JP2021526813A - 多重化抗菌薬感受性試験用の抗菌カートリッジ及びプロセス - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、多重化抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）用のカートリッジ、ＡＳＴ及びＡＳＴの品質管理の両方に有用な単一のカートリッジ、及びそれに関するシステム及び方法を提供する。

Description

本出願は、参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれている、２０１８年６月８日に出願した米国仮特許出願第６２／６８２，５７１号の優先権の利益を主張するものである。

本発明は、一般に抗菌薬感受性試験に関し、より詳細には、臨床試料の高速抗菌薬感受性試験のためのデバイス及び方法に関する。

現行のブロス希釈抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）法は、所望の試験濃度で供給された抗菌化合物が事前に充填された、１３０個未満のリザーバを備えた個々のカートリッジを利用する。抗菌化合物は、溶液状態で不十分な安定性を示し得る。その結果、乾燥した抗菌化合物を含むカートリッジが研究室業務で利用されるが、それは抗菌薬の劣化なしにカートリッジを室温で輸送し貯蔵することができるからである。乾燥したカートリッジは、水性溶液で元に戻されるように設計される。交差汚染を防止するために、ＡＳＴ法は、同じ濃度の微生物を各リザーバに移すことに依拠し、したがって各カートリッジは、供試単一微生物と共に使用されるように設計される。さらに、各カートリッジは、事前に設定されたレイアウト及び範囲の濃度の抗菌化合物を備え、そのことが、様々な患者の試料に関するさらに新しい薬物濃度又はタイプを調査する範囲を制限する。

したがって、堅牢な多重アッセイ設計のための、より多様なカートリッジシステムが求められている。さらに、薬物耐性病原体に利用可能なより多くの数の抗菌薬を試験するために、患者のカートリッジ当たりのリザーバの数を増加させることが求められている。

（要旨）
一態様において、本開示は、ヒト試料由来の微生物の抗菌薬感受性試験と品質管理（ＱＣ）との両方に使用することができる、カートリッジを提供し、ＡＳＴシステムの周期的な通常の品質管理を行うコスト及び複雑さが削減される。本開示のこの態様によるカートリッジは、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２５種の異なる抗菌薬を含む第１の複数のリザーバを含むことができ、各抗菌薬は、異なるリザーバの全体にわたって複数の異なる量又は濃度で存在し、それによって希釈系列を画定する。本開示のこの態様によるカートリッジは、「ＱＣブロック」への複数のこれら希釈系列の配置構成も含むことができ、したがって各ブロックは、同じＱＣ微生物を利用し得る複数の抗菌薬を含むようになる。様々な実施形態において、カートリッジは、少なくとも９６個のリザーバ又は少なくとも３８４個のリザーバを含む。希釈系列は、ある場合には、患者の試料及び品質管理（ＱＣ）生物に関して抗菌薬の予測される最小阻止濃度（ＭＩＣ）の範囲を画定する複数の濃度を含むことができ、各希釈系列は、患者の試料及びＱＣ生物に関する抗菌薬の予測されるＭＩＣの範囲より高い又は低い少なくとも１つの濃度を、様々に含み得る。ある場合には、複数の抗菌薬希釈系列は、最小阻止濃度（ＭＩＣ）の指示されるＱＣ生物を含むのに十分な希釈の程度を含む。各希釈系列は、ａ）抗菌薬が効能を有する最低臨床ブレイクポイント、又はｂ）指示されるＱＣ微生物に関するＱＣ範囲の下端のうち低いほうの値よりも低い、少なくとも１つの濃度を含み得る。最低濃度は、２番目に低い濃度の半分の濃度であってもよい。最低濃度は、２番目に低い濃度の半分未満の濃度であってもよい。最低濃度は、２番目に低い濃度の半分の濃度よりも高くてもよい。各希釈系列は、抗菌薬が効能を有する最高臨床ブレイクポイント、及びＱＣブロックの生物に関するＱＣ範囲の上端のうち高いほうの値よりも高い少なくとも１つの濃度を含んでいてもよい。最高濃度は、２番目に高い濃度の２倍であってもよい。最高濃度は、２番目に高い濃度の２倍未満であってもよい。最高濃度は、２番目に高い濃度の２倍より大きくてもよい。

ある場合には、患者の試料に関する抗菌薬の予測されるＭＩＣの範囲は、ＱＣ生物に関する抗菌薬の予測されるＭＩＣの範囲と同一ではない。カートリッジの２つ以上のリザーバは、任意選択的に、複数のグラム陰性微生物の増殖を阻止するのに十分な量の抗菌化合物を含んでいてもよい。高濃度で存在する抗菌化合物は、カルバペネムであってもよい。カートリッジは、任意選択的に、パネルの各ＱＣブロックに少なくとも１つの十分な増殖のリザーバを含む。ある場合には、カートリッジは、第１及び第２の方向を画定する直交軸を含み；これらの場合、様々な抗菌薬に関する希釈系列が第１の方向に（例えば、垂直に）向けられたとき、カートリッジの接種は、同じ方向（即ち、第１の方向）で又は第２の方向でなされるように指定されてもよい。ある場合には、複数の希釈系列は第１の方向に向けられてもよく、各ＱＣブロックは、第２の方向にわたって互いに隣接する複数の希釈系列を含んでいてもよい。複数の抗菌薬のそれぞれに関する希釈系列は、第１の方向に向けられてもよく、微生物試料は、第１の方向に接種されてもよい。

本開示のこの態様について続けると、カートリッジは：アミカシン、アミカシン−ホスホマイシン、アモキシシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、アジスロマイシン、アジスロマイシン−アビバクタム、アズロシリン、アズトレオナム、アズトレオナム−アビバクタム、ベシフロキサシン、ビアペネム、カダゾリド、カルベニシリン、セファクロル、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェピム−タゾバクタム、セフェタメト、セフィデロコル、セフィキシム、セフメタゾール、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフォトロザン−タゾバクタム、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリン−アビバクタム、セフタジジム、セフタジジム−アビバクタム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトロザン−タゾバクタム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロシン、クロラムフェニコール、シノキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、コリスチン、ダルババンシン、ダプトマイシン、デラフロキサシン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エラバサイクリン、エルタペネム、エリスロマイシン、ファロペネム、フィダキソマイシン、フィナフロキサシン、フレロキサシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、ゲポチダシン、グレパフロキサシン、イクラプリム、イミペネム、イミペネム−レレバクタム、カナマイシン、レファムリン、レボフロキサシン、レボナジフロキサシン、リネゾリド、リノプリスチン−フロプリスチン、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メチシリン、メズロシリン、ミノサイクリン、モキサラクタム、モキシフロキサシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネチルミシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オマダサイクリン、オリタバンシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、ピペラシリン−タゾバクタム、プラゾミシン、ポリミキシンＢ、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ラズペネム、リファムピン、ソリスロマイシン、スパルフロキサシン、スルフィソキサゾール、スロペネム、テジゾリド、テイコプラニン、テレバンシン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン−クラブラン酸、チゲサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロスペクトマイシン、バンコマイシン、アキュレアシンＡ、アムホテリシンＢ、カスポフンジン、クロトリマゾール、フルコナゾール、フルシトシン、５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ニスタチン、ソルダリン、テルビナフィン、バボルバクタム−メロペネム、ボリコナゾール、及びこれらの塩又は水和物形態からなるリストから選択される１種以上の抗菌薬を含んでいてもよい。抗菌薬に対するＱＣ生物は、様々な実施形態において、スタフィロコッカス・アウレウス属種アウレウス（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｓｐ． ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ ２９２１３）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ ２９２１２）；エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ ２５９２２）；クレブシエラ・ニューモニエ属種ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｓｐ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ ７００６０３）；クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２８１４）；シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ ２７８５３）；Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ ５１２９９）；Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＢＡＡ−１７０８）；Ｓ．アウレウス（ＢＡＡ−９７７）；Ｓ．アウレウス（ＡＴＣＣ ４３３００）；ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ ４９６１９）、及びトリコセシウム・プラスモパラエ（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｐｌａｓｍｏｐａｒａｅ（ＡＴＣＣ １３３５３）を含むことができる。本発明のこの態様による例示的なカートリッジのレイアウトは、図２Ｂ及び２Ｃに提示される。

別の態様では、本開示は、少なくとも９６個又は少なくとも３８４個のリザーバと、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、又は３０種の独自の抗菌薬とを含むカートリッジであって、限定するものではないが上記にて提示された本開示の態様によるカートリッジを含むものを使用して、ＡＳＴを行う方法に関する。方法は、使用者に、システムソフトウェアにおいて臨床又はＱＣ試料試験を行うよう選択させることを含む。ある場合には、ＱＣ試料試験が選択された場合、方法は、使用者に、２種以上の異なるＱＣ生物をカートリッジと一緒にシステムに投入させること、２種以上の異なるＱＣ生物をカートリッジに接種すること、カートリッジを、２〜１８時間の期間にわたり微生物増殖を促進させる条件下でインキュベートすること、及び１つ以上のＡＳＴアッセイを行って、カートリッジ上で抗菌薬に対するＱＣ生物に関するＭＩＣを決定することを含む。ＡＳＴアッセイの１つ以上が、十分な増殖アッセイ閾値に達するまで開始されない実施形態では、十分な増殖のアッセイは、代謝プローブを含み抗菌薬を含まない１つ以上の接種されたリザーバに関する１つ以上の光学測定を含み、十分なアッセイの閾値は、所定の光学測定値と定義され、十分なアッセイの閾値は、異なる生物に関しては異なっていてもよい。代謝プローブはレサズリンを含んでいてもよく、光学測定は蛍光測定を含んでいてもよい。１つ以上のＡＳＴアッセイは、代謝アッセイ及び表面結合アッセイを含んでいてもよい。カートリッジ上の複数のリザーバは、ＭＩＣが決定される前に１〜３回、増殖に関して照合されてもよい。

別の態様では、本開示は、ＡＳＴを行う又はＡＳＴにＱＣを提供する方法に関し、このときカートリッジは少なくとも９５個又は少なくとも３８４個のリザーバ及び少なくとも８種の独自の抗菌薬を含み、それぞれは、予測される臨床ブレイクポイント範囲及び予測されるＱＣ生物ブレイクポイント範囲の両方に跨る希釈系列を定める複数の濃度で存在する。方法は、微生物を含む患者由来の試料又はカートリッジ内に存在する抗菌薬に対する少なくとも１種のＱＣ生物のいずれかを、カートリッジに接種すること、カートリッジを、２〜２４時間の期間にわたり微生物増殖を促進させる条件下でインキュベートすること、及び１つ以上のアッセイを行って、試験試料又はＱＣ生物に関して、カートリッジ上の複数の抗菌薬に関する最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定することを含む。カートリッジに患者由来の試料が接種された場合、試験試料に関するＭＩＣを決定するステップは、臨床ブレイクポイント範囲内で、抗菌薬濃度での微生物増殖を比較することを含む。カートリッジにＱＣ生物が接種された場合、ＱＣ生物に関するＭＩＣを決定するステップは、予測されるＱＣ範囲内で、抗菌薬濃度でＱＣ生物増殖を比較することを含む。ある場合には、各抗菌薬希釈系列は２回以上複製され、カートリッジには２種以上の患者由来の試料が接種される。グラム陰性微生物が接種される場合、カートリッジの少なくとも２つのリザーバには、希釈系列が受けるものとは異なる量又は濃度の微生物が接種され、濃度は、カートリッジのその他のリザーバよりも高くなってもよい。次いでカートリッジを、２〜２４時間の期間にわたり、微生物増殖を促進させる条件下でインキュベートし、１つ以上のアッセイを行って、カートリッジ上の複数の抗菌薬に関する患者由来の試料又はＱＣ生物に関するＭＩＣを決定する。ある場合には、カートリッジ上の複数のリザーバが、ＭＩＣが決定される前に１〜５回、増殖に関して照合される。ＱＣ生物が使用される場合、方法は任意選択的に、ＱＣ生物に関する抗菌薬のＭＩＣを参照範囲と比較すること、及びＭＩＣが参照範囲にない場合には、ＡＳＴシステムの使用者に、抗菌薬に関するＭＩＣが範囲外にあることを信号で伝えることを含む。

別の態様では、本開示は、上述のステップを含む、多重カートリッジ（例えば、少なくとも９６個又は少なくとも３８４個のリザーバと、少なくとも８種の独自の抗菌薬とを含み、それぞれは、２回以上複製された希釈系列中に存在する。）でＡＳＴを行う方法に関する。本開示の前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、リザーバの１０％以下が、ＭＩＣ決定アッセイ前に微生物増殖を評価するため照合される。

さらに別の態様では、本開示は、リザーバの複数の同一アレイに組織された複数のリザーバを含み、リザーバの各アレイが、ＡＳＴパネルを画定しかつ複数の抗菌薬を複数の濃度で含む、多重ＡＳＴ試験用のカートリッジに関する。リザーバの各アレイは、場合によっては、異なる量の抗菌薬を含みかつ抗菌薬に関する希釈系列を画定する複数のリザーバと、抗菌薬を含まない少なくとも１つのウェルとを含むことができる。あるいは又はさらに、カートリッジは、リザーバの少なくとも１つのアレイを封止する少なくとも１つの除去可能なカバー、例えば膜又はカバーを含むことができ、いくつかの実施形態は、複数の除去可能なカバーを利用し；除去可能なカバーのそれぞれは、リザーバのアレイを封止する。

別の実施形態では、本開示は、本開示によるカートリッジを含む、抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）を行うためのキットに関する。このキットは、ａ）カートリッジに患者由来の試料を接種するステップ、異なる抗菌薬濃度での細胞増殖の比較に基づいて、抗菌薬の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び抗菌薬に対する感受性の１つを評価するステップを含む、ＡＳＴ法、及び／又はｂ）カートリッジに、カートリッジ上に存在する抗菌薬に特定された少なくとも１種のＱＣ生物を接種するステップ、及び異なる抗菌薬濃度での及びＱＣ生物に関する通常範囲での細胞増殖の比較に基づいて、抗菌薬のＭＩＣがＱＣ生物に関する通常範囲内にあるか否かを評価するステップを含む、品質管理（ＱＣ）法を行うことができる。このキットは、自動化されていてもよい。このキットは、カートリッジへの患者由来の試料の接種がカートリッジ内で汚染を引き起こさないように、同じ方向に向いている希釈系列を含んでいてもよい。このキットは、カートリッジ上に存在する抗菌薬に品質管理をもたらすように使用される複数のＱＣ生物も含んでいてもよく、カートリッジ内の複数の異なるウェルには、複数のＱＣ生物が同時に接種される。

前述のリストは、本開示の態様及び実施形態を限定するのではなく例示することが意図され、当業者なら、これらの態様及び実施形態が、本開示の精神から逸脱することなく、当技術分野で現在公知の手法で修正され得ることが理解されよう。

上記及びその他の特徴は、図面と併せて解釈したときに、下記の詳細な記述から、より明らかに理解されよう。しかしながら図面は単なる例示を目的とし、限定するものではない。

ＡＳＴマスターカートリッジに関する空間要件対利用可能なＡＳＴアッセイプレートを示す図である。５０個のアッセイプレートと比較し、３つの９６ウェルプレートのマスターカートリッジはかなり少ない貯蔵空間しか必要としない。 グラム陽性及びグラム陰性菌の両方に対して作用することがわかっている抗菌薬パネル；グラム陰性菌に対することがわかっている抗菌薬パネル；及びグラム陽性菌に対して活性であることがわかっている抗菌薬パネルを含む、３プレートマスターカートリッジ上の抗菌薬のレイアウトを示す図である。各抗菌薬は、慣例の３文字の略称により示される。 グラム陽性及びグラム陰性菌の両方に対して作用することがわかっている抗菌薬パネル；グラム陰性菌に対することがわかっている抗菌薬パネル；及びグラム陽性菌に対して活性であることがわかっている抗菌薬パネルを含む、３プレートマスターカートリッジ上の抗菌薬のレイアウトを示す図である。各抗菌薬は、慣例の３文字の略称により示される。 グラム陽性及びグラム陰性菌の両方に対して作用することがわかっている抗菌薬パネル；グラム陰性菌に対することがわかっている抗菌薬パネル；及びグラム陽性菌に対して活性であることがわかっている抗菌薬パネルを含む、３プレートマスターカートリッジ上の抗菌薬のレイアウトを示す図である。各抗菌薬は、慣例の３文字の略称により示される。 グラム陽性菌用のＡＳＴシステムに関する例示的な３８４ウェルカートリッジのレイアウトを示す図である。各カートリッジは、多数の抗菌剤に関して複数の希釈系列を含み；各希釈系列は、抗菌薬用に処方された品質管理生物も含む。図中、各希釈系列ごとに、抗菌薬は、表９に提示される３文字コードにより上部ラインで参照され、品質管理生物は、中間ラインに指定される。各ウェルにおける抗菌薬の濃度は、系列の底部ラインに示される。黒く塗られた濃度値は、品質管理生物の抗菌薬のＭＩＣ範囲外にあると予測される濃度を示し、一方、より薄い値は、範囲内にあることが予測される濃度を示す。垂直ブロックに集められた抗生剤希釈系列を備えた各プレートの設計は、多数の品質管理生物を１回の実験操作で投入させかつ処理させる。 グラム陰性菌用の例示的な３８４ウェルカートリッジのレイアウトを示す図である。各カートリッジは、多数の抗菌剤に関して複数の希釈系列を含み；各希釈系列は、抗菌薬用に処方された品質管理生物も含む。図中、各希釈系列ごとに、抗菌薬は、表９に提示される３文字コードにより上部ラインで参照され、品質管理生物は、中間ラインに指定される。各ウェルにおける抗菌薬の濃度は、系列の底部ラインに示される。黒く塗られた濃度値は、品質管理生物の抗菌薬のＭＩＣ範囲外にあると予測される濃度を示し、一方、より薄い値は、範囲内にあることが予測される濃度を示す。垂直ブロックに集められた抗生剤希釈系列を備えた各プレートの設計は、多数の品質管理生物を１回の実験操作で投入させかつ処理させる。 グラム陰性菌用のＡＳＴシステムに関する例示的な３８４ウェルカートリッジのレイアウトを示す図である。 グラム陽性菌用の例示的な３８４ウェルカートリッジのレイアウトを示す図である。 マスターカートリッジＡＳＴアッセイに関する接種ワークフローの概略図である。 ＡＳＴアッセイ用のマスターカートリッジから患者のカートリッジを設定するための、個々のウェルのフローチャートを示す図である。 グラム陰性菌に対する抗菌薬を含む、患者のカートリッジ３８４ウェルの最終レイアウトを示す図である。 グラム陽性菌に対する抗菌薬を含む、患者のカートリッジ３８４ウェルの、最終レイアウトを示す図である。 各抗菌薬ごとに最小阻止濃度（ＭＩＣ）値を示す、細菌増殖の結果を示す図である。上の列のグラフは、３８４ウェルプレートからのデータを含有する。下の列のグラフは、９６ウェルプレートからのデータを含有する。 ２つの異なる実験からの３８４ウェルプレートにおけるＡＳＴアッセイ中の体積損失のパーセンテージ（左パネル）と、３８４ウェルプレート上の中央対縁部のウェルからの体積損失パーセンテージ（右パネル）とを示す図である。 本開示の実施形態による、グラム陽性及びグラム陰性試験片に関する、命令及び試料の取扱いを示す図である。 患者カートリッジの広域スペクトルプレートレイアウトを示す図である。 患者カートリッジの広域スペクトルプレートレイアウトを示す図である。 グラム陽性又はグラム陰性抗菌薬の、患者カートリッジのレイアウトを示す図である。 グラム陽性又はグラム陰性抗菌薬の、患者カートリッジのレイアウトを示す図である。

［定義］
本明細書で言及される特許及び科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立する。発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願、及び本明細書に引用される参考文献は、それぞれが特にかつ個々に参照により組み込まれることが示されるかのように同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される、変数に関する数値範囲の列挙は、本発明が、その範囲内の値のいずれかに等しい変数と共に実施され得ることを伝えることが意図される。したがって、元々離散的な変数の場合、変数は、数値範囲内の、その範囲の端点を含めた任意の整数値に等しくすることができる。同様に、元々連続した変数の場合、変数は、数値範囲内の、その範囲の端点を含めた任意の実数値に等しくすることができる。例として、かつ限定するものではないが、０〜２の値を有すると記述される変数は、変数が元々離散的な場合、０、１、又は２の値をとることができ、変数が元々連続的である場合には、０．０、０．１、０．０１、０．００１、又は任意のその他の実数値≧０及び≦２の値をとることができる。

他に特に指示しない限り、本明細書で使用される「又は」という単語は、「及び／又は」の包括的な意味で使用され、「いずれか／又は」の排他的な意味ではない。

本発明をより容易に理解するために、ある特定の用語を、最初に以下に定義する。下記の用語及びその他の用語に関する追加の定義は、本明細書の全体を通して述べられる。

動物： 本明細書で使用される「動物」という用語は、任意の数の動物界を指す。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にあるヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にある非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物が哺乳類（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、及び／又はブタ）である。一部の実施形態では、動物は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類、及び／又は蠕虫類を含むが、これらに限定するものではない。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作動物、及び／又はクローンである。

抗菌薬： 本明細書で使用される抗菌薬は、微生物を死滅させ（殺菌剤）、弱毒化し（静菌剤）、又は機能を阻害する薬剤を指す。抗菌剤は、化学化合物、生物学的生成物、例えばペプチド、タンパク質、抗体、又は核酸、又は小分子とすることができる。天然に生ずる生成物であっても合成生成物であってもよい。

およそ又は約： 本明細書で使用される「およそ」又は「約」という用語は、問題となっている１つ以上の値に付加されたとき、記述される参照値に類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、他に指示されない限り又は他に文脈から明らかにされない限り（そのような数値が、可能な値の１００％を超えると考えられる場合を除く）、記述される参照値のいずれかの方向（より大きい又はより小さい）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内、又はそれよりも少ない範囲に包含される値の範囲を指す。

様々な抗菌薬に関する臨床ブレイクポイント範囲は、臨床検査標準協会（ＣＬＳＩ）の刊行物「Ｍ１００−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ」、ＦＤＡウェブサイトのｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＡｐｐｒｏｖａｌＰｒｏｃｅｓｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｕｃｍ５７５１６３．ｈｔｍ、及びＥＵＣＡＳＴウェブサイトのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ＿ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ／で提供される。この値の集合は、ＡＳＴアッセイによって決定されたＭＩＣ結果の解釈基準を決定する。影響を受け易い値まで及びこの値を含む全てのＭＩＣ値は、臨床現場の影響を受け易いと報告されることになる。影響を受け易い値よりも高いＭＩＣの場合、抗菌薬及び試験下の試験片に応じて、中間、影響を受け易い用量依存性、及び耐性の値が報告され得る。例えば、シプロフロキサシン及びエンテロバクテリアシー（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の場合、感受性ＭＩＣカットオフは１μｇ／ｍＬであり；ＭＩＣ ２μｇ／ｍＬは、中間値として報告され；４μｇ／ｍＬよりも高い全てのＭＩＣは、耐性であると報告される。

臨床的に関連のある希釈範囲： 本明細書で使用される「臨床的に関連のある希釈範囲」は、臨床ブレイクポイント範囲に、感受性値よりも低い２つの希釈と耐性値よりも高い１つの希釈を加えたものである。例えば、シプロフロキサシン及びエンテロバクテリアシーの場合、感受性ＭＩＣカットオフは１μｇ／ｍＬであり、４μｇ／ｍＬよりも高い全てのＭＩＣは耐性として報告され、したがって臨床的に関連のある希釈範囲は、０．２５μｇ／ｍＬ〜８μｇ／ｍＬに跨ると考えられる。

送達： 本明細書で使用される「送達」という用語は、局所及び全身の両方の送達を包含する。例えば、抗菌薬の送達は、抗菌薬が標的組織に送達されかつコードされたタンパク質が標的組織内で発現しかつ保持される状況（「局所分布」又は「局所送達」とも呼ばれる。）、並びに抗菌薬が標的組織に送達され、コード化されたタンパク質が患者の循環系（例えば、血清）で発現しかつ分泌され、全身に分布されかつその他の組織により取り込まれる状況（「全身分布」又は「全身送達」とも呼ばれる。）を包含する。

希釈範囲： 本明細書で使用される希釈範囲は、ブロス微量希釈ＡＳＴに関して標準的であるような所与の抗菌薬に関する系列希釈（又は「二重」希釈）の範囲を指す。例えば、シプロフロキサシンなどの代表的な抗菌薬の場合、この範囲は、希釈：１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬなどを含んでいてもよい。系列希釈は、２倍（二重希釈）以外の倍率での希釈を指してもよい。ある場合には、系列希釈は、希釈の数の範囲内で望ましい最小及び最大範囲をカバーするために、希釈係数５又は希釈係数１０によって行われてもよい。しかし、本明細書に記述される実施例の目的のため、他に指示しない限り、希釈係数は２である。

半減期： 本明細書で使用される「半減期」という用語は、核酸又はタンパク質の濃度又は活性などの量が、期間の開始時に測定されたその値の半分まで低下するのに必要とされる時間である。

改善する、増大させる、又は低減させる： 本明細書で使用される「改善する」、「増大させる」、若しくは「低減させる」という用語、又は文法上の均等物は、本明細書に記述される処置の開始前の同じ個体における測定、又は本明細書に記述される処置のない状態での対照対象（又は多数の対照対象）における測定などの、ベースライン測定に対する値を示す。「対照対象」は、処置される対象とほぼ同じ年齢である、処置される対象と同じ形の疾患に苦しむ対象である。

マスターカートリッジ、患者カートリッジ、試験カートリッジ： 本明細書で使用されるマスターカートリッジとは、娘「患者」又は「試料」カートリッジが、マスターカートリッジから抗菌化合物を娘患者カートリッジに吐出することによって調製される、親カートリッジである。一部の実施形態において、娘カートリッジは抗菌化合物の系列希釈を有し、それに対してマスターカートリッジは、濃縮された又は凍結乾燥された形の抗菌化合物を含む。本明細書で使用される、患者カートリッジ、娘カートリッジ、試験カートリッジ、試料カートリッジ、又は試料試験カートリッジは同義で使用され、マスターカートリッジとは明らかに区別されるものである。

微生物： 本明細書で使用される微生物は、細菌、ウイルス、原生動物、藻類、真菌、又はヒト若しくは動物対象で疾患を引き起こすことのできる任意の微生物因子などの生物である。微生物は、対象において不定の期間にわたり潜在的なままであってもよく、疾患を一度も引き起こさなくてもよい。

最小阻止濃度（ＭＩＣ）： 本明細書で使用される、抗菌薬のＭＩＣは、その濃度で抗菌活性が検出可能な抗菌薬の最低濃度を指す。

患者： 本明細書で使用される「患者」又は「対象」という用語は、例えば実験、診断、予防、美容、及び／又は治療目的のために、提供された組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、及び／又はヒトなどの哺乳類）が含まれる。一部の実施形態では、患者はヒトである。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。

薬学的に許容される： 本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、良識ある医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、又はその他の問題若しく難題なしに、妥当な利益／リスクの比に見合った、人間及び動物の組織に接触させて使用するのに適した物質を指す。

リザーバ： 本明細書で使用されるリザーバという用語は、試薬又は試料などの組成物を保持するための；又は貯蔵するための；又は調製するための、又はアッセイを行なうための、ハウジング空間を表すのに使用される。用語は、カートリッジ又はマルチウェルマイクロタイタープレート内の、例えば「ウェル」と同義に使用されてもよい。リザーバは、単一ウェル構造であってもよい。リザーバは、丸みの付いたウェル、又は任意の形状若しくはサイズのウェル、又は細長いチャネルを含むがこれらに限定することのない、任意の形及び形状をとってもよい。リザーバは、流体又は乾燥／凍結乾燥粉末物質を保持することを意味する。

試料： 本明細書で使用される、「試料」という用語は、生物学的試料、患者試料、又は微生物含有試料を指す。

対象： 本明細書で使用される「対象」という用語は、ヒト又は任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、又は霊長類）を指す。ヒトには、出生前及び出生後の形態が含まれる。多くの実施形態で、対象は人間である。対象は、医療提供者に疾患の診断又は処置を提示するヒトを指す、患者とすることができる。「対象」という用語は、「個体」又は「患者」と同義で本明細書では使用される。対象は、疾患又は障害に苦しむ又はその影響を受け易い可能性があるが、対象は、疾患又は障害の症状を提示してもしなくてもよい。

実質的に： 本明細書で使用される「実質的に」という用語は、問題となっている特徴又は性質の、全体的な又はほぼ全体的な範囲又は程度を示す定性的状態を指す。生物学の分野の当業者なら、生物学的及び化学的現象は、たとえ在っても稀にしか、終了に至らず及び／又は終了まで進行せず又は絶対的な結果に到達又は回避しないことが理解されよう。したがって「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕えるのに本明細書では使用される。

標的微生物： 本明細書で使用される標的微生物は、それに対して問題となっている抗菌薬が、その感染力に関する微生物のある特定の機能を破壊する殺菌剤、静菌剤、又は阻害剤として有効な、微生物である。

治療有効量： 本明細書で使用される、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、及び／又は状態の症状の発生を処置し、診断し、予防し、及び／又は遅延させるため、疾患、障害、及び／又は状態に苦しむ又はそれらの影響を受け易い対象に投与したときに、十分な量を意味する。治療有効量は、典型的には、少なくとも１単位量を含む投薬レジメンを介して投与されることが、当業者に理解されよう。

処置： 本明細書で使用される「処置する」、「処置」、又は「処置している」という用語は、特定の疾患、障害、及び／又は状態の１つ以上の症状又は特徴を、部分的に又は完全に軽減し、寛解させ、緩和し、阻害し、予防し、その発症を遅延させ、その重症度を低減させ、及び／又はその発生率を低減させるために使用される、任意の方法を指す。処置は、疾患の徴候を示さず及び／又は疾患の早期徴候のみ示す対象に、疾患に関連した病理を発症させるリスクを減少させる目的で、投与されてもよい。

定性的感受性結果（ＱＳＲ）： 本明細書で使用されるＱＳＲは、抗菌薬が微生物に対して影響を及ぼすか否か、及び微生物が抗菌薬に対して感受性があるか否かの、又はその逆の、決定を指す。例えば微生物は、抗菌薬の存在下で増殖を停止し、これは抗菌薬が微生物に対して影響を及ぼすことを示している。

［詳細な記述］
本開示は、とりわけ、単一カートリッジを使用する多重化ＡＳＴに関するシステム及び方法を提供する。一般に、多重化ＡＳＴを対象とする本開示の実施形態は、単一ＡＳＴパネルに必要なリザーバの数よりも多い（例えば、単一患者試料のＡＳＴ分析に必要なリザーバの数よりも、２倍、３倍、４倍、又はそれ以上）、いくつかのリザーバを含むカートリッジを利用する。ある場合には、カートリッジは、単一カートリッジ上で多数の患者試料に関してＡＳＴを提供するように構成され、有利にはＡＳＴの患者試料当たりのコストが削減される。あるいは又はさらに、カートリッジは、グラム陽性及びグラム陰性菌用、広域及び狭域スペクトル抗生剤などの特定のカテゴリーの抗生剤用、又は感染因子及び／又は抗生剤の特定のカテゴリーのＡＳＴ照合用のその他の特定のパネルなど、多数のＡＳＴパネルを含むように構成される。

使用中、上記提示された本開示の実施形態による多重カートリッジは、２つ、３つ、又はそれよりも多くのＡＳＴパネルを含んでいてもよく、単一患者試料が投入されて即座に処理されてもよく、又は多数の患者試料が投入されて（例えば、個別のＡＳＴパネル当たり１つの試料）、カートリッジ上の各ＡＳＴパネルに個別の患者試料が投入されるように若しくはただ１つのＡＳＴパネル若しくは２つだけのＡＳＴパネルが空になるように、処理されてもよい。処理後、カートリッジは処分されてもよく、又は未使用のＡＳＴパネルに追加の患者試料を投入するため保存されてもよい。多数回の使用を容易にするために、多重カートリッジは、各ＡＳＴパネルに属するウェルを封止する１つ以上の膜を含んでいてもよく、その結果、カートリッジの処理中の未使用のＡＳＴパネルへの流体の導入が防止される。あるいは又はさらに、多重カートリッジ上でのパネルの処理に続き、使用したウェルを洗浄し、吸引及び／又は封止して、それらの再使用及びカートリッジ内でのその他のＡＳＴパネルの汚染を防止してもよい。

本開示によるカートリッジは、ＡＳＴシステム及び方法に関して品質管理をもたらすように設計されてもよい。一例として、ＣＬＳＩは、所与の抗菌薬に関して事前に定められたＱＣ範囲の最低濃度の半分から、事前に定められたＱＣ範囲の最大濃度の二倍まで広がってもよい、一連の抗菌薬濃度全体にわたって多数の品質管理生物を使用するＡＳＴシステムの毎日の品質管理試験を推奨する。品質管理生物及びＱＣ範囲は、一般に、ＡＳＴパネル内の各抗菌薬に対して特異的であるが、同じ種類の中での抗菌薬は、類似の又は重なるＱＣ範囲を有していてもよい。

当業者なら、所与のＡＳＴパネルに関し、複数の品質管理生物及び濃度範囲の検査が必要となり得ることが理解されよう。これらの生物全体にわたるＱＣ及び濃度範囲は、所与のシステムに関して得られるＡＳＴ結果の一貫性及び精度を確実にするために規則的に（例えば、毎日又は毎週）行わなければならず、追加の試験は、所与の抗菌薬に関する品質管理生物がどこで範囲内の結果を与えないかを示し得る。当業者なら、現行のＡＳＴシステムを利用する、より小さいＡＳＴ設備の場合、品質管理試験の数は、検査される臨床試料の数に近付き又はさらに超えてもよいことが理解されよう。本開示のある特定の実施形態によるＡＳＴシステムは、数百個のウェルを備えたカートリッジを利用し、有利には、多数の品質管理生物及び／又はブレイクポイント範囲に関する品質管理を単一のカートリッジ上で行わせる。したがって、これらの実施形態によるＡＳＴシステム及び方法の利点は、品質管理試験に必要とされるコスト及び時間の削減、並びにより低いスループットでのＡＳＴの経済的実現可能性の改善である。

本開示は、多数の患者カートリッジ（即ち、娘カートリッジ）を創出するためのマスターカートリッジも提供し、患者カートリッジは、抗菌薬感受性に関する１つ以上の多重アッセイを行うのに使用されるものである。患者カートリッジは、マスターカートリッジの場合よりも、抗菌薬を有するより多くの数のリザーバを有する。患者カートリッジ又は娘カートリッジは、試験が行なわれた後は不要であり、それに対してマスターカートリッジは、複数のそのような試験セットで再使用可能であり、即ちマスターカートリッジは、複数の娘又は患者カートリッジを調製するのに使用することができる。別の態様では、本発明は、１種以上の抗菌薬を含む、１５０個よりも多いリザーバを有する患者カートリッジを提供する。本発明は、患者のニーズに併せてカスタマイズすることができる、より多くの数の抗菌薬及び／又は抗菌薬のより多くの範囲の濃度を試験する多様なシステムを提供する。

既存のＡＳＴプラットフォームの欠点
現行の自動化された表現型抗生剤感受性試験（ＡＳＴ）プラットフォームの著しい欠点は、それらのメニューでは新たに認可された抗生剤に順応できず、その結果、新薬の認可と自動化ＡＳＴメニューでの存在との間に平均で５年の遅延がもたらされることである。このことは、感染疾患（ＩＤ）の患者ケアに関して著しい問題を課すが、それは新しい抗生剤が、ジェネリック代替物よりもしばしばより有効でありかつそれほど毒性がなく、ＩＤ医師は、ＡＳＴ結果なしでは自信をもって目標とする抗生剤治療を処方できないからである。

したがって、新しい高度に有効な抗生剤は、しばしば十分に利用されず、その結果、死亡率及び病院コストの増加をもたらし、この後者は主に入院期間の増加に起因する。このことは、最も適切な抗生剤治療を可能な限り速く各患者に送達することを目標とする、抗生剤適正使用支援プログラムの目標にも有害である。さらに、この遅延は、現行の耐抗生剤エピデミックに対する多大な国際的関心である、新しい抗生剤を開発するという医薬品会社の動機付けを低下させる。

表現型ＡＳＴは、重要な実用的情報を医師に提供して、構成剤のパネルのそれぞれが細菌増殖を阻止する能力を決定することにより適正な抗生剤治療を決定させる。これは、ブロス微量希釈（ＢＭＤ）、患者試料に関する抗生剤のパネルのそれぞれに関して最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定する方法によって、最も一般的に決定される。所与の抗生剤に関して正確なＭＩＣを決定するために、濃度の範囲を試験しなければならない。したがってＡＳＴ「パネル」は、多数の抗生剤を含み、それぞれは、ある範囲の濃度で試験され、各「ウェル」は、所与の濃度で抗生剤を有している。

臨床研究市場を占有する３つの完全自動化表現型ＡＳＴプラットフォーム、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ Ｖｉｔｅｋ２（登録商標）、Ｄａｎａｈｅｒ ＭｉｃｒｏＳｃａｎ（登録商標）、及びＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｐｈｏｅｎｉｘ（登録商標）、及び１つの新しい高速ＡＳＴ新製品、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｈｅｎｏ（登録商標）がある。これらのシステムのそれぞれは、それらのパネルにおける全てのウェルの増殖を繰り返し測定することによって、例えば１５〜３０分ごとに測定することによって、表現型ＡＳＴ決定を行う。次いで結果は、正確なＭＩＣコールを行うために増殖と阻害との間の十分な描写が各抗生剤ごとに入手可能であることを、システムのアルゴリズムが決定するときに、報告される。

既存のＡＳＴプラットフォームは正確な結果をもたらすことができるが、それらの反復測定に対する信頼性は、並行して試験することができる抗生剤の数に対して著しい工学上の制約を課す。したがってこれらのプラットフォームは、２０種未満の抗生剤のメニューに限定される（Ｐｈｅｎｏ（登録商標）に関して１〜１４、生物に依存する。）。この限られた空間は、臨床研究の顧客に対して、それらのパネルに含めるために、抗生剤の非常に限られた選択肢を提供する：新しい抗生剤はしばしば、ジェネリックと比較して用量当たり１０倍超コストがかかるので、顧客はしばしば、より費用効果のある選択肢の代わりにこれの選択が強いられる。

対照的に、検査標準機関センター（ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＣＬＳＩ）ＢＭＤ参照方法、「絶対的基準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）」表現型ＡＳＴ法は、１６〜２０時間のインキュベーション後に単一の光学読取りを行う。したがってこの方法は、単なる単一の「端点」読取りの必要性により、単純化のために時間を犠牲にする。ある場合には、方法は、結果の視覚的（眼による）解釈に依拠する。現行の提供により、９６ウェルプレートを占有する限られた抗菌薬パネルが可能になる。

ＣＬＳＩ参照方法の端点アッセイパラダイムを模倣することにより、本発明の方法は、パネル当たりのウェルの数を低減させるという工学上のプレッシャーを除去することにより、１５０個よりも多くのリザーバ又はウェルを多重化することが可能になる。一部の実施形態では、本発明の方法は、多重アッセイ用に２００個よりも多くのウェルを可能にする。米国特許第９，８３４，８０８号明細書に記載されるように、アッセイは、わずか３．５時間のインキュベーション後に、正確なＡＳＴデータを提供する。バンコマイシン中間体スタフィロコッカス・アウレウス（ＶＩＳＡ）などの低速増殖株に順応するために、方法は、パネル当たり、＜５ウェルを測定して、アッセイ処理を開始するために「十分な増殖」閾値に到達するのを確実にする。特に、これは３８４又は１５３６ウェルの標準のマイクロプレートフォーマットの使用を可能にし、２００よりも多い任意の数のウェルを備えたパネルの並列処理をさらに可能にする。

さらに、この方法は、品質管理のためのコスト削減を可能にする。記述される方法は、ＱＣ専用にしなければならないパネルの数を減少させるので、使用者の負担が減少する。ここで、２、３、４、５、６、７、又は８種のＱＣ生物は、試料試験に使用されるものに関するパネル抗菌薬濃度のいかなる変更もなしに、単一パネル上で並行して実験操作に供されてもよい。ＱＣ生物のそのような多重化によって、より少ないパネルしかＱＣ専用にする必要がない。これは研究室、特に小さい研究室に有利と考えられるが、それは全ての薬物に関して、新しいＡＳＴプラットフォームが大規模にＱＣを行うというＦＤＡの要件があり、６種の異なるＱＣ株は、包括的グラム陽性ＡＳＴパネルのＱＣを行う必要があると考えられ、５種の異なるＱＣ株は、包括的グラム陰性ＡＳＴパネルのＱＣを行う必要があると考えられるからである（表１）。このように、１日当たり５〜１０試料を実験操作に供する研究室の場合、週当たり１１パネルをＱＣ専用にすることによって、コストは＞１５％上昇し得る。したがって、本明細書に記述される多重化ＱＣ法により、標準患者試料を実験操作に供するための消耗品のコストを、より低くすることができる。

伝統的な自動化ＡＳＴシステムは、臨床試料と同様にＱＣ試料を処理するよう設計され、１つのパネルが各試料に専用となる。これはＶｉｔｅｋ（登録商標）２及びＰｈｏｅｎｉｘ（商標）消耗品パネル（カード）及びＭｉｃｒｏＳｃａｎ（商標）接種器（Ｒｅｎｏｋ）の設計によって、義務付けられる。Ｖｉｔｅｋ及びＰｈｏｅｎｉｘパネルは、試料を全てのパネルリザーバに分布させるのに単一の入口を利用し、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ接種器は、単一希釈トレイから同じ試料の９６アリコートを引き出す。したがって、これらのシステム上で実験操作される各ＱＣ生物は、専用パネルを持たなければならない。

必要とされるＱＣ生物の数は、１）商用パネルの大規模なＱＣに関するＦＤＡの最近の要件、及び２）ベータ−ラクタム／ベータ−ラクタマーゼ阻害剤併用療法など、新しいＱＣ生物を必要とする新しい抗生剤の存在により、新しいシステムに関してより高くなり得ることに留意することがさらに重要である。したがって、多重ＱＣ及びこれらを処理するための方法を可能にするパネルは、現在特に重要なものである。

大規模ＱＣに関するＦＤＡ要件を満たすために、Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｐｈｅｎｏ（商標）などの新しいシステムは、臨床又はＱＣ試料の使用者の選択に応じて試験される、抗菌薬の実際の濃度を変える複合カートリッジ（パネル）を開発した。この手法の創意工夫にも係わらず、そのような「動的希釈」が可能な、結果的に得られるカートリッジのコストは、本明細書に記述されるような「静的濃度」パネルの場合よりも著しく高くなる可能性がある。本明細書に記述されるパネル及びＱＣ法は、臨床試料が処理されようと又はＱＣ（又は試験）試料が処理されようと、抗菌薬を含む各リザーバが同量の薬物を含有するように設計される。好ましい方法は、臨床及びＱＣ試料に関して同じ濃度の抗菌薬を試験することであるが、ＱＣ実験操作で例えば、溶液体積の２倍をリザーバに添加することによって臨床濃度の半分を試験することが実現可能となり得ることに、留意するべきである。

多重アッセイ
患者試料当たり多数の多重アッセイを並行して実験操作に供することにより、本発明のプラットフォームは、３つの特定の使用者要件に対処することが可能になり；第１は、最近認可された薬物を含む多数の抗生剤が、標準パネルで利用可能であり；第２は、「完全」希釈系列が利用され；第３は、ブレイクポイント領域付近で複製試験を行うことによって精度が上がることである。

一実施形態では、各患者試料を、３種よりも多く又は３種に等しい抗菌薬で並行して試験することができる。一実施形態では、各患者試料は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９種よりも多い若しくはこれらに等しい、又は３０種よりも多い又は３０種に等しい抗菌薬で、並行して試験することができる。グラム陰性生物の場合、特に、各患者試料は、３５種よりも多くの又は３５種に等しい抗生剤で並行して試験することができる。全ての種類の全ての標準的なジェネリック抗生剤を試験することに加え、これらは：アビカズ、バボマー、ゼルバクサ、テジゾリド、チゲサイクリン、ドリペネム、デラフロキサシン、オリタバンシン、テラバンシン、ダルババンシン、エラバサイクリン、セフィデロコル、オマダサイクリン、プラゾミシン、イクラプリム、レファムリン、ソリテラ、プリマキシン、ＳＰＲ−９９４、及びＭＫ−７６５５を含むがこれらに限定することのない、新たに認可された及びこれから認可される抗生剤を含んでいてもよい。

並行して実験操作に供することができる多数のウェルにより、広い希釈範囲を試験することがさらに可能になる。当業者に公知のように、ＣＬＳＩの基準は、系列（又は２倍）希釈範囲の各抗生剤を実験操作に供して、ＭＩＣを正確に決定することである。範囲は「ブレイクポイント」範囲を含み、ＭＩＣ値では、薬物が臨床上有効（「感受性、Ｓ」）又は無効（「耐性、Ｒ」）になることをＦＤＡ及びＣＬＳＩが決定する。例えば、スタフィロコッカス・アウレウスによるオキサシリンなどの薬物で、２μｇ／ｍＬ又はそれよりも低いＭＩＣは、株が感受性でありかつ薬物が使用されるべきであることを意味すると解釈され、それに対して４μｇ／ｍＬ及びそれよりも高いＭＩＣは、生物に耐性がありかつ臨床的に無効であることを意味する。これらの試験ウェル間では希釈がないので、エスケリキア・コリによるエルタペネムなどのほとんどの薬物は、中間の緩衝領域を提供するよう追加の「中間」ブレイクポイントを有し、その臨床使用は一般に、その他の薬物に対するブレイクポイントに依存する。エンテロバクテリアシー及びＰ．アエルギノサに対して有効であることが公知の、一般に使用される抗菌薬に関する例示的なブレイクポイント表を、表２に提示する。追加の情報には、下記の参考文献からアクセスできる：Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ「Ｍ１００−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ」、ＦＤＡウェブサイト ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＡｐｐｒｏｖａｌＰｒｏｃｅｓｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｕｃｍ５７５１６３．ｈｔｍ、及びＥＵＣＡＳＴウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ／ｃｌｉｎｉｃａｌ＿ｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ。

微生物の進化及び微生物のより新しい抗生剤耐性種の出現により、ＡＳＴに関する抗菌薬の標準プリセットは、各患者を感染の処置に最も良く適合させ得る抗菌薬に対処し同定するための要件を満たしていない。本発明は、部分的には、臨床希釈範囲を超える抗菌薬の範囲が有利であることを証明できるという、意外な発見に基づく。これは臨床希釈範囲を超えた希釈を含むように、試験がなされる抗菌薬希釈範囲を増大させる必要がある。別の実施形態では、本発明は、ある特定の抗菌薬又はある特定の抗菌薬濃度に応答する低速増殖微生物を評価する必要性に対処し、したがってＡＳＴの認められた良い結果は適正に検証され、抗菌薬の最終的な臨床有効性に対する追加の洞察を提供することができるようになる。本明細書で開示される多重化プラットフォームにより提供された多様性は、より多くの数の抗菌薬だけでなくより広い範囲の抗菌薬希釈も試験する利点をもたらす。多重化プラットフォームは、患者の要件、疾患症状及び任意のその他の関連ある因子による特定の試験の設定を、カスタマイズする能力を提供する。

抗菌薬感受性の試験をし報告するための、抗菌薬を選択するための指針は、ＦＤＡリソース、例えばＣＬＳＩ Ｍ１００指針、ＦＤＡウェブサイトｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／Ｄｒｕｇｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＡｐｐｒｏｖａｌＰｒｏｃｅｓｓ／ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＲｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｕｃｍ５７５１６３．ｈｔｍから得ることができる。同様に、試験条件の推奨、通常の品質管理の推奨、追加の薬剤の示唆であって、通常の試験及び報告に関して考慮されるべきものも、上記引用したＣＳＬＩ指針から得ることができる。

拡張された数のウェルは、各希釈濃度を二重に、三重に、若しくはそれよりも多くの複製回数で試験することができ、又は中間希釈濃度（３μｇ／ｍＬなど）を試験することができ、及び／又は抗生剤当たりの希釈範囲を拡張することができる。これらは、より高い精度及び／又は情報を感受性及び／又は耐性にもたらし得る。

＞２００個のリザーバ又はウェルを備えた患者カートリッジの追加の利点は、合併症のない尿管感染症など「単純」であることが当業者に公知の場合、多数の患者試料を単一プレート上で処理できることである。これらの場合には、より小さい数の抗生剤による並行試験しか必要とせず；したがって、コスト及び時間を節約するために、単一カートリッジ当たり多数の試料を実験操作に供することが有益となり得る。

一部の実施形態では、＞２００個のリザーバを備えた患者カートリッジを使用して、同じ患者から収集された多数の試料、例えば血液、ＣＳＦ、血清、肺洗浄液、唾液、又は尿などの体液試料に適応させる。一般に、いくつかの試料は、無菌条件下で収集され、そのような試料を無菌試料と呼ぶ。いくつかの試料の場合、無菌状態を維持することは可能ではなく、そのような試料を非無菌と呼ぶ。２００個よりも多いリザーバの患者カートリッジは、同じカートリッジで無菌及び非無菌の両方の試料の試験を可能にし、隣接するリザーバ内にある２種の試料からの交差汚染を回避する可能性が得られる。

マスターカートリッジ
自動化表現型ＡＳＴにおける現行の標準は、必要な量に存在する全ての希釈に関する全ての必要な抗生剤と共に、（試験供給側から）研究室に送られるカートリッジ上で各患者試料を試験することである。これは正確な抗生剤測定に関する責任を、製造業者の工場現場にのみ負わせている。抗生剤はしばしば乾燥され、それらを安定化させ、したがって抗生剤は、室温で又は冷蔵下で貯蔵されてもよく、主にそのコストにより冷凍（−２０℃）又は凍結冷凍（−８０℃）での貯蔵よりも著しく有利である。しかし乾燥プロセスは、抗生剤の性能に有害な影響を与える可能性があり、生成物を損ないかつリコールをもたらす可能性があることが、当業者に周知である。

本明細書に開示される、マスターカートリッジはしばしば、多数のリザーバを含む単一「マスター」プレートであり、リザーバは、多数の患者試料に関してかつ抗菌薬濃度の範囲全体にわたり、抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）の設定を行うのに十分な量の抗菌薬を含む。一部の実施形態では、単一マスターカートリッジは、２５種よりも多くの独立した患者試料の試験を可能にする。同じマスターカートリッジは、複数の患者試料に関する複数の抗菌薬感受性試験薬を調製するのに、かつ結果の信頼性を得るために同じことを多数回繰り返すのに、十分な量又は濃度にある複数の抗菌薬に適応できる。これは必要とされる貯蔵空間を大いに削減し、抗生剤を冷凍又は凍結冷凍フォーマットで研究室の顧客に提供することが可能になり、そのことが改善されたバッチをもたらして一貫性を捕えることが可能になる。あるいは、抗生剤は、乾燥されても凍結乾燥されてもよく、かつ室温で又は冷蔵下で貯蔵されてもよい。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、個々の抗菌薬及び抗菌薬の組合せの両方を含む。マスターカートリッジ内の１つ以上のリザーバは、複数の抗菌化合物の組合せを収容することができる。

このようにマスターカートリッジは複数のリザーバを含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、３８４個又はそれよりも多くのリザーバを含む。これは９６リザーバカートリッジでは実現することのできない、最近認可されたものを含めた十分な数の抗菌薬の導入を可能にする。さらに、各患者プレートにおける抗菌薬パネルのカスタム化もさらに可能になる。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、いかなる損傷もなく又は抗菌化合物の活性の損失もなく、多数回の凍結融解サイクルを受けることができるように設計される。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、−８０℃よりも低い極端な温度に耐えることが可能であり、広範な温度にわたって亀裂又は撓みなどの構造的損傷を受けることなしに維持することができる。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、１つ以上の包封体又は封止材を含む。外側封止材又は包封体は、使用前にカートリッジを汚染から隔離するよう働くものが存在してもよい。これはカートリッジの輸送及び貯蔵に有用である。一部の実施形態では、リザーバは、別の包封体によって封止される。一部の実施形態では、各リザーバが個々に封止される。一部の実施形態では、各リザーバが気密カバーによって封止される。さらに、各リザーバ封止材は、個々に動作可能であってもよい。一部の実施形態では、包封体が、封止されるパウチである。一部の実施形態では、封止されたパウチはマスターカートリッジを含む。固体形態の抗菌薬を含むマスターカートリッジは、パウチ内に乾燥剤が存在する状態で封止されて、脱水状態に保つ。したがって、マスターカートリッジ及び乾燥剤を含むパウチを使用して、固体状態の抗菌薬を含むマスターカートリッジを封止する。さらに、溶媒和形態で抗菌薬を含むマスターカートリッジは、接着封止材で封止することができ、及び／又はパウチに入れて貯蔵若しくは輸送することができる。

一部の実施形態では、マスターカートリッジが透明である。一部の実施形態では、マスターカートリッジが光保護される。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、光をリザーバのベース部に透過させる。

一部の実施形態では、マスターカートリッジがマトリックス管を含む。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、５０〜１００、１００〜２５０、２５０〜５００、６００〜７５０、又は７５０〜１，０００の患者カートリッジ又はマイクロタイタープレートを調製するのに十分な抗菌薬を提供する。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも１０倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも２０倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも２００倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも５００倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも１，０００倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を少なくとも１０，０００倍多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、患者カートリッジでの最も高い所望の試験濃度に必要な各抗菌薬を１０^６倍程度多い量で含む。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の抗菌薬は、凍結乾燥した又はその他の手法で乾燥した固体形態をとる。そのような実施形態では、固体形態を、各抗菌薬用の高濃度のストック溶液に可溶化又は溶媒和して、溶液の画分を患者カートリッジ又は補助リザーバ若しくは希釈リザーバに分注することが必要である。いくつかの系列希釈は、患者カートリッジ用のマスターカートリッジから発生させることができる。

一部の実施形態では、抗菌薬は、マスターカートリッジ内で溶液状態にある。液体の全体積は、可能な限り低く保たれ、抗菌薬の濃度は高く保たれる。一部の実施形態では、抗菌薬を含有するリザーバ当たりの体積が１ｍｌである。一部の実施形態では、抗菌薬を含有するリザーバ当たりの体積が０．５ｍｌである。一部の実施形態では、抗菌化合物を含有するリザーバ当たりの体積が０．１ｍｌである。

一部の実施形態では、抗菌薬は、水性溶媒中に、マスターカートリッジ内で溶媒和する。一部の実施形態では、抗菌薬は、有機溶媒中に、マスターカートリッジ内で溶媒和する。有機溶媒の例には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、エタノール、メタノール、アセトン、及びＮ−メチル−２−ピロリドンが含まれるが、これらに限定するものではない。一部の実施形態では、緩衝水性溶媒、例えばリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）が使用される。

一部の実施形態では、抗菌薬は、最初に、８よりも大きいｐＨを有する溶媒又は溶液に溶媒和される。一部の実施形態では、いくつかの抗菌薬は、８．１よりも大きい、又は８．２、又は８．３、又は８．４、又は８．５、又は８．６、又は８．７、又は８．８、又は８．９、又はｐＨ９．０よりも大きいｐＨを有する溶媒を使用して溶媒和される。一部の実施形態では、抗菌薬は、最初に、７未満のｐＨを有する溶媒又は溶液中で溶媒和される。一部の実施形態では、いくつかの抗菌薬が、７未満のｐＨ、又は６未満又は５未満又は４未満又は３未満のｐＨを有する溶媒を使用して、溶媒和される。一部の実施形態では、抗菌薬は、最初に有機溶媒中に溶媒和される。一部の実施形態では、抗菌薬は、最初に第１の体積の適切な溶媒を使用して溶媒和され、残りの体積は、所望の濃度を実現するために水性溶媒で又は水で構成される。

この手法は、マスターカートリッジ又はプレートから「患者」又は「娘」カートリッジ又はプレートに抗生剤を分注するのに、液体取扱い器を必要とする。したがって抗生剤は、患者カートリッジ又はプレートで必要とされる多数の濃度である濃度で、マスタープレート内に存在していてもよい。例えば、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び０．５μｇ／ｍＬの娘希釈系列の場合、マスタープレートは、３２０μｇ／ｍＬ、１６０μｇ／ｍＬ、８０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬの濃度を含んでいてもよく、したがって各ウェルは、マスターから娘患者カートリッジへの移送において、濃度が２０倍希釈されるようになる。

マスタープレートは、より少ない希釈しか必要とせず、ウェルが節約されるように、設計されてもよい。これは３８４又は１５３６ウェル娘プレートと共に使用される、９６ウェルマスタープレートを利用するのに有利とすることができ、高体積プレート充填で利点を有することができる。例えば、１６μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、及び０．５μｇ／ｍＬの娘希釈系列では、マスタープレートは、単に３２０μｇ／ｍＬ、４０μｇ／ｍＬ、及び１０μｇ／ｍＬの濃度を含んでいてもよい。この場合、娘プレートには、各マスター濃度ごとに２つの異なる希釈物、２０倍及び４０倍が充填されると考えられる。

さらに、より多くの数の希釈を移送中に行ってもよい。極端な場合、各抗生剤は、単一濃度のみ含んでいてもよく、これを液体取扱い器によって適切な娘プレート希釈範囲に分注する。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、３つの９６ウェルプレートを含み、１つはグラム陰性菌用の抗菌薬のみ含み、１つはグラム陽性菌用の抗菌薬のみ含み、１つは、グラム陽性及びグラム陰性菌の両方に作用する広域スペクトル抗菌薬を含む（広域スペクトルプレート）。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、単一マスターカートリッジプレート上に配置された全ての抗菌薬を含んでいてもよい。

マスターから患者へのカートリッジの抗菌薬の移送は、液体取扱い器によって実現される。例示的なプラットフォームは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｎｅｘｕｓ及びＳｔａｒｌｉｔ及びｔｈｅ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｌｙｎｘを含む。類似のロボット式及び液体取扱い器を含むその他の在庫又はカスタムプラットフォームが利用されてもよい。これらのプラットフォームは、抗生剤、ブロス、及び患者試料を分注してもよく、したがって娘カートリッジを空の機械に「到達」させ、研究室の顧客にとって貯蔵及び取扱いの容易さが大幅に増す。液体取扱い器はさらに、抗生剤のカスタム化を可能にすることができ、したがって抗生剤のサブセットのみが特定の患者試料に関して試験されるようになる。あるいは、抗生剤の選択／抑制は、ＡＳＴ分析器のソフトウェアレベルで行ってもよい。

マスターから娘抗生剤への移送の追加の利益は、その能力を、水にやや（又は全く）溶けにくい抗生剤に適応するように近付ける。これらの薬剤の可溶化は、洗浄剤若しくはその他の液体の使用を通して、又は非水性溶媒の使用を通して、高めることができる。これらは、マスターカートリッジそのものに及び／又は娘プレートを調製する液体取扱い器に付加された試薬パックに存在し得る。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、２つ又はそれよりも多くの異なるマスターカートリッジから誘導された抗菌薬が、患者カートリッジ上に含まれるように設計することができる。

一部の実施形態では、抗菌薬は、マスターカートリッジ上で凍結乾燥される。

一部の実施形態では、抗菌薬は、乾燥粉末としてマスターカートリッジ内に存在する。

一部の実施形態では、抗菌薬は、溶液中に高濃度で存在する。

マスターカートリッジに貯蔵される抗菌薬は、標的微生物用の抗菌薬に関する最小阻止濃度（ＭＩＣ）よりも、少なくとも２０倍高い濃度にある。抗菌薬は、標的微生物用の抗菌薬に関する最小阻止濃度（ＭＩＣ）よりも少なくとも３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、１００倍又は２００倍又は５００倍高い濃度で、マスターカートリッジ内に存在する。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、１つの患者カートリッジを調製するのに必要とされる各抗菌薬の量の１０００倍程度を含む。

一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１マイクログラムよりも多く含有する。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１ミリグラムよりも多く含有する。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１０ミリグラムよりも多く含有する。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１００ミリグラムよりも多く又はそれに等しく含有する。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１グラムよりも多く又はそれに等しく含有する。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１０グラムよりも多く又はそれに等しく含有する。一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の各リザーバは、抗菌薬を１００グラム程度含有する。

一部の実施形態では、マスターカートリッジ内の抗菌薬は、複数回の凍結融解サイクルを通して安定である。マスターカートリッジ内の高濃度の抗菌薬は、１回以上の凍結融解サイクルが抗菌薬の完全性又は機能的効力に影響を及ぼすことができないようなものである。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、３８４ウェルマイクロタイタープレートを含む。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、１つ以上の封止材を含む。一部の実施形態では、外側封止材が周囲からカートリッジを隔離する。これは特に、輸送及び無菌状態の維持に有益であり得る。一部の実施形態では、マスターカートリッジは、１つ以上のリザーバをカバーする内側封止材を含む。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、インキュベーション期間を共有する複数の異なるアッセイを行うために多重ＡＳＴアッセイを設定するのに使用され、各アッセイは、１種以上の抗菌薬の存在下で微生物増殖アッセイを含み、複数の異なるアッセイは、１つ以上のリザーバ及び１種以上の抗菌化合物を含む患者カートリッジで行われ、カートリッジ内の抗菌薬は、０．１ｍＬの適切な溶媒での溶媒和が最も高い所望の試験濃度よりも＞１０倍高い抗菌濃度をもたらすように、十分な質量で存在する各抗菌化合物を含有するマスターカートリッジから患者カートリッジに移送され；相対的な微生物増殖に基づいて、１種以上の微生物の抗菌薬感受性を決定する。

マスターカートリッジは、いかなる患者試料とも接触しなくなり、したがって、異なる時間でそのような多数回のアッセイを設定するのに再使用することができる。

患者カートリッジ
ある特定の場合には、患者試料由来の微生物を含む試料を直接試験するのに適した量で、乾燥又は凍結溶媒和された抗菌薬を備えた患者カートリッジを有することが好ましいと考えられる。自動化ＡＳＴを行うための既存の方法は、患者カートリッジに含まれる抗菌薬による試験下での試料のインキュベーション期間を通して、リザーバに多数回照合する。この手法は、ＭＩＣ又は試験下での抗菌薬に関する増殖／非増殖パラメータを決定するのに利用することができる、増殖曲線を生成する。しかし、典型的な病院臨床微生物研究室のスループット要件（例えば、１０３４床を持つ病院の場合に１日当たり最大１７０のＡＳＴ）と組み合わせた反復試験の必要性は、カートリッジ当たりのリザーバの数を制限する。

自動化ＡＳＴに関する新しい手法、例えば初期の出願、米国特許第９，８３４，８０８号明細書；２０１７年９月２７日出願の係属米国出願第１５／７１７，５６９号明細書、２０１７年６月２６日出願の係属米国仮出願第６２／５２４，９７２号明細書；２０１７年４月２１日出願の公開ＰＣＴ出願ＷＯ２０１７１８５０１２号、及び２０１７年１２月２２日出願の係属ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／６８３０６号であって；その全てが参照により本明細書に組み込まれるものに記載されるものは、より少ないリザーバ照合でＡＳＴを行うことができる。特に、そのような方法は、ＭＩＣを報告するのに増殖曲線を必要としなくてもよい。この進歩により、≧１５０個のリザーバを持つ患者カートリッジは、本発明者らの上述の出願及び特許に記載されるものなどの自動化ＡＳＴプラットフォームと共に利用することが可能になる。

リザーバの数は、試験がなされる抗菌薬の数に、所望の希釈数を乗じることを考慮することにより、決定されてもよい。一部の実施形態では、１種の抗菌薬に必要な希釈数は、別のものとは異なる。例示的な患者カートリッジに関する計算を示す、表３に示されるように、必要な接種リザーバの数は、全抗菌薬に関して必要な希釈数の合計を計算することによって誘導することができ、（ａ）グラム陽性及びグラム陰性菌の両方に対して有効であることが公知の抗菌薬（「広域スペクトル」、Ｃｏｍｂｏ）（ｘ）、（ｂ）グラム陽性（ｙ）に対して有効であることが公知の抗菌薬、及び（ｃ）グラム陰性菌（ｚ）に対して有効であることが公知である抗菌薬を含む（＝ｘ＋ｙ＋ｚ）。ここで試験がなされる、５１種の異なる抗菌薬がある。少なくとも１２８個のリザーバが、広域スペクトル抗菌薬に必要とされ、少なくとも１１５個のリザーバがグラム陰性抗菌薬に対する抗菌薬用であり、少なくとも１０２個のリザーバがグラム陽性抗菌薬に対する抗菌薬用である。したがって表３の例示的な患者カートリッジは、グラム陰性菌用に少なくとも２４３個のリザーバと、グラム陽性菌用の少なくとも２３０個のリザーバを含む。代替の実施形態では、全ての希釈物は、３４５個のリザーバを含む単一プレート上で全ての細菌に関して調製され得る。

３８４ウェルカートリッジフォーマットが本明細書に記述され、再現性があり信頼性があるＭＩＣデータをもたらすことが示される。通常、９６個よりも多いウェルを有するプレートは、ウェルの容量が小さくなるので好ましくなく、特に溶液の蒸発は、小体積の液体で作用させるときのデータ結果に影響を及ぼす可能性がある。さらに、プレート上のウェルの位置に応じて溶液の不均一な損失が生ずることが観察された。周辺のウェルでは、本明細書の例示的な試験で記述される単純な試験に示されるように、ウェルの中心近くのウェルよりも高いレベルの蒸発がある。したがって、３８４ウェルプレートで行ったときにＡＳＴアッセイが首尾良くできたことは、驚くべきことでありかつ意外なことであった。対照的に、３８４ウェルプレートアッセイからのデータは、非常に信頼性があった。

抗菌薬
任意の抗菌薬を、本開示で提供されるシステムに適応させることができる。その例には、アミカシン、アミカシン−ホスホマイシン、アモキシシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、アジスロマイシン、アズロシリン、アズトレオナム、アズトレオナム−アビバクタム、ベシフロキサシン、ビアペネム、カダゾリド、カルベニシリン、セファクロル、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェピム−タゾバクタム、セフェタメト、セフィキシム、セフメタゾール、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフォトロザン−タゾバクタム、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリン−アビバクタム、セフタジジム、セフタジジム−アビバクタム、セフタジジム−アビバクタム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトロザン−タゾバクタム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロシン、クロラムフェニコール、シノキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、コリスチン、ダルババンシン、ダプトマイシン、デラフロキサシン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エラバサイクリン、エルタペネム、エリスロマイシン、ファロペネム、フィダキソマイシン、フィナフロキサシン、フレロキサシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、ゲポチダシン、グレパフロキサシン、イクラプリム、イミペネム、イミペネム−レレバクタム、カナマイシン、レファムリン、レボフロキサシン、レボナジフロキサシン、リネゾリド、リノプリスチン−フロプリスチン、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メチシリン、メズロシリン、ミノサイクリン、モキサラクタム、モキシフロキサシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネチルミシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オマダサイクリン、オリタバンシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、ピペラシリン−タゾバクタム、プラゾミシン、ポリミキシンＢ、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ラズペネム、リファムピン、ソリスロマイシン、スパルフロキサシン、スルフィソキサゾール、スロペネム、テジゾリド、テイコプラニン、テレバンシン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン−クラブラン酸、チゲサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロスペクトマイシン、バンコマイシン、アキュレアシンＡ、アムホテリシンＢ、カスポフンジン、クロトリマゾール、フルコナゾール、フルシトシン、５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ニスタチン、ソルダリン、テルビナフィン、ボリコナゾール、及びこれらの塩又は水和物が含まれるが、これらに限定するものではない。

一部の実施形態では、抗菌薬は、化学的に合成された分子である。一部の実施形態では、抗菌薬は、化学化合物である。一部の実施形態では、抗菌薬は、ペプチドなどの生体分子である。一部の実施形態では、抗菌薬は、ヌクレオチド又はアミノ酸などの生体分子である。一部の実施形態では、抗菌薬は、生物学的に分子である。一部の実施形態では、抗菌薬は抗体である。

抗菌薬は、室温で安定にすることができる。一部の実施形態では、抗菌薬は可溶化形態で、室温で安定ではない。一部の実施形態では、抗菌薬は、室温などのより高い温度で貯蔵したときに分解の影響を受け易い。いくつかの活性アッセイが、任意の貯蔵期間にわたり任意の条件下で抗菌薬の半減期を測定するのに利用可能である。アッセイのそのような方法は当業者に周知であり、本開示でカバーされていない。高い抗菌薬濃度での又は乾燥粉末としてのマスターカートリッジの創出及び貯蔵は、抗菌薬の半減期を延ばす。一部の実施形態では、抗菌薬は、マスターカートリッジに貯蔵した場合、多数回の凍結融解サイクルにわたり安定である。一部の実施形態では、抗菌薬は乾燥形態で存在しかつ適切な溶媒に溶媒和し、及び／又はさらに希釈される。溶媒和流体は、その性質が酸性又は塩基性の有機溶媒又は無機溶媒とすることができる。さらなる希釈は水中で実施される。表４は、ＡＳＴアッセイに必要な一般的な抗菌薬に適した溶媒を提供する。

アッセイの設定は、マスターカートリッジ又は中間系列希釈カートリッジから１つ以上の３８４リザーバ患者カートリッジに抗菌薬を吐出することであって、各抗菌薬が三重に約７種の系列希釈物中にあるものであること、及び有効であることが公知でありしたがって報告されるべきである各抗菌薬の動的範囲をカバーすることにより、患者（標的）カートリッジを調製することを含む。希釈範囲は、各抗菌薬ごとに予測される最小阻止濃度（ＭＩＣ）を含んでいた。しかし最も重要なのは、希釈範囲、即ち有効であることが公知である範囲を超えた抗菌薬濃度は、本発明による患者カートリッジに含まれる。

３８４ウェル患者カートリッジの残りのリザーバは、試験対照を設定するために利用され：無抗菌薬対照（陰性対照）が、各抗菌化合物ごとに含まれ；陽性対照が、各抗菌薬集合ごとに含まれ、抗菌薬に感受性のない微生物をウェルに添加した。各対照集合も、３８４ウェルカートリッジ当たり少なくとも二重に吐出された。追加の試験対照は、当業者が必要と判断した場合には含めてもよい。等量の患者試料を、無試料対照用に設計されたウェルが含まれる場合にはそのウェル以外の、カートリッジのウェルのそれぞれに吐出した。患者カートリッジは、適用された濃度範囲にある１２種の抗菌薬に対する、患者試料からの微生物の感受性を、同時に決定する用意ができた。多数のそのようなプレートは、多数の患者からの試験試料のために並行して、プレート当たり各患者試料ごとに、設定することができる。ＡＳＴアッセイは、調製された患者カートリッジ上で行われた。

一般に、ＡＳＴアッセイは、２４ウェル〜９６ウェルプレートを使用して行われる。本明細書に開示されるように、一部の実施形態では、ＡＳＴアッセイは３８４ウェルプレートで行われる。出願は、高品質ＡＳＴ結果が３８４ウェルプレートアッセイを使用して得ることができることを示す。３８４ウェルプレートの各リザーバの体積は、９６ウェルプレートよりもかなり小さいので、試薬は比例してアッセイに関して規模が小さくなり、それによってアッセイ及びデータ信頼性にかなりの不確実性を課すことになる。例えば蒸発は、溶液中の濃度、細菌増殖速度、又は化学反応に影響を及ぼす可能性がある。意外にも、本発明により使用されるアッセイ法は、３８４ウェルプレートで行われた場合、首尾良くなされるＡＳＴアッセイ及び信頼性ある結果をもたらすことが見出された。

診断又は治療の適用例
本明細書に記述されるカートリッジ及び方法は、対象からの生体試料中の微生物集団の性質を診断するのに有効とすることができる。対象は、ヒト患者とすることができる。対象は、非ヒト動物とすることもできる。生体試料は、分析のための患者から得られる。生体試料は、血液、血漿、血液成分、喀痰、尿、滲出液、鼻スワブ、膣スワブ、喉スワブ、汗、眼脂、又は組織ホモジネートからなる群から選択することができる。定性及び定量評価における１種以上の抗菌薬に対する感受性に関する情報は、本明細書に記述される生成物及び方法の結果として得られる。

本発明は、様々な疾患、障害、及び状態を処置するのに使用されてもよい。短い調査期間中の、患者における１種以上の微生物に対して有効な抗菌薬の決定、並びにＭＩＣ値を得ることは、施術者による処置の判断に良い影響を及ぼす。本発明は、そのような結果をいくつかの方法で容易にする。例えば、マスターカートリッジの利用可能性は、輸送距離の障害、重量の制限、温度及び安定性の懸念を克服することができ、したがって抗菌薬スクリーニングの努力が、微生物感染症の突発的発生の場所で可能になる。さらに、多数の「娘」カートリッジをマスターカートリッジから発生させることができ、患者試料を直接使用する又は多数の患者試料を同時に用いる、定性及び定量の両方の性質の大規模スクリーニングの能力は、患者に対する遅延なしに、有効な治療手法を開始する前に微生物を同定する必要性を、回避する。この手法は、選択される抗菌薬の有効な治療用量の決定を助ける。第３に、マスターカートリッジ手法を使用して、バッチ同士のばらつきを低減させ、診断及び治療の決定の再現性が得られる。

一部の実施形態では、マスターカートリッジは、ある特定の徴候に関する、抗菌薬分析での下流使用のために調製され、当技術分野の施術者は、ある特定の群の抗菌薬が作用することを予測することができる。所与の徴候に関して最も有効な抗菌薬を選択するための、そのような抗菌薬の密接な比較は、そのような抗菌薬が、単一のセットで選択的に存在することが必要と考えられる。したがって、マスターカートリッジに含めることができる抗菌薬を慎重に選択することにより、いくつかのプラットフォーム抗菌薬ＡＳＴアレイを、現場での必要性及び需要に応じてカスタム生成することができる。

ある特定の物品、組成物、及び方法について、ある特定に実施形態に従い特に記述してきたが、下記の実施例は、本発明の実施形態を単に例示する働きをし、本発明を限定するものではない。

［実施例１］
マスターカートリッジを使用する多数のアッセイにおける冷凍庫空間使用
この実施例は、マスターカートリッジフォーマットでＡＳＴアッセイカートリッジを輸送し貯蔵することにより減じられた冷凍庫空間の推量を示す。本発明によるマスターカートリッジは使用されるまで、試験カートリッジ（即ち、患者カートリッジ）を輸送し貯蔵する一般に普及している手順の代替例として冷凍庫で輸送され貯蔵される。マスターカートリッジは、高濃度でかつ十分な質量で抗菌薬を含む。この実施例では、マスターカートリッジは、３つの９６ウェルプレートの積層体であり、５１３ｃｍ^３の空間を必要とする。マスタープレート積層体は、１２８ｍｍ×８５ｍｍ×４７ｍｍのフットプリントを必要とする。マスタープレートは、５０枚のプレートの患者カートリッジの娘セットを作成することができ、各プレートは３８４個のリザーバ（ウェル）を有している。したがってマスターカートリッジは、５０枚の３８４使い捨てウェルプレートに等しく、８８１０ｃｍ^３の積層された計算済みフットプリントを有する（図１）。娘プレートは、アッセイの当日にマスターカートリッジから作成され、したがってアッセイが終了すると不要になる。したがってマスターカートリッジの使用は、輸送及び冷凍庫貯蔵空間を１７分の１に削減する。

［実施例２］
マスターカートリッジ上の抗菌薬のレイアウト
この実施例は、マスターカートリッジ上の抗菌薬のレイアウトを示す。この実施例では、３つの９６ウェルプレートを、図２に示されるマスターカートリッジに使用した。各マスターカートリッジは、３タイプの抗菌薬：（１）両方に対して有効な「広域スペクトル」抗菌薬であるもの（「コンボ」という用語は、このカテゴリーを示す広域スペクトルと同義で、しばしば本明細書で使用される）、（２）グラム陰性菌に対して有効であることが公知であるもの、及び（３）グラム陽性菌に対して有効であることが公知であるものを含有する。したがって図２に示されるように、広域スペクトル抗菌薬を含むプレート、グラム陰性抗菌薬を含むプレート、及びグラム陽性抗菌薬を含むプレートが、レイアウトされる。マスターカートリッジは、各抗菌薬を高濃度で含む（試験がなされる最高濃度の少なくとも５倍よりも高い）。例えば、試験するのに推奨されるアンピシリンの最高濃度は、６４μｇ／ｍｌである。マスタープレートに存在するアンピシリンの最高濃度は、４００μｇ／ｍｌである。さらにマスターカートリッジは、単一のマスターカートリッジから多数の患者カートリッジを調製するよう適合された各抗菌薬も、十分な質量で含む。

［実施例３］
患者カートリッジの調製
この実施例では、自動化ＡＳＴアッセイを行うための、マスターカートリッジから患者カートリッジへの段階的設定が、提供される。

臨床研究室での設定において、「患者カートリッジ」又は標的カートリッジを生成するためにマスターカートリッジを使用するプロセスは、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｔｅｃａｎ、Ｈｕｄｓｏｎ Ｒｏｂｏｔｉｃｓなどを含む多数の製造業者から入手可能な液体ディスペンサを使用して、自動化することができる。接種ワークフローの概略図を図３に示す。

まず、３つのマスタープレートを、冷やしたプレートホルダ（４℃に設定）上に使用者が投入する。これらは、１つの広域スペクトル、１つのグラム陽性、及び１つのグラム陰性抗生剤プレートからなる。次にバルク試薬及びピペットチップをチューブラック上に投入する。マスター及びバルク試薬ピペットチップ、及び試料希釈トレイを、１２試料ごとに再投入する。試験の全てのセットごとに、チューブに入れた最大４つの患者試料及び最大４つの３８４ウェル標的プレート（患者プレート）を投入する。

患者（標的）プレート調製。抗生剤を、広域スペクトルマスタープレートから標的プレートに移送する。抗生剤は、図１０Ａ〜Ｂにより「スタンプ」される。接種器チップは、後続の標的プレートでの使用のために、広域スペクトルチップボックスの同じ位置に戻されるべきであるが、交差汚染を回避するために同じ抗生剤でのみ使用されるべきである。

抗菌薬は、グラム陽性又はグラム陰性マスタープレートから標的プレートに移送され、抗生剤は、図１１Ａ〜Ｂに従い「スタンプ」される。接種器は、後続の標的プレートでの使用のため、正しいチップボックスの同じ位置に、チップを戻すべきである。いかなる交差汚染も防止されるように、十分に注意を払う。

次に、表５によるバルク試薬チップ、標的プレートを使用して、バルク試薬を標的プレートに移送する。

患者試料希釈物の調製。試料チップボックスからの未使用のチップを使用して、患者試料２００μＬを、試料希釈トレイの未使用のカラム内に移送する。使用されたチップは、交差汚染を回避するために即座に処分すべきである。上記ステップを、残りの患者試料に関して繰り返す。

患者試料での標的プレート接種。試料チップボックスからの新しいチップを使用して、希釈した患者試料５０μＬを、表４に従い標的プレート内に移送し、これを「噴霧吐出」により行って交差汚染を回避する。患者試料が標的プレート上の各ウェルに移送された後、交差汚染を回避するためにチップは処分されるべきである。上記ステップを、追加の患者試料及び標的プレートのそれぞれに関して繰り返す。

プロセスは、機械内で１つ以上の補助カートリッジを利用することができる。補助カートリッジ及びマスターカートリッジには微生物が接種されないことに注意を払う。各抗菌化合物の系列希釈は、試料患者カートリッジ上で行われ吐出される。

個々のウェルフローチャートの概略図を、図４に示す。

グラム陰性菌に対する抗菌薬を含む患者カートリッジ（標的プレートとも呼ばれる）の最終レイアウトを、図５に示す。グラム陽性菌に対する抗菌薬を含む患者カートリッジ（標的プレートとも呼ばれる）の最終レイアウトを、図６に示す。

最小阻止濃度（ＭＩＣ）を試験するために、吐出された各抗菌薬系列希釈の範囲は、数桁で動的範囲上のＭＩＣをカバーするのに十分である。定性的感受性試験でも、ＣＬＳＩ標準に従い十分な希釈範囲が試料患者カートリッジ上で調製される。これらの希釈は繰り返し提示されてもよく、追加の希釈が利用されてもよい。試料患者カートリッジ内の抗菌薬溶液の濃度を、「試験濃度」と呼ぶ。試験濃度は、ＣＬＳＩ Ｍ１００Ｓマニュアルにより定義されるように品質管理用の範囲内の全ての濃度又は所与の抗生剤に関するＭＩＣ解釈基準を表す。

［実施例４］
３８４ウェルプレートで行われる高速ＡＳＴは、９６ウェルプレートで行われたアッセイに類似のデータを提供する
この実施例は、高いデータ信頼性をもたらす３８４ウェルプレート上で首尾良くなされたＡＳＴアッセイについて実証する。

示される抗生剤は、バンコマイシン、ダプトマイシン、セフタロリン、及びレボフロキサシンであり、この株に関してブロス微量希釈参照法から得られるＭＩＣは、それぞれ０．５、０．２５、０．１２、及び０．２５μｇ／ｍｌである。Ｓアウレウスの臨床単離体を使用した。データは、ＲＦＵにおけるＴＲＦシグナルを表す。上列のグラフは、３８４ウェルプレートからのデータを含有する。下列のグラフは、９６ウェルプレートからのデータを含有する。

表６及び表７には、それぞれマスターカートリッジフォーマット及び３８４ウェル患者カートリッジ（３欄）を使用する抗菌薬パネル１及び２に関するＭＩＣ結果が、標準の９６ウェルＡＳＴアッセイプレート（右手欄）によって実験操作がなされたものと確実に一致することが示される。図７は、患者試料微生物での抗菌薬ＭＩＣ値を決定する、対応する増殖曲線を示す。これは、３８４ウェルプレートフォーマットを備えたマスターカートリッジが、本明細書で論じられるその他の利点に加え、信頼性ある結果を提供することを示す。

［実施例５］
３８４ウェルプレートで検出された不均一体積損失
プレートでの様々な領域での蒸発速度を試験するために、水４０μｌを、３８４ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレート質量を記録し、蓋付きのプレートを、３５℃、１５０ｒｐｍ（Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍｉｎｉ ＩｎｃｕＳｈａｋｅｒ）で一晩、約１８時間振盪しながらインキュベートした。インキュベーション後、プレートを集めて、インキュベーション中の全体積損失を決定した（図８、左パネル）。このデータは、全プレート上の液体体積の全損失を記録する。個々のウェルに残った体積を決定するために、マイクロピペットを使用した。少なくとも６個の中心又は縁部ウェルでの平均体積損失パーセントを、報告する（図８、右パネル）。このデータは、液体体積の損失が、プレート全体にわたって不均一であり、周縁のウェルは、中心のウェルよりも約６倍多く液体体積を失ったことを示す。

［実施例６］
単一カートリッジ品質管理パネル設計
本発明者らは、抗菌薬のパネルを使用する患者試料のＡＳＴ試験に関して、及びパネルの抗菌薬に特定されたＱＣ生物と共に投入されたときにはカートリッジ上のＡＳＴパネルに品質管理をもたらすために、その両方で使用することができる３８４ウェルＡＳＴカートリッジの設計を案出した。グラム陽性及びグラム陰性微生物に特異的な、例示的なカートリッジレイアウトを、それぞれ図２Ｂ及び図２Ｃに提示する。これらの図において、カセットの行及び列は、左手及び上部余白に示される。ウェルは、以下の表８で述べる３文字の抗菌薬コードによって、及び各グループごとに示されるＱＣ生物によって、一まとめにグループ分けされる。各抗菌薬の濃度は、μｇ／ｍＬを単位として、グループ内の各ウェルごとに示される。

図が示すように、本開示の実施形態による単一カートリッジは、ＡＳＴパネル内の各抗菌薬ごとに、試験及びＱＣ範囲全体にわたって様々な濃度で抗菌薬を含む複数のウェルを含む。当業者なら、患者試料用の抗菌薬のＭＩＣ範囲は、品質管理生物用抗菌薬のＭＩＣ範囲と同一でなくてもよく又はさらに重なり合っていなくてもよく、本開示によるカートリッジ内の抗菌薬に関する希釈範囲は、その他のＡＳＴカートリッジ設計で使用される範囲と必ずしも一致しなくなることが、理解されよう。

図２Ｂ及び２Ｃで具体化される実施形態によるＡＳＴパネルは、グラム陽性菌用の３６種の抗菌薬及びグラム陰性菌用の４１種の抗菌薬の、パネルを構成する。これらのプレートは、さらに、多数の品質管理生物を同時に処理できるようにするのに十分である。現行のＡＳＴパネルは、ほとんどの場合、６４、９６、又は１３２ウェルプレートで実施され、ほとんどのＡＳＴパネルは、２０種よりも少ない異なる抗菌薬を含み、本明細書に記述されるデザインは、単一の実験操作中に単一ＡＳＴカートリッジで試験することができる抗菌薬の数を拡げることに、留意されるべきである。図２Ｂ及び２Ｃで具体化されるカートリッジのデザインにおいて、同じＱＣ生物を利用する抗菌薬に関する希釈系列は、ランダムにではなく同じ軸に沿って一般に集められ、それが単一の実験操作での多数の品質管理生物の投入及び処理を容易にする。

本発明者らは、抗菌薬パネルを使用した患者試料のＡＳＴ試験のため、及びパネル内の抗菌薬に特定されたＱＣ生物と共に投入される場合にはカートリッジ上のＡＳＴパネルに品質管理をもたらすため、両方を使用することができる３８４ウェルＡＳＴカートリッジのデザインを案出した。グラム陽性及びグラム陰性微生物に特異的な例示的なカートリッジのレイアウトを、それぞれ図２Ｄ及び図２Ｅに提示する。これらの図で、カセットの行及び列は、左手及び上部余白に示される。ウェルは、表８に示される３文字の抗菌薬コードによって、及び各グループごとに示されるＱＣ生物によって、一まとめにグループ分けされる。各抗菌薬の濃度は、μｇ／ｍＬを単位として、グループ内の各ウェルごとに示される。

図２Ｄ及び２Ｅで具体化された実施形態によるＡＳＴパネルは、約２３種の抗菌薬に加えてグラム陽性菌用の５つのスクリーニング試験の、及び約３４種の抗菌薬に加えてグラム陰性菌用の１つのスクリーニング試験の、パネルを構成する。これらのパネルは、多数の品質管理生物を同時に処理できるようにするのに、さらに十分である。特に、ＱＣ用の希釈範囲は、いくつかの抗生剤用のパネルにおける完全希釈範囲のサブセットであってもよい。このデザインを実証する例示的なパネルレイアウトを、図２Ｄ及び図２Ｅに示す。これらのレイアウトでは、各パネル上のリザーバの２４個のカラムが、それぞれ８個のカラムの３つの領域に分割される。これらは、それぞれに異なるＱＣ生物がＱＣ試験用に接種され得るので「ＱＣブロック」と呼ばれるが、各プレートには、同じ生物が臨床分離体試験用に接種されることになる。各プレート（グラム陰性及びグラム陽性）は、図２Ｄ及び２ＥにおいてＱＣ−１からＱＣ３と標識された３つの異なるＱＣ実験操作を必要とする。各実験操作ＱＣ−１からＱＣ−３に関して各ブロックで実験操作に供するべきＱＣ生物を、図２Ｄ及び２Ｅで、適切な列に示す。

好ましい実施形態では、システムソフトウェアは、臨床又はＱＣ試料が試験されるか否かを使用者に選択させる。臨床試料が試験される場合、使用者にはさらに、包括的又は多重試験が行なわれるべきか否かを選択させてもよい。使用者が包括的試験を選択する場合、ユーザインターフェース（ＵＩ）は、試料の接種物チューブを彼／彼女に調製させ、これ及び適切な包括的パネルをキャリア内に投入させることになる。図３Ａのスクリーンキャプチャは、使用者が接種物試料チューブを調製しかつパネルをキャリアに投入するステップ中の、４パネルキャリアへの第２のグラム陽性パネルの能動的投入中のＵＩを示す。代わりに使用者が、包括的パネル上でＱＣを行うことをＵＩから選択した場合、システムは、図３Ｂのスクリーンキャプチャで示されるように、彼／彼女に多重キャリアを使用させ、かつ適切なＱＣ生物の接種物試料チューブを調製させる。この実施例は、図２Ｅにおいて「ＱＣ−２」と標識された実験操作を示すことに留意されたい。

一部の実施形態では、１つ以上の抗菌薬希釈物は、ＱＣに必要であるが試験下の試料に関するＭＩＣ又はスクリーニング試験結果の決定を直接裏付けるものではないものを、提示してもよい。例えば、図２Ｅでは、ＡＴＣＣ ７００６０３がＡＭＸに対する耐性を保持することを示すというＱＣに関する確証的結果を得るために、ＡＭＸが存在し、これはＡＭＣ上でＱＣを行うのにこのＱＣ生物を使用するために必要なものである。

現行のＡＳＴパネルは、ほとんどの場合、６４、９６、又は１３２ウェルプレート上で実施され、ほとんどのＡＳＴパネルは２０種よりも少ない異なる抗菌薬を含み、本明細書に記述されるデザインは、単一の実験操作中に単一ＡＳＴカートリッジ上で試験することができる抗菌薬の数を拡張することに、留意すべきである。本明細書に記述される本発明は、試料試験又はＱＣで使用されるとき、パネル濃度に差をつける必要がなく、これは低コストの消耗品の実現に重要であることにも留意すべきである。

図２Ｄ及び２Ｅに具体化されたカートリッジのデザインでは、同じＱＣ生物を利用する抗菌薬用の希釈系列が一般に、ランダムにではなく同軸に沿って集められ、そのことが、単一の実験操作における多数の品質管理生物の投入及び処理を容易にする。特に、これは接種を高速にし得る。図２Ｄ及び２Ｅでは、希釈系列は水平に向く。希釈系列は、患者由来の試料によるカートリッジの接種がカートリッジ内で汚染を引き起こさないように、同じ方向に向いている。この向きは、多数の抗菌薬を含有することができる複合ＡＳＴパネルを可能にする。現行のＡＳＴパネルを使用すると、試験をしなければならないパネルの数が原因で、全パネルに関するＱＣを提供するのに労力を要しかつ費用がかかる。本開示の方法は、はるかに少ない材料を使用しかつ少ない時間しか必要としない、ＱＣ試験を可能にする。

本開示の実施形態によるカートリッジは一般に、しかし必ずしも必要ではないが、全ての目的で参照により組み込まれるＶａｃｉｃらの米国付与前公開第２０１８／００８８１４１号明細書（「Ｖａｃｉｃ」）に記載されるＡＳＴシステムでの使用に適合される。より詳細には、段落７３〜７４は、試料中の微生物の十分な増殖に関してカートリッジの１つ以上の対照ウェルをチェックし、十分な増殖が生じたと決定されたら、異なる濃度の異なる抗菌薬の条件下で増殖微生物を評価する１つ以上のエンドポイントアッセイを実行する第１のステップを含む、ＡＳＴ法について記述する。したがって、ある特定の実施形態では、カートリッジは、抗菌薬を含まずかつ十分な増殖のアッセイに使用され得る、１つ以上のウェルを含む。通常のＡＳＴ試験操作では、カートリッジのウェルに試料が投入され、インキュベートされる；１つ以上の十分な増殖のウェルが、所定の間隔（例えば、０．５、１、２、３、４時間など）で試験され、十分な増殖が明らかにされたら、１つ以上のエンドポイントアッセイを、Ｖａｃｉｃに記載されるように行う。

ＱＣ使用のため、カートリッジの１つ以上の十分な増殖のウェルのそれぞれは、患者試料ではなく品質管理生物を受け取り、例えば少なくとも１つの十分な増殖のウェルは、例えば図２Ｂ及びＣに列挙されたような、カートリッジ上の抗菌薬のそれぞれに関して特定された品質管理生物を受け取ることができる。十分な増殖のウェルは、一組の間隔の後、例えば０．５、１、２、３、又は４時間後に評価されてもよく、ある場合には、十分な増殖がＱＣ生物に関して決定された後、そのＱＣ生物を受け取ったウェルに関してエンドポイント試験を開始し；残りの十分な増殖のウェルは、十分な増殖に関して検査され、各ＱＣ生物が有意な増殖閾値に到達したことが決定されたとき、そのＱＣ生物を含有するウェルに関するエンドポイント試験を開始する。あるいは、エンドポイントアッセイ試験は、多数のＱＣ生物が十分な増殖閾値に到達した後に初めてカートリッジで行なわれてもよく；又はＱＣ生物が、類似の増殖動態を有することが予測される場合、エンドポイント試験は、所定の増殖間隔の後に開始され、単一ＱＣ生物の増殖が確認されてもよい。

均等物
当業者なら、単なる通常の実験を使用して、本明細書に記述される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物が、理解され又は確認できるであろう。本発明の範囲は、上記記述に限定されるものではなく、むしろ下記の特許請求の範囲に記述される通りである。

Claims (44)

1. ヒト試料由来の微生物及び／又は品質管理（ＱＣ）微生物の抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）を行うためのカートリッジであって、
   （ａ）少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２５種の異なる抗菌薬を含む第１の複数のリザーバであり、複数の抗菌薬が、異なるリザーバの全体にわたって複数の異なる量又は濃度で存在し、それによって希釈系列を画定する、第１の複数のリザーバ、及び
   （ｃ）複数のこれら希釈系列の、「ＱＣブロック」への配置構成であり、各ブロックが、同じＱＣ微生物を利用し得る複数の抗菌薬を含むようになされた配置構成
   を含む、カートリッジ。
2. 少なくとも９６個又は少なくとも３８４個のリザーバを含む、請求項１に記載のカートリッジ。
3. 抗菌薬の１つ以上の希釈系列が、１つ以上のＱＣブロックに跨る、請求項１に記載のカートリッジ。
4. 複数の抗菌薬希釈系列が、指示されるＱＣ生物の最小阻止濃度（ＭＩＣ）を含むのに十分な希釈範囲を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
5. 各希釈系列が、
   ａ）抗菌薬が効能を有する最低臨床ブレイクポイント、又は
   ｂ）指示されるＱＣ微生物に関するＱＣ範囲の下端
   のうち低いほうの値よりも低い、少なくとも１つの濃度を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
6. 最低濃度が、２番目に低い濃度の半分である、請求項１〜５に記載のカートリッジ。
7. 最低濃度が、２番目に低い濃度の半分未満である、請求項５に記載のカートリッジ。
8. 最低濃度が、２番目に低い濃度の半分よりも高い、請求項５に記載のカートリッジ。
9. 各希釈系列が、抗菌薬が効能を有する最高臨床ブレイクポイント、及びＱＣブロックの生物に関するＱＣ範囲の上端のうち高いほうの値よりも高い少なくとも１つの濃度を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
10. 最高濃度が、２番目に高い濃度の２倍である、請求項９に記載のカートリッジ。
11. 最高濃度が、２番目に高い濃度の２倍未満である、請求項９に記載のカートリッジ。
12. 最高濃度が、２番目に高い濃度の２倍よりも高い、請求項９に記載のカートリッジ。
13. 患者試料に関する抗菌薬の予測されるＭＩＣの範囲が、ＱＣ生物に関する抗菌薬の予測されるＭＩＣの範囲と同一ではない、請求項１に記載のカートリッジ。
14. カートリッジの２つ以上のリザーバが、複数のグラム陰性微生物の増殖を阻止するのに十分な量の抗菌化合物を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
15. 高濃度で存在する抗菌化合物が、カルバペネムである、請求項１４に記載のカートリッジ。
16. パネルの各ＱＣブロック内に、少なくとも１つの十分な増殖のリザーバを含む、請求項１に記載のカートリッジ。
17. 第１及び第２の方向を画定する２つの直交軸を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
18. 複数の抗菌薬のそれぞれに関する希釈系列が第１の方向に向けられ、微生物試料が第２の方向でカートリッジに接種される、請求項１７に記載のカートリッジ。
19. 複数の抗菌薬のそれぞれに関する希釈系列が第１の方向に向けられ、微生物試料が第１の方向でカートリッジに接種される、請求項１７に記載のカートリッジ。
20. 複数の希釈系列が第１の方向に向けられ、各ＱＣブロックが、第２の方向にわたって互いに隣接する複数の希釈系列を含む、請求項１８に記載のカートリッジ。
21. 複数の希釈系列が第１の方向に向けられ、各ＱＣブロックが、第２の方向にわたって互いに隣接する複数の希釈系列を含む、請求項１９に記載のカートリッジ。
22. 複数の抗菌薬のそれぞれに関する希釈系列が第１の方向に向けられ、微生物試料が第１の方向で接種される、請求項１７に記載のカートリッジ。
23. 抗菌薬の１種以上が、アミカシン、アミカシン−ホスホマイシン、アモキシシリン、アモキシシリン−クラブラン酸、アンピシリン、アンピシリン−スルバクタム、アジスロマイシン、アジスロマイシン−アビバクタム、アズロシリン、アズトレオナム、アズトレオナム−アビバクタム、ベシフロキサシン、ビアペネム、カダゾリド、カルベニシリン、セファクロル、セファマンドール、セファゾリン、セフジニル、セフジトレン、セフェピム、セフェピム−タゾバクタム、セフェタメト、セフィデロコル、セフィキシム、セフメタゾール、セフォニシド、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフォテタン、セフォキシチン、セフォトロザン−タゾバクタム、セフポドキシム、セフプロジル、セフタロリン、セフタロリン−アビバクタム、セフタジジム、セフタジジム−アビバクタム、セフチブテン、セフチゾキシム、セフトビプロール、セフトロザン−タゾバクタム、セフトリアキソン、セフロキシム、セファロシン、クロラムフェニコール、シノキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリナフロキサシン、クリンダマイシン、コリスチン、ダルババンシン、ダプトマイシン、デラフロキサシン、ジリスロマイシン、ドリペネム、ドキシサイクリン、エノキサシン、エラバサイクリン、エルタペネム、エリスロマイシン、ファロペネム、フィダキソマイシン、フィナフロキサシン、フレロキサシン、ホスホマイシン、フシジン酸、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン、ゲンタマイシン、ゲポチダシン、グレパフロキサシン、イクラプリム、イミペネム、イミペネム−レレバクタム、カナマイシン、レファムリン、レボフロキサシン、レボナジフロキサシン、リネゾリド、リノプリスチン−フロプリスチン、ロメフロキサシン、ロラカルベフ、メシリナム、メロペネム、メチシリン、メズロシリン、ミノサイクリン、モキサラクタム、モキシフロキサシン、ナフシリン、ナリジクス酸、ネチルミシン、ニトロフラントイン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、オマダサイクリン、オリタバンシン、オキサシリン、ペニシリン、ピペラシリン、ピペラシリン−タゾバクタム、プラゾミシン、ポリミキシンＢ、キヌプリスチン−ダルフォプリスチン、ラズペネム、リファムピン、ソリスロマイシン、スパルフロキサシン、スルフィソキサゾール、スロペネム、テジゾリド、テイコプラニン、テレバンシン、テリスロマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チカルシリン−クラブラン酸、チゲサイクリン、トブラマイシン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、トロスペクトマイシン、バンコマイシン、アキュレアシンＡ、アムホテリシンＢ、カスポフンジン、クロトリマゾール、フルコナゾール、フルシトシン、５−フルオロシトシン、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ニスタチン、ソルダリン、テルビナフィン、バボルバクタム−メロペネム、ボリコナゾール、及びこれらの塩又は水和物形態からなるリストから選択される、請求項１に記載のカートリッジ。
24. １種以上のＱＣ生物が、スタフィロコッカス・アウレウス属種アウレウス（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｓｐ． ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ ２９２１３）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ ２９２１２）；エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ ２５９２２）；クレブシエラ・ニューモニエ属種ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｓｐ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ ７００６０３）；クレブシエラ・ニューモニエ（ＡＴＣＣ ＢＡＡ２８１４）；シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ ２７８５３）；Ｅ．フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ ５１２９９）；Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＢＡＡ−１７０８）；Ｓ．アウレウス（ＢＡＡ−９７７）；Ｓ．アウレウス（ＡＴＣＣ ４３３００）；ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＡＴＣＣ ４９６１９）、及びトリコセシウム・プラスモパラエ（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｕｍ ｐｌａｓｍｏｐａｒａｅ（ＡＴＣＣ １３３５３）から選択される、請求項１に記載のカートリッジ。
25. 図２に示される抗菌薬希釈系列及びＱＣ生物を含む、請求項１に記載のカートリッジ。
26. 臨床試料試験に関して使用されるものと同一でありかつ少なくとも９６個又は少なくとも３８４個のリザーバ及び少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、又は３０種の独自の抗菌薬を含むカートリッジで、自動化抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）に関する品質管理（ＱＣ）を行う方法であって、
    システムソフトウェアで臨床又はＱＣ試料試験を行うよう、使用者に選択させるステップ、
    ＱＣ試料試験が選択された場合、使用者に、２種以上の異なるＱＣ生物をカートリッジと一緒にシステムに投入させるステップ、
    カートリッジに、２種以上の異なるＱＣ生物を接種するステップ、
    カートリッジを、２〜１８時間の期間にわたり微生物増殖を促進させる条件下でインキュベートするステップ、
    １つ以上のＡＳＴアッセイを行って、カートリッジ上の抗菌薬に対するＱＣ生物に関するＭＩＣを決定するステップ
    を含む方法。
27. 十分な増殖のアッセイが、代謝プローブを含み抗菌薬を含まない１つ以上の接種されたリザーバに関する１つ以上の光学測定を含み、
    十分なアッセイの閾値が、所定の光学測定値と定義され、かつ
    十分なアッセイの閾値が、異なる生物に関しては異なっていてもよい
    ように、ＡＳＴアッセイの１つ以上が、十分な増殖のアッセイの閾値に到達するまで開始されない、請求項２６に記載の方法。
28. 代謝プローブがレサズリンを含み、光学測定が蛍光測定を含む、請求項２７に記載の方法。
29. １つ以上のＡＳＴアッセイが、代謝アッセイ及び表面結合アッセイを含む、請求項２６に記載の方法。
30. カートリッジ上の複数のリザーバが、ＭＩＣが決定する前に１〜３回、増殖に関して照合される、請求項２６に記載の方法。
31. 少なくとも９６個又は少なくとも３８４個のリザーバ及び少なくとも８種の独自の抗菌薬を含み、それぞれが、予測される臨床ブレイクポイント範囲及び予測されるＱＣ生物ブレイクポイント範囲の両方に跨る希釈系列を画定する複数の濃度で存在するカートリッジで、ＡＳＴを行い又はＡＳＴに関する品質管理（ＱＣ）を提供する方法であって、
    カートリッジに、微生物を含む患者由来の試料又はカートリッジ上に存在する抗菌薬に対する少なくとも１種のＱＣ生物のいずれかを接種するステップ、
    カートリッジを、２〜２４時間の期間にわたり微生物増殖を促進させる条件下でインキュベートするステップ、及び
    １つ以上のアッセイを行って、試験試料又はＱＣ生物に関して、カートリッジ上の複数の抗菌薬に関する最小阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するステップ
    を含む方法。
32. ａ）カートリッジに患者由来の試料が接種された場合、試験試料に関するＭＩＣを決定するステップは、臨床ブレイクポイント範囲内で、抗菌薬濃度での微生物増殖を比較することを含み、
    ｂ）カートリッジにＱＣ生物が接種された場合、ＱＣ生物に関するＭＩＣを決定するステップは、予測されるＱＣ範囲内で、抗菌薬濃度でのＱＣ生物増殖を比較することを含む、
    請求項３１に記載の方法。
33. 各抗菌薬希釈系列が２回以上複製され、カートリッジには、２種以上の患者由来の試料が接種される、請求項３１に記載の方法。
34. カートリッジには、グラム陰性微生物を含む患者由来の試料が接種され、カートリッジ内の少なくとも２つのリザーバには、カートリッジのその他のリザーバよりも高い濃度で接種される、請求項３１に記載の方法。
35. ＭＩＣ決定アッセイの開始前に微生物増殖を評価するため、リザーバの１０％以下が照合される、請求項３１に記載の方法。
36. ＱＣ生物に関する抗菌薬のＭＩＣを参照範囲と比較し、ＭＩＣが参照範囲内にない場合には、抗菌薬に関するＭＩＣが範囲外にあることをＡＳＴシステムの使用者に信号で伝えるステップをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
37. リザーバの複数の同一アレイに組織された複数のリザーバを含み、リザーバの各アレイがＡＳＴパネルを画定し、かつ複数の抗菌薬を複数の濃度で含む、
    多重化抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）のためのカートリッジ。
38. リザーバの各アレイが、異なる量の抗菌薬を含みかつ抗菌薬に関する希釈系列を画定する複数のリザーバ、及び抗菌薬を含まない少なくとも１つのウェルを含む、請求項３７に記載のカートリッジ。
39. リザーバの少なくとも１つのアレイを封止する、少なくとも１つの除去可能なカバーを含む、請求項３７に記載のカートリッジ。
40. 複数の除去可能なカバーを含み、除去可能な各カバーがリザーバのアレイを封止する、請求項３７に記載のカートリッジ。
41. 抗菌薬感受性試験（ＡＳＴ）を行うためのキットであって、
    請求項１に記載のカートリッジと、
    ａ）カートリッジに患者由来の試料を接種するステップ、及び
    異なる抗菌薬濃度での細胞増殖の比較に基づいて、抗菌薬の最小阻止濃度（ＭＩＣ）及び抗菌薬に対する感受性の１つを評価するステップを含む、ＡＳＴ法、及び
    ｂ）カートリッジに、カートリッジ上に存在する抗菌薬に特定された少なくとも１種のＱＣ生物を接種するステップ、及び
    異なる抗菌薬濃度での及びＱＣ生物に関する通常範囲での細胞増殖の比較に基づいて、抗菌薬のＭＩＣがＱＣ生物に関する通常範囲内にあるか否かを評価するステップを含む、品質管理（ＱＣ）法
    を行うための取扱い説明書と
    を含むキット。
42. ＡＳＴ法が自動化されている、請求項４１に記載のキット。
43. カートリッジへの患者由来の試料の接種が、カートリッジ内で汚染を引き起こさないように、希釈系列が同じ方向に向いている、請求項４１に記載のキット。
44. 複数のＱＣ生物が、カートリッジ上に存在する抗菌薬に品質管理をもたらすように使用され、カートリッジ内の複数の異なるウェルには、複数のＱＣ生物が同時に接種される、請求項４１に記載のキット。

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