DE102011078184B3

DE102011078184B3 - Biotransformationssensor

Info

Publication number: DE102011078184B3
Application number: DE201110078184
Authority: DE
Inventors: Ulrich Bohrn; Maximilian Fleischer; Evamaria Stütz
Original assignee: Siemens AG
Current assignee: Siemens AG
Priority date: 2011-06-28
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2012-10-25
Anticipated expiration: 2031-06-29
Also published as: WO2013000693A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bewertung mindestens einer chemischen Substanz hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen und deren entsprechende Verwendung. In einem Strömungssystem wird ein biotransformiertes Nährmedium (4) in Kontakt mit einer Detektions-Zellkultur (9) gebracht, an die mindestens ein Sensor (10) angrenzt, der physiologische Veränderungen der Zellen der Detektions-Zellkultur (9) zeitgleich misst.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bewertung mindestens einer chemischen Substanz hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen und eine entsprechende Verwendung dieser Vorrichtung.
Seit den frühen Anfängen der Toxikologie hat sich gezeigt, dass das Wissen um die metabolischen Wege von Giftstoffen ein entscheidender Schritt in der Beurteilung der pharmakologischen und toxikologischen Daten ist. Ungiftige Substanzen können durch Biotransformation, das heißt durch Metabolisierung, die eine chemische Umwandlung ist, in eine giftige Substanz umgewandelt werden. Beispiele hierfür sind die Umwandlung von Methanol in Formaldehyd, die Umwandlung von Parathion in Paraoxon und die Umwandlung von CCl₄ in CCl₃-Radikale. Der Vorgang wird ebenso als Giftung bezeichnet. Hauptverstoffwechselungsorgan im menschlichen Körper ist die Leber, da diese das höchste Expressionslevel an biotransformierenden Enzymen aufweist. Andere Gewebe, wie es beispielsweise die Nasenschleimhaut ist, zeigen ebenso eine derartige Fähigkeit.
Bei einigen Substanzen ist ein umgekehrter Weg bekannt. Ein Wirkstoff wird zuerst in nicht-aktiver Form aufgenommen und erst durch die Umwandlung durch eine Biotransformation wird die Substanz in die eigentliche Wirkform übertragen. Handelt es sich dabei um Medikamente, wie es beispielsweise das Schlafmittel Chloradiazepoxid ist, so bezeichnet man diese Medikamente als Prodrugs.
Obwohl auf einem extrazellulären Metabolisierungssystem beruhende in vitro Modelle nicht die komplexen Wechselwirkungen eines gesamten Organismus widerspiegeln können, erhalten derartige in vitro Methoden steigende Beachtung, da diese in sehr kurzer Zeit viele Informationen einer sehr großen Anzahl an Substanzen liefern können. Die großen Unterschiede zwischen den Metabolisierungsprozessen der einzelnen Säugetierarten erschwert die Interpretation von toxikologischen Daten aus Tierversuchen in deren Extrapolation auf den menschlichen Organismus.
Ein Vergleich von Tierversuchsdaten mit denen von menschlichen in vitro Modellen ermöglicht eine korrekte Darstellung der toxikologischen Vorgänge im menschlichen Körper.
Die bekanntesten in vitro Modelle verwenden die Leber als das Hauptbiotransformationsorgan, und zwar in unterschiedlichen Formen. Einerseits wird versucht die Biotransformation durch Durchleitung von Substanzen durch die ganze Leber ex vivo zu ermöglichen. Andere Herangehensweisen begnügen sich mit der Verwendung von Leberextrakten, wie es beispielsweise das so genannte S9 ist, zur Biotransformation. Derartige Leberextrakte enthalten hohe Mengen an hepatogenen Enzymen, und zwar beispielsweise Cytochrome, und zwar beispielsweise Cytochrom P450, die eine Biotransformation in sehr großem Ausmaß bewirken. Die tatsächliche Biotransformationsrate, bezogen auf die verwendete Anzahl an Leberzellen, kann jedoch nicht festgestellt werden, da sich die Enzyme außerhalb der Hepatozyten, die Leberzellen sind, und somit außerhalb ihrer natürlichen Umgebung befinden. Die Verwendung von isolierten und aufgereinigten Enzymen ist sehr zeitaufwändig und arbeitsintensiv. Die Verwendung von Leberschnitten ist eine bekannte Möglichkeit. Hierbei ist die Gewebsorganisation zumindest teilweise aufrecht erhalten. Des Weiteren ergeben sich Zell-Zell-Interaktionen, die berücksichtigt werden müssen. Ebenso ist die Verwendung von Cytochrom-überexprimierenden Säugetierzellen bekannt, wie es beispielsweise bei HepG2 der Fall ist. Intakte Säugetierzellen stellen einen geeigneten Kompromiss dar zwischen reduktionistischen Ansätzen und der Notwendigkeit so nah wie möglich an der in vivo Situation zu sein.
Es ist Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung und deren Verwendung zur einfachen und zuverlässigen Bewertung biotransformierter chemischer Substanzen hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen bereitzustellen.
Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß dem Hauptanspruch und eine Verwendung der Vorrichtung gemäß dem Nebenanspruch gelöst.
Gemäß einem ersten Aspekt wird eine Vorrichtung zur Bewertung mindestens einer chemischen Substanz hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen bereit gestellt, wobei die Vorrichtung als ein Strömungssystem ausgebildet ist, das die in einem Nährmedium gelöste chemische Substanz zuerst in Kontakt mit einer die chemische Substanz in eine biotransformierte chemische Substanz metabolisierende Biotransformations-Zellkultur und nachfolgend die biotransformierte chemische Substanz in Kontakt mit einer lebende Zellen aufweisenden Detektionszellkultur bringt, an die mindestens ein Sensor angrenzt, der physiologische Veränderungen zeitgleich bei Kontakt der biotransformierten chemischen Substanz mit den Zellen der Detektions-Zellkultur zur Bestimmung der Schädlichkeit der biotransformierten chemischen Substanz für lebende Zellen misst.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Bewertung mindestens einer chemischen Substanz hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen verwendet, wobei die Vorrichtung als ein Strömungssystem ausgebildet ist, bei dem die in einem Nährmedium gelöste chemische Substanz zuerst in Kontakt mit einer die chemische Substanz in eine biotransformierte chemische Substanz metabolisierende Biotransformations-Zellkultur und nachfolgend die biotransformierte chemische Substanz in Kontakt mit einer lebende Zellen aufweisenden Detektions-Zellkultur gebracht wird, wobei mindestens ein an die Detektions-Zellkultur angrenzender Sensor physiologische Veränderungen zeitgleich bei Kontakt der biotransformierten chemischen Substanz mit den Zellen der Detektions-Zellkultur zur Bestimmung der Schädlichkeit der biotransformierten chemischen Substanz für lebende Zellen ist.
Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ermöglicht eine erfindungsgemäße Vorrichtung und eine entsprechende Verwendung die Beobachtung von physiologischen Veränderungen der lebenden Zellen der Detektions-Zellkultur bei Beaufschlagung mit biotransformierten Stoffen in Echtzeit. Der Sensor detektiert physiologische Veränderungen dieser Zellen zeitgleich mit deren Kontakt mit den biotransformierten Stoffen. Es wird eine Echtzeitmessung der physiologischen Veränderungen geschaffen. Des Weiteren erfolgt bei der erfindungsgemäßen zellulären Biotransformation die Metabolisierung, das heißt die Biotransformation, der chemischen Substanzen nicht mittels Enzymlösungen oder Zellisolaten. Auf diese Weise ermöglicht eine erfindungsgemäße Vorrichtung und eine erfindungsgemäße Verwendung, die näher an der tatsächlichen Situation in vivo ist.
Durch das Strömungssystem, das ebenso als Flusssystem bezeichnet werden kann, können die Zellen über einen längeren Zeitraum mit der gleichen Konzentration an chemischen Substanzen im Nährmedium beaufschlagt werden. Bei herkömmlichen Testsystemen in Gefäßen ohne Flusssystem kommt es mit der Zeit zur Anreicherung der ausgeschiedenen und metabolisierten Substanzen, die ihrerseits wieder mit der Zellkultur wechselwirken.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und entsprechenden Verwendungen können die Auswirkungen der Biotransformation chemischer Substanzen auf lebendige Zellen durch ein auf physiologischen Veränderungen beruhendes Messsignal abgelesen werden. Auf diese Weise können gegenüber dem Stand der Technik verbessert Stoffe detektiert werden, die gesundheitsschädlich sind. Es können besonders wirksam Stoffe detektiert beziehungsweise erfasst werden, die primär nicht schädlich sind, aber durch Biotransformation in schädliche Stoffe umgewandelt werden können.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen werden in Verbindung mit den Unteransprüchen beansprucht.
Gemäß einer vorteilhaften Ausgestaltung kann das Strömungssystem das Nährmedium durch einen die Biotransformations-Zellkulturen beinhaltenden erste Behälter und nachfolgend durch einen den die Detektions-Zellkultur tragenden Sensor beinhaltenden zweiten Behälter treiben.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Strömungssystem den ersten Behälter mit einem in Schwerkraftrichtung oben angeordneten Einlass zum Einströmen des Nährmediums in Schwerkraftrichtung zu der Biotransformations-Zellkultur und in dem zweiten Behälter in Schwerkraftrichtung unten den die Detektions-Zellkultur tragenden Sensor und einen Auslass zum Ausströmen des Nährmediums ausbilden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Strömungssystem den ersten Behälter als eine in Schwerkraftrichtung oberen Bereich und den zweiten Behälter als einen in Schwerkraftrichtung unteren Bereich eines Kulturgefäßes ausbilden und mittels eines in Schwerkraftrichtung unteren wasserdurchlässigen Bodens des ersten Behälters voneinander trennen. Auf diese Weise nutzt das Strömungssystem energiesparend die Schwerkraft zum Treiben des Nährmediums.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Strömungssystem von dem ersten Behälter zu dem zweiten Behälter eine Verbindungsleitung ausbilden, mit der das Nährmedium mittels einer Pumpeinrichtung von dem ersten Behälter in den zweiten Behälter gepumpt wird. Mittels der Pumpe kann besonders vorteilhaft eine Strömungsgeschwindigkeit von dem ersten zum zweiten Behälter eingestellt werden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Strömungssystem einen Einlass in die Verbindungsleitung unter einem Boden des ersten Behälters und ein Auslass aus der Verbindungsleitung durch einen Deckel hindurch als ein Einlass des zweiten Behälters ausbilden. Auf diese Weise wird besonders einfach die Pumpwirkung der Pumpe durch die Schwerkraft unterstützt. Des Weiteren kann der Boden des ersten Behälters als Filter ausgebildet sein, der lediglich das biotransformierte Nährmedium durchlässt.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung können die Biotransformations-Zellkultur auf den Boden des ersten Behälters und der Boden des ersten Behälters als eine Membran ausgebildet sein. Die Membran ist besonders vorteilhaft biokompatibel, das heißt, insbesondere chemisch stabil bei Kontakt mit den biochemischen Substanzen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann die Biotransformations-Zellkultur auf losen Substratkörpern, die kugelförmig sein können und ebenso als Beads bezeichnet werden können, im ersten Behälter und der Boden des ersten Behälters als eine Membran ausgebildet sein. Die Membran ist besonders vorteilhaft biokompatibel.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann die Biotransformations-Zellkultur als eine Sol-Gel-Suspension im ersten Behälter und der Boden des ersten Behälters als eine für Wasser durchlässige und für die Sol-Gel-Suspension undurchlässige Auflage ausgebildet sein.
Eine erfindungsgemäße Membran oder Auflage ist derart bereit gestellt, dass diese lediglich das biotransformierte Nährmedium hindurch lassen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann das Nährmedium als ein flüssiges Zellkultur-Medium erzeugt sein. Dies ist eine besonders einfache Ausgestaltung beispielsweise im Vergleich zu einem gasförmigen Nährmedium. Ein flüssiges Nährmedium ist leichter handhabbar.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung können der Auslass des zweiten Behälters und/oder ein Auslass der Verbindungsleitung jeweils ein Ablassventil zur kontaminationsfreien Entnahme des Nährmediums aufweisen. Auf diese Weise wird ein erfindungsgemäßes Strömungssystem als ein geschlossenes System bereit gestellt. Das heißt, die Entnahme einer Flüssigkeitsmenge des ein- beziehungsweise zweifach biotransformierten Nährmediums kann bei einem geschlossenen System erfolgen, so dass sich die Gefahr von Pilz- oder Bakterienkontaminationen, beispielsweise im Hinblick auf Langzeitanwendungen, wirksam verringert.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann der erste Behälter des Kulturgefäßes in Schwerkraftrichtung oben eine Öffnung aufweisen, in die ein vertikal relativ verschiebbarer Durchflusskopf aufgenommen ist, der den Einlass und eine Druckausgleichsöffnung aufweist.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann der die Detektions-Zellkultur tragende Sensor lediglich einen Teil eines Bodens des zweiten Behälters bedecken, so dass auf dem anderen Teil des Bodens des zweiten Behälters ein Abfluss zur Abnahme des lediglich biotransformierten Nährmediums ausgebildet werden kann. Eine derartige Abnahme des Nährmediums kann kontaminationsfrei ausgeführt werden, wenn der Abfluss mit einem Ablassventil geschaffen ist.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann der erste Behälter einen den Einlass aufweisenden Deckel aufweisen, wobei der Einlass ein Ausgang eines oberhalb des Deckels angeordneten Reservoirs des lediglich mit der zu bewertenden Substanz vermischten Nährmediums sein kann.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann eine Wärme- und/oder Kühlreinrichtung an mindestens einer Position des Strömungssystems eine Temperatur regeln. Auf diese Weise kann besonders einfach eine Umgebungsbedingung von lebenden Zellen bereit gestellt werden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung können die Substratkugeln beziehungsweise Beads Polystyren, Glas, Gelatine, Dextran oder magnetische Materialien aufweisen.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung können die Zellen der Biotransformations-Zellkultur und/oder der Detektions-Zellkultur tierisch, pflanzlich, von einem Menschen oder von einem Insekt sein.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung können die Zellen Hep-G2, Hep-3B, SK-HEP-1, PLC-PRF-5, Chang-liver, BRL-3A, AS-30-D, A549 und RPMI2650-Zellen sein.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung kann die zu bewertende chemische Substanz ein Wirkstoff, ein Gift, eine Arznei, eine Haushaltschemikalie oder ein Fermentationsprodukt sein.
Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Figuren näher beschrieben.
Es zeigen:
1 ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
2 das erste Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem gefüllten Zustand;
3 das erste Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einer Abwandlung;
4 ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
5 ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
6 ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.
1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. 1 zeigt einen Querschnitt einer ungefüllten, geschlossenen, vertikalen Vorrichtung zur Online-Messung physiologischer Veränderungen einer Zellkultur bei Kontakt mit biotransformierten chemischen Substanzen.
1 zeigt einen Ausgangszustand, bei dem kein Nährmedium mit gelösten zu untersuchenden chemischen Substanzen Zellen einer Detektions-Zellkultur 9 und einer Biotransformations-Zellkultur 3 bedeckt. Als Biotransformations-Zellkulturen 3 eignen sich beispielsweise folgende zelluläre Prüfsysteme, bei denen eine intrazelluläre Metabolisierungskapazität angenommen wird:

1. Isolate von Primärzellen mit unterschiedlich definierten und in Abhängigkeit von der jeweiligen Isolierungstechnik und dem Isolierungsbatch verschieden vorhandenen Metabolisierungsfähigkeiten beziehungsweise -kapazitäten, und zwar Hepatozyten der Rattenleber oder von humanen Biopsien.
2. Immortalisierte Hepatozyten-Zelllinien, die je nach Subpopulation eine unterschiedliche Metabolisierungsfähigkeit beziehungsweise -kapazität besitzen können, wie es beispielsweise die humane Hepatomzelllinie HepG2 ist.
3. Gentechnologisch veränderte Zellsysteme, wie es beispielsweise von V79 abgeleitete Zelllinien mit definierter Expression spezifischer Cytochrom P-450 Formen sind.
4. Co-Kulturen von metabolisch kompetenten Zellen und nicht metabolisierenden Zellen des primären Zielgewebes der Noxe.
5. Gewebeschnitte. Grundsätzlich sind alle biotransformierenden Zellkulturen vom Schutzumfang der Erfindung umfasst.

1 zeigt ein Kulturgefäß 1, das in einem vertikal mittleren Bereich eine Membran 2 aufweist, auf der die Biotransformations-Zellkultur 3 aufgewachsen ist. Unterhalb der Membran 2 bildet das Kulturgefäß 1 ein Abflussreservoir 5 aus.
Das Kulturgefäß 1 bildet in Schwerkraftrichtung oben einen ersten Behälter und unterhalb der Membran 2 einen zweiten Behälter aus, der das Abflussreservoir 5 erzeugt. Der erste Behälter weist in Schwerkraftrichtung oben eine Öffnung aus, in der ein Durchflusskopf 6 aufgenommen ist. Dieser weist einen Einlass 7 und eine Druckausgleichsöffnung 13 auf. Der Durchlasskopf 6 und der erste Behälter können relativ zueinander vertikal verschiebbar sein, sodass das Volumen des ersten Behälters dem Volumen eines in den ersten Behälter eingeströmten Nährmediums 4 entspricht. In einem Fuß des Kulturgefäßes 1 sind auf einem Substrat 15 mindestens ein Sensor 10 ausgebildet, auf dem die Detektions-Zellkultur 9 aufgewachsen ist. Im untersten Bereich des zweiten Behälters ist ein Auslass 8 geschaffen, der mittels eines Ablassventils 14 geöffnet und geschlossen werden kann. Eine der Messung dienende Oberfläche des Sensors 10 ist der Detektions-Zellkultur 9 zugewandt.
2 zeigt das erste Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 1, diesmal mit einem Nährmedium 4 befüllt. 2 zeigt einen Querschnitt der gefüllten, geschlossenen, vertikalen Vorrichtung zur online Messung physiologischer Veränderungen einer Zellkultur bei Kontakt mit biotransformierten chemischen Substanzen. Das in 2 dargestellte erste Ausführungsbeispiel umfasst als Aufnahmeeinheit für Zellen das Kulturgefäß 1 mit einer Vielzahl von Komponenten zur Beaufschlagung mit in dem Nährmedium 4 gelösten chemischen Substanzen. Dabei ist der Durchflusskopf 6 gegenüber dem Kulturgefäß 1 in vertikaler Richtung verschiebbar angeordnet. Auf dem Boden des Kulturgefäßes 1 sind mehrere planare chemische, elektrochemische und physikalische Sensoren 10 ausgebildet. Beispielsweise können auf einer Chipfläche von beispielsweise 0,7088 cm² fünf Protonenaktivitätssensoren, fünf Sauerstoffsensoren und ein Impedanzsensor untergebracht sein, die mit einer Betriebsschaltung verbunden sind. Protonenaktivitätssensoren, Sauerstoffsensoren und Impedanzsensoren sind Ausführungsbeispiele eines erfindungsgemäßen Sensors 10. Derartige Sensoren können beliebig kombiniert werden. Vom Schutzumfang der Erfindung sind beliebe Anzahlen von Sensoren 10 umfasst. Ein Sensorchip kann beispielsweise mit einem nicht dargestellten Hebel auf Kontakten der Betriebsschaltung befestigt werden. Weiterhin ist im Kulturgefäß 1 auf den chemischen, elektrochemischen und/oder physikalischen Sensoren 10 die Detektions-Zellkultur 9 ausgebildet. Dabei bilden die Sensoren 10 den Boden des Kulturgefäßes 1, so dass die Zellen der Detektions-Zellkultur 9 direkt auf den Sensoren anhaften. Unterhalb der Sensoren 10 ist das Substrat 15 ausgebildet. Über dem Boden des Kulturgefäßes 1 ist eine biokompatible Membran 2 in einem Abstand zu dem Boden des Kulturgefäßes 1 an einer Umwandlung des Kulturgefäßes 1 angebracht. Auf der Oberseite der Membran haften Zellen der Biotransformations-Zellkultur 3 an. Das Volumen zwischen dem Boden des Kulturgefäßes 1 und der Membran 2 bildet das Abschlussreservoir 5. Über eine in den Durchflusskopf 6 gebohrte Zuflussöffnung als Einlass 7 kann das Nährmedium 4 mit den gelösten chemischen Substanzen zu der auf der Membran 2 fest anhaftenden Biotransformations-Zellkultur 3 zugeführt werden.
Der sich ergebende Zustand ist in 2 dargestellt. Die Biotransformations-Zellkultur 3 metabolisiert die im Nährmedium 4 gelösten chemischen Substanzen und gibt sie an das Nährmedium 4 zurück. Durch die Membran 2 kann das nun mit biotransformierten chemischen Substanzen angereicherte Nährmedium 4 langsam in das Abflussreservoir 5 tropfen. Das Abflussreservoir 5 füllt sich mit dem Nährmedium 4 und kommt in direkten Kontakt mit der Detektions-Zellkultur 9. Die biotransformierten chemischen Substanzen im Nährmedium 4 lösen eine Zellreaktion der Detektions-Zellkultur 9 aus, welche über die Sensoren 10 im Kulturgefäß 1 detektiert werden kann. Über den verschließbaren Auslass 8 kann das Nährmedium 4, welches in Kontakt mit der Biotransformations-Zellkultur 3 und der Detektions-Zellkultur 9 gekommen ist, aus dem Abflussreservoir 5 abgelassen werden.
3 zeigt das erste Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 2 mit einer Modifikation. 3 zeigt einen Querschnitt einer gefüllten, geschlossenen, vertikalen Vorrichtung zur online Messung physiologischer Veränderungen einer Zellkultur bei Kontakt mit biotransformierten chemischen Substanzen, wobei zusätzlich ein zweiter Auslass 12 aus dem Abflussreservoir 5 ausgebildet ist. 3 zeigt eine Abänderung des in 2 dargestellten Systems. Eine partielle Erhöhung des Bodens des Kulturgefäßes 1 leitet das durch die Membran 2 tropfende biotransformierte Medium über den zweiten Abfluss 12 aus der Vorrichtung und erlaubt separate biologische, chemische und/oder physikalische Analysen des biotransformierten Nährmediums 4, welches nur in Kontakt mit der Biotransformations-Zellkultur 3 gekommen ist.
4 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. 4 zeigt einen Querschnitt einer gefüllten, zweigeteilten, horizontalen Vorrichtung zur online Messung physiologischer Veränderungen einer Zellkultur bei Kontakt mit biotransformierten chemischen Substanzen, und zwar mit einem Nährmediumsreservoir 18, einer Pumpe 16 und einer als Verbindungsschlauch ausgeführten Verbindungsleitung 19. Die Vorrichtung bildet die Verbindungsleitung 19 von einem ersten Behälter zu einem zweiten Behälter aus. Mittels einer Pumpeinrichtung 16 wird das Nährmedium 4 von einem Auslass 8 des ersten Behälters und der Verbindungsleitung 19 in den zweiten Behälter gepumpt. Der Auslass 8 aus dem ersten Behälter entspricht einem Einlass in die Verbindungsleitung 19 und ist unter einem Boden des ersten Behälters beziehungsweise in einem Boden des ersten Behälters ausgebildet oder positioniert. Ein Auslass aus der Verbindungsleitung 19 ist durch einen Deckel 17 des zweiten Behälters hindurch als ein Einlass in den zweiten Behälter ausgebildet. Der erste Behälter weist ebenso einen den Einlass 7 aufweisenden Deckel 17 auf, wobei dieser Einlass 7 ein Ausgang eines oberhalb des Deckels 17 angeordneten Reservoirs 18 des Nährmediums 4 ist. Die Biotransformations-Zellkultur 3 kann direkt auf dem Boden des ersten Behälters ausgebildet sein. Die Biotransformations-Zellkultur 3 kann alternativ auf einer Membran 2, die in 4 nicht dargestellt ist, oberhalb des Bodens des ersten Behälters ausgebildet sein. Die Biotransformations-Zellkultur 3 kann alternativ auf einem Filter erzeugt sein, der lediglich das biotransformierte Nährmedium 4 in die Verbindungsleitung 19 gelangen lässt. Die Verbindungsleitung 19 kann im Bereich des Auslasses 8 einen Abfluss 12 aufweisen, der zur kontaminationsfreien Abnahme des Nährmediums 4 ein Ablassventil 14 aufweist. Ebenso weist der zweite Behälter einen Auslass 8 mit einem Ablassventil 14 zur kontaminationsfreien Abnahme des Nährmediums 4 auf. Die jeweiligen Deckel 17 des ersten und des zweiten Behälters sind lose auf diesen aufgelegt. Sie können mit dem jeweiligen Behälter geklemmt sein. Der zweite Behälter kann also ein Kulturgefäß 1 ausgebildet sein, in dessen Fuß ein Substrat 15 ausgebildet ist, auf dem der oder die die Detektions-Zellkultur 9 tragenden Sensoren 10 positioniert sind. Mit den Ablassventilen 14 kann die jeweilige Füllhöhe des Nährmediums 4 in dem jeweiligen Behälter eingestellt werden.
5 zeigt ein drittes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. 5 zeigt einen Querschnitt einer ungefüllten, geschlossenen vertikalen Vorrichtung zur online Messung physiologischer Veränderungen einer Zellkultur bei Kontakt mit biotransformierten chemischen Substanzen, wobei die Biotransformations-Zellkultur 3 als eine Suspension in einem Sol-Gel 20 erzeugt ist. Im Übrigen entspricht dieses Ausführungsbeispiel dem ersten Ausführungsbeispiel, wobei an Stelle einer Membran 2 eine für Wasser durchlässige und für die Sol-Gel-Suspension 20 undurchlässige Auflage 21 ausgebildet ist. Durch diese Auflage 21 kann das hier nicht dargestellte biotransformierte Nährmedium 4 tropfen. Die Bezugszeichen in 5 entsprechen denen des ersten Ausführungsbeispiels gemäß 1.
6 zeigt ein viertes Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. 6 zeigt einen Querschnitt einer ungefüllten, geschlossenen, vertikalen Vorrichtung zur online Messung physiologischer Veränderungen einer Zellkultur bei Kontakt mit biotransformierten chemischen Substanzen, wobei die Biotransformations-Zellkultur 3 auf losen Substratkörpern 22 erzeugt ist. Die losen Substratkörper 22 können kugelförmig sein und ebenso als Beads bezeichnet werden. Die Substratkörper 22 bilden mit dem hier nicht dargestellten Nährmedium 4 eine Suspension aus. Die Zellen der Biotransformations-Zellkultur 3 bewachsen diese Substratkörper 22 beziehungsweise Beads. Die Substratkugeln 22 sind lose auf einer Membran 2 im unbefüllten Zustand der Vorrichtung positioniert.
Im Übrigen bezeichnen in allen Figuren gleiche Bezugszeichen gleiche Merkmale. Die in den vorstehenden Figuren dargestellten Ausführungsbeispiele stellen lediglich besonders vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung dar.

Claims

Vorrichtung zur Bewertung mindestens einer chemischen Substanz hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen, wobei die Vorrichtung als – ein Strömungssystem ausgebildet ist, das die in einem Nährmedium (4) gelöste chemische Substanz – zuerst in Kontakt mit einer die chemische Substanz in eine biotransformierte chemische Substanz metabolisierende Biotransformations-Zellkultur (3) und – nachfolgend die biotransformierte chemische Substanz in Kontakt mit einer lebende Zellen aufweisenden Detektions-Zellkultur (9) bringt, an die – mindestens ein Sensor (10) angrenzt, der zeitgleich physiologische Veränderungen der Zellen der Detektions-Zellkultur (9) misst.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Strömungssystem das Nährmedium (4) durch einen die Biotransformations-Zellkultur (3) beinhaltenden ersten Behälter und nachfolgend durch einen den die Detektions-Zellkultur (9) tragenden Sensor (10) beinhaltenden zweiten Behälter treibt.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Strömungssystem den ersten Behälter mit einem in Schwerkraftrichtung oben angeordneten Einlass (7) zum Einströmen des Nährmediums (4) in Schwerkraftrichtung zu der Biotransformations-Zellkultur (3) und in dem zweiten Behälter in Schwerkraftrichtung unten den die Detektions-Zellkultur (9) tragenden Sensor (10) und einen Auslass (8) zum Ausströmen des Nährmediums (4) ausbildet.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Strömungssystem den ersten Behälter als einen in Schwerkraftrichtung oberen Bereich und den zweiten Behälter als einen in Schwerkraftrichtung unteren Bereich eines Kulturgefäßes (1) ausbildet und mittels eines wasserdurchlässigen Bodens des ersten Behälters voneinander trennt.
Vorrichtung nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Strömungssystem von dem ersten Behälter zu dem zweiten Behälter eine Verbindungsleitung (19) ausbildet, mit der das Nährmedium (4) mittels einer Pumpeinrichtung (16) von dem ersten Behälter in den zweiten Behälter gepumpt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Strömungssystem einen Einlass in die Verbindungsleitung (19) unter einem Boden des ersten Behälters und einen Auslass aus der Verbindungsleitung (19) durch einen Deckel (17) hindurch als einen Einlass des zweiten Behälters ausbildet.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformations-Zellkultur (3) auf dem Boden des ersten Behälters und der Boden des ersten Behälters als eine Membran (2) ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformations-Zellkultur (3) auf losen Substratkörpern (22) im ersten Behälter und der Boden des ersten Behälters als eine Membran (2) ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Biotransformations-Zellkultur (3) als eine Sol-Gel-Suspension (20) im ersten Behälter und der Boden des ersten Behälters als eine für Wasser durchlässige und für die Sol-Gel-Suspension (20) undurchlässige Auflage (21) ausgebildet sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium (4) als ein flüssiges Zellkulturmedium erzeugt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Auslass (8) des zweiten Behälters und/oder ein Abfluss (12) der Verbindungsleitung (19) jeweils ein Ablassventil (14) zur kontaminationsfreien Abnahme des Nährmediums (4) aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter des Kulturgefäßes (1) in Schwerkraftrichtung oben eine Öffnung aufweist, in die ein vertikal relativverschiebbarer Durchflusskopf (6) aufgenommen ist, der den Einlass (7) und eine Druckausgleichsöffnung (13) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der die Detektions-Zellkultur (9) tragende Sensor (10) lediglich einen Teil eines Bodens des zweiten Behälters bedeckt und auf dem anderen Teil des Bodens des zweiten Behälters ein Abfluss (12) zur Abnahme des Nährmediums (4) ausbildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Behälter einen den Einlass (7) aufweisenden Deckel (17) aufweist, wobei der Einlass (7) ein Ausgang eines oberhalb des Deckels (17) angeordneten Reservoirs (18) des Nährmediums (4) ist.
Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wärme- und/oder Kühleinrichtung an mindestens einer Position des Strömungssystems eine Temperatur regelt.
Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratkörper (22) Polystyren, Glas, Gelatine, Dextran oder magnetische Materialien aufweisen.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen der Biotransformations-Zellkultur (3) und/oder der Detektions-Zellkultur (9) tierisch, pflanzlich, von einem Menschen oder von einem Insekt sind.
Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Hep-G2, Hep-3B, SK-HEP-1, PLC-PRF-5, Chang-liver, BRL-3A, AS-30-D, A549 oder RPMI 2650-Zellen sind.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zu bewertende chemische Substanz ein Wirkstoff, ein Gift, eine Arznei, eine Haushaltschemikalie oder ein Fermentationsprodukt ist.
Verwendung einer Vorrichtung zur Bewertung mindestens einer chemischen Substanz hinsichtlich deren Schädlichkeit für lebende Zellen, wobei die Vorrichtung gemäß einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 19 als ein Strömungssystem ausgebildet ist, wobei die in einem Nährmedium (4) gelöste chemische Substanz – zuerst in Kontakt mit einer die chemische Substanz in eine biotransformierte chemische Substanz metabolisierende Biotransformations-Zellkultur (3) und – nachfolgend die biotransformierte chemische Substanz in Kontakt mit einer lebende Zellen aufweisenden Detektions-Zellkultur (9) gebracht wird, wobei – zeitgleich mindestens ein an die Detektions-Zellkultur (9) angrenzender Sensor (10) physiologische Veränderungen der Zellen der Detektions-Zellkultur (9) misst.