KR20060117945A - 세포 배양 용구 및 세포 배양 방법 - Google Patents

세포 배양 용구 및 세포 배양 방법 Download PDF

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Abstract

세포 배양 용구는 본체, 상기 본체를 둘러싸는 외벽, 및 상기 외벽 주변에 있는 하나 이상의 용기를 포함한다. 각 용기는 상기 외벽의 원주 아래에 있는 상단 엣지를 갖는다. 복수개의 웰을 갖는 배양 디쉬에 있는 한가지 유형 이상의 세포 물질을 물질과 상호 반응시키는 방법은 서로 다른 유형의 세포 물질을 배양 디쉬의 각 웰에 놓는 단계, 유체 배지로 상기 웰을 서로 연결하는 단계; 및 상기 유체 배지에 물질을 가하는 단계를 포함한다.

Description

세포 배양 용구 및 세포 배양 방법{Cell culture tool and method}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2003년 11월 10일자로 출원된 미국 가출원 제60/518331호의 대한 우선권을 주장하며 상기 가출원은 본 명세서에 인용으로서 통합된다.
기술 분야
본 발명은 조직 배양 용기에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 여러가지 유형의 세포와 조직을 공동 배양하기 위한 신규하고 개선된 조직 배양 용기와, 드러그(drug) 발견 및 개발에서의 적용을 포함하여 생물학적 연구 세포 배양 장치를 적용하는 것을 포함한다.
실험실에서는 예를 들면, 디쉬, 플레이트, 플라스크 및 기타 다른 형태의 용기와 같은 배양 용구들이 다양한 목적으로 광범위하게 사용된다. 통상의 용도에서, 세포 및 조직 배양은 웰의 바닥에 덮혀있는 아가 또는 배지의 사용과 관련이 있다. 기초 생화학 및 세포 생물학 연구를 위해 세포를 연구실에서 배양하여 자발적인 생물학적 과정에 대한 이해를 돕는 것은 일반적인 연구이다. 최근에는 드러그 후보(drug candidate)의 약리학적 효과 및 독성 효과를 테스트하기 위하여 드러그 발견과 개발에 세포 배양 시스템을 사용하고 있다. 이러한 연구는 일반적으로는 단일 배양 테스트 과정인데, 즉 한가지 유형의 세포를 웰, 플레이트 또는 플라스크와 같은 조직 배양 용기에 있는 적절한 배지에서 성장시키는 것이다.
정상적인 세포 배양 플레이트는 수직한 벽에 둘러싸인 편평한 바닥면을 가지고 있어서 액체로 채워질 수 있는 챔버 및 습도를 유지시키고 오염으로부터 보호 역할을 하는 제거형 커버로 구성된다. 도 1a 및 1b에 도시된 것처럼, 통상적으로 사용되는 멀티-웰 플레이트(100)는 6개의 동일한 웰(110)을 갖는다. 웰(110)은, 예를 들면 주입 성형 또는 블로우 성형에 의해 일체형으로 형성될 수 있지만, 바람직한 제조방법은 각 웰에 들어가는 체적을 한정하는 상단 트레이(120)와 각 웰의 바닥 표면을 한정하는 하단 또는 바닥면 트레이(130)를 구비하는 플레이트(100)를 형성하는 것이다. 웰(110) 깊이는 웰(110)의 직경과 함께 각 웰(110)의 유체 용량을 한정한다. 통상적으로는, 예를 들면 6개의 웰 플레이트에 있는 각 웰(110)은 약 0.35㎝의 직경과 2.0㎝의 깊이를 가지며, 웰들은 바람직하게는 2 x 3의 정규 직사각 배열로 배열되는 것이 바람직하다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 셀(140)을 웰(110) 각각의 바닥면에 놓는다. 이어서, 유체(150)를 가하여 세포(140)를 덮는다.
일반적으로 인 비트로 시스템(in vitro system)으로 알려진 세포 배양 시스템이 드러그 특성 평가를 위한 드러그 발견 및 개발에 광범위하게 사용된다. 예를 들면, 세포 배양 시스템은 드러그의 역가, 드러그 대사 또는 드러그 독성을 평가하는데 사용된다. 그러나, 인 비트로 시스템은 복합성 결여 및 인 비트로 시스템에서의 생물학적 과정의 상호작용으로 인해 인 비보(in vivo) 상태에서의 효과를 정확 하게 예측할 수 없다는 것 역시 인정된다. 예를 들어, 배양물에 1차 간 세포 (헤파토사이트)를 사용함으로써 간 세포 상에서의 물질의 효과를 측정할 수 있다. 그러나, 인 비보에서는 물질이 신장과 같은 다른 장기에 의해 대사될 수 있으며, 생성되는 대사물질은 간 세포 상에서 다른 효과를 나타내는데, 이것은 간 세포만을 사용해서는 검출되지 않는 것이다. 이러한 이유로 세포의 공동 배양을 개발하는데 관심이 모아지고 있다. 공동 배양이란 하나의 세포 집단을 다른 세포 집단의 존재하에서 성장시키는 것과 관련이 있다. 세포 공동 배양은 무수한 생물학적 연구에 적용된다. 약리학 및 독성학에 있어서, 예를 들면 암 세포와 같은 표적 세포를, 예를 들면 간과 같은 특정의 장기로부터의 세포와 공동 배양하면, 예를 들어 특정 드러그 또는 드러그 후보의 간 대사물과 같이 특정 장기로부터의 세포에 의해 변형 후 표적 세포 상에서의 화학물질 효과를 평가하는 것이 가능해진다. 통상의 세포 배양 플레이트를 이용하면, 공동 배양법은 서로 다른 유형의 세포를 혼합하거나, 두가지 유형의 세포를 양면에 배양시킬 수 있는 멤브레인을 사용함으로써 달성된다. 각 유형의 세포를 물리적으로 혼합한 후에 또는 막을 이용하여 평가하는 것은 매우 어렵고 시간이 걸린다. 따라서, 세포 공동 배양을 용이하게 하는 신규한 세포 배양 용구가 필요하게 되었다.
발명의 개요
통상의 일 태양에 있어서, 세포 배양 용구는 본체, 상기 본체로부터 연장되는 외벽, 및 상기 본체의 형태에 의해 한정되는 하나 이상의 용기를 포함한다. 각 용기는 외벽 가장자리 아래에 있는 선단 엣지를 갖는다.
구현예는 하기와 같은 하나 이상의 특징을 갖는다. 예를 들면, 본체는 용기들이 구비된 편평한 표면을 갖는데, 각 용기는 상기 본체의 편평한 바닥에 다량의 유체를 담을 수 있도록 고안된 함몰부(depression)를 포함한다. 용기는 원통형 벽과 원형의 바닥을 가지며, 본체의 외표면은 직사각 형태의 플레이트일 수 있다. 외벽의 높이는 약 20 밀리미터일 수 있다.
일 구현예에 있어서, 각 용기는 본체에 연결된 컵을 포함하는데, 각 컵은 외벽의 테두리 아래에 선단 엣지를 갖는다. 다른 구현예에 있어서, 용기는 선단 엣지를 가지며 그 높이가 4밀리미터인 컨테이너 벽을 갖는 컨테이너를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 각 용기는 외벽의 주변부 내로 한정된 공간을 분할하며 선단 엣지를 갖는 격벽을 포함한다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 멀티-웰 배양 디쉬는 복수개의 웰이 있는 편평한 표면을 갖는 베이스와 상기 베이스를 둘러싸는 외벽을 포함한다. 웰 각각은 높이가 외벽의 높이보다 낮은 컨테이닝 벽(containing wall)을 포함한다. 구현예는 전술한 바와 같은 하나 이상의 특징을 포함하며, 디쉬는 6개의 웰을 포함하기도 한다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 멀티 배양 용기는 유체를 순환시키는 장치 (예를 들면 펌프)의 존재 또는 부재하에서 배관(tubing)을 이용하여 연결될 수 있다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 복수개의 웰을 갖는 배양 디쉬에서 물질을 한 종류 이상의 세포 물질과 상호 작용시키는 방법은 배양 디쉬의 개별 웰에 서로 다른 유형의 세포 물질을 넣는 단계, 웰을 유체 배지로 서로 연결하는 단계, 및 물질을 유체 배지에 가하는 단계를 포함한다. 여러가지 구현예에 있어서, 물질은 화학물질 또는 드러그를 포함할 수 있다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 멀티 웰 배양 디쉬 중에 있는 드러그를 대사시키는 방법은 멀티 웰 배양 디쉬의 개별 웰에 서로 다른 유형의 세포 물질을 넣는 단계, 상기 개별 웰을 유체 배지로 연결하는 단계, 및 드러그를 유체 배지에 도입하는 단계를 포함한다.
구현예는 하기의 특징중 하나 이상 또는 전술한 바와 같은 특징중 임의의 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 물질은 간 세포, 신장 세포, 비장 세포 또는 폐 세포, 또는 배양될 수 있는 임의의 세포, 또는 조직 조각 또는 조직 분획을 포함할 수 있다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 6개의 웰과 상기 6개의 웰을 둘러싸는 벽이 구비된 본체를 갖는 세포 배양 디쉬에서 드러그를 대사시키는 방법은 6개 웰의 첫번째 웰에 신장 세포를, 두번째 웰에 간 세포를, 3번째 웰에 심장 세포를, 네번째 웰에 폐 세포를, 다섯번째 웰에 비장 세포를, 그리고 여섯번째 웰에 뇌 세포를 넣는 단계, 디쉬에 유체 배지를 채워서 6개 웰을 유체로 서로 연결하는 단계, 및 상기 유체 배지에 드러그를 도입하는 단계를 포함한다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 각 웰에 있는 서로 다른 세포를 공동 배양하는 방법은 각 웰을 채워서 웰들을 유체로 서로 연결함으로써 각 웰에 있는 서로 다른 세포를 공통의 유체 배지를 통해 연결시키는 단계를 포함한다.
공동 배양법은 다양한 구현예들을 포함한다. 예를 들면, 각 웰에 있는 서로 다른 세포들은 첫번째 웰에는 간 세포를, 두번째 웰에는 신장 세포를, 세번째 웰에는 심장 세포를, 네번째 웰에는 비장 세포를, 다섯번째 웰에는 뇌 세포를, 그리고 여섯번째 웰에는 폐 세포를 포함한다. 다른 구현예에 있어서, 각 웰에 있는 서로 다른 세포는 첫번째, 두번째 및 세번째 웰에 간 세포를, 네번째, 다섯번째 및 여섯번째 웰에는 심장 세포를 포함한다. 또 다른 구현예에 있어서, 공동 배양법은 물질을 공통 유체 배지에 도입하여 각 웰에 있는 서로 다른 세포를 동일한 물질에 접촉시키는 단계를 포함한다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 개별 웰을 갖는 배양 디쉬에 있는 드러그의 안정성과 약효를 테스트하는 방법은 배양 디쉬의 개별 웰에 서로 다른 장기의 세포를 넣는 단계, 다른 개별 웰에 유해한 제제를 넣는 단계, 개별 웰을 유체 배지로 서로 연결하는 단계 및 소정 용량의 드러그를 유체 배지에 도입하는 단계를 포함한다.
이 방법은 하기의 특징중 하나 이상 또는 전술한 임의의 특징들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이 방법은 장기의 서로 다른 장기의 세포가 소정 용량의 드러그에 의해 손상을 입는지의 여부, 유해한 제제가 소정 용량의 드러그에 의해 감소되는지 여부, 및/또는 서로 다른 장기의 세포가 손상을 입지 않고 유해한 제제가 감소되지 않는다면 드러그의 용량을 증가시켜야 하는지를 결정하는 것을 포함한다.
유해한 제제로는 종양 세포를 들 수 있으며, 드러그는 항종양제를 포함할 수 있다. 서로 다른 장기의 세포는 인체의 간, 신장, 심장, 폐, 비장 및/또는 뇌로부터의 세포를 포함할 수 있다.
또한 이 방법은 드러그가 서로 다른 장기의 세포들을 손상시킬 때까지 드러그의 용량을 증가시키는 단계와, 서로 다른 장기의 세포들을 손상시키는 드러그의 용량을 유독한 용량 수준으로서 결정하는 단계를 포함한다. 이 방법은 유해한 제제의 영향이 감소될 때까지 드러그의 용량을 증가시키는 단계와, 유해한 제제의 영향을 감소시키는 드러그의 용량을 유효량 농도로 결정하는 단계를 포함한다.
유해한 제제는 콜레스테롤일 수 있으며, 드러그는 항콜레스테롤제일 수 있고, 서로 다른 세포는 간 세포를 포함할 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 유해한 제제는 암 세포일 수 있고, 드러그는 일정 용량 이상으로서 바람직하지 않은 독성을 나타내는 항암제이다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 멀티 웰 디쉬에서 세포를 공동 배양하는 방법은 멀티 웰 디쉬의 제1 웰에서 제1 세포 유형을 배양하는 단계와, 멀티 웰 디쉬의 제2 웰에서 제2 세포 유형을 배양하는 단계를 포함한다. 제2 웰에서 배양된 세포는 제1 세포 유형의 성장을 돕는 대사물을 제공할 수 있다.
다른 일반적인 태양에 있어서, 제1 세포 유형이 제2 세포 유형의 성장을 증진시킬 수 있는지를 평가하는 방법은 제1 웰에서 제1 세포 유형을 배양하는 단계, 제2 웰에서 제2 세포 유형을 배양하는 단계, 제1 웰과 제2 웰을 유체로 서로 연결하는 단계, 및 배양된 제1 세포 유형이 제2 세포 유형의 성장에 영향을 미치는지를 검사하는 단계를 포함한다.
세포 배양 용구는 공동 배양될 것이지만 물리적으로는 여전히 분리된 복수개의 세포 유형에 대한 간편한 방법을 제공함으로써 각각의 세포 유형들을 공동 배양된 세포들의 부재하에서 개별적으로 평가할 수 있다.
이 용구는, 예를 들면 서로 다른 부착 기질, 서로 다른 배지 또는 서로 다른 세포 유형과 같은 서로 다른 조건 하에 개별 웰에서 세포를 배양한 다음 서로 다른 웰이 공통 배지를 통해 서로 연결될 수 있도록 한다. 공통 배지와 통합된 배양물로서 배양한 후, 배지를 제거하고 각 웰을, 예를 들면 소정의 생화학물질을 측정하기 위한 세정제로 용해하거나, 형태 평가를 위해 고정하고 염색하는 등의 독립적인 특정의 조작을 실시할 수 있다.
전술한 바와 같이, 이 방법에서는 서로 다른 장기 (예를 들면, 간, 심장, 신장, 비장, 뉴우런, 혈관 표면 세포 (blood vessel lining cell), 갑상선 세포, 부신 세포, 홍채 세포, 암 세포)로부터의 복수개의 1차 세포(multiple primary cell)를 배양시키는데 적용됨으로써, 플레이트는 각 세포 유형의 설정 및 범람(flooding)후 전체 동물의 인 비트로 실험 모델로서 표시된다. 배양 용구의 다른 적용은 복수개의 세포 유형에 대한 물질의 영향을 평가하는 것이다. 드러그의 발견 및 개발에 있어서, 배양 시스템은 복수개의 장기로부터의 세포에 의해 새로운 드러그 또는 드러그 후보의 대사물을 평가하거나 복수개의 장기로부터의 세포의 기능과 생존력에 대한 드러그 또는 드러그 후보의 영향을 평가하는데 사용될 수 있다. 이러한 적용의 일 예는 종양 세포와 함께 복수개의 장기로부터의 세포를 배양한 다음, 항암제와 공동 배양 처리하여 서로 다른 장기의 세포에 대한 제제의 독성을 암 세포에 대한 제제의 독성과 비교하여 평가함으로써 제제의 치료 지수를 평가하는 것이다. 달리 말하자면, 각 플레이트는 항암제를 이용한 전체 동물의 치료를 촉진한 다음 후속하는 각 장기를 검사한다. 복수개의 종양 세포 유형은 서로 다른 유형의 종양에 대하여 테스트된 드러그 또는 드러그 후보의 효능을 평가하는데 사용될 수도 있다.
서로 다른 세포 유형이 서로 다른 웰에 놓여질 때 세포 유형들을 이들이 놓여지는 배지와 함께 물리적으로 혼합하지 않고, 서로 다른 세포 유형으로부터의 외래 요소를 필요로 하는 세포를 배양하는데 상기 용구를 사용함으로써 대사물 및/또는 분비된 생분자의 교환을 가능하게 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
종래 발명을 구현하는 용구(200, 300, 400)의 구현예가 도 2a 내지 5b 및 도 10에 도시된다. 용구(200, 300, 400)는 내부에 세포 유형 각각을 배양시킬 수 있는 복수개의 웰을 포함하는데, 서로 다른 웰 안에 있는 세포들이 공통 배지를 공유할 수 있도록 각 웰은 채우거나 범람시킬 수 있다. 이는 각 웰이 더 큰 플레이트 내부에 만입부(indentation)으로서 형성되거나 (도 2a 및 2b), 더 큰 플레이트 내부에 짧은 격벽(partitions)을 놓거나 (도 3a 및 도 3b), 더 큰 플레이트 내부에 작은 인서트를 놓음 (도 4a 및 4b)으로써 달성된다. 그러나, 본 발명은 플레이트마다 임의 갯수의 웰을 갖는 선택적 멀티 웰 포맷에 적용될 수 있다.
도 2a 및 2b에 있어서, 본 발명의 멀티 웰 용구(200)은 실질적으로 편평한 상단 표면(210)을 갖는 본체(205), 및 상기 본체(205)로부터 연장되는 외벽(215)을 포함한다. 여섯개의 웰(220)은 상단 표면(210)을 함몰시킴으로써 본체(205)에 형성된다. 각 웰(220)은 편평한 표면(210)으로부터 아래쪽으로 기울어지거나 상기 표면에 대해 수직할 수 있는 컨테이닝 벽(containing wall; 225)을 갖는다.
용구(200)의 전체적인 크기는 길이가 약 12.60 ㎝이고 폭이 약 8.40 ㎝일 수 있다. 본체(205)는 높이가 0.20 ㎝이고 편평한 표면(210)으로부터 윗쪽으로 연장되는 약 0.15 ㎝의 외벽(215)을 가질 수 있다. 각 컨테이닝 벽(225)의 높이는 0.05 ㎝이다. 웰(220)은 규칙적으로 배열되며 약 0.02 ㎝로 이격된다. 다른 구현예(미도시)에 있어서, 웰을 원의 외주 둘레에 위치시킴으로써 웰을 서로 동일한 간격으로 이격시킬 수 있다. 용구(200)의 크기는 대략 설명한 것이지만, 용구(200)는 각 웰(220)에 있는 세포가 잠기지 않도록 하면서 웰(220)이 공통 유체 배지에서 서로 연결되도록 각 웰(220)을 덮을 수 있는 형태로 만들어진다.
도3a 및 3b에 있어서, 멀티 웰 용구(300)는 편평한 상단 표면(310)을 가지며 외벽(315)에 둘러싸인 본체(305)를 포함한다. 격벽(320)은 상단 표면(310)에 위치해 있어서 외벽(315)에 결합된 공간을 여섯개의 웰(325)로 분할한다. 외벽(315)은 상단 표면(310)으로부터 0.15 ㎝ 윗쪽으로 연장되며 격벽의 높이는 약 0.05 ㎝이다. 따라서, 각 웰(325)은 유체 배지에서 웰(325)이 서로 연결되도록 채워져 있다.
격벽(320)은 상단 표면(310)과 외벽(315)에 결합될 수 있다. 다른 구현예에서는, 격벽(320)을 제거할 수 있다.
도 4a 및 4b에 있어서, 멀티 웰 용구(400)는 편평한 상단 표면(410)을 가지며 외벽(415)으로 둘러싸인 본체(405)를 포함한다. 인서트(420)가 편평한 표면(410) 상에 위치해 있는데 각 인서트는 바닥(425)과 컨테이닝 벽(430)으로 한정된다. 컨테이닝 벽의 높이는 약 0.05 ㎝이고 외벽의 높이는 상단 표면(410)으로부터 0.15 ㎝ 연장된다. 다른 구현예에 있어서, 인서트(420)는 컵, 디쉬 또는 트레이를 포함할 수 있는데, 이들은 상단 표면(310)으로부터 제거될 수 있다.
도 2a 내지 4b에 개시된 멀티 웰 플레이트는 각각이 복수개의 웰(515)을 갖는 복수개의 격실 또는 챔버(510)를 갖는 단일 본체(505)로서 세포 배양 트레이(550)를 형성하도록 분류될 수 있어서 (도 5a 및 5b), 각 격실에 서로 다른 세포 선별, 액상 배지 또는 서로 다른 외래 물질을 이용한 실험을 가능하게 한다. 각 격실(510)을 둘러싸는 리미팅 벽(limiting wall; 520)은 격실(510) 내에 있는 각 웰(515)의 컨테이닝 벽(525)보다 높은데, 리미팅 벽(520)은 0.20 ㎝의 높이를 가지며, 더 큰 본체(505) 내부에 있는 각 웰(515)는 0.04 의 높이를 갖는다.
용구(200 - 500)는 다양하고 적절한 물질로 형성될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 용구(200 - 500)는 용구(200 - 500)를 이용하여 실시될 수 있는 분석에 채용되는 유체와 실질적으로 화학적 반응을 일으키지 않는 실질적으로 경직성이고 수 불용성이며 유체-불투과성이며 통상적으로 열가소성인 물질로 형성된다. 본 명세서에서 사용되는 "실질적으로 경직성"이라는 용어는 물질이 가벼운 기계적 또는 열적 하중 하에서 변형 또는 포장에 대해 내성이 있는 것을 의미하는데, 변형은 물질이 다소간 탄성임에도 불구하고 실질적으로 편평한 표면이 유지되는 것을 방해한다. 적절한 물질은, 예를 들면 공중합되거나 되지 않은 폴리스티렌 또는 폴리비닐 클로라이드, 폴리에틸렌, 폴리스티렌, 폴리스티렌-아크릴로니트릴, 폴리프로필렌, 폴리비닐렌 클로라이드 등이다. 폴리스티렌은 매우 낮고 비특이적인 단백질 결합을 하고 있어서 하나 이상의 단백질을 포함하는, 예를 들면 혈액, 바이러스 및 박테리아와 같은 샘플과 함께 사용하기에 적합하다는 특성이 있어서 세포 배양 용기에 사용되는 통상의 폴리머이므로 폴리스티렌은 사용 가능한 물질이다. 유리도 적절한 물질인데 세포 배양 용기에서 일상적으로 사용되며 매 사용후에 세척 및 살균처리될 수 있다.
세포 배양 용구는 드러그 대사물을 테스트하는데 사용될 수 있다. 도 6에 도시된 것처럼, 드러그를 대사하는 것으로 알려진 주요 장기는 간(610), 소장과 신장(620)인 반면, 심장(630), 비장(640), 폐(650) 및 혈관(660)과 같은 장기는 특이적인 대사 경로를 가지고 있다. 도 7에 있어서, 세포 배양 용구를 사용하는 방법은 복수개의 세포 유형(700)에 의해 외래 물질의 대사물을 측정하는 단계를 포함한다. 용구를 이용함에 있어서, 간, 소장, 신장, 심장, 비장, 폐 및 뇌를 포함하는 주요 장기로부터의 세포를 복수개의 웰 플레이트에 놓는데, 각 장기로부터의 세포들을 각 웰에 분리하여 놓는다 (단계 710). 예를 들면, 여섯개의 웰 포맷에서는, 간 세포를 웰 1에, 소장 세포를 웰 2에, 신장 세포를 웰 3을, 심장 세포를 웰 4에, 비장 세포를 웰 5에, 그리고 폐 세포를 웰 6에 넣는다. 각각의 세포 유형은 서로 다른 부착 기질과 배양 배지를 이용하여 배양할 수 있는데 (단계 720), 예를 들면, 간 세포는 콜라겐 상에서 최적으로 배양되며 인슐린과 덱사메타손의 보강을 필요로 하고, 비장 세포는 아가 현탁액 등에서 배양된다. 각각의 세포 타입을 설정한 후, 각 웰을 채워 플레이트를 "범람"시켜서 (단계 730), 서로 다른 웰로부터의 세포들은 공통의 액상 배지를 공유한다. 예를 들면, 드러그, 드러그 후보, 환경 오염물, 천연 생성물과 같은 외래 물질을 배지에 가하고 (단계 740), 소정 시간 동안 인큐베이트한다 (단계 750). 인큐베이트한 후, 결정된 분석 방법을 이용하여 대사 정도 조사 (얼마나 많은 모(母) 물질이 남아있는지 조사) 또는 대사 페이트(fate)의 조사 (대사물의 정체가 무엇인지 조사)하기 위하여 배지를 수거할 수 있다 (단계 760).
도 8에 있어서, 세포 배양 용구를 이용하는 다른 방법(800)은 복수개의 세포 유형에 대한 외래 물질의 독성을 평가하는 단계를 포함한다. 드러그 독성에 쉽게 영향을 받는 주요 장기는 간, 소장, 신장, 심장, 비장, 폐 및 뇌이다. 용구를 이용하여 간, 소장, 신장, 심장, 비장, 폐, 뇌 및 혈관으로부터의 세포를 복수개의 웰 플레이트에 놓는다 (단계 810). 각 장기로부터의 세포를 각 웰에 놓는다. 예를 들면, 8개의 웰 포맷에 있어서, 간 세포를 웰 1에, 소장 세포를 웰 2에, 신장 세포를 웰 3에, 심장 세포를 웰 4에, 비장 세포를 웰 5에, 폐 세포를 웰 6에, 뇌 세포를 웰 7에, 그리고 혈관 세포를 웰 8에 놓는다. 서로 다른 부착 기질과 배양 배지를 이용하여 각 세포 유형을 배양하는데 (단계 820), 예를 들면 간 세포는 콜라겐 상에서 최적으로 배양되며 인슐린과 덱사메타손과 같은 보강물질을 필요로 하고, 비장 세포는 아가 현탁액 등에서 배양된다. 각 세포 유형을 설정한 후, 각 웰을 채워서 플레이트를 범람시키는데, 각 웰로부터의 세포는 공통의 액상 배지를 공유한다 (단계 830). 예를 들면, 드러그, 드러그 후보, 환경 오염물, 또는 천연 생성물과 같은 외래 물질을 배지에 가한다 (단계 840). 이어서, 혼합물을 소정 시간 동안 인큐베이트한다 (단계 850). 인큐베이트 후, 배지를 제거할 수 있으며, 각 세포 유형은, 예를 들면 현미경 분석처럼 형태학적으로 독성에 대해 평가되고 (단계 860), 예를 들면 세정제로 용해시켜서 각 웰 중의 세포의 ATP 함량을 측정하는 생화학적 분석에 의해 평가될 수 있다.
세포 배양 용구는 드러그 약효와 안전성의 평가에도 사용될 수 있다. 드러그 발견에 있어서는 손상되지 않은 세포가 드러그 약효의 인디케이터로서 사용된다. 신규한 콜레스테롤 합성 저해제를 콜레스테롤 수치가 높은 환자에서 콜레스테롤 수치를 낮추는 드러그로서 개발하기 위하여 간 세포를 이용하여 드러그가 콜레스테를 합성에 미치는 영향을 평가할 수 있다. 전술한 바와 같은 복수개 장기로부터의 세포를 배양시켜서 복수개의 장기에서의 콜레스테롤 합성에 대한 드러그 후보의 효과를 평가할 수 있다. 이 방법은 배양 시스템을 이용하여 약효, 대사 및 독성을 동시에 평가하는데 사용될 수 있는 방법이다.
예를 들면, 드러그의 유효성과 독성을 결정하는 인디케이터 세포로서 간 세포를 이용함으로써 높은 콜레스테롤 수치를 치료하는 잠재적인 신규 드러그의 "치료 지수"를 평가할 수 있다. 모든 키 세포 유형 (key cell types)의 대사물의 존재 하에서 약효를 측정함으로써 대사물이 새로운 드러그의 약효를 낮출 수 있는 (또는 약효를 증가시키는) 인 비보 상황을 모방할 수 있다.
도 9에 있어서, 드러그의 치료 지수를 설정하는 방법(900)은 멀티 웰 플레이트의 각 웰에 세포를 놓는 단계 (단계 910), 예를 들면 종양 세포와 같은 유해한 제제를 다른 웰에 놓는 단계 (단계 920), 웰들을 유체 배지로 서로 연결하는 단계 (단계 930), 및 드러그를 유체 배지에 가하는 단계 (단계 940)를 포함한다.
드러그가 다양한 장기 세포에 미치는 영향을 측정하여 안정성을 평가한다 (단계 950). 드러그가 임의의 장기 세포를 손상시키는 경우, 드러그 용량은 안전한 정도를 넘어서는 것으로 간주한다 (단계 960). 건강한 세포가 손상되지 않으면, 드러그가 유해한 제제를 감소시키는 효과를 조사한다. 유해한 제제가 감소되면, 그 결과를 유효한 용량으로서 기록한다 (단계 970). 드러그 용량을 증가시키고 (단계 980) 이 과정을 반복한다.
이 용구는 많은 수의 잠재적인 드러그 후보를 평가할 수 있는 하이 쓰루풋 스크리닝(high throughput screening) 공정에 사용될 수도 있다. 이 방법에서는 로봇 시스템을 멀티 웰 플레이트와 함께 이용하여 실험을 실시한다. 전술한 바와 같은 멀티 격실 용구를 사용함으로써, 전술한 바와 같이 공동 배양된 복수개의 세포 유형들을 이용한 HTS를 약효, 독성 및 대사용으로 실시할 수 있다.
또 다른 방법은 공동 배양 조건을 평가하는 것을 포함한다. 일부 세포 유형은 배양하기 어려운 세포 유형의 배양을 향상시킬 수 있다. 이것은 시행착오에 의해 실시된다. HTS 포맷을 이용하면, 서로 다른 세포 유형이 배양하기 어려운 세포의 성장에 미치는 영향을 검사할 수 있다. 예를 들면, 어떤 세포가 배양된 간 세포의 분화(differenciation)를 유지하는데 최적인지를 평가하기 위해서 간 세포를 격실 1에 있는 세포 유형 1 (예를 들면 내피 세포); 격실 2에 있는 세포 유형 2 (예를 들면 3T3 세포) 등과 공도 배양할 수 있다. 공동 배양 말기에 공동 배양된 세포에 의한 합병증 없이 간 세포의 특성을 평가할 수 있다.
도 10에 있어서, 세포 배양 용구(1000)는 드러그 흡수를 측정하는데 적용되는 것을 도시한다. 세포 배양 용구(1000)는 외벽(1115)에 둘러싸인 실질적으로 편평한 상단 표면(1110)을 갖는 본체(1105)를 포함한다. 상단 표면(1110)을 함몰시켜서 여섯개의 웰(1120)을 본체(1105)에 형성한다. 각 웰(1120)은 편평한 표면(1110)에 수직한 컨테이닝 벽(1125)을 갖는다.
인서트 트레이(1130)는 외벽(1115)의 상단부에 있는 립(1135) 상에 놓여있다. 인서트 트레이(1130)는 외벽(115) 내부에 위치해 있는 다공성 멤브레인(1145)을 갖는 챔버(11138)를 포함한다.
소장 세포(1140)를 멤브레인 근처에 있는 챔버(1138)의 바닥에 놓는다. 용구(1000)이 채워지면, 멤브레인(1140)을 관통하도록 유체 수위를 상승시키고 드러그(1150)를 챔버(1138)에 가한다. 드러그(1150)를 멤브레인(1140)에 침투시켜서 세포(1120)와 서로 반응시키면 드러그(1150)가 "흡수"된다. 즉, 흡수량을 측정하여 소장 내에서의 드러그 흡수를 촉진시킬 수 있다.
상기 장치 및 방법은 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한 어떠한 변화도 가능하기 때문에 상기 상세한 설명에 포함되거나 첨부 도면에 도시된 모든 것들은 본 발명을 설명하기 위한 것이지 본 발명을 제한하는 것이 아닌 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 개시된 기술의 단계들이 다른 순서로 실시되고 / 되거나 개시된 시스템의 요소들이 다른 방식으로 결합되고 / 되거나 다른 요소로 대체되거나 다른 요소에 의해 보강되면 바람직한 결과를 얻어질 수 있다. 따라서, 다른 구현예들이 첨부된 청구범위의 범위 내에 있다.
도 1a는 종래의 멀티 웰 배양 플레이트의 투시도이고;
도 1b는 도 1a에 도시된 종래의 멀티 웰 배양 플레이트의 횡단면도이며;
도 2a는 세포 배양 용구의 투시도이고;
도 2b는 도 2a에 도시된 세포 배양 용구의 횡단면도이며;
도 3a는 세포 배양 용구의 다른 구현예의 투시도이고;
도 3b는 도 3a에 도시된 세포 배양 용구의 횡단면도이며;
도 4a는 세포 배양 용구의 또 다른 구현예의 투시도이고;
도 4b는 도 4a에 도시된 세포 배양 용구의 횡단면도이며;
도 5a는 격리된 챔버와 챔버마다 복수개의 웰을 구비한 세포 배양 용구의 투시도이고;
도 5b는 도 5a에 도시된 세포 배양 용구의 횡단면도이며;
도 6은 동물의 장기 시스템의 일부를 나타내고;
도 7은 복수개의 셀 유형에 의한 외래 물질의 대사물 평가 흐름도이며;
도 8은 복수개의 세포 유형에 대한 외래 물질의 독성을 평가하는 흐름도이고;
도 9는 드러그의 치료 지수를 설정하는 흐름도이며;
도 10은 인서트 트레이가 구비된 세포 배양 용구를 나타낸다.
도면의 참조 번호는 편의상 발명의 상세한 설명 부분의 참조번호에 대응된 다.

Claims (18)

  1. 액체를 함유하도록 고안된 저장부(reservoir)에 하나 이상의 웰을 한정하는 본체를 포함하는 세포 배양 용구.
  2. 제1항에 있어서, 상기 본체가
    실질적으로 편평한 표면을 갖는 트레이;
    편평한 표면으로부터 연장되어 하나 이상의 웰을 한정하는 복수개의 컨테이닝 벽; 및
    편평한 표면을 둘러싸서 저장부를 한정하며 상기 컨테이닝 벽보다 높이가 높은 외벽을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 용구.
  3. 제2항에 있어서, 투과성 멤브레인을 포함하며 외벽 상에 놓이도록 고안되어 있어서 멤브레인을 저장부 내에 위치시키는 디쉬를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 용구.
  4. 제1항에 있어서, 상기 본체가
    각각 하나 이상의 웰을 한정하는 하나 이상의 함몰부를 갖는 실질적으로 편평한 표면을 갖는 플레이트; 및
    상기 플레이트를 둘러싸며 상기 편평한 표면보다 높이가 높아서 저장부를 한 정하는 벽을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 용구.
  5. 제4항에 있어서, 투과성 멤브레인을 포함하며 외벽 상에 놓이도록 고안되어 있어서 멤브레인을 저장부 내에 위치시키는 디쉬를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 용구.
  6. 복수개의 웰을 갖는 실질적으로 편평한 표면과 상기 편평한 표면을 둘러싸는 벽을 갖는 배양 디쉬에서 물질을 한가지 유형 이상의 세포 물질과 상호 반응시키는 방법으로서,
    개별 웰에서 하나 이상의 세포 물질을 배양하는 단계;
    유체 배지를 상기 편평한 표면 위로 가해서 웰을 유체로 서로 연결하는 단계; 및
    웰을 서로 연결하는 유체 배지에 상기 물질을 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 물질을 유체 배지에 도입하는 단계가,
    투과성 멤브레인의 제1 면에 상기 물질을 놓는 단계; 및
    투과성 멤브레인의 제2 면이 유체 배지와 접촉하도록 놓는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 물질을 놓는 단계가 투과성 멤브레인의 제1 면에 소장 내피 세포를 놓는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 물질을 도입하는 단계가 화학적 조성물을 첨가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 세포 물질을 웰에 놓는 단계로서, 제1 웰에 신장 세포를, 제2 웰에 간 세포를, 제3 웰에 심장 세포를, 제4 웰에 폐 세포를, 제5 웰에 뇌 세포를, 그리고 제6 웰에 암 세포를 놓는 단계를 포함하며,
    상기 물질을 도입하는 단계가 드러그 또는 드러그 후보를 유체 배지에 도입하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 물질 도입 단계가 소정 용량의 드러그 또는 드러그 후보를 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 드러그 또는 드러그 후보가 다양한 세포 유형 상에서 바람직한 효과를 나타내는지를 결정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 드러그 또는 드러그 후보가 바람직한 효과를 나타내는지를 결정하는 단계가 드러그 또는 드러그 후보가 암 세포에 대한 독성으로서 정의되는 항암 효과를 보이는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항에 있어서, 드러그 또는 드러그 후보가 다양한 세포 유형 상에서 바람직하지 않는 결과를 나타내는지를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 드러그 또는 드러그 후보가 바람직하지 않는 효과를 나태내는지를 결정하는 단계가 드러그 또는 드러그 후보가 정상 세포에 대한 독성을 보이는지를 결정하는 단계를 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제6항에 있어서,
    도입된 물질이 하나 이상의 세포 물질에 분포하는지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제6항에 있어서, 하나 이상의 세포 물질과의 상호 작용에 의한 도입된 물질의 생물학적 변형을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 복수개의 웰을 갖는 단일 트레이에서 제1 세포 유형이 제2 세포 유형의 특성에 미치는 효과를 평가하는 방법으로서,
    제1 셋트의 웰에 있는 제1 세포 유형과 제2 셋트의 웰에 있는 제2 세포 유형 을 각각 배양하는 단계; 및
    상기 제1 셋트의 웰과 제2 셋트의 웰을 유체로 서로 연결하는 단계를 포함하는 방법.
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