IT201900016376A1 - Dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici - Google Patents

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Carmen Giordano
Manuela Teresa Raimondi
Luca Izzo
Matteo Lagana'
Diego Albani
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Milano Politecnico
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Description

Descrizione di un brevetto d’invenzione avente per titolo: “Dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici.
Esistono dispositivi per la coltura cellulare, come bioreattori modulari a camere separate perfuse dove ciascuna camera è indipendente e isolata dalle altre come circuito di perfusione, ma allo stesso tempo è collegabile tramite bypass. Tali camere sono otticamente accessibili e permettono l’ispezione della coltura cellulare tramite sia microscopia ottica standard che confocale, sia in luce bianca, che in contrasto di fase, che in fluorescenza.
Un dispositivo, di cui sopra, è descritto nella domanda di brevetto WO2017199121 a nome dello stesso Richiedente.
Scopo della presente invenzione è quello di provvedere ad un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici che abbia una maggiore modularità rispetto a quelli dell’arte nota.
Altro scopo è quello di provvedere ad un dispositivo che permetta una maggiore facilità di uso.
Ulteriore scopo è quello di provvedere ad un dispositivo che sia di semplice realizzazione.
In accordo con la presente invenzione, tali scopi ed altri ancora vengono raggiunti da un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici comprendente: un corpo principale comprendente almeno un primo foro chiuso sul fondo; un separatore; una membrana fissata a detto separatore; un tappo di chiusura di detto primo foro; detto separatore atto ad essere posto in detto primo foro; detto separatore essendo estraibile da detto primo foro; detta membrana divide detto primo foro in una semi camera superiore ed una semi camera inferiore; una coppia di tubi per perfondere detta semi camera inferiore; una coppia di tubi per perfondere detta semi camera superiore.
Ulteriori caratteristiche dell’invenzione sono descritte nelle rivendicazioni dipendenti.
I vantaggi di questa soluzione rispetto alle soluzioni dell’arte nota sono diversi.
L’invenzione consiste in un dispositivo a tenuta per la coltura perfusa di cellule o batteri sia in sospensione che in adesione, in 2D o 3D, per la realizzazione di soluzioni perfuse contenenti parti derivate da cellule (ad esempio, micro/nanovescicole), o molecole biologiche (ad esempio, proteine o DNA isolato) o anche composti chimici bioattivi (ad esempio, farmaci).
Il dispositivo è costituto da un sistema ospitante formato da diverse camere di coltura/diluizione, indipendenti fra loro, estraibili e realizzabili con diversi diametri/misure. L’estraibilità consente un’agevole semina di cellule su ambo i lati della membrana, e la possibilità di riutilizzare il corpo del dispositivo sostituendo le camere di coltura utilizzate con camere nuove e sterilizzando nuovamente il dispositivo risultante.
Le camere ospitano una membrana, che le separa in due semi camere, di tipo permeabile o semipermeabile con diverse porosità oppure non permeabile, composta di diversi materiali, come ad esempio policarbonato, PET, PVC, TEFLON, PDMS, acetato di cellulosa, poliestere, polistirene, nylon ed altre.
Scegliendo opportunamente il materiale e la porosità delle membrane, le due semi camere possono essere interconnesse o indipendenti.
Le colture cellulari possono essere realizzate su uno o su ambo i lati della membrana, localizzata nella camera di coltura.
Il dispositivo è otticamente accessibile con microscopia ottica standard ed in contrasto di fase, sia diritta che rovesciata, sia in luce bianca che fluorescenza, e con microscopia confocale. Il dispositivo permette quindi l’ispezione della coltura cellulare tramite le suddette tecniche di microscopia senza interrompere la coltura stessa. L’accessibilità ottica consente l’utilizzo del dispositivo con qualsiasi sensore ottico, ad esempio per la misura di pH, ossigeno, anidride carbonica e consente di misurare la concentrazione di soluti in un solvente perfuso.
Il dispositivo è realizzabile sia in assenza che in presenza di elettrodi, utili per la misura di parametri elettrici rilevanti per il comportamento cellulare e batterico e per la stimolazione elettrica delle colture cellulari o batteriche contenute in ciascuna camera di coltura, in una configurazione che non compromette l’accessibilità ottica garantendo una ampia superficie di contatto con il contenuto della camera di coltura. Gli elettrodi possono essere convenientemente e economicamente ricavati tramite taglio Laser da idonee lamiere metalliche, ad esempio di acciaio inox o metalli preziosi di spessore da 0,05 a 0,2 mm.
Il dispositivo è modulare relativamente a diversi aspetti.
a) Geometria della camera di coltura perfusa, che può essere realizzata anche di diverse misure e può alloggiare sia cellule che batteri in sospensione, in mono strato (2D), in gel (3D) o in supporti tridimensionali (3D), da soli o interfacciati attraverso la membrana di separazione localizzata nella camera di coltura stessa.
b) Numero di camere perfuse, ciascuna indipendente dalle altre come circuito di perfusione, ma allo stesso tempo collegabili tra loro tramite bypass.
c) Meccanismo di apertura/chiusura, poiché ogni camera di perfusione possiede il proprio coperchio che è operabile indipendentemente dalle altre camere.
In particolare, più dispositivi possono essere connessi fra loro realizzando una piattaforma multi dispositivo in grado di ospitare e interfacciare fra loro contemporaneamente diverse tipologie di colture cellulari e batteriche o contenenti derivati da cellule/batteri, ovvero molecole di sintesi chimica, nelle configurazioni sopradescritte, sia per sospensioni che con cellule adese coltivate in 2D o in 3D.
Il dispositivo e la piattaforma risultante possono essere interfacciati con sistemi di coltura batterica liquida, direttamente o attraverso un sistema dedicato per la realizzazione di colture batteriche, sia in condizioni di coltura liquida standard, in sospensione ed in 2D, che coltivati in matrici opportune in 3D, con una geometria simile alle camere di coltura del dispositivo.
d) Sistema di supporto della membrana, facilmente estraibile dal dispositivo e manipolabile. Tale caratteristica consente di effettuare le operazioni di semina cellulare e/o effettuare saggi e misure al di fuori del dispositivo, con tecniche routinarie consolidate. Il sistema di supporto estraibile permette inoltre di cambiare velocemente la geometria delle camere di perfusione, semplicemente cambiando il tipo di supporto della membrana utilizzato. Il vantaggio di questo sistema altamente modulare è quello di poter imporre condizioni sperimentali diverse in ogni camera, anche utilizzando lo stesso corpo base del dispositivo e/o senza dover rimontare completamente tutto il set-up sperimentale.
e) Sistema caratterizzato da un doppio livello di guarnizioni atte a isolare i due percorsi fluidi da entrambi i lati della membrana e a impedire perdite di liquido all’esterno della camera.
f) Sistema di sicurezza anti sollevamento dei tappi, costituito da viti che rendono il sistema operabile anche ad alte pressioni/elevate portate. Tale sistema rende sicuro l’uso del dispositivo anche per tempi prolungati, nonché a fronte di frequenti manipolazioni per eseguire le ispezioni microscopiche, ovvero quando montato stabilmente all’interno di un microscopio dotato di incubatore cellulare.
Il dispositivo è utilizzabile per la ricerca e per l’analisi di molecole bioattive in ambito biologico, medico, biochimico e chimico, farmacologico e tossicologico. In generale, il dispositivo è applicabile in tutte quelle situazioni, note o a venire, caratterizzate dalla necessità di dover ispezionare otticamente e/o stimolare elettricamente e/o misurare elettricamente parametri biologici a seguito di interazioni tra due liquidi (uguali o diversi) che perfondono due lati di una membrana (oppure le superfici di un setto non poroso), e che contengono materiale biologico vitale, derivato da sistemi vitali o di natura chimica, sulla quale membrana o setto può o meno essere disposto un terzo elemento (adeso o deposto).
Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata di una sua forma di realizzazione pratica, illustrata a titolo di esempio non limitativo negli uniti disegni, nei quali:
la figura 1 mostra un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva dall’alto, in accordo alla presente invenzione;
la figura 2 mostra un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva dal basso, in accordo alla presente invenzione;
la figura 3 mostra un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, senza tappi, visto in prospettiva dall’alto, in accordo alla presente invenzione;
la figura 4 mostra un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, senza tappi e senza separatori, visto in prospettiva dall’alto, in accordo alla presente invenzione;
la figura 5 mostra un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva e in sezione, in accordo alla presente invenzione;
la figura 6 mostra una camera in sezione di un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, in accordo alla presente invenzione;
la figura 7 mostra un tappo di un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva dall’alto, in accordo alla presente invenzione;
la figura 8 mostra un tappo di un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva da sotto, in accordo alla presente invenzione;
la figura 9 mostra un separatore di un dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva e in sezione, in accordo alla presente invenzione;
la figura 10 mostra un primo elettrodo di dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, in accordo alla presente invenzione;
la figura 1 1 mostra un secondo elettrodo di dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, in accordo alla presente invenzione;
la figura 12 mostra dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici, visto in prospettiva e in sezione, in accordo ad una versione alternativa della presente invenzione.
Riferendosi alle figure allegate, un dispositivo 10 per la coltura cellulare, in accordo alla presente invenzione, comprende un corpo principale 1 1 a forma di rettangolo, avente ingombro in pianta tale da poter essere alloggiato in un supporto per vetrino porta oggetto da microscopia standard e confocale (esempio: lunghezza da 60 mm a 80 mm, larghezza da 20 a 30 mm, preferibilmente lunghezza 68 mm larghezza 25 mm).
Il corpo principale 1 1 , come raffigurato, comprende tre camere 12, 13 e 14, con circuito idraulico indipendente.
Il numero delle camere può essere variabile da una a molteplici secondo le esigenze.
Le tre camere 12, 13 e 14 sono dotate ognuna di un tappo 15 di forma ovalizzata e comunque allungata che raggiunge i bordi del corpo 1 1 . Sul bordo del corpo 1 1 sono predisposti incavi 16 in cui si posizionano gli estremi del tappo 15 per avere una guida per il corretto posizionamento dei tappi 15 stessi.
I tappi 15 comprendono, preferibilmente, due fori 17 passanti, posti agli estremi, per fissarli in modo stabile sul corpo 1 1 mediante viti. In alternativa, è possibile utilizzare altri mezzi di fissaggio dei tappi 15 al corpo 1 1 , come ad esempio ganci o sistemi a pressione.
I tappi 15 hanno una componente superiore 20 sostanzialmente piatta ed una componente inferiore 21 di forma cilindrica.
Sulla componente superiore e centrale al tappo 15 è installato un vetrino 22 di forma preferibilmente circolare che permette la completa visione dell’interno della camera, per l’uso con i microscopi.
Esternamente alla componente inferiore 21 è predisposta una guarnizione 23 circolare.
Inferiormente al corpo 1 1 si notano per ogni camera due coppie di tubi che escono perpendicolari al corpo 1 1 , e più in particolare, fuoriescono da un ingrossamento 24 inferiore del corpo 1 1 che fornisce spazio alle camere 12-14.
Una coppia di tubi 25 interna, con un tubo di ingresso e uno di uscita, per una prima semi camera (che definiremo successivamente) ed una coppia di tubi 26 esterna, con un tubo di ingresso e uno di uscita, per una seconda semi camera.
Sul corpo 1 1 si notano i fori filettati 30 che corrispondono ai fori 17 per il fissaggio dei tappi 15 sul corpo 1 1 , mediante le viti 27.
Rimossi i tappi 15 si notano i separatori 35 che permettono di dividere ognuna delle camere 12-14 in due semi camere.
I separatori 35 hanno una forma cilindrica cava aperti inferiormente e chiusi superiormente da una membrana 36. La membrana 36 divide la semi camera superiore dalla semi camera inferiore.
La membrana 36 può essere posta (incollata) alla sommità dei separatori 35 come mostrato nelle figure 3 e 9, ma può essere posta in posizione interna al separatore 35, come mostrato nelle figure 5 e 6, in particolare ad una distanza predefinita dalla sommità del separatore 35.
In particolare, se la membrana 36 viene posta alla sommità dei separatori 35, la semi camera superiore è alta 0,3 mm. Nel caso di altro posizionamento della membrana 36, si realizza un separatore 35 formato da due parti di altezze prefissate. La membrana 36 viene incollata sulla parte del separatore inferiore e quindi viene incollata la parte superiore del separatore, posizionando quindi la membrana all’altezza voluta ed ottenendo le due semi camere di altezze predefinite.
Il posizionamento della membrana 36 permette di aumentare o diminuire il volume della semi camera superiore e di conseguenza diminuire o aumentare il volume della semi camera inferiore.
All’interno dei separatori 35, preferibilmente in posizione distanziata dalla membrana 36 viene posta una guarnizione 37 circolare.
Rimossi i separatori 35, nel corpo 1 1 si notano le aree predisposte per le camere.
Per ogni camera 12-14 vi è un foro 40 nel corpo 1 1 chiuso sul fondo. Al centro del foro 40, e coassialmente ad esso, si erge un corpo cilindrico 41 . Sulla sommità del corpo cilindrico 41 è posto un vetrino 42 di forma preferibilmente circolare che permette la completa visione dell’interno della camera, per l’uso con i microscopi.
Il vetrino 42 può essere omesso se i materiali utilizzati per la realizzazione del dispositivo sono trasparenti.
L’interno del corpo cilindrico 41 è cavo e forma un foro 43, coassiale al corpo cilindrico 41 , che è aperto inferiormente e chiuso superiormente dal vetrino 42.
Il foro 43 permette di avere meno materiale nel percorso ottico dei microscopi, consentendo così una migliore visione dell’interno delle semi camere.
Le coppie di tubi 25 e 26 sono allineati lateralmente al foro 43 e trasversali al corpo 1 1 .
Il dispositivo comprende preferibilmente due elettrodi conduttivi elettricamente, uno per ogni semi camera.
Gli elettrodi possono essere utilizzati sia per la misura di parametri elettrici che per la stimolazione elettrica delle colture contenute in ciascuna camera di coltura, come ad esempio per misurare la resistenza trans-epiteliale/transendoteliale, per determinare l’insorgenza di correnti ioniche attraverso le membrane cellulari, utili per studi di fisiologia e neurobiologia o per indurre una contrazione tissutale, utile per simulare contrazioni muscolari quali la peristalsi.
Un elettrodo 50 per la semi camera inferiore ha un corpo principale a forma di corona circolare 51 con due barrette 52 che si estendono dal corpo circolare 51 e sono rivolte verso il basso, per la connessione elettrica.
L’elettrodo 50 trova posto superiormente al corpo cilindrico 41 ed il corpo circolare 51 risulta esterno al vetrino 42 e nell’area della semi camera inferiore. Le due barrette 52 fuoriescono inferiormente dal corpo 1 1 (ingrossamento 24).
Un elettrodo 55 per la semi camera superiore ha un corpo principale a forma di corona circolare 56, e presenta alcune barrette 57, per facilitare il posizionamento, ed una barretta 58, più lunga delle precedenti per la connessione elettrica, che si estendono dal corpo circolare.
L’elettrodo 55 trova posto in un alloggiamento sul tappo 15, ed il corpo circolare 56 è esterno e al di sotto del vetrino 22, in modo che si trovi nell’area della semi camera superiore.
Gli elettrodi 50 e 55 hanno un corpo principale a forma di corona circolare, quindi con un foro centrale, che non compromette l’accessibilità ottica.
Ogni semi camera è a tenuta e isolata e comunica con l’esterno solo con le coppie di tubi 25 e 26. Solo il tipo di membrana 36 determina la permeabilità tra le due semi camere. Ad esempio, è possibile inserire membrane in policarbonato, PET, PVC, TEFLON, PDMS, acetato di cellulosa, poliestere, polistirene, nylon, con porosità definita a priori.
La guarnizione interna 37 dei separatori 35 interferisce con la superficie laterale esterna del corpo cilindrico 41 , e chiude la semi camera inferiore, delimitata superiormente dalla membrana 36, inferiormente dal vetrino 42 e lateralmente dal separatore 35.
La guarnizione esterna 23 del tappo 15 interferisce con la superficie laterale interna del foro 40, e chiude la semi camera superiore, delimitata superiormente dal vetrino 22, inferiormente dalla membrana 36 e lateralmente dalla componente inferiore 21 del tappo 15 o dal separatore 35.
Il corpo cilindrico 41 , che emerge dal foro 40, forma una base una base 45, attorno al corpo cilindrico 41 , con una forma a corona circolare che funge da battuta di riferimento inferiore sia del coperchio 15 (componente inferiore 21 ) che dalla base del separatore 35.
La perfusione delle camere avviene tramite le coppie di tubi 25 e 26.
La semi camera superiore utilizza la coppia di tubi 26 più esterna. Essi sono fissati in un foro 60 del corpo 1 1 e raggiungono la base 45 e sono allineati alla linea in cui si affiancano il separatore 35 e il tappo 15.
Tra il separatore 35 e il tappo 15 è predisposto un passaggio che raggiunge la semi camera superiore. Tale passaggio è una coppia di scanalature 61 predisposte sulla parete laterale interna del tappo 15 e, per facilitare l’afflusso all'interno della semi camera, la scanalatura prosegue parzialmente anche sulla parete superiore interna del tappo 15 fino a raggiungere il vetrino 22 e/o l’elettrodo 55.
Tale percorso fluido può anche essere convenientemente realizzato tramite tubi metallici connessi al tappo e solidali ad esso e che risultano prossimi o, meglio, si innestano direttamente nel lume interno dei tubi 26 una volta assemblato il dispositivo.
La semi camera inferiore utilizza la coppia di tubi 25 più interna. Essi sono fissati in un foro 65, affiancato alla parete interna del separatore 35 e raggiunge un foro 66 di passaggio, tra il bordo esterno del separatore 35 ed il vetrino 42.
Nel caso fosse presente l’elettrodo 50, in corrispondenza del foro 66 presenta uno smusso 67 per lasciare fluire la perfusione.
Gli elettrodi 50 e 55, realizzati in un materiale conduttore elettrico, possono essere presenti o assenti nel dispositivo secondo le necessità.
In una forma di realizzazione del dispositivo il corpo 1 1 presenta una dimensione di 25x68 mm, le semi camere (superiore e inferiore) hanno un diametro medio compreso fra 5 e 12 mm (preferibilmente 10 mm) ed una profondità compresa tra 0.3 mm e 1 ,8 mm (preferibilmente 0.3 mm per la semi camera superiore e 1.8 mm per la semi camera inferiore). In questo caso la membrana 36 è stata posta superiormente al separatore 35. Il dispositivo 10 può essere utilizzato per la coltura di cellule derivate da organismi viventi sia di tipo immortalizzato (cioè capaci di replicarsi indefinitamente in coltura) che primario (cioè con una limitata o nulla capacità di replicarsi in coltura), sia in sospensione che in adesione, in 2D ed ospitate in 3D in opportuni supporti e matrici polimeriche. Potrebbe anche essere adatto per incubare parti derivate da cellule (ad esempio, microvescicole o particolari organelli cellulari), così come per batteri o soluzioni contenenti molecole chimiche, inclusi farmaci.
Può essere utilizzato anche per abbinare una coltura, come ad esempio neuroni o cellule endoteliali o batteri specifici, coltivati singolarmente o in cocoltura come nel microbiota intestinale, in una semi camera, ed una coltura nell’altra semi camera, come ad esempio astrociti o cellule ematiche o cellule endoteliali dell'intestino per verificare come la loro interazione abbia rilevanza fisiologica o patologica.
In accordo ad una versione alternativa della presente invenzione il dispositivo, viene ora mostrato come dispositivo singolo ma potrebbe essere conformato come nel caso precedente con due o più dispostivi posti in un unico corpo.
In questo caso il singolo dispositivo 70 ha un corpo 71 sostanzialmente circolare, e comprende un separatore 72, estraibile, formato da un disco circolare al cui fondo è fissata una membrana 73, che divide il corpo 71 in due semi camere, una superiore ed una inferiore. Il separatore 72, quando inserito nel corpo 71 , appoggia su un bordo predisposto nel corpo 71 stesso.
I canali di perfusione 74 e 75, creati all’interno del corpo 71 , accedono lateralmente alle due semi camere, e risultano parallele alla membrana. Ai canali 74 e 75 è possibile applicare tubi di connessione (non mostrati).
Il dispositivo 70 può essere utilizzato a se stante oppure può essere utilizzato in congiunzione con il dispositivo 10.
In particolare è possibile coltivare nel dispositivo 70 una coltura batterica posta in una semi camera, alimentata da un fermentatore o una coltura batterica in un contenitore adeguato, collegata potenzialmente anche ad un dispositivo che permette il mescolamento di batteri in una matrice polimerica che simula ad esempio il muco intestinale in caso di coltura batterica in 3D; il secretoma derivante, cioè l’insieme delle molecole prodotte dalla risultante coltura, si trasferisce attraverso la membrana nell’altra semi camera e viene inviato ad una o più camere del dispositivo 10 per verificare l’impatto delle molecole prodotte su organi e sistemi biologici particolari, in condizioni fisiologiche o patologiche tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo: endotelio intestinale: fegato; sistema immunitario; barriera ematoencefalica; cervello. In questo caso come membrana si è utilizzata una membrana porosa con un taglio molecolare che permetta il passaggio di sostanze ma non delle cellule (tipicamente 0,1 micrometri tra batteri e secretoma e 0,4 per le altre semicamere ospitanti colture cellulari).
Tutti i componenti sono stati realizzati in materiali plastici e elastomerici e sono stati progettati per essere realizzati tramite stampaggio a iniezione di materie plastiche o altro metodo di realizzazione applicabile su scala industriale.
I materiali utilizzati, nonché le dimensioni, e le forme potranno essere qualsiasi a seconda delle esigenze e dello stato della tecnica. Ad esempio le camere e tutti gli elementi connessi sono stati realizzati di forma circolare ma nulla vieta che siano realizzati di altre forme come ad esempio di forma quadrata od ovale.
Il dispositivo così concepito è suscettibile di numerose modifiche e varianti, tutte rientranti nell'ambito del concetto inventivo; inoltre tutti i dettagli sono sostituibili da elementi tecnicamente equivalenti.

Claims (15)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici comprendente: un corpo principale (1 1 ) comprendente almeno un primo foro (40) chiuso sul fondo; un separatore (35); una membrana (36) fissata a detto separatore (35); un tappo (15) di chiusura di detto primo foro (40); detto separatore (35) atto ad essere posto in detto primo foro (40); detto separatore (35) essendo estraibile da detto primo foro (40); detta membrana (36) divide detto primo foro (40) in una semi camera superiore ed una semi camera inferiore; una coppia di tubi (25) per perfondere detta semi camera inferiore; una coppia di tubi (26) per perfondere detta semi camera superiore.
  2. 2. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di comprendere un primo vetrino (22) posto centralmente su detto tappo (15).
  3. 3. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto di comprendere un secondo vetrino (42) posto centralmente a detto primo foro (40).
  4. 4. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 3 caratterizzato dal fatto che da detto primo foro (40) si erge un corpo cilindrico (41 ) e sulla sommità di detto corpo cilindrico (41 ) è posto detto secondo vetrino (42).
  5. 5. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 4 caratterizzato dal fatto che detto corpo cilindrico (41 ) presenta un secondo foro (43), coassiale a detto corpo cilindrico (41 ).
  6. 6. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta membrana (36) è scelta tra una membrana permeabile o una impermeabile o una semipermeabile.
  7. 7. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta membrana (36) è realizzata con uno o più dei seguenti materiali: policarbonato, PET, PVC, TEFLON, PDMS, acetato di cellulosa, poliestere, polistirene, nylon.
  8. 8. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta membrana (36) è posta alla sommità di detto separatore (35).
  9. 9. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta membrana (36) è posta ad una distanza predefinita dalla sommità di detto separatore (35).
  10. 10. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto comprendere un primo elettrodo (50) conduttivo per detta semi camera inferiore.
  11. 1 1. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 10 caratterizzato dal fatto che detto primo elettrodo (50) ha un corpo principale a forma di corona circolare.
  12. 12. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto comprendere un secondo elettrodo (55) conduttivo per detta semi camera superiore.
  13. 13. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 12 caratterizzato dal fatto che detto secondo elettrodo (55) ha un corpo principale a forma di corona circolare.
  14. 14. Dispositivo in accordo alla rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che detta semi camera superiore è isolata fluidodinamicamente da detta semi camera inferiore, solo il tipo di membrana determina la permeabilità tra dette due semi camere.
  15. 15. Uso del dispositivo millifluidico per colture avanzate di agenti biologici in accordo alla rivendicazione 1 per la coltura cellulare di cellule immortalizzate o primarie o batteri sia in sospensione che in adesione, in 2D o 3D, per la realizzazione di soluzioni perfuse contenenti parti derivate da cellule (ad esempio, microvescicole o organelli), o molecole biologiche (ad esempio, proteine o DNA isolato) o anche molecole bioattive (ad esempio, farmaci).
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