可包括提高药物剂量，直到有害物质的作用降低，将有害物质作用降低的药物剂量指定为有效水平剂量。

有害物质可以是胆固醇，所述药物可以是抗胆固醇药，不同细胞包括肝细胞。在另一实施方式中，有害物质包括癌细胞，所述药物是在特定剂量以上产生不良毒性的抗癌药。

在另一个总的方面，在多孔皿中共培养细胞的方法包括：将第一种类型细胞培养在多孔皿的第一孔中，将第二种类型细胞培养在多孔皿的第二孔中。第二孔中培养的细胞可产生有益于第一种类型细胞生长的代谢产物。

在另一个总的方面，评价第一种类型细胞能否促进第二种类型细胞的生长的方法包括：将第一种类型细胞培养在第一孔中，将第二种类型细胞培养在第二孔中，使第一孔和第二孔液体相连，检查培养的第一种类型细胞对第二种类型细胞生长的影响。

所述细胞培养器材提供了共培养多种类型细胞的方便方法，但这些细胞仍然是物理上隔开的，以便在共培养后可以在没有共培养细胞的情况下分别评价各类型细胞。

该培养板可在各孔中以不同条件，如不同的附着基质、不同培养基或不同类型细胞来培养细胞，然后通过共同培养基使不同孔相互连通。用共同培养基整合培养后，可去除该培养基，对各孔进行独立的特定操作，如用去污剂裂解以测量特定的生化物质或者固定并染色进行形态学评价。

如上述方法所述，一种应用是培养多种得自不同器官的原代细胞(如肝、心脏、肾、脾、神经元、血管内膜细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、虹膜细胞、癌细胞)，所以该培养板在建立和长满了各类型细胞后，能够代表整体动物的体外实验模型。该培养板的另一应用是评价某物质对多种类型细胞的作用。在药物发现和开发中，此培养系统可用于评价不同器官的细胞对新药或候选药物的代谢作用，或者药物或候选药物对多种器官的细胞的功能和活力的影响。

此应用的一个例子是：将多种器官的细胞与肿瘤细胞一起培养，然后用某抗癌药处理该共培养物，比较该药物对不同器官细胞的毒性与对癌细胞的毒性，评价该药物的治疗指数。换言之，各培养板模拟了用抗癌药治疗整体动物，然后检查各器官的情况。也可用多种类型的肿瘤细胞来评价受测药物或候选药物对不同类型肿瘤的效果。

可利用该器材培养需要其它类型细胞提供外源性因子的细胞，而无需将这些类型的细胞物理混合，因为将不同类型细胞置于不同孔中时重叠的培养基允许交换代谢物和/或分泌的生物分子。

                            附图简要说明

图1A是常规多孔培养板的立体图；

图1B是图1A所示常规多孔培养板的截面图；

图2A是所述细胞培养器材的立体图；

图2B是图2A所示细胞培养器材的截面图；

图3A是所述细胞培养器材的另一实施方式的立体图；

图3B是图3A所示细胞培养器材的截面图；

图4A是所述细胞培养器材的又一实施方式的立体图；

图4B是图4A所示细胞培养器材的截面图；

图5A是具有隔开的小室，每小室有多个孔的细胞培养器材的立体图；

图5B是图5A所示细胞培养器材的截面图；

图6显示了动物的器官系统的一部分；

图7是评价多种类型细胞对外源性物质代谢的流程图；

图8是评价外源性物质对多种类型细胞的毒性的流程图；

图9是确定某药物治疗指数的流程图；和

图10显示了具有插入托盘的细胞培养器材。

附图中所用的参考编号与发明详述中的编号相对应，以易于参照。

                            发明详述

使本发明具体化的器材200、300、400的实施方式见图2A-5B和图10。培养板200、300、400包括多个孔格，在各孔格中可培养一种类型细胞，但可使各孔溢出或长满细胞，以致不同孔格中的细胞可共享共同的培养基。这可通过将各孔格的形状定为较大板内的凹陷(图2A和2B)，将短隔板置入较大板内(图3A和3B)，或将小插入板置入较大板内(图4A和4B)来实现。然而，本发明可应用于每块板具有任意数量孔格的任何多孔格形式。

参照图2A和2B，本发明的多孔板200包含的体部205具有基本平坦的上表面210，和从体部205延伸的外壁215。通过上表面210中的凹陷在体部205中形成六个孔220。各孔220具有的容器壁225可从平表面210向下倾斜或垂直于平表面210。

培养板200的总尺寸可长12.60厘米，宽8.40厘米。体部205的高度可以是0.20厘米，从平表面210向上延伸的外壁215高约为0.15厘米。各容器壁225的高度可以是0.05厘米。将孔220设置为规则排列，分开大约0.02厘米。在另一实施方式(未显示)中，将这些孔置于一个圆周上使这些孔相互等距。然而，培养板200的这些尺寸仅为说明性，培养板200的构型是使各孔220(中的培养液)能够溢出，以使在共同液体培养基中连通诸孔220，同时防止各孔220中的细胞被冲走。

参照图3A和3B，多孔格培养板300的体部305包括被外壁315围绕的平坦上表面310。隔板320位于上表面310上，将外壁315围绕的空间分成六个孔格325。外壁315从上表面310向上延伸0.15厘米，隔板的高度约为0.05厘米。因此，各孔325可溢出，在液体培养基中连通诸孔325。

隔板320粘合于上表面310和外壁315。在另一实施方式中，隔板320可取出。

参照图4A和4B，多孔培养板400的体部405包括被外壁415围绕的平坦上表面410。插入物420位于平面410上，各插入物由底面425和容器壁430界定。容器壁高约0.05厘米，从上表面410向上延伸的外壁高为0.15厘米。在其它实施方式中，插入物420可包括可从上表面310取出的杯、皿或托盘。

可将如图2A-4B所述的多孔板集合成组，形成细胞培养托盘500，成为具有多个空腔或小室510的单一体部505(图5A和5B)，每个腔室510具有多个孔515，得以在各腔室中进行不同细胞的选择、液体培养基或不同外源性物质实验。围绕各腔室510的限制性壁520比腔室510内各孔515的容器壁525高，限制性壁520高0.20厘米，较大的体部505内各孔515的高度为0.04厘米。

培养板200-500可用各种合适材料制备。在一个实施方式中，培养板200-500由基本坚硬的、不溶于水、不透水、一般为热塑性的材料制备，它基本不会与用培养板200-500进行试验所用的液体发生化学反应。本文所用术语“基本坚硬的”指该材料在轻微的机械载荷或热负荷下不会变形或翘曲，这种变形会造成不能保持基本平坦的表面，但是该材料可具有一些弹性。合适的材料包括例如：含有或不含共聚物的聚苯乙烯或聚氯乙烯，聚乙烯，聚苯乙烯，聚苯乙烯-丙烯腈，聚丙烯，聚偏-1，1-二氯乙烯等。可采用聚苯乙烯是因为它是用于细胞培养容器的常用聚合物，这是由于它的特征是与蛋白质的非特异性结合非常低，这使其适合用于掺入一种或多种感兴趣蛋白质的样品，如血液、病毒和细菌。玻璃也是一种合适的材料，它是细胞培养容器中常规使用的材料，每次使用后可洗涤和灭菌。

该细胞培养板可用于测试药物代谢。如图6所示，已知代谢药物的主要器官是肝脏610、肠和肾620，而其它器官如心脏630、脾640、肺650和血管660也具有特定的代谢途径。参照图7，采用细胞培养板的方法包括评价多种类型细胞700对外源性物质的代谢。利用该器材可将主要器官包括肝、肠、肾、心脏、脾、肺和脑的细胞置入多孔板中，将不同器官的细胞分别置入不同孔中(操作710)。例如，在六孔板中，肝细胞置于孔1中，肠细胞置于孔2中，肾细胞置于孔3中，心脏细胞置于孔4中，脾细胞置于孔5中，肺细胞置于孔6中。可利用不同的附着基质和培养基来培养各类型细胞(操作720)，例如，最好在胶原上培养肝细胞，并需要补充胰岛素和地塞米松；在琼脂悬液中培养脾细胞等。建立各类型细胞后，可使各孔溢出而“淹没”该板，让不同孔中的细胞共享共同的液体培养基(操作730)。可将外源性物质如药物、候选药物、环境污染物或天然产物加入到培养基中(操作740)，孵育特定时间(操作750)。孵育后，可收集该培养基，用已建立的分析方法检查代谢程度(母体物质还剩多少)，或代谢结局(鉴定的代谢物是什么)(操作760)。

参照图8，利用该细胞培养板的另一方法800包括评价外源性物质对多种类型细胞的毒性。易受药物毒性影响的主要器官是肝、肠、肾、心脏、脾、肺和脑。利用该器材时，可将肝、肠、肾、心脏、脾、肺、脑和血管的细胞置入多孔板中(操作810)。将不同器官的细胞置入不同孔中。例如，在八孔板中，肝细胞置于孔1中，肠细胞置于孔2中，肾细胞置于孔3中，心脏细胞置于孔4中，脾细胞置于孔5中，肺细胞置于孔6中，脑细胞置于孔7中，血管细胞置于孔8中。可利用不同的附着基质和培养基来培养各种类型细胞(操作820)，例如，最好在胶原上培养肝细胞，并需要补充胰岛素和地塞米松；在琼脂悬液中培养脾细胞等。建立各种类型细胞后，可使各孔溢出“淹没”该板，让不同孔中的细胞共享共同的液体培养基(操作830)。可将外源性物质如药物、候选药物、环境污染物或天然产物加入到培养基中(操作840)，然后孵育该混合物特定时间(操作850)。孵育后，可去除该培养基，通过细胞形态学分析，如显微镜分析，以及生化分析，如用去污剂裂解后，测定各孔中细胞的ATP含量，来评价对各种类型细胞的毒性(操作860)。

该细胞培养板也可用于评价药效和药物安全性。在药物发现中，利用完整的细胞作为药效的指示物。例如，可用肝细胞来评价药物对胆固醇合成的作用，来开发新的胆固醇合成抑制剂，如能降低高胆固醇患者的胆固醇水平的药物。如上所述，可培养多种器官来源的细胞，来评价候选药物对多种器官胆固醇合成的作用。该方法可利用此培养体系同时评价药效、代谢和毒性。

例如，可用肝细胞作为指示细胞通过测定潜在新药的效果和毒性来评价该药治疗高胆固醇的“治疗指数”。可在所有关键类型细胞的代谢都存在的情况下测定药效，从而模拟代谢可能降低新药药效(或提高药效)的体内环境。

参照图9，确定某药物治疗指数的方法900包括将细胞沉积在多孔板的分开孔中(操作910)，将有害物质如肿瘤细胞沉积在另一孔中(操作920)，利用液体培养基连通这些孔(操作930)，将药物加入该液体培养基中(操作940)。

通过测定药物对各种器官细胞的作用来评价安全性(操作950)。如果该药物伤害了任何器官的细胞，就认为该药物的剂量超过了安全水平(操作960)。如果健康细胞是完整的，则检测该药物减少有害物质的作用。如果有害物质减少，将结果记录为有效剂量水平(操作970)。然后提高该药物的剂量(操作980)，重复此过程。

该培养板也可用于高通量筛选(HTS)过程，来评价大量的潜在候选药物。在此方法中，利用装有多孔板的机器人系统进行实验。如上所述通过采用本文所述的多室培养板，可利用共培养的多种类型细胞进行HTS药效、毒性和代谢。

又一方法包括评价共培养条件。一些类型细胞可促进对难于培养的类型细胞的培养。这样做常常会遇到艰难和失误。采用HTS方式，可检测不同类型细胞对难于培养细胞生长的作用。例如，为了评价哪种细胞最适合维持培养的肝细胞分化，可将肝细胞在培养室1中与类型1细胞(如内皮细胞)共培养；在培养室2中与类型2细胞(如3T3细胞)共培养，等等。在共培养结束后，评价该肝细胞的特性，而不会因共培养细胞而复杂化。

参照图10，显示细胞培养板1000适合用于测定药物的吸收。细胞培养板1000的体部1105包括被外壁1115围绕的基本平坦的上表面1110。通过使上表面1110凹陷形成体部1105中的六个孔1120。各孔1120的容器壁1125垂直于平面1110。

插入托盘1130放在外壁1115顶端的唇边1135上。插入托盘1130包括装有多孔膜1145的室1138，多孔膜1145位于外壁1115内侧。

将小肠细胞1140置于离膜最近的室1138底部。当培养板1000加满液体时，液面水平升高超过膜1140，将药物1150加入室1138中。当药物1150穿过膜1140与细胞1120相互作用时被“吸收”。因此，可通过测定吸收量来模拟药物在肠内的吸收。

因为可对上述装置和方法做出某些改变，但这不背离本文所包括的本发明范围，应认为以上说明书中所述或附图中所示的所有内容都是说明性而非限制性。例如，如果以不同顺序实施本文所公开技术的各步骤和/或如果以不同方式组合本文所公开系统中的各组分和/或用其它组分取代或补充，仍然可以获得有益结果。因此，这些其它实施方式包括在所附权利要求书的范围内。

Claims (18)

1.一种细胞培养器材，所述器材包括：体部，它在贮存容器中界定了多个孔格，各孔格可装有一定体积的液体。

2.如权利要求1所述的细胞培养器材，其特征在于，所述体部包括：

一个具有基本平表面的托盘；

从所述平表面延伸从而界定了多个孔格的多个容器壁；和

围绕所述平表面从而界定了所述贮存容器的外壁，该外壁高度在容器壁高度之上。

3.如权利要求2所述的细胞培养器材，还包括：

具有可渗透膜的平皿，将所述平皿构造在外壁上，从而使渗透膜位于容器内。

4.如权利要求1所述的细胞培养器材，其特征在于，所述体部包括：

具有基本平表面的板，板上具有多个凹陷，各凹陷界定了多个孔格；和

围绕所述板的壁，其高度在所述平表面以上，从而界定了所述贮存容器。

5.如权利要求4所述的细胞培养器材，还包括：

具有可渗透膜的平皿，将所述皿构造在壁上，从而使渗透膜位于容器内。

6.一种在具有多个孔格的基本平表面和环绕所述平表面的壁的培养皿中使一种物质与多种类型的细胞相互作用的方法，所述方法包括：

将多种细胞培养在分开的孔格中；

将液体培养基加到平表面以上的高度，以使这些孔格流体相互连通；和

将所述物质加入到使这些孔格相互连通的液体培养基中。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述物质加入液体培养基包括：

使所述物质沉积在可渗透膜的一侧上；和

使可渗透膜的另一侧与所述液体培养基相接触。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，沉积所述物质包括使肠上皮细胞沉积在可渗透膜的一侧上。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加入所述物质包括加入化学组合物。

10.如权利要求6所述的方法，还包括：

使细胞沉积在所述孔格中，包括：

使肾细胞沉积在第一孔格中，

使肝细胞沉积在第二孔格中，

使心脏细胞沉积在第三孔格中，

使肺细胞沉积在第四孔格中，

使脑细胞沉积在第五孔格中，和

使癌细胞沉积在第六孔格中；和

加入所述物质，包括将药物或候选药物加入到液体培养基中。

11.如权利要求6所述的方法，其特征在于，加入所述物质包括加入一定剂量的药物或候选药物。

12.如权利要求11所述的方法，还包括：

测定所述药物或候选药物对各种类型细胞是否具有所需作用。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，测定所述药物或候选药物是否具有所需作用包括测定所述药物或候选药物是否显示抗癌作用，所述抗癌作用定义为对癌细胞的毒性。

14.如权利要求11所述的方法，还包括：

测定所述药物或候选药物对各种类型细胞是否具有不良作用。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，测定所述药物或候选药物是否具有不良作用包括测定所述药物或候选药物是否对正常细胞有毒性。

16.如权利要求6所述的方法，还包括：

测定加入的物质在多种细胞中的分布。

17.如权利要求6所述的方法，还包括：

测定加入的物质通过与多种细胞的相互作用所发生的生物转化。

18.一种在一个具有多个孔格的托盘中评价第一种类型细胞对第二种类型细胞性质的影响的方法，所述方法包括：

分别在第一组孔格中培养第一种类型细胞，在第二组孔格中培养第二种类型细胞；和

使第一组孔格和第二组孔格流体相连。

Images