JP6772195B2

JP6772195B2 - 迅速かつ高感度なバクテリア検出

Info

Publication number: JP6772195B2
Application number: JP2017565887A
Authority: JP
Inventors: 法明山本
Original assignee: コニカミノルタラボラトリーユー．エス．エー．，インコーポレイテッド
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2016-06-20
Publication date: 2020-10-21
Anticipated expiration: 2036-06-20
Also published as: EP3314261B1; JP2018530308A; US20180135094A1; EP3314261A1; EP3314261A4; US10323265B2; CN107735684A; WO2016209777A1

Description

本発明は、代謝モニタリングによるバクテリア検出（例えば、バクテリア生存率、薬剤耐性等）に関する。本発明は、特に、酸素感受性蛍光材料を用いたバクテリア検出、及びバクテリアと蛍光材料の共局在性を向上させる方法に関する。

マイクロウェルアレイ及び酸素感受性蛍光フィルムを用いた迅速バクテリア検出技術は、２０１４年健康増進及びポイント・オブ・ケア技術会議（２０１４年１０月８〜１０日、米国、ワシントン州シアトル）におけるAyyashらの「代謝モニタリングを用いた迅速かつ安価なバクテリア生存率及び薬剤耐性検出（Fast and inexpensive detection of bacterial viability and drug resistance through metabolic monitoring）」（以下、「Ayyash et al. 2014」）に記載されている。この技術においては、バクテリアを含むウェル内の酸素消費により蛍光シグナルが発生する。論文の抜粋を以下に示す。

小型化及び並列化により、バクテリア感染を迅速かつ正確に診断するための革新的な検出方法（を紹介する）。この方法は、さまざまな形（四角、丸）、径（１００〜１０００μｍ）及び深さ（１００μｍ以下）のウェルで証明される。概念実証を確立するために、モデル病原体として実験室系統の大腸菌が使用される。蛍光酸素センサーであるトリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム六水和物（ＲＴＤＰ）を組み込むことにより、バクテリア代謝の尺度として溶解酸素濃度をモニターできる。濃度が１０２〜１０８細胞／ｍｌの間で変化する場合、マイクロウェル内のバクテリアの検出時間は数時間（４〜５時間）にまで迅速化できる。適切な薬剤を培養液に加え、蛍光を用いて成長を測定することにより、薬剤耐性も調べることが可能である。ここで報告されるウェルの微細加工方法は、迅速、経済的、広用途、かつ容易である（要約）。
この方法において、標本は、目的とする特定のバクテリアに特異的な増殖培地とともにチャンバーに配置される。この液体培地は、目的とする特定のバクテリアを成長させる一方、混入した他種の成長を妨げる特異的な条件を提供する。培地には酸素の存在下で消光する蛍光体が溶解されている。バクテリアは好気性であるため、培地に存在する酸素を代謝中に消費して周辺環境の酸素を枯渇させ、蛍光を発生させる。適切な薬剤を培養液に加え、蛍光を用いて成長の有無を測定することにより、薬剤耐性を調べることが可能である。（Ｐｐ．２２−２３）
この代謝モニタリングは、大きな体積（１〜１０ｍｌ）内で実施される場合、長い時間を要する。しかし、標本が数千またはそれ以下の体積に分割された場合、目的のバクテリアを含むウェルと含まないウェルができる。この分割のプロセスにより、バクテリアの局所的濃度は数倍のオーダーで増加する。従って、小さな体積中に存在する栄養素は迅速に枯渇し、その事実は、より早く感知され得る。これが、我々の迅速なバクテリア代謝モニタリングの原理である。（Ｐ．２３）
実験のセットアップ及び手順。典型的な実験において、標本は増殖培地（ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地）及び酸素感受性蛍光体（トリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム六水和物（ＲＴＤＰ）−０．１ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液と混合され、マイクロアレイ上に分注される。スワイプする容易なプロセスによって標本は親水性マイクロウェルに分注される一方、最上面が疎水性であることにより標本は最上部から綺麗に取り除かれる（図１の工程４、５）。次に、マイクロアレイは、ガラススライド（界面活性剤を用いて親水性とされたもの）でキャップされ、蛍光顕微鏡で撮像され、蛍光強度が測定される（Ｐ．２３）。

Ayyash et al. 2014の図１の一部を、本願の図１に示す。本願の図１Ａは、Ayyash et al. 2014に記載された分割の一例の概略を示す。この分割により、バクテリアの局所的な濃度が増加し、酸素は迅速に枯渇する。

Ayyash et al. 2014に記載された検出技術によれば、バクテリアによって酸素が消費される位置と蛍光フィルムの間には距離があることから、酸素消費によって、直ちに蛍光フィルムの蛍光シグナル発光は起こらない。

本発明の実施形態によれば、バクテリア及び酸素により消光される蛍光材料の共局在性を用いて、改良された、迅速かつ高感度なバクテリア検出方法が提供される。蛍光材料はターゲットとするバクテリアへの親和性を有してもよい。
本発明の目的は、バクテリア検出の所要時間を改良することである。これにより、迅速かつ高感度な検出が実現される。
本発明のさらなる特徴及び利点は以下に記載される通りであり、一部は明細書から明らかであるか、または発明の実施により理解されるだろう。本発明の目的及び他の利点は、明細書、請求の範囲、及び添付された図面において特に示される構造により、認識かつ達成されるだろう。

これらの目的及び／又は他の目的を達成するため、具体化及び広く記載されている通り、本発明は、生きたバクテリアの検出方法であって、酸素により消光される蛍光材料を供給する工程と、前記蛍光材料と前記バクテリアを、バクテリア培養チャンバー内のある領域に共局在させる工程と、前記バクテリアを成長させる工程と、前記共局在された領域において前記蛍光材料が発する蛍光シグナルを検出する工程と、を含む方法であって、前記蛍光材料は蛍光ナノ粒子を含み、前記蛍光ナノ粒子のそれぞれが、金属コア、前記金属コアの外側のスペーサー層、及び前記スペーサー層の外側の蛍光材料、を含む方法を提供する。

蛍光材料は、蛍光ナノ粒子又は蛍光フィルムであり、バクテリアに親和性を有していてもよい。共局在性は、遠心分離、電気泳動、マイクロ流路、磁場、３次元マトリクス、等を用いて実現し得る。

別の側面において、本発明は、酸素により消光される蛍光分子を含み、さらにターゲットとするバクテリアに親和性を有することを特徴とする、バクテリア検出に有用な材料を提供する。
上記の概略的な説明と下記の詳細な説明は共に例示的かつ解説的なものであり、特許請求の範囲で請求される本発明を更に説明することを意図していると理解すべきである。

図１は、マイクロウェルアレイ及び酸素感受性蛍光フィルムを用いたバクテリア検出方法を概略的に示す図である。図１Ａは、マイクロウェルアレイ及び酸素感受性蛍光フィルムを用いたバクテリア検出方法を示す概略図である。図２は、本発明の実施形態によるバクテリア検出の原理を概略的に示す図である。図３Ａは、本発明の実施形態により蛍光ナノ粒子をバクテリアと共局在させることの利点を概略的に示す図である。図３Ｂは、本発明の実施形態により蛍光ナノ粒子をバクテリアと共局在させることの利点を概略的に示す図である。図４Ａは、本発明の実施形態により、蛍光ナノ粒子と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図４Ｂは、本発明の実施形態により、蛍光ナノ粒子と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図４Ｃは、本発明の実施形態により、蛍光ナノ粒子と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図４Ｄは、本発明の実施形態により、蛍光ナノ粒子と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを示す概略図である。図５Ａは、本発明の実施形態により、固定された蛍光材料と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図５Ｂは、本発明の実施形態により、固定された蛍光材料と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図５Ｃは、本発明の実施形態により、固定された蛍光材料と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図５Ｄは、本発明の実施形態により、固定された蛍光材料と目的のバクテリアの共局在性を実現又は高めるためのメカニズムを概略的に示す図である。図６Ａは、金属コアを有する蛍光ナノ粒子の構造の概略図である。図６Ｂは、金属コアを備えたプラズモニックナノ粒子を用いた蛍光シグナル増強を示す図である。図７Ａは、図４Ａの実施形態に適用可能な、改良された遠心分離装置の概略図である。図７Ｂは、図４Ａの実施形態に適用可能な、改良された遠心分離装置の概略図である。図７Ｃは、図４Ａの実施形態に適用可能な、改良された遠心分離装置の概略図である。図７Ｄは、図４Ａの実施形態に適用可能な、改良された遠心分離装置の概略図である。

本発明の実施形態によれば、バクテリア及び酸素で消光される蛍光分子を含有する蛍光材料を共局在させるバクテリア検出方法が提供される。ある実施形態において、蛍光材料は、ターゲットとするバクテリア又は細胞への親和性も有する。酸素感受性蛍光材料とバクテリアの距離が近いため、バクテリアによる酸素消費によって、直ちに、蛍光材料からの蛍光シグナルが発生する。これにより、迅速かつ高感度なバクテリア検出が実現される。

図２は、本発明の実施形態によるバクテリア検出の原理を示す概略図である。このバクテリア検出方法には、酸素により消光される蛍光分子を含有する蛍光材料１０が用いられる。蛍光材料１０は、より詳しく後述される共局在メカニズムによって、生きたバクテリア２０と共局在化される（工程Ｓ１）。バクテリア２０は、成長して酸素を消費する（工程Ｓ２）。この酸素消費により、隣の蛍光材料１０から酸素が奪われる。その結果、蛍光材料は、蛍光シグナルを発する。共局在された場所から発する蛍光シグナルが検出される（工程Ｓ３）。工程Ｓ３においては、Ayyash et al. 2014に記載の蛍光シグナル検出用セットアップを使用してもよく、また、他の適したセットアップを使用してもよい。

ある実施形態において、蛍光材料は、ターゲットとするバクテリアを含む標本に混合された蛍光ナノ粒子である。当該蛍光ナノ粒子は、酸素により消光される蛍光分子でコートされたコアで形成されてもよい。ある実施形態では、蛍光ナノ粒子は目的のバクテリアに親和性を有する。目的のバクテリアを含む標本は、マイクロウェルまたはマイクロ流体デバイスなどのバクテリア培養チャンバーに導入される。図３Ａ及び３Ｂは、蛍光ナノ粒子とバクテリアの共局在の利点を概略的に示す図である。図３Ａは、（Ayyash et al. 2014に記載されるように）底部に蛍光フィルム１１がコートされたマイクロウェル３１及び当該マイクロウェル内の目的のバクテリア２０を含む標本を示す概略図である。図３Ｂは、本発明の実施形態による、標本内のバクテリア２０を囲む蛍光ナノ粒子１２を示す。ナノ粒子１２はバクテリア２０を囲むことができるため、ナノ粒子から酸素が奪われる可能性が増え、これにより、蛍光フィルムが使用された場合（図３Ａ）と比較して、蛍光シグナルが高まる。

蛍光ナノ粒子１２とターゲットとするバクテリア２０の共局在性を高めるために、様々なメカニズムが使用される。メカニズムのいくつかの例は、図４Ａ〜Ｄを参照して以下で説明される。

第一の共局在化方法は、遠心分離を用いる（図４Ａ）。ターゲットとするバクテリア２０を含む標本及び蛍光ナノ粒子１２は、バクテリア培養チャンバー３２（例えば、遠心管）内に設置され、遠心分離機（図示なし）内で回転される。その結果、バクテリア２０及び蛍光ナノ粒子１２の両方が、遠心力によって遠心管の底領域３２Ａに集まり、ここで互いに近接する（具体的には、共局在化される）こととなる。

第二の共局在化方法は、マイクロ流体デバイス３３における電気泳動を用いる（図４Ｂ）。蛍光ナノ粒子１３としては、ターゲットとするバクテリアと似た電気移動度特性を有するものが選択される。バクテリア２０を含む標本及びナノ粒子１３は、マイクロ流体デバイス３３に導入され、ここで電場がかけられる。バクテリア及びナノ粒子は、電場によってマイクロ流体デバイス内の同じ領域に集中し、ここで互いに近接する（具体的には、共局在化される）こととなる。

第三の共局在化方法は、マイクロ流体デバイスを用いる（図４Ｃ）。このマイクロ流体デバイスにおいて、マイクロ流路３４は、バクテリアに親和性を有する捕捉材料３Ａ（例えば、抗体）で修飾されている。マイクロ流路３４は、マイクロ流体デバイスの一部でもよい。本実施形態の蛍光ナノ粒子１４も、例えば表面に抗体を有し、これによりバクテリアに親和性を有する。ターゲットとするバクテリア２０を含む標本及び蛍光ナノ粒子１４がマイクロ流路３４を通って流れる際に、バクテリア２０は捕捉材料３４Ａによって流路中にトラップされる。蛍光ナノ粒子１４は、マイクロ流路３４中のバクテリア２０によってバクテリアの近傍にトラップされ、その結果、蛍光ナノ粒子及びバクテリアは互いに近接する（具体的には、共局在化される）こととなる。

第四の共局在化方法は、常磁性をさらに有する蛍光ナノ粒子１５を用いる（図４Ｄ）。本実施形態の蛍光ナノ粒子１５も、バクテリアへの親和性を有する。バクテリア２０を含む標本及び蛍光ナノ粒子１５は、バクテリア培養チャンバー３５に設置されて混合され、バクテリアは、磁性ナノ粒子によりトラップされる。磁気素子３５Ａによってバクテリア培養チャンバー３５に磁場がかけられ、磁性ナノ粒子１５及びバクテリア２０は磁力によりバクテリア培養チャンバーの一端に集められる。その結果、磁性ナノ粒子及びバクテリアは互いに近接する（具体的には、共局在化される）こととなる。

上述の第三及び第四の共局在化方法（図４Ｃのマイクロ流路及び図４Ｄの磁力）において、蛍光ナノ粒子はバクテリアに親和性を有する必要がある。第一及び第二の共局在化方法（図４Ａの遠心分離及び図４Ｄの電気泳動）において、蛍光ナノ粒子とバクテリアの間の親和性は、必要ではないが、共局在効果を高めるために有用である。また、バクテリアに親和性を有する蛍光ナノ粒子の使用は、蛍光ナノ粒子とバクテリアの共局在性の安定にもつながる。

上述の共局在化方法（図４Ａ〜４Ｄ）は、互いに組み合わせて用いてもよい。

他の実施形態において、酸素感受性蛍光材料は、蛍光フィルム又はバクテリア培養チャンバー又はマイクロ流路に固定された他の材料であり、バクテリアと固定された蛍光材料の共局在化を促すメカニズムが提供される。メカニズムのいくつかの例は、図５Ａ〜５Ｄを参照して以下で説明される。

第一の共局在化方法は、遠心分離を用いる（図５Ａ）。蛍光フィルム１６は、バクテリア培養チャンバー３６（遠心管）の底領域に固定される。ターゲットとするバクテリア２０を含む標本は、遠心管３６に設置され、遠心分離機（図示なし）内で回転される。その結果、バクテリア２０は遠心力によって遠心管の底領域に集まり、つまり、蛍光フィルム１６のごく近傍に位置する（具体的には、共局在化される）こととなる。

第二の共局在化方法は、電気泳動を用いる（図５Ｂ）。蛍光フィルム１７は、バクテリア培養チャンバー３７の末端の壁に固定される。ターゲットとするバクテリア２０を含む標本がバクテリア培養チャンバー３７に設置されて電場がかけられると、バクテリアはその末端の壁に向かって移動してそこに集まる。その結果、バクテリアは蛍光フィルム１７のごく近傍に位置する（具体的には、共局在化される）こととなる。

第三の共局在化方法は、マイクロ流体デバイス３８を用いる。このマイクロ流体デバイス３８において、マイクロ流路の側面は蛍光材料１８で修飾されて（図５Ｃ）、マイクロ流路の同じ側面は、バクテリアに親和性を有する材料３８Ａ、例えば抗体でも修飾されている。バクテリア２０は、マイクロ流路を通過する際に、抗体３８Ａによりトラップされ、その結果、バクテリアは蛍光材料１８のごく近傍に位置する（具体的には、共局在化される）こととなる。

第四の共局在化方法は、マイクロ流路内に３次元マトリクス１９を備えたマイクロ流体デバイス３９を用いる（図５（Ｄ））。３次元マトリクス１９は、カルボキシメチルデキストランなどの基材で作られ、バクテリアに親和性を有する抗体などの材料だけでなく、蛍光材料のコーティングにより修飾されている。バクテリア２０は、マトリクス１９を通過する際に抗体により３次元マトリクス内にトラップされ、その結果、バクテリアは蛍光材料のごく近傍に位置する（具体的には、共局在化される）こととなる。

上述の第三及び第四の共局在化方法において、マイクロ流路表面１８及び３次元マトリクス１９は、バクテリアに親和性を有する必要がある。第一及び第二の共局在化方法（遠心分離及び電気泳動）においては、蛍光フィルム１６及び１７に、バクテリアに親和性を有する材料は、必要ではないが、共局在化の効果を高めるために有用ではある。また、バクテリアに親和性を有する蛍光材料の使用は、蛍光材料とバクテリアの共局在性の安定にもつながる

上述の共局在化方法（図５Ａ〜５Ｄ）は、互いに組み合わせて用いてもよい。

固定された蛍光材料を使用する実施形態の別の利点は、蛍光材料が固定された場所にバクテリアが集まるため、蛍光材料を集めるためのさらなるプロセスまたはメカニズムが不要であることである。

上述の共局在化方法（図４Ａ〜４Ｄ及び図５Ａ〜５Ｄ）のいずれによっても、バクテリア及び蛍光ナノ粒子または固定された蛍光材料が互いに近接するという結果が得られ、その結果、バクテリアが蛍光材料から酸素を奪う作用が高まる。蛍光ナノ粒子又は固定された蛍光材料に含まれる蛍光分子は、酸素により消光されるものである。

蛍光ナノ粒子（例えば、図４Ａ〜４Ｄ）及び蛍光フィルム（例えば、図５Ａ〜５Ｄ）を用いる実施形態において、粒子及びフィルムの蛍光シグナルは、金属増強蛍光（ＭＥＦ）の原理を用いてさらに高められてもよい。ＭＥＦは、蛍光材料が金属の近傍にある場合に蛍光シグナルの強度が増加する現象である。

蛍光ナノ粒子に関し、図６Ａは、プラズモニックナノ粒子と称される金属コアを有する蛍光ナノ粒子４０の構造の概略図を示す。蛍光ナノ粒子４０は、金属コア４１、金属コアの外側のスペーサー層４２、及びスペーサー層４２の外側の蛍光材料層４３により形成される。金属コア４１の金属としては、金、銀、アルミニウム等を用いることができる。スペーサー層４２は、シリカ又は他の好適な材料で作成できる。蛍光材料４３は、酸素により消光されるものである。好ましくは、トリス（２，２‘−ビピリジル）ジクロロルテニウム六水和物（ＲＴＤＰ、励起波長：４６０ｎｍ、発光波長：６００ｎｍ）が蛍光材料として使用され、この場合は、銀がＭＥＦに適した金属である。図６Ｂに示されるように、５００ｎｍ以上の波長において、プラズモニックナノ粒子の蛍光シグナルは、金属コアを持たないナノ粒子が発する蛍光シグナルの３０倍となり得る。プラズモニックナノ粒子は、例えば、以下に記載されて知られている；米国特許8759110号、D.Brouardらの「多層蛍光ナノ複合体及びカチオン性高分子トランスデューサーに基づく無標識バイオセンサー（Label-Free Biosensing Based on Multilayer Fluorescent Nanocomposites and a Cationic Polymeric Transducer）」（ACS NANO誌、第５巻、３号、1888-1896（2011））。

図５Ａ〜５Ｄに示される実施形態のような蛍光フィルムまたはコーティングの場合、ＭＥＦを利用するためには、バクテリア培養チャンバー又は３次元マトリクスの表面の上の金属層、金属層の上のスペーサー層、及びスペーサー層の上の蛍光材料層を含む複数の層でフィルムを形成させてもよい。プラズモニックナノ粒子に関して上で記載したものと同じ材料を、この蛍光フィルムの様々な層として用いることができる。

図７Ａ〜７Ｄは、バクテリアと蛍光ナノ粒子の共局在性をさらに高めるために図４Ａの実施形態に適用可能な、改良された遠心分離装置の概略図である。図７Ａに示される従来の遠心分離装置において、遠心管７２は、回転軸７１に対して鋭角に配置されている。図７Ａは、回転軸が図面用紙の平面内にある側面図である。図７Ｂ〜７Ｄは、別の遠心分離装置の３つの例の上面図を示す。ここでは、回転軸７１が図面用紙の平面に対して垂直である。これらの上面図において、遠心容器７２は回転軸７１に関して形が対称である。図７Ｂ及び７Ｄにおいて、遠心容器７２は、それぞれチューブ形状又は三角形状であり、それぞれ、２又は３の狭い端部を有する。この狭い端部において、バクテリア及びナノ粒子が小さな体積に濃縮される。狭い端部を有する他の好適な形状を用いることもできる。

上述の様々な実施形態において、蛍光材料（蛍光ナノ粒子又は固定された蛍光材料）以外の材料から酸素を捕捉することを避けるため、バクテリア培養チャンバーは、できる限り小さいことが好ましい。

当業者にとっては、本発明の範囲や趣旨から逸脱しない範囲で、本発明のバクテリア検出方法及び関連する装置に様々な改良や変更が行えることは明らかであろう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内となる改良や変更を包含するものである。

Claims

生きたバクテリアの検出方法であって、
酸素により消光される蛍光材料を供給する工程と、
前記蛍光材料と前記バクテリアを、バクテリア培養チャンバー内のある領域に共局在させる工程と、
前記バクテリアを成長させる工程と、
前記共局在された領域において前記蛍光材料が発する蛍光シグナルを検出する工程と、
を含む方法であって、
前記蛍光材料は蛍光ナノ粒子を含み、
前記蛍光ナノ粒子のそれぞれが、
金属コア、
前記金属コアの外側のスペーサー層、及び
前記スペーサー層の外側の蛍光材料、
を含む方法。
前記蛍光材料は前記バクテリアに親和性を有する、請求項１に記載の方法。
前記金属コアは、金、銀又はアルミニウムで作られる、請求項１に記載の方法。
前記共局在化の工程は、
（１）前記バクテリアを含む標本及び前記蛍光ナノ粒子に遠心分離を施す工程、
（２）前記バクテリアを含む標本及び前記バクテリアと同じ移動度を有する前記蛍光ナノ粒子に電気泳動を施す工程、
（３）前記バクテリアを含む標本及び前記バクテリアに親和性を有する前記蛍光ナノ粒子を、表面が前記バクテリアに親和性を有する材料で修飾されたマイクロ流路に通す工程、
（４）前記バクテリアを含む標本及び常磁性を有する前記蛍光ナノ粒子に磁場をかける工程、
の少なくとも１つを含む、請求項１又は３に記載の方法。
生きたバクテリアの検出方法であって、
酸素により消光される蛍光材料を供給する工程と、
前記蛍光材料と前記バクテリアを、バクテリア培養チャンバー内のある領域に共局在させる工程と、
前記バクテリアを成長させる工程と、
前記共局在された領域において前記蛍光材料が発する蛍光シグナルを検出する工程と、
を含む方法であって、
前記共局在させる工程は、
（１）フィルムとして形成された前記蛍光材料を備えた表面領域を有するバクテリア培養チャンバーを供給する工程と、
前記バクテリアを含有する標本を前記バクテリア培養チャンバーに設置する工程と、
前記蛍光フィルムが位置する前記領域に前記バクテリアを集めるために、前記バクテリア培養チャンバーに遠心分離を施す工程、
（２）フィルムとして形成された前記蛍光材料を備えた表面領域を有するバクテリア培養チャンバーを供給する工程と、
前記バクテリアを含有する標本を前記バクテリア培養チャンバーに設置する工程と、
前記蛍光フィルムが位置する前記領域に前記バクテリアを集めるために、前記バクテリア培養チャンバーに電気泳動を施す工程、
（３）フィルムとして形成された前記蛍光材料を表面に備え、前記バクテリアに親和性を有する捕捉材料で前記表面がさらに修飾されたマイクロ流路を備えたマイクロ流体デバイスを供給する工程と、
前記バクテリアを含有する標本を、前記マイクロ流路を通して流す工程、
及び、
（４）コーティングとして形成された前記蛍光材料を備え、前記バクテリアに親和性を有する捕捉材料でさらに修飾された３次元マトリクスが内部に設置されたマイクロ流路を備えたマイクロ流体デバイスを供給する工程と、
前記バクテリアを含有する標本を、前記マイクロ流路内の前記３次元マトリクスを通して流す工程、
のいずれか１つを有し、
前記蛍光フィルム又はコーティングは、
金属層、
前記金属層の上のスペーサー層、及び
前記スペーサー層の上の蛍光材料層、
を含む方法。
前記金属層は、金、銀又はアルミニウムで作られる、請求項５に記載の方法。
生きたバクテリアの検出装置であって、
酸素により消光される蛍光材料及び前記バクテリアを成長させるための培地が供給されるバクテリア培養チャンバーと、
前記蛍光材料と前記バクテリアを、前記バクテリア培養チャンバー内のある領域に共局在させるための共局在手段と、
前記共局在された領域において前記蛍光材料が発する蛍光シグナルを検出する手段を有し、
前記蛍光材料は蛍光ナノ粒子を含み、
前記蛍光ナノ粒子のそれぞれが、
金属コア、
前記金属コアの外側のスペーサー層、及び
前記スペーサー層の外側の蛍光材料、
を含む、検出装置。
生きたバクテリアの検出装置であって、
酸素により消光される蛍光材料及び前記バクテリアを成長させるための培地が供給されるバクテリア培養チャンバーと、
前記蛍光材料と前記バクテリアを、前記バクテリア培養チャンバー内のある領域に共局在させるための共局在手段と、
前記共局在された領域において前記蛍光材料が発する蛍光シグナルを検出する手段を有し、
前記共局在手段は、
（１）フィルムとして形成された前記蛍光材料を備えた表面領域を有し、前記バクテリアを含有する標本が設置された前記バクテリア培養チャンバーに、遠心分離を施して前記蛍光フィルムが位置する前記領域に前記バクテリアを集める遠心分離装置、
（２）フィルムとして形成された前記蛍光材料を備えた表面領域を有し、前記バクテリアを含有する標本が設置された前記バクテリア培養チャンバーに、電気泳動を施して前記蛍光フィルムが位置する前記領域に前記バクテリアを集める電気泳動装置、
（３）フィルムとして形成された前記蛍光材料を表面に備え、前記バクテリアに親和性を有する捕捉材料で前記表面がさらに修飾されたマイクロ流路を備えたマイクロ流体デバイス、
及び、
（４）コーティングとして形成された前記蛍光材料を備え、前記バクテリアに親和性を有する捕捉材料でさらに修飾された３次元マトリクスが内部に設置されたマイクロ流路を備えたマイクロ流体デバイス、
のいずれかであり、
前記蛍光フィルム又はコーティングは、
金属層、
前記金属層の上のスペーサー層、及び
前記スペーサー層の上の蛍光材料層、
を含む、検出装置。