JP7223311B2 - 細胞培養チップ、及びこれを用いた細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養チップに関し、特に複数の細胞を独立して培養する用途に利用される細胞培養チップに関する。また、本発明は、この細胞培養チップを用いた細胞培養方法に関する。

従来、多数の細胞を同時に培養することを目的として、複数のウェルを備えた細胞培養チップが知られている。このような細胞培養チップは、「マルチウェル型」の培養チップと呼ばれることがある。従来のマルチウェル型の細胞培養チップの構造を、図１０及び図１１に示す。図１０は斜視図に対応し、図１１は断面図に対応する。

図１０に図示される細胞培養チップ１００は、６つの同形状のウェル１１０を備える。より詳細には、細胞培養チップ１００は、貫通孔を有する上部トレイ１２０と、上部トレイ１２０に接触して配置された下部トレイ１３０を備え、下部トレイ１３０の面と上部トレイ１２０の貫通孔とによってウェル１１０が形成されている。

図１１に図示されるように、細胞１４０が各ウェル１１０の底面に配置され、培養液１５０が細胞１４０を覆うように添加される。

しかし、図１０に示される細胞培養チップ１００の構成では、各ウェル１１０が独立しているため、各ウェル１１０に配置された細胞１４０同士の相互作用を検査する目的に利用することができない。かかる観点から、例えば下記特許文献１には、異なるウェルに収容される培養液（培地）を共通化させることのできる細胞培養チップが開示されている。

特開２００７－５１０４２９号公報

図１２及び図１３は、特許文献１に開示されたマルチウェル型の細胞培養チップの構造例である。図１２は斜視図に対応し、図１３は断面図に対応する。

図１２に示すマルチウェル型の細胞培養チップ２００は、本体２０５と、本体２０５の上面２１０に配置された外壁２１５を有する。本体２０５の上面２１０の所定の箇所には、６つの凹部が設けられており、これによってウェル２２０が形成されている。

細胞を培養する際には、細胞１４０を各ウェル２２０の底面に配置し、細胞１４０を覆うように培養液１５０を添加する。ここで、図１３に図示されるように、培養液１５０の液面が各ウェル２２０の上面を超える位置になるまで、培養液１５０を細胞培養チップ２００に対して供給する。このとき、培養液１５０を介して、各ウェル２２０が連絡される。このため、あるウェル２２０内で培養された細胞１４０から放出された生理活性物質が、他のウェル２２０内で培養された別の細胞１４０に対して及ぼす影響を観察することができる。

ところで、本発明者らは、より生体内に近い環境を模擬してＥＳ／ｉＰＳ細胞の機能・作用を研究している。かかる研究の過程で、生体内に近い環境を模擬することを検討した場合、ある細胞Ａと別の細胞Ｂとを同時に培養しておき、細胞Ｂから放出された生理活性物質Ｘｂが細胞Ａに与える影響を排除した状態で、細胞Ａから放出された生理活性物質Ｘａが細胞Ｂに与える影響を観察する必要性が存在することを見出した。

しかし、図１２及び図１３に示される細胞培養チップ２００の場合、全てのウェル２２０で培養された各細胞１４０間の相互作用を観察することはできるものの、特定のある細胞から、別の特定のある細胞に対する影響を観察する用途には用いることができない。

別の方法として、ポンプなどの駆動機構を用いて培養液を一方向に強制的に流しながら細胞を培養する方法が考えられる。しかし、細胞を培養する際に、ポンプなどの駆動機構を用いると、チップのサイズが極めて大型化する上、電源の取り回しなどが複雑化するという課題が存在する。チップのサイズを小型化できれば、同一の面積内で多数の細胞が培養できるため、研究の効率化が極めて向上する。

本発明は、上記の課題に鑑み、駆動機構を別途用いることなく、方向性を有した状態で細胞同士の相互作用の観察が可能な、細胞培養チップ及び細胞培養方法を提供することを目的とする。

本発明に係る細胞培養チップは、
細胞の培養が可能な第一培養チャンバと、
前記第一培養チャンバとは離間した位置に配置され、前記第一培養チャンバに対して独立して細胞の培養が可能な第二培養チャンバと、
前記第一培養チャンバに連結され、液体の貯留が可能な第一ウェルと、
前記第二培養チャンバに連結され、液体の貯留が可能な第二ウェルと、
前記第一ウェルに貯留された第一液体の液面が所定の高さ位置以上になると、前記第一ウェルから前記第二ウェルに前記第一液体を流入させる連結部とを備えたことを特徴とする。

前記細胞培養チップによれば、培養液の溶液量を制御するのみで、第一ウェルから第二ウェルに対して第一液体を流入させることができる。この第一液体は、第一培養チャンバに連結された第一ウェルに貯留されていたため、第一培養チャンバ内で培養されていた細胞（以下、「第一細胞」と呼ぶ。）から放出された生理活性物質（以下、「第一生理活性物質」と呼ぶ。）が含まれる。よって、この第一液体が、第二ウェルを介して第二培養チャンバに流入されることで、第一液体に含まれる第一生理活性物質が、第二培養チャンバ内で培養されている細胞（以下、「第二細胞」と呼ぶ。）に接触する。この結果、第一生理活性物質が第二細胞に対して及ぼす影響を観察することができる。

一方で、前記細胞培養チップによれば、第二培養チャンバに接触している培養液が第一培養チャンバ側に流入することがない。この結果、第二細胞から放出された生理活性物質（以下、「第二生理活性物質」と呼ぶ。）が、第一細胞に対して影響を作用させることが回避できる。

また、前記細胞培養チップによれば、単に培養液の供給量を調整するのみで、第一生理活性物質を第二細胞に接触させることができるため、ポンプなどの駆動機構を別途設ける必要がない。この結果、細胞培養チップのサイズの小型化が実現される。

前記細胞培養チップにおいて、
前記第一ウェルと前記第二ウェルとは、隔壁を介して隣接されており、
前記連結部が前記隔壁で構成されているものとしても構わない。

この場合において、前記隔壁は、底面の高さ位置が場所によって変化する切り欠き部を備えるものとしても構わない。

上記の構成によれば、切り欠き部の形状に応じて第一液体が第二ウェル内に流入する速度や、第一液体を第二ウェル内に流入させるために供給する培養液の量を自在に調整することができる。

前記細胞培養チップにおいて、
前記第一ウェルと前記第二ウェルとは、樋状流路を介して隣接されており、
前記連結部が前記樋状流路で構成されているものとしても構わない。

前記細胞培養チップにおいて
前記第一ウェルの底面と、前記第一培養チャンバの底面とが共通の面で構成され、
前記第一培養チャンバの鉛直方向に係る長さは、前記第一ウェルの底面から前記所定の高さ位置までの長さよりも短いものとしても構わない。

かかる構成によれば、第一ウェルの底面と第一培養チャンバの底面とが共通化されるため、簡易な方法で細胞培養チップを製造することができる。

前記細胞培養チップは、
前記第一培養チャンバに対して、前記第一ウェルとは反対側の位置で連結された第三ウェルと、
前記第二培養チャンバに対して、前記第二ウェルとは反対側の位置で連結された第四ウェルとを備えるものとしても構わない。

上記の構成によれば、第三ウェル側から培養液を流入させることで、第一ウェル内に貯留された第一液体が第二ウェル側へと押し出される。また、第二培養チャンバを通流した液体を、第四ウェル側から取り出すことができる。

なお、上記構成において、前記第一ウェルの底面と、前記第一培養チャンバの底面と、前記第三ウェルの底面と、記第二ウェルの底面と、前記第二培養チャンバの底面と、前記第四ウェルの底面とが、全て共通の面で構成されているものとしても構わない。

本発明に係る細胞培養方法は、
前記第一培養チャンバ内及び前記第二培養チャンバ内で、それぞれ独立に細胞を培養する工程（ａ）と、
前記第一培養チャンバを介して培養液を流入して、前記第一ウェル内に貯留される前記第一液体の液面の高さ位置を上昇させる工程（ｂ）とを有し、
前記工程（ｂ）において、前記第一液体が前記連結部、前記第二ウェルを介して前記第二培養チャンバ内に流入するように、前記培養液の流入量を調整することを特徴とする。

前記細胞培養方法において、
前記細胞培養チップは、前記第一培養チャンバに対して、前記第一ウェルとは反対側の位置で連結された第三ウェルを備え、
前記工程（ｂ）は、前記第三ウェルから前記培養液を流入する工程であるものとしても構わない。

本発明によれば、駆動機構を別途用いることなく、方向性を有した状態で細胞同士の相互作用の観察が可能な、細胞培養チップ及び細胞培養方法が実現される。

細胞培養チップの一実施形態の構造を示す写真である。 図１に示された細胞培養チップの構造を模式的に示す平面図である。 図２内のＸ１－Ｘ１線断面図である。 図２内のＸ２－Ｘ２線断面図である。 図２内のＸ３－Ｘ３線断面図である。 第一ウェルと第二ウェルの部分を図示した模式的な斜視図である。 図６において、隔壁を第一ウェルから第二ウェルに向かう方向に見たときの模式的な平面図である。 細胞培養チップの使用方法を模式的に示す工程図である。 細胞培養チップの使用方法を模式的に示す工程図である。 細胞培養チップの別実施形態の構造を模式的に示す斜視図である。 従来のマルチウェル型の細胞培養チップの構造の一例を模式的に示す斜視図である。 図１０に図示された細胞培養チップの構造を模式的に示す断面図である。 従来のマルチウェル型の細胞培養チップの構造の一例を模式的に示す斜視図である。 図１２に図示された細胞培養チップの構造を模式的に示す断面図である。

本発明に係る細胞培養チップ及び細胞培養方法につき、図面を参照して説明する。なお、以下の各図面はあくまで模式的に図示されたものである。すなわち、図面上の寸法比と実際の寸法比とは必ずしも一致しておらず、また、各図面間においても寸法比は必ずしも一致していない。

［構造］
図１は、細胞培養チップの一実施形態の構造を示す写真である。図２は、図１に示された細胞培養チップ１の構造を模式的に示す平面図である。図３は、図２内のＸ１－Ｘ１線で細胞培養チップ１を切断したときの模式的な断面図である。図４は、図２内のＸ２－Ｘ２線で細胞培養チップ１を切断したときの模式的な断面図である。図５は、図２内のＸ３－Ｘ３線で細胞培養チップ１を切断したときの模式的な断面図である。

図１～図５に図示された細胞培養チップ１は、第一培養チャンバ１１、第二培養チャンバ１２、第一ウェル２１、第二ウェル２２、第三ウェル２３、及び第四ウェル２４を備える。第一培養チャンバ１１、第二培養チャンバ１２、第一ウェル２１、第二ウェル２２、第三ウェル２３、及び第四ウェル２４は、いずれも周囲が壁部によって覆われた筒状又は管状の空間を構成する。第一培養チャンバ１１及び第二培養チャンバ１２は、細胞を培養する空間を構成する。

本実施形態において、細胞培養チップ１は、底部３と本体５とを備える。本体５は、４つの貫通孔を有しており、この貫通孔の一方の面が底部３と接触することで、各ウェル（２１～２４）が形成されている。また、本体５は、底部３側の面に、一対の細管状の凹部を有しており、この凹部と底部３との間の領域によって各培養チャンバ（１１，１２）が形成されている。

第一培養チャンバ１１は、一方の端部が第三ウェル２３に連結され、他方の端部が第一ウェル２１に連結されている。第二培養チャンバ１２は、一方の端部が第二ウェル２２に連結され、他方の端部が第四ウェル２４に連結されている。

図１～図４に示すように、第一培養チャンバ１１と第二培養チャンバ１２とは離間した位置に配置されている。また、第一ウェル２１と第二ウェル２２との間には隔壁６が形成されている。本実施形態では、この隔壁６が「連結部」を構成する。一方、図５に示すように、第三ウェル２３と第四ウェル２４とは本体５の壁によって完全に分離されている。

図６は、細胞培養チップ１から第一ウェル２１と第二ウェル２２の部分のみを抽出して図示した模式的な斜視図である。第一ウェル２１と第二ウェル２２との間には隔壁６が施されている。本実施形態において、隔壁６は、位置に応じて高さの異なる切り欠き部６ａを有する。図７は、隔壁６を、第一ウェル２１から第二ウェル２２に向かう方向に見たときの模式的な平面図である。

第一培養チャンバ１１の高さｈ１１は、隔壁６の高さｈ６よりも低い。また、第一ウェル２１の高さｈ２１は、隔壁６の高さｈ６よりも高い。

寸法の一例は以下の通りである。底部３の高さ（厚み）ｗ３は約１ｍｍであり、好ましくは１００μｍ以上、２ｍｍ以下である。第一ウェル２１の高さｈ２１、第二ウェル２２の高さｈ２２、第三ウェル２３の高さｈ２３、及び第四ウェル２４の高さｈ２４は、いずれも約５ｍｍである。第一培養チャンバ１１の高さｈ１１、及び第二培養チャンバ１２の高さｈ１２は、いずれも約４００μｍである。隔壁６の高さｈ６は約３ｍｍである。第一ウェル２１、第二ウェル２２、第三ウェル２３、及び第四ウェル２４の、底部３の面に平行な方向に係る面（開口面）の大きさは、約３．５ｍｍ□である。第三ウェル２３の第一ウェル２１とは反対側に係る端面２３ａから、第一ウェル２１の第三ウェル２３とは反対側に係る端面２１ａまでの距離は約１２．５ｍｍである。第二ウェル２２の第四ウェル２４とは反対側に係る端面２２ａから、第四ウェル２４の第二ウェル２２とは反対側に係る端面２４ａまでの距離は約１２．５ｍｍである。第一培養チャンバ１１の長手方向に係る長さｔ１１、及び第二培養チャンバ１２の長手方向に係る長さｔ１２は、いずれも約５．５ｍｍである。

細胞培養チップ１を構成する底部３及び本体５は、いずれも透明性を有する材料からなるのが好ましい。これにより、第一培養チャンバ１１及び第二培養チャンバ１２内で培養されている細胞を細胞培養チップ１の外側から視認することができる。加えて、細胞培養チップ１を構成する底部３及び本体５は、射出成形が可能な材料であることが好ましい。

［使用方法］
以下、上記の細胞培養チップ１の使用方法の一例について、図８Ａ及び図８Ｂを参照して説明する。

図８Ａ（ａ）に図示されるように、第三ウェル２３側から、所定の細胞４１を含む培養液４２を流入し、第四ウェル２４側から、所定の細胞５１を含む培養液５２を流入する。なお、細胞５１は、細胞４１から放出された生理活性物質による影響を評価する対象の細胞とする。一例として、細胞４１を肝臓の細胞とし、細胞５１を腎臓の細胞とすることができ、また別の一例として、細胞４１を心臓の細胞とし、細胞５１を腎臓の細胞とすることができる。また、それらの逆も可能である。

培養液（４２，５２）の流入に際しては、例えばマイクロピペットを用いることができる。第三ウェル２３側から流入された培養液４２は、第一培養チャンバ１１を通じて第一ウェル２１内に達する。第四ウェル２４側から流入された培養液５２は、第二培養チャンバ１２を通じて第二ウェル２２内に達する。

このとき、培養液４２の流入量は、第一ウェル２１内に達したときに隔壁６を乗り越えない範囲内の量とする。同様に、培養液５２の流入量は、第二ウェル２２内に達したときに隔壁６を乗り越えない程度の量とする。

次に、図８Ａ（ｂ）に図示されるように、第一ウェル２１内に貯留された培養液４２、第二ウェル２２内、及び第四ウェル２４内に貯留された培養液５２を、除去する。培養液（４２，５２）の除去に際しても、マイクロピペットを用いることができる。その後、第三ウェル２３内に貯留された培養液４２が、第一ウェル２１側へと流れ込み、図８Ａ（ｃ）に図示される状況となる。

この工程により、第一培養チャンバ１１内に、細胞４１を含む培養液４２が保持され、第二培養チャンバ１２内に、細胞５１を含む培養液５２が保持される。すなわち、第一培養チャンバ１１内で細胞４１が培養され、第二培養チャンバ１２内で細胞５１が培養される環境が形成される。この工程が工程（ａ）に対応する。

この状態で所定の時間を保持することで、第一培養チャンバ１１内で培養された細胞４１が、培養液４２内に生理活性物質を放出する。ここでいう生理活性物質とは、例えば内分泌作用を示すサイトカイン、ホルモン、脂質、細胞外基質、マイクロＲＮＡ、エクソソーム、栄養素、又は、薬剤などが挙げられる。なお、必要に応じて、第一ウェル２１内に貯留された培養液４２が隔壁６を乗り超えない範囲内の量の培養液４２を、第三ウェル２３側から追加的に流入させても構わない。

所定時間が経過した後、第三ウェル２３側から培養液４３を流入させる（図８Ｂ（ａ））。培養液４３は培養液４２と同一の材料であっても構わないし、細胞４１に対する影響が生じない範囲において培養液４２と異なる材料であっても構わない。培養液４２が「第一液体」に対応する。これにより、第一ウェル２１内に貯留されていた培養液４２の液面が上昇する。培養液４３は、培養液４２が隔壁６を乗り越えられる程度の量だけ流入される。この結果、細胞４１から放出された生理活性物質を含む培養液４２が、第二ウェル２２を介して第二培養チャンバ１２へと供給される（図８Ｂ（ｂ）、図８Ｂ（ｃ））。この工程が工程（ｂ）に対応する。

そして、図８Ｂ（ｃ）の状態で所定時間待機する。これにより、細胞４１から放出された生理活性物質が、第二培養チャンバ１２内で培養されていた細胞５１に接触された状態で一定時間保持されるため、細胞４１から放出された生理活性物質の細胞５１に対する影響の有無及びその態様を評価することができる。

以上のように、細胞培養チップ１によれば、第三ウェル２３側から流入させる培養液４３の供給量を調整するのみで、細胞４１から放出された生理活性物質を細胞５１に接触させることができるため、ポンプなどの駆動機構を別途設ける必要がない。また、細胞５１から放出された生理活性物質が細胞４１に対して作用することがないため、細胞４１から放出された生理活性物質の細胞５１に対して与える影響を、より正しく評価することが可能となる。

［別実施形態］
以下、別実施形態につき説明する。

〈１〉上記実施形態の細胞培養チップ１は、第一ウェル２１と第二ウェル２２との間が隔壁６によって隔てられており、培養液４２の液面が隔壁６の高さを乗り越えることで、培養液４２が第一ウェル２１から第二ウェル２２側へ流入する構成であった。しかし、細胞培養チップ１はこのような形態に限定されない。すなわち、細胞培養チップ１は、隔壁６に限らず、培養液４２の液面が所定の高さを超えると初めて第一ウェル２１から第二ウェル２２へと培養液４２を流入させる連結部を備える構成であればよい。

一例として、図９に模式的に図示されるように、細胞培養チップ１は、第一ウェル２１と第二ウェル２２とを連結する樋状流路７を備える構成とすることもできる。この樋状流路７は、第一ウェル２１内に貯留される培養液４２の液面が樋状流路７の高さｈ７を超えると初めて、培養液４２を第二ウェル２２側へと導く。かかる構成によっても、第三ウェル２３側から流入させる培養液４３の供給量を調整するのみで、細胞４１から放出された生理活性物質を細胞５１に接触させることができる。

なお、その他の例として、細胞培養チップ１は、第一ウェル２１と第二ウェル２２とを連結するチューブ状流路を備えるものとしても構わない。

〈２〉細胞培養チップ１は、第一培養チャンバ１１に対して培養液４２（４３）を注入することができればよく、この限りにおいて第三ウェル２３を必ずしも備えなくても構わない。同様に、細胞培養チップ１は、必ずしも第四ウェル２４を備えなくても構わない。

〈３〉上記実施形態では、細胞培養チップ１が２つの培養チャンバ（１１，１２）を備える場合について説明した。しかし、細胞培養チップ１は、直列に接続された３つ以上の培養チャンバを備えるものとしても構わない。

〈４〉上記実施形態では、各ウェル（２１，２２，２３，２４）及び各培養チャンバ（１１，１２）が、底部３の上面を共通の底面である場合について説明した。しかし、この態様は一例である。ただし、細胞培養チップ１の製造工程を容易化すると共に、細胞培養チップ１のサイズを極めて小型化することができるという点において、各ウェル（２１，２２，２３，２４）及び各培養チャンバ（１１，１２）の底面が共通化されるのが好ましい。

〈５〉上記実施形態では、隔壁６が切り欠き部６ａを有する形状を示す場合について説明した。しかし、細胞培養チップ１が隔壁６を備える場合において、隔壁６の高さが第一ウェル２１の他の壁面の高さよりも低く構成されていれば、必ずしも隔壁６が切り欠き部６ａを備えない形状であっても構わない。なお、切り欠き部６ａを有した隔壁６を備える場合には、切り欠き部６ａの形状や高さ位置によって培養液４２を第二培養チャンバ１２側へ流入させる速度を適宜調整することができる。

１ ： 細胞培養チップ
３ ： 底部
５ ： 本体
６ ： 隔壁
６ａ ： 隔壁の切り欠き部
７ ： 樋状流路
１１ ： 第一培養チャンバ
１２ ： 第二培養チャンバ
２１ ： 第一ウェル
２１ａ ： 第一ウェルの壁面
２２ ： 第二ウェル
２２ａ ： 第二ウェルの壁面
２３ ： 第三ウェル
２３ａ ： 第三ウェルの壁面
２４ ： 第四ウェル
２４ａ ： 第四ウェルの壁面
４１ ： 細胞
４２，４３ ： 培養液
５１ ： 細胞
５２ ： 培養液
１００ ： 従来の細胞培養チップ
１１０ ： ウェル
１２０ ： 上部トレイ
１３０ ： 下部トレイ
１４０ ： 細胞
１５０ ： 培養液
２００ ： 従来の細胞培養チップ
２０５ ： 本体
２１０ ： 本体の上面
２１５ ： 外壁
２２０ ： ウェル

Claims (4)

1. 底部と前記底部に結合した本体とを含んでなる細胞培養チップであって、
   前記底部の面に平行な第一方向に関して相互に隣接した位置に形成され、前記本体を貫通して前記底部を露出する貫通孔からなる、第一ウェル及び第二ウェルと、
   前記第一方向に関して前記第一ウェル及び前記第二ウェルとは離間した位置に形成され、前記本体を貫通して前記底部を露出する貫通孔からなる、第三ウェル及び第四ウェルと、
   前記本体の前記底部側の面に形成された凹部であって、前記第一ウェルと前記第三ウェルとを前記第一方向に延在する細管状を呈して連絡する第一培養チャンバと、
   前記本体の前記底部側の面に形成された凹部であって、前記第二ウェルと前記第四ウェルとを前記第一方向に延在する細管状を呈して連絡する第二培養チャンバと、
   前記第一方向に関して前記第一ウェルと前記第二ウェルとに挟まれた位置において、前記底部の面に直交する第二方向に、前記本体よりも低い高さを有して前記底部から突出する形状を呈して形成され、前記第一ウェルと前記第二ウェルとを前記第一方向に区画する隔壁とを備え、
   前記第三ウェルと前記第四ウェルとは、前記本体の壁によって分離されており、
   前記第一培養チャンバ及び前記第二培養チャンバの高さは、前記隔壁の高さよりも低いことを特徴とする、細胞培養チップ。
2. 前記隔壁は、底面の高さ位置が場所によって変化する切り欠き部を備えることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養チップ。
3. 請求項１に記載の細胞培養チップを用いた細胞培養方法であって、
   前記第一培養チャンバ内及び前記第二培養チャンバ内で、それぞれ独立に細胞を培養する工程（ａ）と、
   前記第一培養チャンバを介して培養液を流入して、前記第一ウェル内に貯留される第一液体の液面の高さ位置を上昇させる工程（ｂ）とを有し、
   前記工程（ｂ）において、前記第一液体が前記隔壁、前記第二ウェルを介して前記第二培養チャンバ内に流入するように、前記培養液の流入量を調整することを特徴とする、細胞培養方法。
4. 前記工程（ｂ）は、前記第三ウェルから前記培養液を流入する工程であることを特徴とする、請求項３に記載の細胞培養方法。
   

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