CN114317669A - 一种基于细胞内蛋白激酶c激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置 - Google Patents
一种基于细胞内蛋白激酶c激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114317669A CN114317669A CN202210001136.9A CN202210001136A CN114317669A CN 114317669 A CN114317669 A CN 114317669A CN 202210001136 A CN202210001136 A CN 202210001136A CN 114317669 A CN114317669 A CN 114317669A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- drug
- protein kinase
- screening
- drug screening
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 42
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 title claims description 16
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims abstract description 91
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108091006068 Gq proteins Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000052606 Gq-G11 GTP-Binding Protein alpha Subunits Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 74
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 43
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 43
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 43
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 16
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 15
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 13
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 10
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 claims description 10
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 9
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 claims description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N Silane Chemical group [SiH4] BLRPTPMANUNPDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 claims 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 abstract description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 abstract 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N apigenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2O1 KZNIFHPLKGYRTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940117893 apigenin Drugs 0.000 description 3
- XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N apigenin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=CC(=O)C2=CC(O)=C(O)C=C2O1 XADJWCRESPGUTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008714 apigenin Nutrition 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000010408 film Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 3
- 239000005304 optical glass Substances 0.000 description 3
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003596 drug target Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 11-mercaptoundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCS GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INOAASCWQMFJQA-UHFFFAOYSA-N 16-sulfanylhexadecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCS INOAASCWQMFJQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMNQZZPAVNBESS-UHFFFAOYSA-N 6-sulfanylhexanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCS CMNQZZPAVNBESS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYEMIKRWWMYBFG-UHFFFAOYSA-N 8-sulfanyloctanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCS FYEMIKRWWMYBFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 description 1
- WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N antimony atom Chemical compound [Sb] WATWJIUSRGPENY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- AJNVQOSZGJRYEI-UHFFFAOYSA-N digallium;oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[Ga+3].[Ga+3] AJNVQOSZGJRYEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229910001195 gallium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940042040 innovative drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000011112 process operation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置，该方法包括以下步骤：首先将细胞置于药物筛选芯片上，使细胞直接贴于药物筛选芯片表面后，置于药物筛选装置中，调整偏振光的入射角度为发生表面等离子共振时的角度，此时检测单元中反射光强度为最低；将待筛选药物依次加入上述生物芯片表面，进行检测单元中反射光的强度变化情况的检测，若待筛选药物中存在Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂，则细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度增强。本发明实验准确率更高，先导化合物无需标记，细胞也无需荧光等染色试剂处理，具有操作简便、过程简单、检测时间短、检测成本低等优势。
Description
技术领域
本发明涉及药物筛选技术领域，具体涉及一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置。
背景技术
药物筛选是指从天然产物或者人工合成的化合物中筛选出具有生物活性的新药或者先导化合物，是新药研发过程中的关键步骤。创新药物的发现需要采用适当的药物作用靶点对大量化合物样品进行筛选。而随着基因组学、蛋白质组学、代谢组学、组合化学等学科的发展，药物分子库在不断扩大，药物作用靶点也越来越多，这使得药物发现的范围逐渐扩大，药物筛选的工作量急剧增加。因此高通量筛选（high-throughput screening）技术应运而生。
高通量筛选系统以分子水平或细胞水平的实验方法为基础，通过自动化操作系统、灵敏快速的检测系统和数据分析系统实现数千个反应同时测试和分析的系统，大大提高了药物筛选的实验规模和效率。其中，基于细胞水平的药物筛选系统因为更加接近人体生理条件，实验准确率更高，因此成为了主要的筛选模型。
目前已经发展成熟的细胞高通量筛选系统主要是基于多孔板进行的。它们利用自动化的液体转移分配机械臂完成对液体的多步操控和试剂运输，并使用多孔板扫描仪或者自动化显微镜扫描拍摄技术对细胞的生存情况进行检测。但是这些自动化设备的价格相对较高，不利于普通小型的研究中心或实验室使用，且细胞长时间存在于多孔板中也会造成其生长状态的异常。另外，用于药物筛选的生物样品和药物库的成本也较高，而目前常规液体处理设备能够准确操控的液体体积在数百纳升水平。因此，开发一种简单、快速、低成本的细胞反应分析方法以发挥基于细胞的药物筛选和评价的发展优势是非常必要的。
微流控技术是近年来的研究热点之一，其核心是将常规化学、生物等领域所涉及的基本操作单元集成到方寸大小的芯片上，实现对nL级至pL级液体的精准操控，在化学、生物学、医学等领域都具有广泛的应用。利用微流控技术可以构建高通量、低成本细胞水平的药物筛选系统，系统具有样品及试剂消耗量少、系统高度集成化和自动化等优点。同时，微流控芯片与传统的细胞培养器皿相比，在细胞培养上也具有诸多优势。如通过选择不同的芯片材料或者设计不同的细胞培养腔室结构，更容易实现细胞的三维（3D）培养。因此，基于微流控技术的细胞筛选系统是一种极具潜力的药物筛选系统。目前，按照微流体操控模式的不同，可将微流控细胞筛选系统分为3类，分别是灌注流模式、液滴模式和微阵列模式。
尽管微流控技术在试剂消耗、筛选通量、细胞培养微环境控制等方面与常规方法相比已经展现出明显的优势，但仍然有很大的发展空间。首先，现有的多数微流控系统还没办法在保证超微量和高通量水平的前提下，完成从细胞阵列的形成、培养到加药和检测等全过程操作的自动化。其次，目前在微流控系统下构建的细胞培养环境与实际体内细胞的微环境还有较大差距。最后，在目前微流控细胞筛选系统中，通常会涉及细胞的接种、培养液的更换或添加、药物的加入与清洗、细胞染色试剂的添加等操作，过程较为繁琐、检测时间较长。
统计表明，目前70%左右的药物的作用靶点是致病相关的受体与酶，其中39.5%的受体和酶的靶点与蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）相关。蛋白激酶C是Gq蛋白偶联受体与一部分酪氨酸激酶受体系统中的效应物，广泛分布于多种组织、器官和细胞中。未激活的蛋白激酶C游离存在于胞质溶胶中，当蛋白激酶C相关受体被激活时，蛋白激酶C以Ca2+依赖的形式从胞质溶胶中移位到细胞膜上，此过程称之为转位（translocation）。因此，一般将蛋白激酶C的转位作为蛋白激酶C激活的标志。蛋白激酶C通过催化多种蛋白质上的Ser/Thr磷酸化，调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。在新药研发中，蛋白激酶C及其相关受体与酶是研究治疗风湿病、关节炎、哮喘、脑肿瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、乳腺癌、结肠直肠肿瘤、肺癌、心血管疾病等多种疾病重要的药物靶点。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法，包括以下步骤：
S1、将目标细胞提前24 h于37℃，5% CO2条件下，培养于带有flexiPERM方形孔的药物筛选芯片上，使细胞直接贴于药物筛选芯片表面，
S2、将细胞贴壁后的生物芯片置于药物筛选装置的药物筛选芯片耦合单元中，调整偏振光的入射角度为发生表面等离子共振时的角度，即为共振角，此时检测单元中反射光强度为最低；
S3、将待筛选药物依次加入上述生物芯片表面；
S4、进行检测单元中反射光的强度变化情况的检测，若待筛选药物中存在Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂（agonist），则蛋白激酶C将从胞质溶胶中移位到细胞膜上，从而进入表面等离子共振中的敏感区域，导致表面等离子共振的条件发生改变，表现为细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度增强；
若待筛选药物为Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的拮抗剂，则在步骤S3后，于每种待筛选药物后加入已知的蛋白激酶C激动剂；若细胞区域反射进入检测单元的反射光强度变弱或者不变，则证实筛选到的药物为Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的拮抗剂。
进一步地，所述步骤S1中，可以通过利用目标细胞自身生长特性，在正常培养环境下直接贴壁固定于药物筛选芯片；也可以采用5-羧基-1-戊硫醇﹑7-羧基-1-庚烷硫醇﹑10-羧基-1-癸烷硫醇﹑15-羧基-1-十五烷硫醇等带有羧基等官能团的巯基或胶原蛋白等增强细胞吸附和贴壁的试剂对药物筛选芯片进行包被，然后将细胞悬浮液加至药物筛选芯片上，通过重力作用使细胞吸附和贴壁到药物筛选芯片上。
进一步地，所述药物筛选装置包括表面等离子共振激发光单元、检测单元和药物筛选芯片耦合单元，所述表面等离子共振激发光单元包括平行光镜筒、偏振光片、偏振光片切换机构以及组装固定部件，平行光镜筒用于提供平行光光源，经偏振光片后产生线性偏振光，以一定的角度入射进药物筛选芯片耦合单元；药物筛选芯片耦合单元包括药物筛选芯片和耦合棱镜，所述耦合棱镜采用具有高折射率的光学材料制作而成，入射的线性偏振光通过耦合棱镜后照射药物筛选芯片上的细胞；所述检测单元包括连续变倍放大镜头和检测器，从耦合棱镜出来的反射光经过连续变倍放大镜头放大后被检测器收集并检测。
本发明还提供了一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，包括表面等离子共振激发光单元、检测单元和药物筛选芯片耦合单元，所述表面等离子共振激发光单元包括平行光镜筒、偏振光片、偏振光片切换机构以及组装固定部件，平行光镜筒用于提供平行光光源，经偏振光片后产生线性偏振光，以一定的角度入射进药物筛选芯片耦合单元；药物筛选芯片耦合单元包括药物筛选芯片和耦合棱镜，所述耦合棱镜采用具有高折射率的光学材料制作而成，入射的线性偏振光通过耦合棱镜后照射药物筛选芯片上的细胞；所述检测单元包括连续变倍放大镜头和检测器，从耦合棱镜出来的反射光经过连续变倍放大镜头放大后被检测器收集并检测。
进一步地，所述的平行光镜筒采用但不限于光源一体式平行光镜筒、光源特定波长滤过一体式平行光镜筒、光纤传导式平行光镜筒、光纤传导式特定波长滤过平行光镜筒以及其它可以实现提供平行光的光学结构及仪器部件。
进一步地，所述的偏振光片用于实现线性偏振光的整合，采用但不限于金属线栅偏光板﹑高分子薄膜偏光板﹑渥拉斯顿棱镜﹑格兰泰勒棱镜﹑格兰汤普逊棱镜﹑罗歇偏振棱镜﹑偏光立方体分光器以及其它可以实现线形偏光的光学结构及仪器部件。
进一步地，所述偏振光片切换机构用于改变偏振光片的配位，从而实现P偏振光与S偏振光的切换，包括直流电机/步进电机/伺服电机等动力装置，齿轮/链条等传动装置和光电传感器/霍尔传感器/编码传感器等定位传感器。值得注意的是，在偏振光片切换机构中，可省略定位传感器以实现仪器成本的降低等。也可省略此偏振光片切换机构以实现仪器成本的降低等。偏振光片与偏振光片切换机构可以置于表面等离子共振激发光单元中，也可置于检测单元中。
进一步地，所述的连续变倍放大镜头采用但不限于连续变焦镜头﹑定焦显微镜头﹑凸透镜﹑平凸镜以及其它可以实现显微放大的光学结构及仪器部件。
进一步地，所述的检测器用于药物筛选芯片耦合单元的反射光信号的收集，采用包括但不限于CCD﹑CMOS以及其它可以实现反射光信号收集的检测器。
进一步地，所述的药物筛选芯片包括光学玻璃﹑PMMA﹑CR-39或PC等高折射率的基质与金﹑银或铜等金属膜构，为了增加金属膜与基质的附着性，可以在金属膜与基质之间加入铬﹑锑﹑氧化镓或二氧化钛等辅助附着层，并且，为了提高细胞对于药物筛选芯片的吸附和贴壁，可在药物筛选芯片表面实施硅烷链﹑胶原蛋白等化学修饰。
进一步地，所述的耦合棱镜采用光学玻璃﹑PMMA﹑CR-39或PC等高折射率的材料制成，为了减小药物筛选芯片与耦合棱镜贴合时的空隙导致的检测噪音，可以在药物筛选芯片与耦合棱镜之间加入包括但不限于折射率匹配液﹑光学浸入液﹑光学凝胶等。
测试时，首先将细胞置于药物筛选芯片上，使细胞直接贴于药物筛选芯片表面后，将载有细胞的药物筛选芯片放入药物筛选芯片耦合单元中。随后，表面等离子共振激发光单元发出的P偏振光以一定的角度入射进药物筛选芯片耦合单元发生表面等离子共振时，反射进入检测单元的反射光的强度将减小。
当筛选的药物为Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂（agonist）时，如图1所示，当加入药物筛选芯片耦合单元中的药物作用于药物筛选芯片上的细胞后，蛋白激酶C将从胞质溶胶中移位到细胞膜上，从而进入表面等离子共振中的敏感区域，导致表面等离子共振的条件发生改变，最终使细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度增强。因此，通过检测细胞区域反射光强度的变化即可实现药物的筛选与评价。当筛选的药物为Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的拮抗剂（antagonist）时，首先使用待筛选的拮抗剂药物干预细胞，随后加入已知的激动剂。当加入药物筛选芯片耦合单元中的激动剂无法使蛋白激酶C将从胞质溶胶中移位到细胞膜上，将导致细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度不变或变化减弱，则证明待筛选的拮抗剂药物有效。反之，则证明待筛选的拮抗剂药物无效。
本发明提供的药物筛选方法是基于细胞的药物筛选和评价，因此更加接近人体生理条件，实验准确率更高。并且，在本发明的细胞药物筛选方法中，先导化合物无需标记，细胞也无需荧光等染色试剂处理，因此具有操作简便、过程简单、检测时间短、检测成本低等优势。此外，本发明中的药物筛选仪器是基于直接光学仪器原理所设计开发，因此具有高通量实时分析等优点。
附图说明
图1为本发明的药物筛选原理示意图。
图2为本发明的药物筛选仪器的结构示意图，图中：1-表面等离子共振激发光单元，2-检测单元，3-药物筛选芯片耦合单元，11-平行光镜筒，12-偏振光片，13-偏振光片切换机构，21-连续变倍放大镜头，22-检测器，31-药物筛选芯片，32-耦合棱镜。
图3为本发明实施例1中激动剂的药物筛选实验结果。
图4为本发明实施例2中拮抗剂的药物筛选实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下述实施例中所用药物筛选装置的结构如图2所示，包括表面等离子共振激发光单元1、检测单元2和药物筛选芯片耦合单元3，所述表面等离子共振激发光单元1包括平行光镜筒11、偏振光片12、偏振光片切换机构13以及组装固定部件，平行光镜筒11用于提供平行光光源，经偏振光片12后产生线性偏振光，以一定的角度入射进药物筛选芯片耦合单元；药物筛选芯片耦合单元3包括药物筛选芯片31和耦合棱镜32，所述耦合棱镜32采用具有高折射率的光学材料制作而成，入射的线性偏振光通过耦合棱镜32后照射药物筛选芯片上的细胞；所述检测单元2包括连续变倍放大镜头21和检测器22，从耦合棱镜出来的反射光经过连续变倍放大镜头放大后被检测器收集并检测。采用780 nm的LED单色光源，最大输出为1.15 mW。平行光镜筒的照射直径为25.4 mm，有效照射直径大于10 mm。采用金属线栅偏光板﹑位置传感器﹑步进电机与齿轮传动结构实现P偏振光与S偏振光的切换，摆动精度小于0.01°。检测单元光学放大倍率为1.6至7.0﹑像素为772×580（8.3×8.3 µm）﹑曝光时间为1s。耦合棱镜采用折射率为1.805的SF10光学玻璃制作而成。在实施例检测时，棱镜内入射光与反射光角度为50.7°，检测限小于10-5 RIU。
实施例1. 激动剂（agonist）的药物筛选
在37°C下在含有5%二氧化碳的细胞培养箱中，使用含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的EMEM培养基培养RBL-2H3细胞。在实验实施的前一天，取300 μL的细胞培养液（约5×104个细胞）添加至药物筛选芯片上过夜培养，使RBL-2H3细胞附着于药物筛选芯片表面。在激动剂的药物筛选实验实施前1小时，使用Hanks溶液（pH 7.4，37 °C）置换EMEM培养液，并用0.1 μg/mL抗DNP-IgE预敏化1小时。
在本实施例中，4β-phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）作为激动剂激活蛋白激酶C。首先，将载有抗DNP-IgE预敏化处理的RBL-2H3细胞的药物筛选芯片放入本发明中的仪器中，此时细胞监测仪区域反射光强度较低。其次，在实验开始5 min后加入 100 μMPMA水溶液，与RBL-2H3 细胞的孵育时间为60 min，观测细胞检测区域反射光强度的变化。最后，以只使用抗DNP-IgE预敏化处理，但不加入PMA的RBL-2H3细胞作对照。为确保实验的可靠性，共选取七个细胞区域（1至7）和一个非细胞区域（8）作为样本区，分别检测这八个区域内反射光强度随时间的变化。由图3所示，相较于单独只做DNP-IgE预敏化处理的RBL-2H3细胞，加入PMA后的60 min内，细胞区域1-7内的反射光强度均随时间的增加而变强，从而表明本发明可以有效地对Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂实施筛选。
实施例2. 拮抗剂（antagonist）的药物筛选
如上所述，在37°C下在含有5%二氧化碳的细胞培养箱中，使用含有10%FBS和1%青霉素/链霉素的EMEM培养RBL-2H3细胞。在实验实施的前一天，取300 μL的细胞培养液（约5×104个细胞）添加至药物筛选芯片上过夜培养，使RBL-2H3细胞附着于药物筛选芯片表面。在激动剂的药物筛选实验实施前1小时，使用Hanks溶液（pH 7.4，37 °C）置换EMEM培养液，并用0.1 μg/mL抗DNP-IgE预敏化1小时。
在本实施例中，4′,5,7-trihydroxyflavone（Apigenin）作为拮抗剂抑制RBL-2H3细胞的脱颗粒反应，DNP作为已知激动剂用于激活RBL-2H3细胞的脱颗粒反应。首先，使用含有0 μM和100 μM Apigenin的Hanks溶液（pH 7.4，37 °C）分别干预抗DNP-IgE预敏化处理的RBL-2H3细胞1小时；其次，将载有上述处理过后的RBL-2H3细胞的药物筛选芯片放入本发明中的仪器中，此时检测单元内反射光强度较低。最后，在实验开始5 min后加入激动剂DNP（10 μg/ml）的水溶液，观察60 min内检测区域内反射光强度的变化。同样为确保实验的可靠性，共选取七个细胞区域（从 1 到 7）和一个非细胞区域（8 ）作为样本区，分别检测这八个区域内反射光强度随时间的变化。由图4a和4b所示，只加入激动剂DNP的细胞区域1-7内发射光强度均随检测时间的增加而变强，与此同时，由4c和4b所示，经拮抗剂Apigenin处理后的细胞，即使加入同等浓度的DNP，在60 min内的检测时间内细胞区域1-7内的反射光强度均未发生明显变化，也表明本发明可以有效地对Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的拮抗剂实施筛选。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、将目标细胞提前24 h于37℃，5% CO2条件下，培养于带有flexiPERM方形孔的药物筛选芯片上，使细胞直接贴于药物筛选芯片表面，
S2、将细胞贴壁后的生物芯片置于药物筛选装置的药物筛选芯片耦合单元中，调整偏振光的入射角度为发生表面等离子共振时的角度，即为共振角，此时检测单元中反射光强度为最低；
S3、将待筛选药物依次加入上述生物芯片表面；
S4、进行检测单元中反射光的强度变化情况的检测，若待筛选药物中存在Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的激动剂（agonist），则蛋白激酶C将从胞质溶胶中移位到细胞膜上，从而进入表面等离子共振中的敏感区域，导致表面等离子共振的条件发生改变，表现为细胞区域反射进入检测单元的反射光的强度增强；
若待筛选药物为Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C的拮抗剂，则在步骤S3后，于每种待筛选药物后加入已知的蛋白激酶C激动剂；若细胞区域反射进入检测单元的反射光强度变弱或者不变，则证实筛选到的药物为Gq蛋白偶联受体﹑部分酪氨酸激酶受体或蛋白激酶C等的拮抗剂。
2.如权利要求1所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的方法，其特征在于：所述步骤S1中，可以通过利用目标细胞自身生长特性，在正常培养环境下直接贴壁固定于药物筛选芯片；也可以采用带有羧基官能团的能增强细胞吸附和贴壁的试剂对药物筛选芯片进行包被，然后将细胞悬浮液加至药物筛选芯片上，通过重力作用使细胞吸附和贴壁到药物筛选芯片上。
3.一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：包括表面等离子共振激发光单元（1）、检测单元（2）和药物筛选芯片耦合单元（3），所述表面等离子共振激发光单元（1）包括平行光镜筒（11）、偏振光片（12）、偏振光片切换机构（13）以及组装固定部件，平行光镜筒（11）用于提供平行光光源，经偏振光片（12）后产生线性偏振光，以一定的角度入射进药物筛选芯片耦合单元；药物筛选芯片耦合单元（3）包括药物筛选芯片（31）和耦合棱镜（32），所述耦合棱镜（32）采用具有高折射率的光学材料制作而成，入射的线性偏振光通过耦合棱镜（32）后照射药物筛选芯片上的细胞；所述检测单元（2）包括连续变倍放大镜头（21）和检测器（22），从耦合棱镜出来的反射光经过连续变倍放大镜头放大后被检测器收集并检测。
4.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：所述的平行光镜筒（11）采用但不限于光源一体式平行光镜筒、光源特定波长滤过一体式平行光镜筒、光纤传导式平行光镜筒、光纤传导式特定波长滤过平行光镜筒以及其它可以实现提供平行光的光学结构及仪器部件。
5.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：所述的偏振光片（12）用于实现线性偏振光的整合，采用但不限于金属线栅偏光板﹑高分子薄膜偏光板﹑渥拉斯顿棱镜﹑格兰泰勒棱镜﹑格兰汤普逊棱镜﹑罗歇偏振棱镜﹑偏光立方体分光器以及其它可以实现线形偏光的光学结构及仪器部件。
6.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：所述偏振光片切换机构（13）用于改变偏振光片的配位，从而实现P偏振光与S偏振光的切换，包括动力装置、传动装置和光定位传感器。
7.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：所述的连续变倍放大镜头（21）采用但不限于连续变焦镜头﹑定焦显微镜头﹑凸透镜﹑平凸镜以及其它可以实现显微放大的光学结构及仪器部件。
8.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：所述的检测器（22）用于药物筛选芯片耦合单元的反射光信号的收集，采用包括但不限于CCD﹑CMOS以及其它可以实现反射光信号收集的检测器。
9.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：所述的药物筛选芯片（31）包括高折射率的基质与金属膜构，为了增加金属膜与基质的附着性，在金属膜与基质之间加入辅助附着层，并且，为了提高细胞对于药物筛选芯片的吸附和贴壁，在药物筛选芯片表面实施硅烷链﹑胶原蛋白修饰。
10.如权利要求3所述的一种基于细胞内蛋白激酶C激活状态筛选药物的高通量筛选装置，其特征在于：在药物筛选芯片与耦合棱镜之间加入折射率匹配液﹑光学浸入液或光学凝胶。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210001136.9A CN114317669A (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 一种基于细胞内蛋白激酶c激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210001136.9A CN114317669A (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 一种基于细胞内蛋白激酶c激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114317669A true CN114317669A (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=81023274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210001136.9A Pending CN114317669A (zh) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 一种基于细胞内蛋白激酶c激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114317669A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000020859A1 (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-13 | Duke University | METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING BINDING INTERACTIONS $i(IN VIVO) |
| US20090142790A1 (en) * | 2005-04-05 | 2009-06-04 | Ye Fang | Label Free Biosensors and Cells |
| US20090226931A1 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-10 | Bunch Thomas A | Dual-target biosensor cell assays |
| US20090325211A1 (en) * | 2007-10-06 | 2009-12-31 | Ye Fang | System and method for dual-detection of a cellular response |
| CN101782569A (zh) * | 2009-01-21 | 2010-07-21 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种甲酰肽受体激动剂筛选用微流控芯片组及筛选方法 |
| JP2011193752A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Hiroshima Univ | 細胞活性分析装置及び細胞活性分析方法、並びに細胞同定方法 |
| CN105659087A (zh) * | 2013-06-13 | 2016-06-08 | 比奥德赛公司 | 筛选靶向靶生物实体的候选生物实体的方法 |
-
2022
- 2022-01-04 CN CN202210001136.9A patent/CN114317669A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000020859A1 (en) * | 1998-10-05 | 2000-04-13 | Duke University | METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING BINDING INTERACTIONS $i(IN VIVO) |
| US20090142790A1 (en) * | 2005-04-05 | 2009-06-04 | Ye Fang | Label Free Biosensors and Cells |
| US20090325211A1 (en) * | 2007-10-06 | 2009-12-31 | Ye Fang | System and method for dual-detection of a cellular response |
| US20090226931A1 (en) * | 2008-03-05 | 2009-09-10 | Bunch Thomas A | Dual-target biosensor cell assays |
| CN102037357A (zh) * | 2008-03-05 | 2011-04-27 | 康宁股份有限公司 | 双靶生物传感器细胞试验 |
| CN101782569A (zh) * | 2009-01-21 | 2010-07-21 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种甲酰肽受体激动剂筛选用微流控芯片组及筛选方法 |
| JP2011193752A (ja) * | 2010-03-17 | 2011-10-06 | Hiroshima Univ | 細胞活性分析装置及び細胞活性分析方法、並びに細胞同定方法 |
| CN105659087A (zh) * | 2013-06-13 | 2016-06-08 | 比奥德赛公司 | 筛选靶向靶生物实体的候选生物实体的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| OLIVER VON AHSEN，等: "High-Throughput Screening for Kinase Inhibitors", CHEMBIOCHEM, vol. 6, no. 3, pages 481 - 490 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220099671A1 (en) | Sensitive and rapid determination of antimicrobial susceptibility | |
| US20150322479A1 (en) | Apparatus and method for quantification of replicative lifespan and observation of senescene | |
| KR20120026551A (ko) | 세포 집단 및 혼합된 세포 집단에서의 변화의 검출 방법 | |
| JP2008523820A (ja) | 高速の微生物検出および抗菌剤感受性試験 | |
| WO2006047038A1 (en) | Apparatus and method for cell migration assays | |
| JP2021104056A (ja) | 生物学的実体におけるコンホメーションのハイスループット分析のためのシステムおよび方法 | |
| CN108593944A (zh) | 一种液滴芯片免疫分析系统及其分析方法 | |
| CN108291909A (zh) | 分析物检测及其方法 | |
| JP2004271337A (ja) | 表面プラズモン共鳴現象を利用した細胞の多検体同時解析装置 | |
| US20120058507A1 (en) | Clonal Derivation and Cell Culture quality Control Screening Methods | |
| CN114317669A (zh) | 一种基于细胞内蛋白激酶c激活状态筛选药物的方法及高通量筛选装置 | |
| JP2006214880A (ja) | 平板型セル | |
| WO2004015061A2 (en) | Determination of protein function | |
| JPH11504507A (ja) | 生物学的に活性な基質を、生きている細胞に関するこれらの影響によって同定するための方法 | |
| CN112945919A (zh) | 一种病毒中和抗体的检测方法、系统及其应用 | |
| JP2004271336A (ja) | 細胞に発現する表面抗原を迅速に同定するための分析方法 | |
| JP2023539473A (ja) | 粒子運動を用いたバイオセンサ | |
| EP1974211B1 (en) | Molecular identification through membrane-engineered cells | |
| AU2012241186A1 (en) | Sensitive and rapid biodetection |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20220706 Address after: 100871 No. 5, the Summer Palace Road, Beijing, Haidian District Applicant after: Peking University Address before: 100871 No. 5, the Summer Palace Road, Beijing, Haidian District Applicant before: Peking University Applicant before: Zhu Xianwei |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |