JP2017044939A - 光規制器具および撮像方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】撮像装置に平行光を生成する機能を必要とせず、より簡便に平行光照明下で撮像を行うことを可能とする技術を提供する。
【解決手段】拡散光L1を出射する照明部12と、ウェルWに撮像対象物である生試料を担持するウェルプレートWPとの間に、上下方向に貫通する多数の微小な貫通孔を有する規制プレート2を載置した状態で撮像を行う。貫通孔の内壁面は黒化処理されて光の反射率が低く抑えられており、規制プレート2に対し小さな入射角で入射した光のみがウェルWに照射されることで、コントラストの良好な画像が得られる。
【選択図】図1

Description

この発明は、試料容器に担持された生試料を照明下で撮像する技術に関するものであり、特にその照明光を調節する技術に関する。
医療や生化学等の分野では、細胞や細菌等を含む生試料を観察したり分析したりするために、当該生試料を撮像するための装置が実用化されている。例えば特許文献1に記載の撮像装置では、ウェルプレートと称される試料容器に担持されるスフェロイド(細胞集塊)に対し照明光としての白色拡散光を上方から入射させ、下方へ透過してくる光を受光することで、撮像対象である生試料としてのスフェロイドの撮像が行われる。
特開2015−118036号公報(例えば、段落0025)
生試料として、例えば容器の底面に沿って二次元的な広がりを有する細胞または細胞コロニーを撮像対象物とするものが用いられる場合がある。この場合、細胞が透明に近いため、拡散光による照明下では十分なコントラストが得られないことがある。このような生試料については、平行光による照明下で撮像を行うことでコントラストの改善が図れることがわかっている。
一方、このような撮像装置において、照明光として拡散光を必要とするケースも依然として多い。したがって、照明光源を拡散光と平行光とで切り替えることができれば便宜である。しかしながら、拡散光源と比較して平行光源は概して装置構成が複雑である。また適切な照明方法を選択するには光学的な知識が必要であり、不慣れなユーザが所望する画像品質を得るのに手間取ってしまうという問題も生じ得る。そこで、平行光を生成する機能を撮像装置に付加しなくても、より簡便に平行光照明下での撮像を行うことのできる技術が求められる。
この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、撮像装置に平行光を生成する機能を必要とせず、より簡便に平行光照明下で撮像を行うことを可能とする技術を提供することを目的とする。
この発明の一の態様は、生試料を担持する試料容器に載置可能な平板形状を有し、一方主面側から入射する光のうち入射角が所定角度以下のものを他方主面側に通過させ、入射角が前記所定角度より大きいものを遮光することで前記他方主面側から出射される光を略平行光とする光規制器具であって、上記目的を達成するため、前記一方主面側から前記他方主面側に貫通する複数の貫通孔が前記一方主面に沿って二次元的に近接配列された隔壁形成部材を備え、前記貫通孔の各々は、前記一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有し、その内部が前記隔壁形成部材により互いに離隔された導光路となっており、前記隔壁形成部材のうち前記導光路に臨む表面が光吸収性を有し、前記導光路の断面における最大の開口幅をD、前記導光路の前記法線方向の長さをL、前記所定角度をθとしたとき、下式:
tanθ=D/L
の関係が満たされる。
このように構成された発明では、光規制器具の一方主面側から入射する光のうち入射角が比較的大きい成分は隔壁形成部材により吸収され、他方主面側からは進行方向が規制された平行光に近い光が出射される。そして、この光規制器具は試料容器に載置可能な平板状に形成されている。そのため、試料容器に光規制器具を載置することにより、既存の撮像装置や試料容器に何ら変更を加えることなく、平行光照明下での生試料の撮像を行うことが可能である。
また、この発明の他の態様は、生試料を担持する試料容器を水平に支持し、その上方に照明光源を、下方に撮像手段をそれぞれ配置し、上記構成の光規制器具を、前記一方主面側を前記照明光源に向けて前記照明光源と前記試料容器との間に配置し、前記照明光源からの光を、前記光規制器具を介して前記試料容器に入射させ、前記試料容器の下方に透過する光を前記撮像手段で受光することで、前記生試料を撮像する撮像方法である。
このように構成された発明では、試料容器に担持された生試料に対し、光規制器具を介して略平行光とされた照明光が入射する。このため、試料容器内で二次元的に分布する細胞等の生試料を良好なコントラストで撮像することが可能である。また、照明光源は例えば一般的な拡散光源であってもよく、照明光源や撮像手段に改変を加える必要がないため、撮像コストの上昇を抑えることができ、不適切な照明による撮像の失敗も回避することができる。
上記のように、本発明によれば、光規制器具を用いることで出射光の方向が規制された照明光が得られるので、撮像装置に平行光を生成する機能を必要とせず、より簡便に平行光照明下での撮像を行うことができる。
この発明にかかる撮像方法の一実施形態を示す図である。 撮像対象物と照明光源との組み合わせを例示する図である。 規制プレートの構造を示す斜視図である。 規制プレートの側面断面図である。 有孔パネルの作用を説明する図である。 貫通孔の断面形状の各種の例を示す図である。 規制プレートの寸法関係を考察するための図である。 規制プレートの効果の一例を示す図である。
図1はこの発明にかかる撮像方法の一実施形態を示す図である。この撮像方法では、ウェルプレートWPの上面に形成されたウェルWと称される窪部に注入された液体中で培養される細胞等の生試料が、撮像装置1により撮像される。このとき、ウェルプレートWPの上部に規制プレート2が載置された状態で撮像が行われることが、本発明にかかる撮像方法の特徴の1つである。ここではまず、規制プレート2を用いない一般的な撮像方法について説明する。図1において、XY平面は水平面、Z軸は鉛直軸を表す。より詳しくは、(+Z)方向が鉛直上向き方向を表している。
ウェルプレートWPは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものであり、平板状のプレートの上面に、断面が略円形の筒状に形成され底面が透明で略平坦なウェルWが複数設けられている。1つのウェルプレートWPにおけるウェルWの数は任意であるが、例えば96個(12×8のマトリクス配列)のものを用いることができる。各ウェルWの直径および深さは代表的には数mm程度である。なお、この撮像装置1が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの数はこれらに限定されるものではなく任意であり、例えば12ないし384穴のものが一般的に使用されている。また、複数ウェルを有するウェルプレートに限らず、例えばディッシュと呼ばれる平型の容器で培養された生試料の撮像にも、この撮像装置1を使用することが可能である。
ウェルプレートWPの各ウェルWには、培地としての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞が、この撮像装置1の撮像対象となる。培地は適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルWに投入された後ゲル化するものであってもよい。後述するように、この撮像装置1では、例えばウェルWの内底面で培養されたスフェロイドを撮像対象とすることができる。常用される一般的な液量は、50ないし200マイクロリットル程度である。
なお、ウェルW内で培養され撮像対象となる生試料としては、孤立した細胞、多数の細胞が培地内で二次元的に広がるように分布した細胞コロニー、細胞が培地内で三次元的に集まってなるスフェロイド(細胞集塊)などを適用可能である。また、撮像装置1を用いて、細菌や生体組織などの生試料を撮像することも可能である。以下、撮像対象物となるこれらを総称して「細胞等」という。
撮像装置1は、細胞等を培地とともに各ウェルWに担持するウェルプレートWPの下面周縁部に当接してウェルプレートWPを略水平姿勢に保持するホルダ11と、ホルダ11の上方に配置される照明部12と、ホルダ11の下方に配置される撮像部13と、これら各部の動作を制御するCPU141を有する制御部14とを備えている。
照明部12は、ホルダ11により保持されたウェルプレートWPに向けて適宜の照明光(例えば白色光)を出射する。より具体的には、例えば光源としての白色LED(Light Emitting Diode)光源と拡散板とを組み合わせたものを、照明部12として用いることができる。照明部12下部の光出射面は、ウェルプレートWP上面よりも大きな平面サイズを有し、ウェルプレートWP上面のうちウェルWが形成された領域の全体を覆うように設けられる。このような構成では、照明部12下部の各部から種々の方向に出射される拡散光L1により、ウェルプレートWPに設けられた各ウェルW内の細胞等が上方から均一に照明される。
ホルダ11により保持されたウェルプレートWPの下方に、撮像部13が設けられる。撮像部13には、ウェルプレートWPの直下位置に図示を省略する撮像光学系が配置されており、撮像光学系の光軸は鉛直方向(Z方向)に向けられている。
撮像部13により、ウェルW内の生試料が撮像される。具体的には、照明部12から出射されウェルWの上方から培地Mに入射した光が撮像対象物である細胞等を照明し、ウェルW底面から下方へ透過した光が、撮像光学系を介して図示しない撮像素子の受光面に入射する。撮像光学系により撮像素子の受光面に結像する撮像対象物の像が、撮像素子により撮像される。撮像素子としては例えばCCDセンサまたはCMOSセンサを用いることができ、二次元イメージセンサおよび一次元イメージセンサのいずれであってもよい。
撮像部13は、制御部14に設けられたメカ制御部146によりXYZ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ制御部146が、CPU141からの制御指令に基づき、撮像部13をX方向およびY方向に移動させることにより、撮像部13がウェルWに対し水平方向に移動する。またZ方向への移動によりフォーカス調整がなされる。1つのウェルW内の撮像対象物が撮像されるときには、メカ制御部146は、光軸が当該ウェルWの中心と一致するように、撮像部13を水平方向に位置決めする。撮像部13の撮像素子が一次元イメージセンサである場合には、イメージセンサの長手方向と直交する方向に撮像部13を走査させることにより二次元画像を撮像することができる。このような撮像方法では、撮像対象である細胞等に対し非接触、非破壊かつ非侵襲で撮像を行うことができ、撮像による細胞等へのダメージを抑えることができる。
撮像部13の撮像素子から出力される画像信号は、制御部14に送られる。すなわち、画像信号は制御部14に設けられたADコンバータ(A/D)143に入力されてデジタル画像データに変換される。CPU141は、受信した画像データに基づき適宜画像処理を実行する。制御部14はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ144と、CPU141が実行すべきプログラムやCPU141により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ145とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。CPU141は、メモリ145に記憶された制御プログラムを実行することにより、後述する各種の演算処理を行う。
その他に、制御部14には、インターフェース(IF)部142が設けられている。インターフェース部142は、ユーザからの操作入力の受け付けや、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。なお、制御部14は、上記したハードウェアを備えた専用装置であってもよく、またパーソナルコンピュータやワークステーション等の汎用処理装置に、後述する処理機能を実現するための制御プログラムを組み込んだものであってもよい。すなわち、この撮像装置1の制御部14として、汎用のコンピュータ装置を利用することが可能である。汎用処理装置を用いる場合、撮像装置1には、撮像部13等の各部を動作させるために必要最小限の制御機能が備わっていれば足りる。
図2は撮像対象物と照明光源との組み合わせを例示する図である。ウェルW内の撮像対象物が、図2(a)に示すように培地M内で立体的な形状を有する例えばスフェロイドSである場合、照明部12から出射される拡散光L1が入射することで、スフェロイドSの表面の広い範囲が効果的に照明される。このため、コントラストの良好な画像を撮像することが可能である。
これに対して、図2(b)に示すように、撮像対象物がウェルWの内底面Wbに沿って培地M内で二次元的に薄く広がる細胞(または細胞コロニー)Cである場合、細胞自体が透明に近いことから、高いコントラストを得にくい。細胞Cの周縁部があたかもレンズのように作用することで出射光の方向が変化するという現象があるが、拡散光による照明下ではこのような光を選択的に検出することは難しい。このような場合には、図2(c)に示すように平行光に近い照明光L2がより好ましい。照明光L2は細胞Cの周縁部で屈折するため、撮像された画像では細胞Cの周縁部が他の領域よりも低輝度となり、細胞Cの輪郭がより明瞭に現れる。
細胞等の表面や内部のテクスチャを詳細に観察するという目的とは別に、ウェルW内に分布する細胞等のサイズや個数を高速に自動計測するという用途のために撮像が行われる場合がある。特にこのような用途においては、細胞等の輪郭部分が周囲の背景部分と明瞭に異なる輝度で表現された画像が有用である。
このように、照明方法は撮像対象物や撮像の目的によって使い分ける必要があり、撮像装置1としては、照明部12から出射される照明光が撮像対象物によって拡散光と平行光とで切り替え可能であることが望ましい。しかしながら、撮像装置1に2種類の光源を設ける、あるいは拡散光から擬似的に平行光を生成するための機構を設けることは装置構成の大型化・複雑化を招き、撮像コストの上昇理由ともなり得る。また、撮像対象物とのマッチングに適さない照明が使用された結果、所望の画像品質が得られないという失敗の原因にもなり得る。
そこで、この発明にかかる撮像方法では、撮像装置1には拡散光を出射する照明部12のみが設けられる。そして、照明光として平行光が必要な場合には、次に説明する規制プレート2がウェルプレートWPの上部に載置されることにより、ウェルW内の撮像対象物に略平行光である照明光L2が入射するようにする。すなわち、規制プレート2は、照明部12から出射される拡散光のうち上面への入射角が所定角度以下の光成分を下面側へ通過させる一方、入射角が所定角度より大きい非平行な成分の通過を規制する機能を有する。規制プレート2の下面からは、進行方向が規制された、より具体的には撮像部13の撮像方向(Z方向)に対し傾きが所定角度以下の進行方向を有する略平行な光が出射され、各ウェルWに入射する。
図3は規制プレートの構造を示す斜視図である。また、図4は規制プレートの側面断面図である。より詳しくは、図4(a)は図3の切断面Aにおいて規制プレート2の断面を見たときの分解組立図であり、図4(b)は規制プレート2がウェルプレートWPに載置された状態を示す断面図である。
規制プレート2の主要部は、ウェルプレートWPの上面のうちウェルWが配置された領域Rwの全体を覆う平面サイズを有する有孔パネル21である。有孔パネル21は、両主面21a,21bが平行な平板状の外形を有しており、一方主面21a側から他方主面21b側へこれらの主面に対し垂直な、つまりこれらの主面の法線に平行な方向に貫通する貫通孔21cが多数設けられている。貫通孔21cの配列は、主面に沿った方向に二次元的かつ規則的となっている。図3右上の円内は有孔パネル21の一方主面21aの部分拡大図であり、同図に示すように各貫通孔21cは六角形断面を有し、有孔パネル21はいわゆるハニカム構造となっている。このような構造では、軽量で比較的高い強度が得られる。
なお、以下の説明では、有孔パネル21の両主面のうち、ウェルプレートWP上に載置された時に照明部12と対向することとなる上側の一方主面21aを「上面」、ウェルプレートWPの上面と接する下側の他方主面21bを「下面」と称することがある。規制プレート21自体は、以下に説明するように表裏の区別のない構造となっており、上下を入れ替えても同じように機能する。
有孔パネル21は、外形が矩形で内部に矩形の開口が設けられた額縁状のフレーム22に収められており、フレーム22により有孔パネル21の側面が保護される。また、有孔パネル21を挟むように、透明材料、例えばアクリル樹脂により形成された薄板状で互いに同一形状のカバー部材22,23がフレーム22にはめ込まれている。有孔パネル21の上面21aおよび下面21bは、これらのカバー部材23,24により覆われることで保護される。なお、カバー部材は有孔パネル21の上面21a側および下面21b側のいずれか一方のみに設けられてもよい。
このように、有孔パネル21の上面21aおよび下面21bがカバー部材23,24によって保護され、有孔パネル21の側面がフレーム22によって保護される構造となっているため、有孔パネル21自体には機械的強度がさほど必要とされない。したがって、有孔パネル21としては、例えば帯状の金属箔(例えばアルミニウム箔)を多数重ねてそれらを部分的に接合し、それを重畳方向に広げてなる構造のハニカムパネルを用いることができる。この場合、帯状金属箔の幅が貫通孔21cの深さとなる。このような構造のハニカムパネルは各種サイズのものが既に製品化されている。
上記各部材が組み合わされた構造を有する規制プレート2は、図4(b)に示すように、ウェルプレートWPの上面にカバー部材24の下面が接した状態で、有孔パネル21の上面21aを上向きにして水平姿勢でウェルプレートWP上に載置される。したがって、有孔パネル21に設けられた各貫通孔21cの軸方向は鉛直方向(Z方向)となる。
ウェルプレートWP上面のうちウェルWが配置された領域Rwの全体が有孔パネル21に覆われるように、規制プレート2が載置される必要がある。この目的のために、規制プレート2の上面側および下面側の少なくとも一方に、ウェルプレートWPと係合することでウェルプレートWPとの間で位置決めを行う係合部位が設けられてもよい。規制プレート2の上面側および下面側の両側に係合部位が設けられた場合、規制プレート2の上下の区別は不要である。
図5は有孔パネルの作用を説明する図である。上記したように、有孔パネル21は一方主面(上面)21aから他方主面(下面)21bに、両主面の双方にほぼ垂直に貫通する貫通孔21cを多数有している。各貫通孔21cの断面形状は、一方主面から他方主面に向かう貫通孔の軸方向(Z方向)において一定である。個々の貫通孔21cの作用に着目すると、図5(a)に示すように、貫通孔21cには、上面21aに対向配置される照明部12から種々の方向の成分La,Lb,Lcを有する拡散光L1が入射する。
一点鎖線で示される貫通孔21cの軸方向(Z方向)に対し平行または極めて小さい傾きで入射する、入射角度の小さい光成分Laは、貫通孔21内を直進して下面21b側の開口から下向きまたは略下向きに出射される。一方、入射角の十分大きい光成分Lcは、貫通孔21cの上面21a側開口から入射して貫通孔21cの内壁面に入射する。
このように入射角の大きい光成分を除去するために、有孔パネル21では、貫通孔21cの内壁面が黒化処理または黒色に塗装されている。したがって、貫通孔21cの内壁面は光吸収性を有し、壁面での反射率が極めて低くなっている。そのため、大きい入射角で貫通孔21cに入射した光は内壁面によって吸収され、下面21b側開口からはほとんど出射されない。
上面21a側から貫通孔21cに入射し、側壁面に吸収されることなく下面21b側から出射される光成分のうち最も大きな傾きを有する光成分Lbの入射角θは、貫通孔21cの開口幅Dと軸方向長さ(すなわち有孔パネル21の厚さ)Lとに依存し、図5(a)から明らかなように下式:
tanθ=D/L … (式1)
により表される。すなわち、貫通孔21cの開口幅Dおよび軸方向長さLを適宜に選択することにより、貫通孔21c内で吸収されることなく規制プレート2の下面から出射される光の最大入射角θを調整することが可能である。
有孔パネル21の下面21bから出射される光は、貫通孔21cの軸方向であるZ方向、つまり鉛直方向からの傾き角が上記角度θ以下である成分のみを含むものである。貫通孔21cの開口幅Dを十分小さく、かつ軸方向長さLを十分大きくすることにより、図5(b)に示すように、規制プレート2は、照明部12から照射される拡散光L1から略平行な照明光L2を生成してウェルプレートWPを照明することが可能となる。(式1)の右辺は、照明部12および規制プレート2を含む照明系のNA(開口数)の概数を表している。より厳密には、NAは下式:
NA=D/{L+(D/2)1/2 … (式2)
により表され、L≫Dであれば近似的に(D/L)と表すことができる。このように、貫通孔21cの開口幅Dおよび軸方向長さLの設定により、出射光のNAを制御することが可能である。
なお、光の進行方向を制御する目的でハニカム構造のパネルを使用する例は従来から知られている。例えば一般的な撮像技術においては、照明光源の前面に「ハニカムグリッド」と称される器具を配置することで照明範囲を制限することが行われている。このような器具は、広角に出射される照明光をより狭い範囲に集中させるためのものである。したがって、光パワーを有効に活用することができるように貫通孔の内壁面が反射性となっている。そのため、図5(c)に比較例として示すように、ハニカムグリッドGの貫通孔G1の一方側開口に比較的大きな入射角で入射した光L3は、貫通孔内部で反射して他方側開口から出射される。すなわち、このような器具と、拡散光から撮像方向に非平行な光成分を除去し略平行光を生成する規制プレート2とは目的が異なるものである。
図6は貫通孔の断面形状の各種の例を示す図である。上記した有孔パネル21はハニカムパネルであり、各貫通孔21cの断面および開口形状は、図6(a)に示すように六角形である。この場合、断面は正六角形である必要はないが、対辺が平行な六角形とすることで、同一形状の貫通孔21cを隙間なく配置することができる。隣接する貫通孔21cを隔てる隔壁部分の上面に当たった光は下面側に通過せず損失となるため、隔壁はできるだけ薄いことが好ましい。この点からも、帯状の箔により形成されたハニカム構造が好適であると言える。
この他に、図6(b)に示すように帯状部材が格子状に組み合わされて矩形の断面を有する貫通孔21d、図6(c)に示すように帯状部材が互いに異なる3種類の角度で組み合わされた三角形断面を有する貫通孔21e、平らな帯状部材と周期的な波型の帯状部材とが組み合わされた図6(d)に示す形状の貫通孔21f、周期的な波型の帯状部材同士が逆位相で組み合わされた図6(e)に示す形状の貫通孔21gなど、種々の断面形状を有する貫通孔を有する有孔パネルを使用可能である。貫通孔の断面形状が上記したものである有孔パネルは、工業的生産が比較的容易と考えられるものである。
また、図6(f)に示すように、平板状の部材に多数の貫通孔21hが穿設された構造の有孔パネルであってもよい。この場合、光の損失を抑えるために、隣接する貫通孔21h間の間隔はできるだけ小さいことが望ましい。すなわち、有孔パネルの表面積に対して開口面積の占める割合(開口率)が100%にできるだけ近いことが望ましい。
なお、(式1)への開口幅Dの適用に当たって、貫通孔の断面形状が円形である場合には当該円の直径を開口幅Dとすることができる。一方、断面形状が円形でない場合には、開口内に引ける線分のうち長さが最大となる(例えば矩形の場合は対角線)ものの長さを、照明の最大照明角度を与える開口幅Dと見なすことができる。
また、複数の貫通孔の間において断面形状や断面サイズが互いに同一でなくても、上記した照明光の方向規制効果はある程度期待できる。しかしながら、ウェルWの各部に均一な照明光を入射させるためには、各貫通孔の断面の形状およびサイズを互いに同一としておくことがより好ましい。
図7は規制プレートの寸法関係を考察するための図である。より具体的には、図7(a)は、薄い細胞を撮像するときの照明系のNAと画像コントラストとの関係を示す図であり、図7(b)は好ましい寸法関係を説明するための図である。図2(b)に示すように二次元的に広がる薄い細胞Cを撮像対象とするとき、図7(a)に示すように、照明系のNAの逆数(1/NA)が小さいとき得られるコントラストが低く、NAの逆数(1/NA)が大きくなるとコントラストは大きくなるが、最終的にはコントラストの上昇は飽和する。
このことから、NAの大きい拡散光での照明では高いコントラストが得られず、より平行光に近い照明が求められるが、極端に高精度な平行光を必要とするものでもないことがわかる。図7(a)に示すように、コントラストの上昇が鈍る点Qに対応するNAが得られるように、規制プレート2各部の寸法が設定されることが現実的である。あるいは、必要とされるコントラスト値に対応するNAとなるような寸法関係が採用されてもよい。
図7(b)にはウェルWにおいて均一な照明条件を得るために必要な寸法関係が示されている。ここでは、細胞等が付着するウェルWの内底面Wbにおいて照度分布が一定となるような関係を求める。図において点線で示されるように、照明部12から出射された光のうち有孔パネル21の上面21aに対する入射角が所定角度θ以下のものがウェル内底面Wbに入射する。1つの貫通孔21cを通過する光の光量分布は、一点鎖線で示される当該貫通孔21cの中心軸を中心とする山型の分布を有する。近接配置された複数の貫通孔21cによる光量分布が部分的に重なることにより、それらが合成されてなる照度分布は均一なものに近づく。
符号Tは有孔パネル21の下面21bから細胞等が存在するウェル内底面Wbまでの距離であり、規制プレート2がウェルプレートWPに載置される場合にはウェルWの深さに下面側カバー部材24の厚さを加えたものに相当する。下面側カバー部材24がない構成においては、ウェルWの深さと等しい。この距離Tが小さい場合、あるいは照明系のNA(≒D/L)が小さい場合には、近接する貫通孔21c間での光量分布の重なりが小さく、照度分布の均一性が損なわれる。
例えば個々の貫通孔21cからの出射光の光量分布が貫通孔21cの配列ピッチPの2倍以上であれば、光量分布の重なりによる照度分布をほぼ均一とすることができる。このための条件は、図7(b)より、下式:
P≦D(1/2+T/L)≒L・NA(1/2+T/L)=NA(L/2+T)
… (式3)
により表すことができる。ある貫通孔と、それに隣接する貫通孔のうち中心間の距離が最大のものとの間の距離が、(式3)における配列ピッチPとなる。六角形の貫通孔21cでは、1つの貫通孔とこれに隣接する6つの六角形との中心間距離は同一であり、この距離が配列ピッチPである。また、矩形の貫通孔21dでは、1つの矩形を取り囲む8つの矩形のうち、当該矩形と頂点が接する斜め方向位置にある矩形との中心間距離が、配列ピッチPであり、それらの中心を結ぶ線分と平行な方向(すなわち対角線の方向)の開口幅が、(式3)における開口幅Dである。
例えば、有孔パネル21の厚さLが7mm、ウェル内底面Wbまでの距離Tが10mmである場合、NA=0.1に相当する画像コントラストを得ようとすると、貫通孔21cの開口幅Dを0.7mm、その配列ピッチPを1.35mm以下とすればよい。言い換えれば、このような寸法関係を有する規制プレート2を用いることで、NA=0.1相当のコントラストを有する画像をよりNAの大きい拡散光源を用いて撮像することが可能である。各部の寸法が異なる規制プレートを複数種用意しておけば、用途に応じて適宜選択して使用することが可能になる。
また、既存の規制プレート2を用いて撮像対象物側から見た照明のNAを変化させたい場合には、規制プレート2とウェルプレートWPとの距離を調整すればよい。このように、規制プレート2を撮像装置1の構成部品とせず、小型かつ軽量な可般部材として構成することにより、簡単な構成で照明のNAを調節して、画像品質の良好な画像を得ることが可能である。
図8は規制プレートの効果の一例を示す図である。発明者は、照明部12として拡散光源を有する撮像装置1を用い、ウェルW内底面に細胞等が薄く分布する同一の生試料を撮像して規制プレート2の有無による違いを検証した。図において上段の2つの画像はウェルWの全体を撮像した画像であり、下段の2つの画像はその部分拡大図である。また、左欄の2つの画像は規制プレート2を用いずに撮像された画像であり、右欄の2つの画像はウェルプレートWP上に規制プレート2が載置された状態で撮像された画像である。
実験に用いられた規制プレート2は、セルサイズ(図6(a)に示す寸法Sc)0.7mm、厚さ7mmのハニカムパネルを有孔パネル21としたものである。
図からわかるように、規制プレート2を用いずに撮像された画像では細胞等の存在する部分と背景部分とで濃淡の差が少なく、細胞等の輪郭が不明瞭である。これに対し、規制プレート2を用いて撮像された画像では、画像全体の明るさはやや低下しているものの、細胞等に対応する部分と背景部分とで濃淡の差がより顕著となっており、細胞等の個数、大きさ、位置等を計測するのに好適な画像となっていることがわかる。
以上のように、この実施形態の撮像方法では、照明光源として拡散光源を有する撮像装置1を用いて、照明部12と生試料を担持するウェルプレートWPとの間に、通過する光の方向を規制する規制プレート2を配置した状態で撮像が行われる。規制プレート2は入射する拡散光から略平行な光成分のみを選択的に通過させる機能を有しており、撮像装置1の構成部品ではなく、ウェルプレートWPと同程度のサイズの小型かつ軽量な独立した部材として構成されている。規制プレート2をウェルプレートWPに載置するだけで、必要なコントラストを得るための平行光に近い照明光が得られるので、装置に新たな構成を付加することなく、簡便な構成で平行光照明下での撮像を行うことが可能となっている。
また、規制プレート2は撮像装置1に取り付けるものではなく、該装置に対しウェルプレートWPとともに搬入・搬出されるものである。したがって、規制プレート2を必要としない試料に対し誤って規制プレート2が適用されることに起因する撮像の失敗が回避される。
以上説明したように、上記実施形態においては、規制プレート2が本発明の「光規制器具」に相当しており、有孔パネル21が本発明の「隔壁形成部材」として機能している。また、貫通孔21の側壁面により囲まれた中空部分の空間が本発明の「導光路」に相当している。また、フレーム22が本発明の「フレーム部材」に、カバー部材23,24が本発明の「カバー部材」に、それぞれ相当している。また、上記した撮像装置1においては、照明部12および撮像部13がそれぞれ本発明の「照明光源」および「撮像手段」として機能している。また、上記実施形態では、ウェルプレートWPが本発明の「試料容器」に相当している。
なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記した規制プレート2は、有孔パネル21を破損や埃の侵入等から保護するために、フレーム21およびカバー部材23,24により囲まれた空間内に有孔パネル21を収容している。しかしながら、照明の制御という機能に対してはフレーム21およびカバー部材23,24は必須の構成というわけではない。
例えば、上記実施形態では中空である貫通孔の内部を、照明光に対して透明な材料(例えばアクリル樹脂やポリカーボネート樹脂)で充填した構成とすることもできる。このような構成では、貫通孔が中実となることで有孔パネル自体に必要十分な強度を持たせることが可能となり、フレームおよびカバー部材のいずれかまたは両方を省くことが可能となる。
また、上記実施形態では有孔パネル21として金属箔により形成されたハニカムパネルが用いられているが、有孔パネルの材料はこれに限定されず、例えば紙やアラミド樹脂などを素材として形成されたハニカムパネルを用いることが可能である。この場合でも、例えば黒色の塗装や染色により、素材の表面は光の反射率が小さく抑えられていることが好ましい。
また、上記実施形態の規制プレート2はウェルプレートWPの上部に載置されることが前提となっているが、規制プレートからウェル内底面までの距離を調節するために、規制プレート2とウェルプレートWPとの間に挟み込むスペーサ部材が別途用意されていてもよい。このような構成では、スペーサ部材を使用することで照明系のNAを所定範囲内で変化させることが可能となり、画像品質の微調整が容易となる。
以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、この発明にかかる光規制器具では、例えば、隔壁形成部材のうち一方主面側および他方主面側の少なくとも一方の表面が、透明で平板状のカバー部材により覆われていてもよい。このような構成では、隔壁形成部材により奏される光学的効果を損なうことなく、隔壁形成部材を損傷や埃から保護することが可能となる。これにより、光規制器具の取扱いが容易となる。
また例えば、カバー部材に代えて、あるいはこれに加えて、隔壁形成部材の側面を覆うフレーム部材が設けられてもよい。こうすることによっても、隔壁形成部材を機械的に保護することが可能となる。そのため、隔壁形成部材として強度の低い部材を用いることも可能になる。
また例えば、貫通孔の内部に透明な固体が充填されていてもよい。このような構成では、貫通孔の内部が中実となっていることで機械的損傷や不透明な埃等による目詰まりが未然に防止されており、光規制器具の取扱いがより簡単となる。
また例えば、複数の貫通孔におけるそれぞれの断面形状が互いに同一であってもよい。このような構成では、各貫通孔を通過する光が貫通孔間で一様となるため、均一な照度分布を得やすくなる。
また、貫通孔の断面形状は任意であるが、例えば多角形、特に平行な対辺を有する六角形となるようにすると、工業的に生産が容易であるため、製造コストを低く抑えることが可能となる。例えば、貫通孔の長さと同じ幅を有する複数の帯状部材が部分的に接合されてなるものをその積層方向に広げることによって、上記のような開口形状を有するパネル体を製造する技術が実用化されており、これを利用することができる。
この場合の帯状部材は、例えば表面を黒化された金属箔とすることができる。表面が黒化処理されることにより、貫通孔の側壁面での光の反射を抑え、一方主面側に大きな入射角で入射した光が貫通孔を通過し他方主面側から出射されるのを抑制することができる。
また、本発明にかかる撮像方法においては、例えば光規制器具が、試料容器の上面に載置されてもよい。このような構成では、光規制器具を保持するための部材や機構を別途設ける必要がなく、また貫通孔から撮像対象物である生試料までの距離を容易に確定させることができる。また、照明光源から遠く、生試料に近い位置に光規制器具が配置されることで、貫通孔から出射された光が容器内での反射等により再び拡散光としての性質を帯びるのを抑制することができる。
また例えば、光規制器具において複数の貫通孔が一定ピッチPで配列されており、光規制器具の他方主面から試料容器の内底面までの距離をTとするとき、下式:
P≦D・(1/2+T/L)
の関係が満たされるような各部の寸法関係とされてもよい。このような構成では、近接配置された貫通孔から出射される光の分布が互いに重なり合うことで、均一に近い照明条件を実現することができる。
また例えば、照明光源は、下向きに拡散光を出射するように構成されてもよい。生試料を撮像する装置における照明光源として、拡散光源は比較的簡単な構成および低コストで実現可能なものであり、本発明の光規制器具は、簡単な構成で拡散光から略平行な照明光を生成することができるものである。これらを組み合わせることで、撮像コストを抑えつつ、所望の品質の画像を得ることが可能となる。
本発明は、例えば培地中で二次元培養された細胞または細胞コロニーのように、拡散光照明下では十分なコントラストを得ることができない試料を、照明光として拡散光源を有する撮像装置で撮像する場合に好適である。
1 撮像装置
2 規制プレート(光規制器具)
12 照明部(照明光源)
13 撮像部(撮像手段)
21 有孔パネル(隔壁形成部材)
21a (有孔パネルの)一方主面
21b (有孔パネルの)他方主面
21c 貫通孔
22 フレーム(フレーム部材)
23,24 カバー部材
W ウェル
WP ウェルプレート(試料容器)

Claims (13)

  1. 生試料を担持する試料容器に載置可能な平板形状を有し、一方主面側から入射する光のうち入射角が所定角度以下のものを他方主面側に通過させ、入射角が前記所定角度より大きいものを遮光することで前記他方主面側から出射される光を略平行光とする光規制器具であって、
    前記一方主面側から前記他方主面側に貫通する複数の貫通孔が前記一方主面に沿って二次元的に近接配列された隔壁形成部材を備え、
    前記貫通孔の各々は、前記一方主面の法線方向に沿って一様な断面形状を有し、その内部が前記隔壁形成部材により互いに離隔された導光路となっており、
    前記隔壁形成部材のうち前記導光路に臨む表面が光吸収性を有し、
    前記導光路の断面における最大の開口幅をD、前記導光路の前記法線方向の長さをL、前記所定角度をθとしたとき、下式:
    tanθ=D/L
    の関係が満たされる光規制器具。
  2. 前記隔壁形成部材のうち前記一方主面側および前記他方主面側の少なくとも一方の表面が、透明で平板状のカバー部材により覆われている請求項1に記載の光規制器具。
  3. 前記隔壁形成部材の側面を覆うフレーム部材を備える請求項1または2に記載の光規制器具。
  4. 前記貫通孔の内部に透明な固体が充填された請求項1ないし3のいずれかに記載の光規制器具。
  5. 複数の前記貫通孔におけるそれぞれの断面形状が互いに同一である請求項1ないし4のいずれかに記載の光規制器具。
  6. 前記貫通孔の断面形状が多角形である請求項5に記載の光規制器具。
  7. 前記貫通孔の断面形状が、平行な対辺を有する六角形である請求項6に記載の光規制器具。
  8. 前記隔壁形成部材は、前記法線方向における前記貫通孔の長さと同じ幅を有する複数の帯状部材が部分的に接合されてなる請求項1ないし7のいずれかに記載の光規制器具。
  9. 前記帯状部材は、表面を黒化された金属箔である請求項8に記載の光規制器具。
  10. 生試料を担持する試料容器を水平に支持し、その上方に照明光源を、下方に撮像手段をそれぞれ配置し、
    請求項1ないし9のいずれかに記載の光規制器具を、前記一方主面側を前記照明光源に向けて前記照明光源と前記試料容器との間に配置し、
    前記照明光源からの光を、前記光規制器具を介して前記試料容器に入射させ、前記試料容器の下方に透過する光を前記撮像手段で受光することで、前記生試料を撮像する撮像方法。
  11. 前記光規制器具が、前記試料容器の上面に載置される請求項10に記載の撮像方法。
  12. 前記光規制器具において複数の前記貫通孔が一定ピッチPで配列されており、前記光規制器具の前記他方主面から前記試料容器の内底面までの距離をTとするとき、下式:
    P≦D・(1/2+T/L)
    の関係が満たされる請求項10または11に記載の撮像方法。
  13. 前記照明光源が下向きに拡散光を出射する請求項10ないし12のいずれかに記載の撮像方法。
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