CN112410206A - 一种快速检测系统及方法 - Google Patents

Abstract

本申请属于生物检测技术领域，特别是涉及一种快速检测系统及方法。现有的检测方法和仪器存在检测耗时较长、无法检测未知病原菌等问题，无法满足临床应用的及时性需求。本申请提供了一种快速检测系统，所述系统包括细菌培养捕获子系统、成像子系统、图像处理子系统、数据分析子系统和终端，所述终端与所述细菌培养捕获子系统连接，所述终端与所述成像子系统连接，所述终端与所述图像处理子系统连接，所述终端与所述数据分析子系统连接，所述图像处理子系统与所述数据分析子系统连接。能够实现在2小时内对多种临床致病细菌的耐药性进行快速检测的功能。

Description

一种快速检测系统及方法

技术领域

本申请属于生物检测技术领域，特别是涉及一种快速检测系统及方法。

背景技术

细菌的耐药性已经成为世界性难题，它是指细菌对于抗菌药物的耐受性。耐药性的产生会明显降低药物的治疗作用。细菌产生耐药性是不可避免的自然进化过程，但是近年来抗生素的过度使用大大加速了这一进程，给人类的缓冲时间和应对策略提出了极大的挑战。快速确定细菌对抗生素的敏感性是为临床治疗提供及时和合理指导的前提和关键。临床治疗中耐药性的检测包括对感染病人的样本采集、体外分离培养以及抗生素敏感性检测等步骤。根据采集病例的样本和菌种的不同，体外分离培养得到单克隆一般需要1～3天，而进一步地对抗生素敏感性进行检测的结果通常需要额外耗时1～2天，不能满足临床需求的及时性。抗生素敏感性的检测结果对医生具有指导意义，可以帮助确定抗生素的选择及合理剂量。在缺乏检测结果的期间医生只能依靠经验治疗，不仅容易错过急性感染或感染初期的最佳诊断时机，而且会让耐药情况更加严重。对于临床诊疗而言，缩短细菌耐药性检测周期的时间可以提高及时治疗的成功率，因此临床中亟需一种对细菌耐药性的快速检测手段。

在对细菌耐药性的研究和临床检测方法中，主要的分析手段分为两大类：常规药敏实验和耐药基因分析。常规的药敏实验检测方式是对微生物进行表型筛查，即通过检测药物对细菌生长状况的影响来判断耐药性的程度。传统方法有纸片法、E-test法、微量稀释法和琼脂稀释法等，其中以纸片法和微量稀释法最为常用。目前的市场上有多种这种基于表型分析的自动检测设备，如PhoenixTM细菌鉴定药敏系统，VITEK-AMS细菌鉴定和药敏分析系统和Sensititre荧光快速微生物鉴定/药敏系统等。细菌产生耐药性的遗传基础是基因突变或获得耐药基因，基于耐药基因检测的新技术是重要的手段和途径，包括飞行时间质谱技术、基于聚合酶链式反应(PCR)扩增技术的检测方法、基因芯片和全基因组测序。

现有的基于常规药敏实验的分析手段是在细菌有无抗生素刺激下，通过检测细菌的吸光度值或抑菌区域的大小来进行评价。相关的仪器设备具有先进的自动化系统和广泛的鉴定功能，适用于临床微生物实验室、卫生防疫和商检系统等，虽然在一定程度上缩短了微生物的鉴定和抗生素敏感性的检测时间，但耗时仍然较长(通常18～36小时)，难以满足目前临床急症感染的快速诊断需求。现有技术中基于耐药基因分析的方法因其较高的灵敏性和特异性，可以在药敏实验结果之前为临床提供参考，但是也存在诸多不足之处，如利用飞行时间质谱进行病原菌指纹图谱识别的方法由于技术设备和配套试剂昂贵、检测耐药种类有限，主要用于细菌耐药的科研领域。全基因组测序在发现新耐药基因/机制上有着先天优势，但对基因数据库要求严格，因此适合对耐药机制的深入挖掘和研究工作；基因芯片技术基于核酸杂交的特异性未知样品进行检测和分析，具有高通量、快速准确的特点，其局限性在于如技术成本昂贵、检测灵敏度较低等，这些制约了大规模推广应用；PCR方法通过针对不同细菌设计特异性引物进行扩增和检测，对病菌检测具有很高的灵敏性和选择性，是一种通用并可扩展的微生物鉴定方法。但由于其复杂的预处理过程，难以在商业化仪器的应用中普遍推广。

发明内容

1.要解决的技术问题

基于常规药敏实验的分析手段普遍操作复杂，检测周期较长，需要1～3天才能获得分析结果。而基于耐药基因分析方法目前尚不能检测新的耐药机制，且不能确定含有耐药基因的菌株是否处于耐药状态。现有的检测方法和仪器存在检测耗时较长、无法检测未知病原菌等问题，无法满足临床应用的及时性需求的问题，本申请提供了一种快速检测系统及方法。

2.技术方案

为了达到上述的目的，本申请提供了一种快速检测系统，所述系统包括细菌培养捕获子系统、成像子系统、图像处理子系统、数据分析子系统和终端，所述终端与所述细菌培养捕获子系统连接，所述终端与所述成像子系统连接，所述终端与所述图像处理子系统连接，所述终端与所述数据分析子系统连接，所述图像处理子系统与所述数据分析子系统连接。

本申请提供的另一种实施方式为：所述细菌培养捕获子系统包括芯片、压力调节组件和温度调节组件，所述压力调节组件与所述芯片连接，所述温度调节组件与所述芯片连接，所述压力调节组件与所述终端连接，所述芯片与所述终端连接，所述芯片设置于所述温度调节组件内。

本申请提供的另一种实施方式为：所述芯片为微流控芯片，所述压力调节组件为压力泵或者程控注射器，所述温度调节组件为恒温箱。

本申请提供的另一种实施方式为：所述成像子系统包括显微平台、物镜、电动平移台、自动对焦单元和成像相机；所述电动平移台设置于所述显微平台上，所述物镜设置于所述显微平台内，所述温度调节组件设置于所述电动平移台上，所述电动平移台与所述终端连接，所述电动平移台与所述自动对焦单元连接，所述自动对焦单元与所述终端连接，所述显微平台与所述成像相机连接，所述成像相机与所述终端连接。

本申请提供的另一种实施方式为：所述图像处理子系统包括通道识别算法模块和细菌识别算法模块，

所述通道识别算法模块，用于对采集的图像进行细菌捕获通道的定位和识别；

所述细菌识别算法模块，用于对从通道识别算法提取出的细菌捕获通道中的细菌进行形态学识别，得到定量的细菌形态参数。

本申请提供的另一种实施方式为：所述数据分析子系统包括细菌追踪算法模块和表型统计算法模块，所述细菌追踪算法模块，用于对延时显微成像过程中采集的每个位点每帧图像，得到细菌随时间演变的形态变化矩阵数据；

所述表型统计算法模块，用于对细菌追踪算法得到的形态变化矩阵数据分析，计算得到细菌表型指标，得出在不同药物环境下细菌表型指标的值。

本申请提供的另一种实施方式为：所述芯片为微流控芯片，所述微流控芯片包括若干微流通道，所述微流通道包括连通的进样口、主通道、细菌捕获通道和出样口。

本申请提供的另一种实施方式为：所述微流控芯片为基于聚二甲基硅氧烷的微流控芯片。

本申请还提供一种快速检测方法，采用所述的快速检测系统进行检测。

本申请提供的另一种实施方式为：所述方法包括如下步骤：

1)制备芯片；

2)对细菌进行培养捕获；

3)运行多位点延时显微成像检测过程；

4)采集细菌图像；

5)计算包含细菌形态学信息的数据结构；

6)定量分析细菌对药物耐受情况；

7)重复步骤4～6直至全部位点及足够的时间帧采集完毕。

3.有益效果

与现有技术相比，本申请提供的一种快速检测系统及方法的有益效果在于：

本申请提供的快速检测系统，涉及细菌耐药性检测技术领域，具体涉及结合微流控和显微成像技术。

本申请提供的快速检测系统，通过将细菌培养捕获子系统、成像子系统、图像处理子系统、数据分析子系统和终端结合，实现对细菌耐药性的快速检测功能，检测分析时间小于2小时。

本申请提供的快速检测系统，为一种用于细菌耐药性检测的微流控显微成像快速检测系统。

本申请提供的快速检测系统，基于微流控芯片和高分辨率显微成像技术，结合自动化的图像处理算法和数据分析算法，实现对细菌耐药性的快速检测功能，检测分析时间小于2小时。

本申请提供的快速检测系统，能够实现在2小时内对多种临床致病细菌的耐药性进行快速检测的功能。

本申请提供的快速检测系统，采用微流控芯片作为细菌的恒温培养装置实现高通量的细菌捕获，在自动化的显微成像系统上进行多位点延时显微成像检测过程，实时地对采集的细菌图像在单细菌水平上进行图像处理及数据分析。

本申请提供的快速检测方法，根据菌株的表型变化探索其耐药种类和耐药程度，为临床应用提供指导。

附图说明

图1是本申请的快速检测系统示意图；

图2是本申请的芯片结构示意图；

图3是本申请的快速检测方法示意图；

图4是本申请的微流控芯片局部放大示意图；

图5是本申请的图像处理子系统处理过程数据图；

图6是本申请的细菌生长速率在不同抗生素浓度环境下生长速率的变化示意图；

图7是本申请的鲍曼不动杆菌生长情况和耐药性示意图；

图8是本申请的传统方法下鲍曼不动杆菌在不同浓度氨苄青霉素溶液中的生长曲线图；

图中：1-图像处理子系统，2-数据分析子系统，3-终端，4-芯片，5-压力调节组件，6-温度调节组件，7-显微平台，8-物镜，9-电动平移台，10-自动对焦单元，11-成像相机，12-进样口，13-主通道，14-细菌捕获通道，15-出样口。

具体实施方式

在下文中，将参考附图对本申请的具体实施例进行详细地描述，依照这些详细的描述，所属领域技术人员能够清楚地理解本申请，并能够实施本申请。在不违背本申请原理的情况下，各个不同的实施例中的特征可以进行组合以获得新的实施方式，或者替代某些实施例中的某些特征，获得其它优选的实施方式。

近年来，微流控显微成像技术快速发展，在细菌耐药性的检测上具有光明的应用前景。

现有技术中基于常规药敏实验的分析手段普遍操作复杂，检测周期较长，需要1-3天才能获得分析结果。而基于耐药基因分析方法目前尚不能检测新的耐药机制，且不能确定含有耐药基因的菌株是否处于耐药状态。综合而言，现有的检测方法和仪器存在检测耗时较长、无法检测未知病原菌等问题，无法满足临床应用的及时性需求。

参见图1～8，本申请提供一种快速检测系统，所述系统包括细菌培养捕获子系统、成像子系统、图像处理子系统1、数据分析子系统2和终端3，所述终端3与所述细菌培养捕获子系统连接，所述终端3与所述成像子系统连接，所述终端3与所述图像处理子系统1连接，所述终端3与所述数据分析子系统2连接，所述图像处理子系统1与所述数据分析子系统2连接。

进一步地，所述细菌培养捕获子系统包括芯片4、压力调节组件5和温度调节组件6，所述压力调节组件5与所述芯片4连接，所述温度调节组件6与所述芯片4连接，所述压力调节组件5与所述终端3连接，所述芯片4与所述终端3连接，所述芯片4设置于所述温度调节组件6内。

本申请中的终端为计算机或者其他可以满足控制的装置。

进一步地，所述芯片4为微流控芯片，所述压力调节组件5为压力泵或者程控注射器，所述温度调节组件6为恒温箱。

进一步地，所述芯片为微流控芯片，所述微流控芯片包括若干微流通道，所述微流通道包括连通的进样口、主通道、细菌捕获通道和出样口。

微流控芯片的结构包含多条微流通道，每条微流通道由连通的进样口12、主通道13、细菌捕获通道14和出样口15组成。其中细菌捕获通道14位列主通道13两侧，形成并排排列的半封闭的通道，细菌捕获通道14的宽度和高度尺寸刚好可以捕获单个细菌，使其在通道内持续的生长。用于维持细菌生长的培养基在主通道13持续通流的情况下，会进入两侧的细菌捕获通道14为细菌提供生长培养环境。细菌在生长过程中分裂的子代细胞会自然地从细菌捕获通道14进入主通道13，随即被流动的培养基冲走。微流控芯片结构示意图如图2所示。

微流控芯片的进样口通过微流管道连接培养基和压力泵，压力泵控制通入微流控芯片内的液体流速，可由计算机程序控制，为培养基液体提供恒定压力从而控制其流速，使其持续的通入所述微流控芯片的进样口。微流控芯片的出样口通过微流管道与收集瓶相连，用于收集流出的培养基废液。微流控芯片置于恒温箱内，恒温箱为芯片提供恒定的培养温度。恒温箱可以固定于显微平台载物台上，进行细菌培养和显微观察。

微流控芯片的结构不限于本申请提及的特定结构和尺寸，可以是具备捕获细菌和培养细菌的其他芯片结构设计；压力泵可以为其他可提供压力驱动培养基持续通流的装置，如程控注射器等。

进一步地，所述微流控芯片为基于聚二甲基硅氧烷的微流控芯片。

进一步地，所述成像子系统包括显微平台7、物镜8、电动平移台9、自动对焦单元10和成像相机11；所述电动平移台9设置于所述显微平台7上，所述物镜8设置于显微平台7内，所述温度调节组件6设置于所述电动平移台9上，所述电动平移台9与所述终端3连接，所述电动平移台9与所述自动对焦单元10连接，所述自动对焦单元10与所述终端3连接，所述显微平台7与所述成像相机11连接，所述成像相机11与所述终端3连接。

成像子系统中的电动平移台9、自动对焦单元10和成像相机11均与计算机相连，用于细菌的实时图像检测，实现多位点延时显微成像功能。

细菌培养捕获子系统的恒温箱置于显微平台载物台上；成像子系统的显微平台7配置高数值孔径物镜8，收集细菌的高分辨率图像信号，并成像于成像相机11的感光片上形成图像数据；显微平台载物台为电动平移台9，提供平面移动功能，用于拍摄多位点图像的平面移动操作；自动对焦单元10，用于补偿在多位点延时显微成像过程中存在的显微成像系统焦点漂移情况，提供对焦校正功能，保证成像聚焦清晰。

成像子系统中的显微平台，可以是其他具备显微成像能力的平台或设备(如显微镜)；显微成像技术包含并不限于以下多种成像方式：明场图像、相差图像和荧光图像等；显微成像系统中的高数值孔径物镜不限于100X，只要能清晰成像，具备足够分辨率看清细菌即可满足本申请需求。

进一步地，所述图像处理子系统1包括通道识别算法模块和细菌识别算法模块，所述通道识别算法模块，用于对采集的图像进行细菌捕获通道的定位和识别；所述细菌识别算法模块，用于对从通道识别算法提取出的细菌捕获通道中的细菌进行形态学识别，得到定量的细菌形态参数，例如长度、宽度和面积等。

所述图像处理子系统1用于实时地从图像中识别细菌并计算得到含有细菌形态学信息的数据结构。对所述显微成像系统得到的细菌图像数据应用图像处理算法，识别得到细菌的表型信息(如长度、宽度、面积等)。该算法系统包括两个顺序执行的算法模块：通道识别算法模块和细菌识别算法模块。

图像处理子系统1对每帧图像数据进行图像处理运算，得到的细菌形态学信息存储为清晰的数据结构，以便数据分析算法系统进一步运算处理。

图像处理子系统1不限于所述算法模块，其他可完成相应细菌识别的算法系统应当均视为本申请所提及范围；

进一步地，所述数据分析子系统2包括两个顺序执行的算法模块：细菌追踪算法模块和表型统计算法模块，所述细菌追踪算法模块，对延时显微成像过程中采集的每个位点每帧图像，由所述图像处理算法系统得到的包含细菌形态学信息的数据结构进行分析，追踪每个细菌捕获通道中细菌的形态变化，得到细菌随时间演变的形态变化矩阵数据。

所述表型统计算法模块对细菌追踪算法得到的形态变化矩阵数据分析，计算得到细菌表型指标，如长度生长速率的变化、细菌分裂长度的分布等。表型统计算法对数据进行统计学分析，得出在不同药物环境下(不同种类抗生素药物，不同浓度抗生素等)细菌表型指标的值。从细菌表型指标值的实时变化可以反映出细菌对药物的耐受情况。

数据分析子系统2不限于所述算法模块，其他可完成相应细菌识别的算法系统应当均视为本申请所提及范围。

本申请还提供一种快速检测方法，采用所述的快速检测系统进行检测。

进一步地，所述方法包括如下步骤：

1)制备芯片。

2)对细菌进行培养捕获。

3)运行多位点延时显微成像检测过程。

4)采集细菌图像。

5)计算包含细菌形态学信息的数据结构。

6)定量分析细菌对药物耐受情况。

7)重复步骤4～6直至全部位点及足够的时间帧采集完毕。

1.制备芯片。

具体地，利用光刻制备基于硅片衬底的微流控芯片模板，模板结构包含多条微流通道，每条微流通道由连通的进样口12、主通道13、细菌捕获通道14和出样口15组成。使用该模板制备基于聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)的微流控芯片，其具备可连接微流管道的进样口12和出样口15。粘接结合微流控芯片与载玻片，使其可以置于显微观测平台上用于培养和观测细菌。

2.对细菌进行培养捕获。

具体地，准备待测细菌并将其装载入微流控芯片内。细菌进入微流控芯片的细菌捕获通道内后，将盛有液体培养基的溶液瓶通过微流管道接入芯片进样口12，芯片出样口12通过微流管道连接收集瓶。培养基溶液瓶通过微流管道与压力泵连接，调整压力泵输出合适压力值，使灌流培养基以恒定适中的速度持续地从进样口12通入微流控芯片的主通道13；将灌菌和培养基的微流控芯片置于恒温箱中，即细菌培养捕获子系统，固定于成像子系统的显微平台载物台上，进行恒温培养。

3.运行多位点延时显微成像检测过程，包括以下步骤：

调校成像子系统使成像视野亮度均匀且对比度良好；设定多个拍摄位点并调焦清晰，记录拍摄位点空间坐标数值；设置延时成像过程参数，包括曝光时间、延时间隔、总拍摄时长等参数；开始运行显微成像检测过程。

4.采集细菌图像。

具体地，由计算机控制成像子系统的电动平移台移动至待拍摄位点后，成像子系统利用自动对焦单元进行自动对焦校正，使位点成像清晰。待系统对焦稳定后，使用成像相机拍摄当前位点、当前时间帧的细菌图像并传输至计算机。

5.计算包含细菌形态学信息的数据结构。

具体地，实时读取当前位点当前时间帧的图像，通过图像处理算法系统中的通道识别算法模块对其进行细菌捕获通道的定位和识别；通过细菌识别算法提取出的细菌捕获通道中的细菌进行形态学识别，得到定量的细菌形态参数，例如长度、宽度和面积等。

6.定量分析细菌对药物耐受情况。

具体地，通过数据分析算法系统中的细菌追踪算法模块对步骤5中得到的数据结构进行分析，追踪每个细菌捕获通道中细菌的形态变化，得到细菌随时间演变的形态变化矩阵数据；应用表型统计算法对该形态变化矩阵数据进行统计学分析，实时计算得到细菌表型指标，如长度生长速率随时间的变化趋势、细菌分裂长度的分布等；通过对此等指标数值的变化实时地反映出细菌对药物的耐受情况。

7.重复步骤4～6，直至全部位点及足够的时间帧(2小时)采集完毕。

实施例

本申请涉及系统和方法两部分，因此对其中一些实施方式做介绍。

1.制备芯片，包括以下步骤：

a.光刻制备基于硅片衬底的微流芯片模板：模板结构包含多条微流通道，每条微流通道由连通的进样口、主通道、细菌捕获通道和出样口组成。主通道宽100微米高20微米，供培养基液体持续通流；细菌捕获通道长宽高各为25、1、1微米，位列主通道两侧形成并排排列的半封闭通道，用于捕获单细菌。微流控芯片模板的局部放大示意图如图4所示；

b.制备基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的微流控芯片：配制PDMS预聚物，浇注在硅片模板上并固化。在微流通道进样口和出样口处各封接一块空白PDMS块，并打孔形成可连接微流管道的进样口和出样口；

c.粘接结合微流控芯片与载玻片：将制备的PDMS微流控芯片置于载玻片上，利用等离子处理将PDMS微流控芯片粘接到载玻片基底上，使其可以置于显微观测平台上用于培养和观测细菌。

2.准备细菌培养捕获子系统，对细菌进行培养捕获，包括以下步骤：

a.准备待测细菌：选取待测菌株的单克隆，涂布在琼脂板上并培养出单菌落；挑选单克隆菌落至液体培养基内，37℃培养过夜后重新接种至液体培养基内；

b.微流控芯片内装载细菌：将细菌悬液装离心管内离心摇匀后抽取菌液到1ml针管中，通过微流控芯片的进样口连接的微流管道将其灌注到芯片通道内；

c.灌流培养基：细菌进入微流控芯片的细菌捕获通道内后，将盛有液体培养基的溶液瓶通过微流管道接入芯片进样口，芯片出样口通过微流管道连接收集瓶。培养基溶液瓶通过微流管道与压力泵连接，调整压力泵输出合适压力值，使灌流培养基以恒定适中的速度持续地从进样口通入微流控芯片的主通道；

d.恒温培养：将灌菌和培养基的微流控芯片置于恒温箱中，并固定于显微平台载物台上。打开恒温箱控制箱，使恒温箱保持37℃温度恒定。

3.运行多位点延时显微成像检测过程，包括以下步骤：

a.调校成像子系统：100X油浸式高数值孔径物镜加油，调节聚焦；调整照明光源高度、强度，使成像视野亮度均匀且对比度良好；

b.设定多个拍摄位点：使用电动平移台依次设置数个拍摄位点，对每个拍摄位点进行调整物镜聚焦并设定自动对焦功能，使位点成像清晰；记录拍摄位点空间坐标数值等参数；

c.设置延时成像过程参数：设置合适相机曝光时间，使图像亮度适中(通常为20-100ms)；设置延时间隔(通常60-120s)；设置总拍摄时长(通常2小时)；

d.开始运行显微成像检测过程：运行检测过程计算机程序。

4.采集细菌图像，包括以下步骤：

a.移动至拍摄位点：由计算机控制成像子系统的电动平移台按顺序移动至当前待拍摄位点，电动平移台的移动速度、加速度等参数均预先设置好合适数值；

b.自动对焦校正：待系统移动动作完毕后，成像子系统进行自动对焦校正，对当前拍摄位点脱离清晰聚焦面的漂移值进行校正，使位点成像清晰；

c.拍摄细菌图像：待系统对焦稳定后，拍摄当前位点、当前时间帧的细菌图像并传输至计算机。

5.图像处理算法实例，如图5所示具体处理过程数据图，包括以下步骤：

a.读取图像：在多位点延时显微成像检测的过程中，对每个位点采集的每帧图像，实时应用图像处理算法进行细菌识别。原始图像为仅包含细菌捕获通道区域的显微成像图像，其数据由显微成像系统中的成像相机传输至计算机，数据类型为UINT8或UINT16；

b.应用通道识别算法模块：对原始图像进行处理，具体地，识别出图像中每个细菌捕获通道并提取其区域，去掉通道间的冗余图像数据，得到仅包含所有细菌捕获通道的中间图像；

c.应用细菌识别算法模块：对仅包含所有细菌捕获通道的中间图像进行处理，具体地，去掉空白通道后对包含细菌的通道进行形态学识别，得到每个细菌捕获通道内单细菌的形态掩模，根据掩模可计算出每个细菌的长度、宽度、面积和倾斜角度等信息，形成包含细菌形态学信息的数据结构。

6.数据分析算法实例，包括以下步骤：

a.应用细菌追踪算法：对包含细菌形态学信息的数据结构进行分析。具体地，随着时间帧数据的累积，对沿时间分布的数据结构进行分析，追踪每个细菌的形态变化，得到细菌随时间演变的形态变化矩阵数据；

b.应用表型统计算法：对形态变化矩阵进行分析，具体地，对细菌长度随时间变化等细菌表型指标的曲线进行数据分析，得到其生长过程中每代分裂的数据集并计算得出细菌该子代的实时生长速率；细菌长度生长速率值随时间的变化趋势反映出细菌对药物的耐受情况。

如图6所示，选用大肠杆菌待测菌株，加入包含不同抗生素(氯霉素)浓度的培养基，得到细菌生长速率实时的变化情况。所加抗生素浓度分别为0.5ug/ml,1.5ug/ml,2.5ug/ml，实线为相应浓度数据集生长速率的平均值。可以看出，随着抗生素浓度的增加细菌的生长速率逐渐下降，该细菌菌株对该抗生素是不耐受的。

微流控显微成像检测技术能够实现高通量的细菌捕获并追踪单细菌生长，通过在不同抗菌药物培养条件下的时间延迟图像进行对比，为细菌耐药性的快速检测提供了新的方法思路。微流控是研究微米尺度通道中生化微流体的精确操控与分析的技术，可将生物和化学实验室的功能微缩到数平方厘米的芯片上，具有低成本、高通量、集成化、微型化等特点，该技术结合显微成像对微流控芯片内的单细菌进行延时成像，收集能够揭示耐药性内在机制重要的单细菌统计信息，形成全新的细菌耐药性检测技术。此外，微流控芯片对细菌单克隆样本的数目要求较低，可以进一步降低对采集样本培养的时间，大幅缩减检测时间。微流控显微成像技术对细菌表型进行持续的监测，检测时间决定于细菌的分裂周期。常见的致病菌在最适条件下的分裂周期通常为10～40分钟，如大肠杆菌、绿脓假单胞菌和金黄色葡萄球菌等。对单细菌的连续监测2小时即可覆盖至少两个分裂周期，通过分析其耐药指标的变化，在统计水平下得出细菌耐药性的定量结果。

(1)现有技术中常规药敏实验普遍操作复杂，检测周期较长，需要2-3天才能获得分析结果。本申请基于对单细菌生长状态的检测，能够实现细菌分裂数代时间内(即2小时内)对细菌的耐药性进行快速检测；

(2)现有技术中耐药基因分析方法目前尚不能检测新的耐药机制，且不能确定含有耐药基因的菌株是否处于耐药状态，无法检测未知病原菌。本申请基于细菌表型检测方式，通过快速检测耐药细菌的表型变化，得出定量的耐药指标变化量，从而可以对各种临床致病细菌的耐药性进行检测。

(3)本申请涉及的系统和方法能够实现高通量的单细菌观测，包含了单细菌尺寸变化的动力学信息，更好的揭示细菌的耐药情况；

(4)本申请涉及的系统为全自动化计算机控制，且检测结果实时可见，大幅提高检测效率；

(5)本申请涉及的快速检测方法基于统计学分析，为临床的应用指导提供充足的理论依据。

本申请已实现上述技术方案，并测定其效果。

(1)本申请实施例展示了一种典型的技术方案的实验：如图5和图6所示，使用本申请涉及的系统和方法，对一种大肠杆菌菌株进行了检测其对氯霉素抗生素耐药情况的实验。图像处理算法系统对本申请涉及的系统采集的多位点多时间帧图像数据进行分析，如图5所示可以得到准确的细菌表型的形态学信息；数据分析算法系统分析了菌株对不同抗生素浓度情况下的细菌表型指标，如图6所示，可以看出该菌株对不同浓度的抗生素有着明显不同的生长响应，从而反映出其非耐药的情况。

(2)使用本申请涉及的系统和方法，对5株从医院患者标本中分离出的耐药致病菌株进行了2小时内的实验检测。菌株包括：肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠埃希菌。同时对5株致病菌做传统的基于酶标仪和孔板的菌株培养，与本申请涉及的方法进行比较，得出有关耐药性的一致性结论。例如图7和图8所示鲍曼不动杆菌的实验验证，对菌株CL-2进行抗生素氨苄青霉素快速检测(图7)并与传统方法(图8)比较，可以看出抗生素的添加不会改变其生长分裂状态，从而证实该菌株是氨苄青霉素耐药菌，并且对比传统测定方法结论一致。从图7和图8可以看出本申请涉及的系统和方法可以在2小时内对细菌耐药性做出检测结果。

图7为鲍曼不动杆菌生长情况和耐药性示意图，其中矩形框内为培养基内添加100μg/ml氨苄青霉素，其他为未加氨苄青霉素。图8为传统方法下鲍曼不动杆菌在不同浓度氨苄青霉素溶液中的生长曲线图，其中标示了不同的氨苄青霉素浓度。

本申请实施例列举了细菌长度生长速率变化趋势作为反映细菌对药物耐受情况的指标，其他可反映细菌对药物耐受情况的指标应均视为本申请所提及范围(例如细菌面积生长速率变化趋势、细菌数量倍增变化趋势等)；

本申请涉及的快速检测方法步骤不限于所述步骤，可根据实际实施例及情况进行适当的步骤增减及顺序调整，以能够完成多位点延时显微成像检测过程为目的；

本申请涉及的快速检测系统和方法可以实时地对细菌耐药性进行检测，然而计算机计算速度的飞速发展，使对采集的图像进行后续图像处理和分析也依然可以耗费较短时间，从而实现对细菌耐药性的快速检测。因此本申请涉及的快速检测方法不限于检测过程中的实时计算。

尽管在上文中参考特定的实施例对本申请进行了描述，但是所属领域技术人员应当理解，在本申请公开的原理和范围内，可以针对本申请公开的配置和细节做出许多修改。本申请的保护范围由所附的权利要求来确定，并且权利要求意在涵盖权利要求中技术特征的等同物文字意义或范围所包含的全部修改。

Claims (10)

1.一种快速检测系统，其特征在于：所述系统包括细菌培养捕获子系统、成像子系统、图像处理子系统、数据分析子系统和终端，所述终端与所述细菌培养捕获子系统连接，所述终端与所述成像子系统连接，所述终端与所述图像处理子系统连接，所述终端与所述数据分析子系统连接，所述图像处理子系统与所述数据分析子系统连接。

2.如权利要求1所述的快速检测系统，其特征在于：所述细菌培养捕获子系统包括芯片、压力调节组件和温度调节组件，所述压力调节组件与所述芯片连接，所述温度调节组件与所述芯片连接，所述压力调节组件与所述终端连接，所述芯片与所述终端连接，所述芯片设置于所述温度调节组件内。

3.如权利要求2所述的快速检测系统，其特征在于：所述芯片为微流控芯片，所述压力调节组件为压力泵或者程控注射器，所述温度调节组件为恒温箱。

4.如权利要求2所述的快速检测系统，其特征在于：所述微流控芯片包括若干微流通道，所述微流通道包括连通的进样口、主通道、细菌捕获通道和出样口。

5.如权利要求2所述的快速检测方法，其特征在于：所述微流控芯片为基于聚二甲基硅氧烷的微流控芯片。

6.如权利要求1所述的快速检测系统，其特征在于：所述成像子系统包括显微平台、物镜、电动平移台、自动对焦单元和成像相机；所述电动平移台设置于所述显微平台上，所述物镜设置于所述显微平台内，所述温度调节组件设置于所述电动平移台上，所述电动平移台与所述终端连接，所述电动平移台与所述自动对焦单元连接，所述自动对焦单元与所述终端连接，所述显微平台与所述成像相机连接，所述成像相机与所述终端连接。

7.如权利要求1所述的快速检测系统，其特征在于：所述图像处理子系统包括通道识别算法模块和细菌识别算法模块，

所述通道识别算法模块，用于对采集的图像进行细菌捕获通道的定位和识别；

所述细菌识别算法模块，用于对从通道识别算法提取出的细菌捕获通道中的细菌进行形态学识别，得到定量的细菌形态参数。

8.如权利要求1所述的快速检测系统，其特征在于：所述数据分析子系统包括细菌追踪算法模块和表型统计算法模块，

所述细菌追踪算法模块，用于对延时显微成像过程中采集的每个位点每帧图像，得到细菌随时间演变的形态变化矩阵数据；

所述表型统计算法模块，用于对细菌追踪算法得到的形态变化矩阵数据分析，计算得到细菌表型指标，得出在不同药物环境下细菌表型指标的值。

9.一种快速检测方法，其特征在于：采用权利要求1～8中任一项所述的快速检测系统进行检测。

10.如权利要求9所述的快速检测方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)制备芯片；

2)对细菌进行培养捕获；

3)运行多位点延时显微成像检测过程；

4)采集细菌图像；

5)计算包含细菌形态学信息的数据结构；

6)定量分析细菌对药物耐受情况；

7)重复步骤4～6直至全部位点及足够的时间帧采集完毕。

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