WO2017122401A1 - 撮像装置および撮像方法 - Google Patents

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WO2017122401A1
WO2017122401A1 PCT/JP2016/080362 JP2016080362W WO2017122401A1 WO 2017122401 A1 WO2017122401 A1 WO 2017122401A1 JP 2016080362 W JP2016080362 W JP 2016080362W WO 2017122401 A1 WO2017122401 A1 WO 2017122401A1
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imaging
light
image
cell
imaged
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PCT/JP2016/080362
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Inventor
小林　正嘉
Original Assignee
株式会社Ｓｃｒｅｅｎホールディングス
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G—PHYSICS
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    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
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    • G02B21/06—Means for illuminating specimens
    • G—PHYSICS
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    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
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    • G—PHYSICS
    • G03—PHOTOGRAPHY; CINEMATOGRAPHY; ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ELECTROGRAPHY; HOLOGRAPHY
    • G03B—APPARATUS OR ARRANGEMENTS FOR TAKING PHOTOGRAPHS OR FOR PROJECTING OR VIEWING THEM; APPARATUS OR ARRANGEMENTS EMPLOYING ANALOGOUS TECHNIQUES USING WAVES OTHER THAN OPTICAL WAVES; ACCESSORIES THEREFOR
    • G03B15/00—Special procedures for taking photographs; Apparatus therefor
    • G03B15/02—Illuminating scene
    • H—ELECTRICITY
    • H04—ELECTRIC COMMUNICATION TECHNIQUE
    • H04N—PICTORIAL COMMUNICATION, e.g. TELEVISION
    • H04N23/00—Cameras or camera modules comprising electronic image sensors; Control thereof
    • H04N23/70—Circuitry for compensating brightness variation in the scene
    • H04N23/75—Circuitry for compensating brightness variation in the scene by influencing optical camera components

Definitions

  • the present invention relates to a technique for imaging a raw sample carried on a sample container under illumination, and particularly to the illumination.
  • a light shielding unit in which a light source and a dark part are periodically arranged, and a light shielding part and an opening are provided with a phase opposite to the periodic light source.
  • a combination of lighting is used.
  • light directed directly from the light source to the imaging unit is shielded by the light shielding unit, and only light refracted or scattered by the imaging target is incident on the imaging unit. Is obtained.
  • the periodic pitch of the light source and the light shielding means can be made constant.
  • a telecentric optical system with a wide field of view is not suitable for downsizing and tends to be expensive.
  • a light source and a light shielding means having a non-uniform periodic pitch are required to meet the light condensing characteristic.
  • Imaging in a wide field of view that includes many cells that are imaging objects may be performed for the purpose of measuring the number and size of cells distributed in a sample. In such a case, an image in which the outline of each cell appears more clearly than the internal texture of each individual cell is required.
  • the above prior art is not necessarily suitable for such needs.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object thereof is to provide a technique capable of obtaining an image with a clear outline of an object to be imaged with a simple device configuration.
  • a holding unit that holds a sample container that holds a raw sample that is an object to be imaged, an illuminating unit that illuminates the sample container, and an illuminating unit that emits light.
  • An image sensor that receives transmitted light that passes through the sample container and captures a transmitted image of the object to be imaged, and is disposed between the sample container and the image sensor to couple the transmitted light to the image sensor.
  • an imaging unit having an imaging optical system for imaging.
  • a lighting unit illuminates a sample container carrying a raw sample, which is an object to be imaged, and a light emitted from the lighting unit and transmitted through the sample container.
  • An imaging element that receives transmitted light and captures a transmission image of the object to be imaged, and an imaging optical system that is disposed between the sample container and the imaging element and forms an image of the transmitted light on the imaging element.
  • an imaging unit having a step of acquiring an image of the object to be imaged.
  • the illuminating means are two-dimensionally arranged at a constant arrangement pitch apart from each other along a plane parallel to the focal plane of the imaging optical system, and each emits diffused light toward the sample container.
  • the plane is farther than the range of the depth of field of the imaging optical system when viewed from the imaging unit, and includes the field of view of the imaging unit out of the plane, and more than the field of view.
  • the plurality of light emitting portions are arranged in a wide area. According to such a configuration, it is possible to obtain an image having a good contrast, in particular, a clear outline of the object to be imaged, with a simple device configuration. The reason is as follows.
  • a plurality of light emitting portions arranged at a constant pitch are included in the visual field when the illumination means is viewed from the imaging means. Therefore, the light emitted from the plurality of light emitting portions is directly incident on the imaging element, and the image includes the image of the light emitting portion. Since the plane on which the light emitting part is disposed is farther than the depth of field of the imaging optical system, the image of the light emitting part is defocused in the imaged image. Therefore, if the light emitting part is disposed sufficiently far away, a clear image of the light emitting part does not appear in the image, and only a periodic and moderate brightness variation corresponding to the arrangement pitch of the light emitting parts appears.
  • an object to be imaged such as a cell in a living sample is nearly transparent, but the cell acts like a lens, and in particular, the traveling direction changes due to refraction of light incident on the periphery of the cell. For this reason, when there is no object to be imaged, even if the light is not incident on the image capturing unit, the path may be bent in the direction of entering the image capturing unit by being refracted by the object to be imaged. This tendency is particularly strong at the periphery of the object to be imaged, which selectively brightens the periphery of the object to be imaged.
  • Such a refraction phenomenon occurs even with a general diffuse light source.
  • the entire image becomes bright, and the effect of improving the contrast at the peripheral edge of the cell is limited.
  • diffused light is emitted from each of the discretely arranged light emitting units. This causes periodic brightness fluctuations in the background portion of the object to be imaged. Therefore, the average brightness of the background portion is lower than that in the case of using uniform illumination, that is, illumination in which the light emitting portions are arranged without gaps.
  • the background is brighter than the dark field imaging technique in which direct light is completely blocked or the technique described in Patent Document 1.
  • the contour portion of the object to be imaged is emphasized in the captured image.
  • the resulting image includes an image of the imaged object in which the contour portion is emphasized, and periodic brightness and darkness of the background portion that appears corresponding to the arrangement pitch of the light emitting portions. Since the period of light and dark fluctuations in the background portion is known, it is relatively easy to remove such a spatial frequency component from the image. By subtracting the periodic brightness fluctuations of the background portion from the image, it is possible to obtain an image composed of a background with little luminance change and an image of the object to be imaged in which the contour portion is emphasized.
  • the light amount distribution itself of the light emitted from the object to be imaged is such that the light amount is enhanced at the contour portion of the object to be imaged. Therefore, the same effect can be obtained regardless of the light collection characteristics of the imaging optical system.
  • the object to be imaged is illuminated under illumination by illumination means in which a plurality of light emitting portions that emit diffused light are arranged at a constant pitch along a plane farther than the depth of field of the imaging optical system. Is imaged through. According to such a configuration, it is possible to obtain an image with a clear outline of the object to be imaged while having a simple device configuration.
  • FIG. 1 shows the effect
  • 2nd figure which shows the effect
  • It is a 1st figure which shows distribution of light when a cell exists in the focal plane vicinity.
  • It is a 2nd figure which shows distribution of light when a cell exists in the focal plane vicinity.
  • It is a 1st figure which shows the positional relationship of a point light source and the peripheral part of a cell.
  • FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of an imaging apparatus and an imaging method according to the present invention.
  • a living sample such as cells cultured in a liquid injected into a depression called a well W formed on the upper surface of the well plate WP is imaged by the imaging device 1.
  • the XY plane represents a horizontal plane.
  • the Z axis represents the vertical axis, and more specifically, the ( ⁇ Z) direction represents the vertical downward direction.
  • the well plate WP is generally used in the fields of drug discovery and biological science.
  • the well plate WP is formed in a cylindrical shape with a substantially circular cross section on the top surface of a flat plate, and has a transparent bottom surface and a substantially flat well.
  • a plurality of W are provided.
  • the number of wells W in one well plate WP is arbitrary, for example, 96 (12 ⁇ 8 matrix arrangement) can be used.
  • the diameter and depth of each well W is typically about several mm.
  • the size of the well plate and the number of wells targeted by the imaging apparatus 1 are not limited to these, and are arbitrary. For example, commonly used ones having 12 to 384 holes can be used. .
  • the imaging apparatus 1 can be used not only for the well plate having a plurality of wells but also for imaging a raw sample cultured in, for example, a flat container called a dish.
  • a predetermined amount of a liquid as the medium M is injected into each well W of the well plate WP, and cells cultured in the liquid under a predetermined culture condition become an object to be imaged in the imaging apparatus 1.
  • the medium M may be added with an appropriate reagent, or may be in a liquid state and gelled after being put into the well W.
  • Commonly used liquid volume is about 50 to 200 microliters.
  • the imaging apparatus 1 includes a holder 11 that holds the well plate WP, an illumination unit 12 that is disposed above the holder 11, an imaging unit 13 that is disposed below the holder 11, and a CPU 141 that controls the operations of these units.
  • the control part 14 which has.
  • the holder 11 abuts on the peripheral edge of the lower surface of the well plate WP carrying the cells and the like together with the culture medium M to hold the well plate WP in a substantially horizontal posture.
  • the illumination unit 12 emits illumination light (for example, white light) toward the well plate WP held by the holder 11. More specifically, the illuminating unit 12 includes a surface light source 121 that emits diffused light having a downward direction component, and a light-shielding plate 122 disposed between the surface light source 121 and the well plate WP.
  • the light shielding plate 122 is a flat plate member in which a plurality of openings are two-dimensionally arranged at a constant pitch. Of the diffused light emitted from the surface light source 121, the light component that has passed through the opening of the light shielding plate 122 is irradiated to the well plate WP. In other words, in the illumination unit 12, each of the openings of the light shielding plate 122 emits diffused light toward the well plate WP.
  • An imaging unit 13 is provided below the well plate WP held by the holder 11.
  • an imaging optical system 131 including an objective lens is disposed immediately below the well plate WP, and the optical axis AX of the imaging optical system 131 is oriented in the vertical direction (Z direction).
  • the imaging optical system 131 is typically shown as one objective lens, but may be a combination of a plurality of optical elements such as lenses.
  • the raw sample in the well W is imaged by the imaging unit 13. Specifically, the light emitted from the illumination unit 12 and incident on the culture medium M from above the well W illuminates cells or the like as the object to be imaged, and the light transmitted downward from the bottom surface of the well W passes through the imaging optical system 131. Through the light receiving surface of the image sensor 132. An image of the object to be imaged formed on the light receiving surface of the image sensor 132 by the imaging optical system 131 is captured by the image sensor 132.
  • the image sensor 132 for example, a CCD sensor or a CMOS sensor can be used, and either a two-dimensional image sensor or a one-dimensional image sensor may be used.
  • the imaging unit 13 can be moved in the XYZ directions by a mechanical control unit 146 provided in the control unit 14. Specifically, the mechanical control unit 146 moves the imaging unit 13 in the X direction and the Y direction based on a control command from the CPU 141, so that the imaging unit 13 moves in the horizontal direction with respect to the well W. Further, focus adjustment is performed by moving the imaging unit 13 in the Z direction.
  • the mechanical control unit 146 positions the imaging unit 13 in the horizontal direction at a position directly below the well W to be imaged.
  • the imaging device of the imaging unit 13 is a one-dimensional image sensor, a two-dimensional image can be captured by scanning the imaging unit 13 in a direction orthogonal to the longitudinal direction of the image sensor. In such an imaging method, it is possible to perform non-contact, non-destructive and non-invasive imaging on a cell or the like as an object to be imaged, and damage to the cell or the like due to imaging can be suppressed.
  • the image signal output from the imaging device 132 of the imaging unit 13 is sent to the control unit 14. That is, the image signal is input to an AD converter (A / D) 143 provided in the control unit 14 and converted into digital image data.
  • the CPU 141 executes image processing as appropriate based on the received image data.
  • the control unit 14 further includes an image memory 144 for storing and storing image data, and a memory 145 for storing and storing programs to be executed by the CPU 141 and data generated by the CPU 141. It may be integral.
  • the CPU 141 executes various control processes described later by executing a control program stored in the memory 145.
  • control unit 14 is provided with an interface (IF) unit 142.
  • the interface unit 142 accepts operation input from the user, presents information such as processing results to the user, and exchanges data with an external device connected via a communication line.
  • the control unit 14 may be a dedicated device equipped with the hardware described above, and a control program for realizing processing functions to be described later is incorporated into a general-purpose processing device such as a personal computer or a workstation. It may be. That is, a general-purpose computer device can be used as the control unit 14 of the imaging device 1. In the case of using a general-purpose processing device, it is sufficient that the imaging device 1 has a minimum control function for operating each unit such as the imaging unit 13.
  • FIG. 2 is a diagram showing the configuration of the illumination unit in more detail.
  • the illuminating unit 12 has a structure in which a light shielding plate 122 is disposed close to the lower side of the surface light source 121.
  • the light shielding plate 122 has a structure in which a plurality of openings 122a are provided at a constant pitch in the X direction and the Y direction on a flat plate member made of a light shielding material.
  • the outer size of the light shielding plate 122 is the same as or larger than the planar size of the surface light source 121. In the example shown in FIGS. 1 and 2, there is a gap between the surface light source 121 and the light shielding plate 122, but these may be in close contact with each other.
  • the light shielding plate 122 is preferably detachable from the light source 121.
  • the openings 122a are arranged so that a plurality of openings 122a are included in the X direction and the Y direction in the imaging field of view FV of the imaging unit 13 when the lower surface of the light shielding plate 122 is viewed from the imaging unit 13. In each of the X direction and the Y direction, at least one opening 122a is also provided outside the both ends of the imaging field of view FV. Specific example dimensions will be described later.
  • the light emitted from the surface light source 121 is shielded by the light shielding plate 122, but the light incident on the opening 122a passes through the light shielding plate 122 and is emitted to the well plate WP side.
  • the opening 122a has a function of partially passing light emitted from the surface light source 121, and the light shielding plate may have another structure as long as it has a similar function.
  • a structure in which a transparent window is provided in the opening may be used.
  • a structure may be employed in which a transparent flat plate member is provided with a mask pattern made of a light-shielding material, and transmission portions that allow light to pass through the mask pattern are regularly arranged.
  • the light shielding plate is not limited to a plate-like shape as long as the surface facing the well plate WP and having the openings arranged therein is substantially flat.
  • an opening may be provided on the bottom surface of the case that accommodates the surface light source, and the bottom surface may have a function as a light shielding plate.
  • the lower surface of the light shielding plate 122 functions as a “light emitting surface” that emits illumination light. That is, the openings 122a provided in the light shielding plate 122 at a constant pitch are effective “light emitting portions” for emitting diffused light as illumination light, and each opening 122a is regarded as a pseudo point light source. Can do.
  • the reason for describing “pseudo” is that the aperture 122a has a finite aperture size and is different from an ideal point light source. And such a light emission part is regularly arranged in the lower surface of the light shielding plate 122, and this lower surface becomes a light-projection surface. Therefore, in the following description, the illumination unit 12 may be schematically represented as “a plurality of point light sources arranged in a matrix at a constant pitch on the light exit surface”.
  • FIG. 3A and 3B are diagrams showing the operation of the illumination unit in this embodiment. More specifically, FIG. 3A is a diagram illustrating a positional relationship between the illumination unit 12 and the imaging unit 13. FIG. 3B is a diagram illustrating a light amount distribution of transmitted light received by the imaging unit 13.
  • the illumination unit 12 is represented as a plurality of point light sources 124 arranged on a horizontal light emitting surface 123.
  • the focus of the imaging unit 13 is adjusted to a position where cells or the like as the imaging target are distributed. That is, the focus is adjusted so that the object to be captured is within the depth of field DOF of the imaging optical system 131, and at this time, the focal plane FP of the imaging optical system 131 is approximately near the bottom surface of the well W.
  • the illumination unit 12 is disposed farther than the object to be imaged when viewed from the imaging unit 13, and the light exit surface 123 is sufficiently far from the depth of field DOF of the imaging optical system 131.
  • a plurality of point light sources 124 are arranged in the imaging field FV of the imaging unit 13. For this reason, a part of the emitted light from each point light source 124 is directly incident on the imaging optical system 131 of the imaging unit 13, and the image to be captured includes an image of the point light source 124 in the imaging field of view FV.
  • the image of the point light source 124 is defocused. Therefore, as shown in FIG. 3B, the light incident on the imaging unit 13 has a light amount distribution such that light and dark change gradually with a period corresponding to the arrangement pitch of the point light sources 124.
  • a dotted line indicates a light amount distribution when illuminated by a lighting unit having a surface light source that emits substantially uniform diffused light, that is, an equivalent light source in which point light sources are arranged in close proximity. ing.
  • the light quantity distribution of the light incident on the imaging unit 13 is substantially uniform.
  • the amount of light is small because the light sources are dispersed, and the light amount distribution has a periodic variation spatially.
  • FIG. 4A and 4B are diagrams showing the light distribution when cells are present near the focal plane. More specifically, FIG. 4A is a diagram illustrating an example of a ray diagram at this time, and FIG. 4B is a diagram illustrating a light amount distribution of transmitted light received by the imaging unit 13.
  • Cell C is generally transparent, and the difference between its refractive index and the refractive index of the medium is very small. Therefore, especially in the case of the cell C that spreads thinly along the bottom surface of the well W, the difference in optical density with the background medium is small under diffuse illumination. However, since the curvature of the surface of the cell C is large in the portion corresponding to the peripheral portion when the cell C is viewed from above or from below, the refraction of light is relatively large in this portion.
  • the light incident on the imaging unit 13 from the peripheral edge of the cell C is selectively enhanced, and as a result, the outline of the cell C is brightly emphasized in the captured image. That is, as shown in FIG. 4B, the light received by the imaging unit 13 is locally present at a position corresponding to the peripheral portion of the cell C on the background having the same periodic light amount fluctuation as in the case where no cell exists.
  • the light intensity distribution is a superposition of high light intensity peaks.
  • the illumination unit is a uniform surface light source
  • illumination light is incident on each point on the focal plane FP from various directions, and an image with uniform brightness is obtained. For this reason, the refracted light at the cell periphery is mixed with the background and the effect of enhancing the outline is small.
  • the illumination light is incident from the point light sources 124 scattered on the light emitting surface 123
  • the incident directions of the direct light to each point on the focal plane FP are discrete. Therefore, although the average brightness of the entire image is lower than that of a uniform light source, the increase in the amount of light when the direct light incident on the cell periphery from the point light source 124 is refracted and incident on the imaging unit 13 is further increased. Become prominent. As a result, the contour enhancement effect is also remarkable.
  • the arrangement pitch of the point light sources 124 in the illumination unit 12 will be described.
  • the arrangement pitch of the light sources is larger than the size of the cell or the cell colony that is the object to be captured in the captured image.
  • the actual size of the object to be imaged and the arrangement pitch of the light sources are not directly compared, but the size of the object to be imaged in the image is compared with the fluctuation period of the background light in the image. This is because the apparent size in the image changes depending on the imaging magnification, the viewing angle, the object to be imaged, and the distance from the objective lens of the light emitting surface 123.
  • the size of cells to be imaged is about several tens of ⁇ m. Therefore, for example, it is considered relatively easy to satisfy the above condition by setting the arrangement pitch of the point light sources to several mm.
  • a plurality of point light sources 124 be included in the imaging field FV of the imaging unit 13. More specifically, as shown in FIG. 2, a plurality of point light sources 124 (see FIG. 2) two-dimensionally, that is, in each of two different directions, in a region included in the imaging field of view FV of the imaging unit 13 on the light exit surface 123. Then, it is desirable that the opening 122a) is disposed.
  • a condition for obtaining the contour enhancement effect at any position in the imaging field of view FV of the imaging unit 13 will be considered.
  • the condition required for this is as follows: “The light incident on the peripheral edge of the cell from at least one point light source does not enter the imaging unit 13 when there is no cell, and only when there is refraction by the cell. The state of “incident on” is established regardless of the position of the object to be imaged. When this condition is satisfied, there is at least one point light source that generates refracted light that emphasizes the outline of the cell.
  • FIG. 5A to 5C are diagrams showing the positional relationship between the point light source and the peripheral edge of the cell.
  • FIG. 5A shows a state in which the horizontal distance Dh between the point light source 124 and the peripheral portion of the cell C is relatively small
  • FIG. 5B shows that the horizontal distance Dh between the point light source 124 and the peripheral portion of the cell C is relatively small. It shows a large state
  • FIG. 5C shows a state where the horizontal distance Dh between the point light source 124 and the peripheral portion of the cell C is an intermediate value between the state shown in FIG. 5A and the state shown in FIG. 5B.
  • the imaging optical system 131 does not enter the light collection range. Therefore, in these cases, there is no effect of enhancing the outline of the cell C, and the point light source 124 simply increases the brightness of the background.
  • the horizontal distance Dh between the point light source 124 and the cell C is a moderate moderate distance
  • the light enters the imaging optical system 131.
  • the light that is not refracted at the peripheral edge of the cell C enters the light collection range (shown by a broken line in the figure) of the imaging optical system 131 as indicated by the dotted arrow.
  • Such light has an effect of brightening and emphasizing the outline of the cell C in the imaged image.
  • the horizontal distance between the contour portion and the point light source 124 needs to be within an appropriate range.
  • the point light source 124 is arranged so that at least one point light source 124 is always present within this range, no matter what position the cell C exists in the imaging field of view FV, A contour emphasis effect by refraction can be obtained.
  • FIG. 6 is a diagram showing conditions for obtaining a contour enhancement effect regardless of the position of the cell.
  • the light L5 directed from the point light source 124a toward the peripheral edge of the cell C enters the imaging optical system 131 if there is refraction at the peripheral edge of the cell C, and does not enter the imaging optical system 131 if there is no refraction. That is, the state shown in FIG. 5C.
  • the point light source 124a has an effect of emphasizing the outline of the left peripheral portion of the cell C in the drawing.
  • the point light source 124a shown in FIG. 6 is located at the leftmost position in the drawing within the range where the above conditions are satisfied. That is, if the point light source 124a is slightly to the left of the position shown in the drawing (it is equivalent even if the cell C is considered to be slightly to the right), as shown in FIG. The light directed toward the peripheral edge of the light enters the imaging optical system 131 regardless of the presence or absence of refraction, and the effect of enhancing the outline of the cell C is lost. In this sense, the position of the point light source 124a with respect to the cell C in FIG. 6 is a critical position for the point light source 124a to have an effect of enhancing the outline of the cell C.
  • the point light source 124b shown in FIG. 6 is a position adjacent to the point light source 124a and the most rightward position that satisfies such a condition. That is, the position of the point light source 124b in FIG. 6 is a position at which the light L6 from the point light source 124b toward the position of the peripheral part of the cell C is refracted at the peripheral part of the cell C and enters the imaging optical system 131. Of these, it is the position on the rightmost side. If the point light source 124b is slightly on the right side of this, the light L6 refracted at the peripheral edge of the cell C will not enter the imaging optical system 131, and the contour enhancement effect cannot be obtained.
  • the positional relationship between the point light sources 124a and 124b shown in FIG. 6 represents the allowable maximum distance between the two.
  • the distance between the two point light sources at the closest position is larger than this, there may be a case where the contour enhancement effect cannot be obtained depending on the position of the cell C.
  • the interval between the two point light sources is smaller than the maximum interval, the effect of increasing the amount of light incident on the imaging optical system 131 from the peripheral portion of the cell C is not impaired.
  • the density of the light source increases, the background brightness increases, or the width of the contour portion is enhanced by light entering the peripheral portion of the cell C from various directions, so that the contour of the cell C is enhanced.
  • the effect of selective emphasis may decline on the contrary. Therefore, as the arrangement pitch of the point light sources 124, it is preferable to select a value of the above-mentioned maximum interval or a value slightly smaller than this. In particular, in consideration of variations in the optical characteristics of the cells, it is possible to obtain a contour emphasis effect more reliably by using an arrangement pitch that is smaller than the maximum interval value.
  • ⁇ Attempt to derive the maximum interval described above, that is, the maximum value of the point light source array pitch.
  • the incident angle of the light L6 from the point light source 124b to the peripheral edge of the cell C is represented by ⁇ 1
  • the outgoing angle of the light L6 below (on the imaging optical system 131 side) is represented by the symbol ⁇ 2.
  • the incident angle of the light L5 from the point light source 124a to the peripheral edge of the cell C is represented by reference sign ⁇ 3.
  • the position of the point light source 124a is such that the incident angle ⁇ 3 of the light L5 incident on the peripheral edge of the cell C from the point light source 124a is the half angle ⁇ o of the light collection range of the imaging optical system 131. Is a position that matches.
  • the position of the point light source 124b is such that the emission angle ⁇ 2 of the light L6 refracted from the point light source 124b at the peripheral edge of the cell C and emitted downward (on the imaging optical system 131 side) is within the condensing range of the imaging optical system 131.
  • the position coincides with the half angle ⁇ o.
  • the maximum value of the arrangement pitch of the two point light sources is represented by symbol P.
  • the interval between the light exit surface 123 and the focal plane FP is represented by the symbol H.
  • the diameter of the cell C is represented by a symbol ⁇
  • the distance between the centers of the cell C and the point light source 124a in the horizontal direction is represented by a symbol L.
  • the maximum value P of the preferred arrangement pitch of the point light sources 124 in the illumination unit 12 depends on the size of the cell C as the object to be imaged and the focal length when the cell C is regarded as a lens.
  • the diameter ⁇ of a typical cell is about 20 ⁇ m
  • the focal length f when this is regarded as a lens is about 0.1 mm.
  • the value of the array pitch P is about 1.5 mm from (Equation 7).
  • FIG. 7 is a diagram showing how to determine the focal length when a cell is regarded as a lens.
  • the focal length f when the cell C is regarded as a lens can be obtained experimentally as follows, for example.
  • an evaluation sample is prepared.
  • the sample for evaluation is one in which an appropriate sample container Ds such as a dish carries the same medium Ms as the medium M injected into the well W to be imaged and the same type of cells Cs as the object to be imaged. . Since the refractive index is different when the culture medium is different, the lens action of the cell may not be appropriately evaluated.
  • a light source LS that emits parallel light Lp downward is disposed above the sample container Ds, and a camera (for example, a microscope camera) CM is disposed below.
  • a camera for example, a microscope camera
  • the size of the spot where the illumination light is converged is changed by the lens action of the cell Cs.
  • this spot is the smallest, it can be said that the focal position of the cell Cs as a lens coincides with the focal position of the camera CM in the vertical direction. Accordingly, the distance from the focal position of the camera CM to the cell Cs at this time can be set as the focal length f of the cell Cs as a lens.
  • each opening 122a is a square with a side of 0.5 mm and the arrangement pitch is 1.5 mm. Then, imaging was performed using 3T3 cells as the imaging target, and the effect of the light shielding plate 122 was confirmed.
  • FIG. 8A to 8D are diagrams showing examples of imaging results.
  • FIG. 8A shows an example of an imaging result under diffuse illumination without using the light shielding plate 122.
  • FIG. 8B is an example of an image captured by installing the light shielding plate 122 having the above dimensions, and it can be seen that the outline of each cell shines brightly so that the shape can be seen more easily.
  • periodic light and dark appear in the background due to the influence of the direct light incident through each opening 122a. Since the illumination unit 12 is sufficiently far away from the depth of field of the imaging optical system 131, the image of the opening 122a does not appear clearly, but is greatly defocused and appears in the image as fluctuations in brightness.
  • FIG. 8C is an image obtained by performing two-dimensional filtering on the image shown in FIG. 8B and removing a relatively low spatial frequency component corresponding to the periodic component of the background. It can be seen that the change in periodic light and darkness of the background is greatly reduced, and an image in which the outline portion of each cell is brightly emphasized is obtained. Such an image has a clear cell outline, and is suitable for measuring the shape, size, number, etc. of cells visually or automatically. In addition, the texture information inside the cell is stored relatively well.
  • FIG. 8D is an example of an image in which the contour portion of the cell is further emphasized by performing a known edge enhancement process on the image shown in FIG. 8C.
  • the outline portion of the cell appears selectively brightly. For this reason, it is also possible to create an image in which the outline of the cell is more emphasized as shown in FIG. 8D by performing an appropriate edge enhancement process as necessary.
  • the imaging method of the present embodiment is a method suitable for obtaining an image that clearly represents the outline of the cell. It is shown that there is.
  • the larger the opening area of each opening 122a the larger the amount of illumination light and the brighter the image.
  • the effect of emphasizing the cell outline is diminished because it approaches a uniform diffuse light source.
  • the opening area of the opening 122a is reduced, the brightness ratio between the contour portion and the other portions is increased, but the image itself is darkened. In this case, if the amount of light emitted from the surface light source 121 can be increased, the brightness of the image can be improved.
  • a plurality of light shielding plates having the same arrangement pitch of the openings 122a and different opening areas may be prepared.
  • the preferred arrangement pitch of the point light sources 124 varies depending on the type and state of the object to be imaged. For this reason, in order to perform favorable imaging with respect to various types of imaging objects, it is desirable to change the arrangement pitch of the point light sources 124 in the illumination unit 12 according to the imaging objects.
  • the first method that enables this is as follows. In this method, the light shielding plate 122 is configured to be detachable from the illumination unit 12, and a plurality of types of light shielding plates 122 having different arrangement pitches of the openings 122a are prepared. Then, the light shielding plate 122 is replaced according to the purpose.
  • the value P obtained by (Equation 7) from the characteristics of the object to be imaged gives a preferable upper limit of the arrangement pitch, and does not require that the arrangement pitch of the light sources be strictly set to this value P. Therefore, among the plurality of prepared light shielding plates 122, the one having the largest arrangement pitch of the openings 122a below the obtained value P may be selected.
  • FIG. 9A and FIG. 9B are diagrams showing another configuration example of the illumination unit that can change the arrangement pitch of the point light sources.
  • the illumination unit 12a includes a surface light source 125 that emits uniformly diffused light downward, and a shutter member 126 that is provided along the lower surface of the surface light source 125, for example, a liquid crystal shutter.
  • the control unit 14 is provided with an illumination control unit 147 that controls the illumination unit 12a.
  • the illumination control unit 147 controls the shutter member 126 to set a transmission pattern of light transmitted from the upper surface side to the lower surface side of the shutter member 126.
  • a liquid crystal display panel in which a liquid crystal shutter and a backlight are integrated can be suitably used.
  • the transmission pattern by the shutter member 126 is similar to the transmission pattern in the light shielding plate 122 of FIG. 2, and the transmission parts 126a that transmit light are arranged at a constant pitch inside the non-transmission parts 126b that do not transmit light. Is done. Thereby, each transmission part 126a fulfill
  • the illumination control unit 147 can change and set the transmission pattern of the shutter member 126 in various ways, thereby changing the arrangement pitch and size of the point light sources 124 in various ways.
  • the illumination unit 12b includes a large number of minute light emitting elements 127 arranged in a matrix along a horizontal plane.
  • a matrix array having a light emitting diode (LED) as the light emitting element 127 can be used as the illumination unit 12b.
  • the control unit 14 is provided with an illumination control unit 148 that individually controls lighting of each light emitting element 127. It is possible to cause the light emitting element 127 to be lit to function as the point light source 124 by lighting all or a part selected at a predetermined pitch of the many light emitting elements 127 provided in the illumination unit 12b.
  • the illumination control unit 148 changes and sets the combination of the light emitting elements 127 to be lit, so that the arrangement pitch of the point light sources 124 can be variously changed. More preferably, the light quantity of each light emitting element 127 can be changed.
  • FIG. 10 is a flowchart showing an operation example of the imaging apparatus.
  • An operation example of the imaging apparatus 1 configured as described above will be described with reference to FIG.
  • the operation described here is a process of imaging each well W of the well plate WP carried into the apparatus and creating an image in which the contour of the object to be imaged in each well W is emphasized. Even when an object to be imaged is carried in the dish instead of the well plate WP, it is possible to perform imaging basically in the same manner.
  • This processing is realized by the CPU 141 provided in the control unit 14 executing a control program recorded in advance in the memory 145 to cause each unit of the device to perform a predetermined operation.
  • the arrangement pitch (light source pitch) of the point light sources 124 is set according to the raw sample (step S102). ). Specifically, the one corresponding to the array pitch P calculated based on (Expression 7) is selected from the plurality of types of light shielding plates 122 according to the cells that are the imaging objects in the sample, and the imaging device 1 Set to Even when the configuration of the illumination unit is as shown in FIG. 9A or 9B, the illumination control unit 147 or 148 appropriately sets the light source pitch according to the object to be imaged.
  • the well W is imaged by the imaging unit 13 under the illumination conditions set in this way (step S103). Imaging may be performed for all wells W provided in the well plate WP, or imaging may be performed only for specific wells W. By trimming the obtained image, a portion corresponding to the well W is cut out as a well image (step S104), and blank portions other than the well are removed.
  • the outline of the cell in the well W is brightly emphasized, but includes periodic fluctuations of the background luminance due to the light sources distributed in a discrete manner. Yes.
  • Such background light and darkness is removed by the filtering process (step S105).
  • the cutoff frequency is set so that the spatial frequency component corresponding to the light / dark fluctuation period in the well image is included in the stop band, and the low-frequency removal process is executed.
  • the light / dark fluctuation cycle in the image is not necessarily the same as the arrangement pitch (light source pitch) of the point light sources 124 in the illumination unit 12.
  • the imaging magnification, the viewing angle of the imaging optical system 131, the distance from the focal plane FP to the light exit surface 123, and the like are reflected in the fluctuation cycle in the image. Since these conditions are known, it is possible to determine the light / dark fluctuation cycle in the image from the arrangement pitch of the point light sources 124. It is also possible to determine the spatial frequency component to be removed.
  • the arrangement pitch of the point light sources 124 is variable, the fluctuation period of the background also changes. Therefore, strictly speaking, it is necessary to change the cutoff frequency in the filtering process.
  • the signal corresponding to the cells in the image and the signal corresponding to the background can be clearly separated, it is not always necessary to finely change the cutoff frequency according to the arrangement pitch. For example, consider a case where the minimum value of the fluctuation cycle of the background luminance that changes corresponding to the arrangement pitch of the light sources is sufficiently larger than the size of the cells in the image. At this time, by setting the cut-off frequency so that the periodic component can be removed, it is also possible to remove a fluctuation component having a longer period (low spatial frequency). Therefore, it is not necessary to change the cutoff frequency.
  • step S106 edge enhancement processing is performed on this image (step S106), and as shown in FIG. 8D, an image in which the outline portion of the cell is further enhanced is obtained. That is, the execution of step S106 is not essential and is optional. Note that image capturing and image processing may be executed by different devices.
  • an image in which the contour of the object to be imaged is brightly emphasized can be obtained while using a simpler device configuration without using a complicated device configuration such as a dark field imaging device. Is possible.
  • the well plate WP corresponds to the “sample container” of the present invention, and the holder 11 that holds this functions as the “holding means” of the present invention.
  • the illumination unit 12 functions as the “illuminating unit” of the present invention
  • the surface light source 121 and the light shielding plate 122 function as the “surface light source” and “light shielding unit” of the present invention, respectively.
  • each opening 122a of the light shielding plate 122 corresponds to a “window portion” of the present invention, and further corresponds to a “light emitting portion” of the present invention.
  • the imaging unit 13 functions as an “imaging unit” of the present invention
  • the CPU 141 functions as an “image processing unit” of the present invention.
  • the illumination unit 12a functions as the “illuminating means” of the present invention, and among these, the surface light source 125 and the shutter member 126 correspond to “surface light source” and “liquid crystal shutter” of the present invention, respectively. is doing. 9B, the illumination unit 12b having a large number of light emitting elements 127 functions as the “illumination unit” of the present invention, and the illumination control unit 148 corresponds to the “lighting control unit” of the present invention.
  • a plurality of point light sources 124 are arranged in a two-dimensional matrix at a constant pitch in each of the X direction and the Y direction.
  • the arrangement of the point light sources is not limited to this. For example, the following arrangement may be adopted.
  • FIG. 11 is a diagram showing another example of the arrangement of point light sources.
  • the rows of point light sources 124 arranged at a constant pitch P1 in the Y direction are arranged at the same pitch P1 in the X direction, except that the positions differ by half the pitch P1 in the Y direction.
  • another point light source 124 is arranged at each vertex of a regular hexagon centering on one point light source 124. Therefore, six point light sources 124 are arranged at equal distances and at equal angular intervals around one point light source 124.
  • an illumination unit having these arrangements, it is possible to capture an image in which the contour portion of the object to be imaged is emphasized in the same manner as described above. In these cases, the appearance of the fluctuation of the background luminance in the image due to the discrete point light source is different. In order to cope with this, further changes may be made regarding the direction of the filtering process and the cutoff frequency.
  • the filtering process is performed on the captured image, and the spatial frequency component corresponding to the periodic fluctuation of the background luminance is removed.
  • the filtering process may be omitted.
  • the filtering process can be omitted for the purpose of detecting the outline of a cell by edge extraction processing or the like and automatically counting the number of cells in the image. In such a case, the filtering process can be omitted.
  • the light shielding plate 122 in the above embodiment has an opening 122a having a square cross section.
  • the opening shape is not limited to this and is arbitrary.
  • the internal space of the opening 122a may be filled with a light transmissive material.
  • the imaging device and the imaging method according to the present invention have, for example, illumination in which the illumination unit has periodic light and dark corresponding to the arrangement pitch with respect to the sample container, as described above by exemplifying specific embodiments.
  • the structure which makes light enter may be sufficient. According to such a configuration, periodic light and dark appear in the image, but the period is known. For this reason, if necessary, it can be removed later by image processing, for example. By allowing such background fluctuations, it is possible to obtain an image in which the peripheral portion of the object to be imaged is more effectively emphasized.
  • the arrangement pitch of the light emitting portions may be changeable. According to such a configuration, it is possible to further improve the enhancement effect of the peripheral portion of the object to be imaged by optimizing the illumination pattern according to the object to be imaged.
  • the object to be imaged is a cell
  • the diameter of the cell is ⁇
  • the focal length when the cell is regarded as a lens is f
  • the distance between the plane and the focal plane is H
  • the arrangement pitch is P
  • the illumination means includes a surface light source that emits diffused light toward the sample container, a light-shielding flat plate disposed parallel to the focal plane between the surface light source and the sample container, and a light-transmitting window portion.
  • a surface light source that emits diffused light toward the sample container
  • a light-shielding flat plate disposed parallel to the focal plane between the surface light source and the sample container
  • a light-transmitting window portion May be configured to include a plurality of light-shielding portions provided at an arrangement pitch. According to such a configuration, the diffused light is emitted from each of the plurality of window portions, so that the window portion functions as the light emitting portion, and the effects of the present invention can be obtained.
  • the light shielding part may be configured to be detachable, and a plurality of light shielding parts having different arrangement pitches may be selectively mounted. According to such a configuration, the arrangement pitch of the light emitting portions can be changed according to the purpose.
  • the illumination unit may have a configuration having a plurality of light emitting elements arranged two-dimensionally in a plane. According to such a configuration, each of the light emitting elements functions as a light emitting portion, so that the effects of the invention as described above can be obtained.
  • a lighting control unit that controls lighting of the light emitting element and can change a combination of the light emitting element to be turned on and the light to be turned off may be provided. According to such a configuration, it is possible to change the arrangement pitch of the light emitting portions by changing the combination of light emitting elements to be lit.
  • the illumination unit may have a configuration including a surface light source that emits diffused light toward the sample container, and a liquid crystal shutter disposed between the surface light source and the sample container.
  • the liquid crystal shutter realizes a predetermined transmission pattern, so that it is possible to configure an illuminating unit in which the light emitting units are discretely distributed as described above.
  • a filtering process for removing a spatial frequency component corresponding to the arrangement pitch may be performed on the captured image. According to such a configuration, it is possible to obtain an image from which fluctuations in the background luminance of the image due to the light emitting units arranged discretely are removed.
  • the imaging method according to the present invention may further include a step of setting an arrangement pitch according to the object to be imaged. According to such a configuration, by changing the arrangement pitch of the light emitting portions, it is possible to capture images of various objects to be captured under appropriate illumination conditions and obtain an image in which the peripheral portion is emphasized. It is.
  • the arrangement pitch may be set so that the fluctuation cycle of the background luminance in the image is larger than the size of the object to be imaged.
  • an image in which a high spatial frequency component corresponding to the object to be captured is superimposed on a relatively low spatial frequency component corresponding to the background can be obtained. Therefore, the background and the object to be imaged can be clearly separated by the spatial frequency.
  • the present invention can clearly image an object to be imaged that cannot obtain sufficient contrast under diffused light illumination, such as a cell or a cell colony that is two-dimensionally cultured in a medium, particularly its outline. Suitable for required applications.
  • Imaging device 11 Holder (holding means) 12, 12a, 12b Illumination part (illumination means) 13 Imaging unit (imaging means) 121, 125 Surface light source 122 Light shielding plate (light shielding part) 122a opening (window, light exit) 123 Light exit surface 124 Point light source (light exit part) 126 Shutter member (liquid crystal shutter) 127 Light emitting element (light emitting part) 131 Image pickup optical system 132 Image pickup element 141 CPU (image processing means) 148 Illumination control unit (lighting control means) C cell (object to be imaged) WP well plate (sample container)

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Abstract

簡単な装置構成で、被撮像物の輪郭が明瞭な画像を得られる撮像装置および撮像方法を提供する。一定ピッチで離散的に配置された複数の光出射部１２４を有する照明手段１２により被撮像物Ｃを照明し、撮像手段１３により透過撮像する。被撮像物Ｃの周縁部が入射光を屈折させることで、被撮像物がなければ入射しない光Ｌ２，Ｌ３が撮像手段１３に入射するようになる。このため、被撮像物Ｃの輪郭が明るく強調された画像を得ることができる。

Description

撮像装置および撮像方法
　この発明は、試料容器に担持された生試料を照明下で撮像する技術に関するものであり、特にその照明に関する。
　医療や生化学等の分野では、細胞や細菌等を含む生試料を観察したり分析したりするために、これらの生試料を撮像するための装置が実用化されている。培養液中の細胞は透明に近いため、例えば被撮像物が容器の底面に沿って二次元的な広がりを有する細胞である場合、一般的な明視野撮像では十分なコントラストが得られないことがある。このような被撮像物の撮像には暗視野撮像技術や位相差顕微鏡が用いられるが、照明および撮像光学系の構造が特殊であるため、特に広い視野を撮像する場合には装置構成が大型で高価なものとなる。
　この問題に対し、例えば特許文献１に記載の観察装置では、明部と暗部とが周期的に配置された周期光源に、これと逆の位相で遮光部と開口部とが設けられた遮光手段を組み合わせた照明が用いられている。このような構成では、光源から直接撮像手段に向かう光が遮光手段によって遮光され、被撮像物で屈折されたり散乱されたりした光のみが撮像手段に入射するため、暗視野撮像と同様の撮像結果が得られる。
特開２００８－２５６６１０号公報
　上記従来技術では、撮像光学系の集光特性に応じて照明の構成を変える必要がある。例えば撮像光学系がテレセントリック特性を有するものであれば、光源および遮光手段の周期ピッチを一定とすることができる。ただし、視野の広いテレセントリック光学系は小型化に適しておらず高コストになりがちである。また例えば、撮像光学系が非テレセントリック特性を有するものであれば、その集光特性に適合するためには周期ピッチが不均等な光源および遮光手段が必要となる。さらに、照明と撮像光学系との位相を合わせるために、両者の相対位置が変わらないようにする必要もある。
　被撮像物である細胞を多数含むような広い視野での撮像は、試料内に分布する細胞の数やサイズを計測する目的で行われることがある。このような場合、個々の細胞の内部テクスチャよりも各細胞の輪郭が明瞭に現れた画像が必要となる。上記従来技術は、必ずしもこのようなニーズに適したものとは言えない。
　この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、簡単な装置構成で、被撮像物の輪郭が明瞭な画像を得ることのできる技術を提供することを目的とする。
　この発明の一の態様は、上記目的を達成するため、被撮像物である生試料を担持する試料容器を保持する保持手段と、前記試料容器を照明する照明手段と、前記照明手段から出射され前記試料容器を透過する透過光を受光して前記被撮像物の透過像を撮像する撮像素子、および、前記試料容器と前記撮像素子との間に配置されて前記透過光を前記撮像素子に結像させる撮像光学系を有する撮像手段とを備える撮像装置である。
　また、この発明の他の態様は、上記目的を達成するため、被撮像物である生試料を担持する試料容器を照明手段が照明する工程と、前記照明手段から出射され前記試料容器を透過する透過光を受光して前記被撮像物の透過像を撮像する撮像素子、および、前記試料容器と前記撮像素子との間に配置されて前記透過光を前記撮像素子に結像させる撮像光学系を有する撮像手段が前記被撮像物の画像を取得する工程とを備える撮像方法である。
　これらの発明において、前記照明手段は、前記撮像光学系の焦点面に平行な平面に沿って互いに離隔して一定の配置ピッチで二次元配置されて各々が前記試料容器に向けて拡散光を出射する複数の光出射部を有し、前記平面は、前記撮像手段から見て前記撮像光学系の被写界深度の範囲よりも遠く、該平面のうち前記撮像手段の視野を含み該視野よりも広い領域内に、前記複数の光出射部が配置されている。このような構成によれば、簡単な装置構成で、コントラストの良好な、特に被撮像物の輪郭が明瞭な画像を得ることが可能である。その理由は以下の通りである。
　本発明では、撮像手段から照明手段を見たときの視野内に、一定ピッチで配置された複数の光出射部が含まれる。したがって、撮像素子には複数の光出射部から出射された光が直接入射し、画像には光出射部の像が含まれる。光出射部が配置される平面は撮像光学系の被写界深度よりも遠くにあるため、撮像される画像において光出射部の像はデフォーカスされている。したがって光出射部が十分遠くに配置されていれば、画像には光出射部の鮮明な像は現れず、光出射部の配置ピッチに対応する周期的かつ緩やかな明暗変動が現れるのみである。
　生試料における細胞等の被撮像物は透明に近いが、細胞がレンズのように作用し、特に細胞の周縁部に入射した光が屈折により進行方向が変化することが知られている。このため、被撮像物がない場合には撮像手段に入射しない光であっても、被撮像物により屈折することで撮像手段に入射する方向に進路が曲げられることがある。特に被撮像物の周縁部でこの傾向が強く、このことは被撮像物の周縁部を選択的に明るくする。
　一般的な拡散光源でもこのような屈折現象は起きる。しかしながら、被撮像物内部やその外側の背景部でも種々の方向から光が入射しているため画像全体が明るくなり、細胞周縁部でのコントラストの向上効果は限定的である。一方、本発明では、視野内で略一様な光量分布を得ようとする拡散照明と異なり、離散的に配置された光出射部の各々から拡散光が出射される。これにより被撮像物の背景部には周期的な明暗変動が生じる。したがって、背景部の平均的な明るさは一様な照明、つまり光出射部が隙間なく配置された照明を用いた場合よりも低下する。ただし、直接光が完全に遮光された暗視野撮像技術や特許文献１に記載の技術よりも背景部は明るい。
　このため、屈折に起因する被撮像物の周縁部での明るさが、背景部に対し相対的に強められることとなる。したがって、撮像される画像では被撮像物の輪郭部分が強調されることとなる。結果として得られる画像は、輪郭部分が強調された被撮像物の像と、光出射部の配置ピッチに対応して現れる背景部の周期的な明暗とを含んだものとなる。背景部の明暗変動の周期は既知であるから、このような空間周波数成分を画像から除去することは比較的容易である。画像から背景部の周期的な明暗変動を差し引くことで、輝度変化の少ない背景と輪郭部分が強調された被撮像物の像とで構成された画像を得ることができる。
　本発明では、被撮像物から出射される光の光量分布そのものが、被撮像物の輪郭部分において光量が強められたものとなっている。そのため、撮像光学系の集光特性によらず同様の効果を得ることが可能である。
　このように、本発明では、拡散光を出射する複数の光出射部が撮像光学系の被写界深度よりも遠い平面に沿って一定ピッチで配置された照明手段による照明下で、被撮像物が透過撮像される。このような構成によれば、簡単な装置構成でありながら、被撮像物の輪郭が明瞭な画像を得ることが可能である。
　この発明の前記ならびにその他の目的と新規な特徴は、添付図面を参照しながら次の詳細な説明を読めば、より完全に明らかとなるであろう。ただし、図面は専ら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。
この発明にかかる撮像装置および撮像方法の一実施形態を示す図である。 照明部の構成をより詳細に示す図である。 この実施形態における照明部の作用を示す第１の図である。 この実施形態における照明部の作用を示す第２の図である。 焦点面付近に細胞が存在するときの光の分布を示す第１の図である。 焦点面付近に細胞が存在するときの光の分布を示す第２の図である。 点光源と細胞の周縁部との位置関係を示す第１の図である。 点光源と細胞の周縁部との位置関係を示す第２の図である。 点光源と細胞の周縁部との位置関係を示す第３の図である。 細胞がどの位置にあっても輪郭の強調効果が得られる条件を示す図である。 細胞をレンズと見なす場合の焦点距離の求め方を示す図である。 撮像結果の例を示す第１の図である。 撮像結果の例を示す第２の図である。 撮像結果の例を示す第３の図である。 撮像結果の例を示す第４の図である。 点光源の配列ピッチを変更可能な照明部の他の例を示す第１の図である。 点光源の配列ピッチを変更可能な照明部の他の例を示す第２の図である。 この撮像装置の動作例を示すフローチャートである。 点光源の配置の他の例を示す第１の図である。 点光源の配置の他の例を示す第２の図である。
　図１はこの発明にかかる撮像装置および撮像方法の一実施形態を示す図である。この実施形態では、ウェルプレートＷＰの上面に形成されたウェルＷと称される窪部に注入された液体中で培養される細胞等の生試料が、撮像装置１により撮像される。図１において、ＸＹ平面は水平面を表す。また、Ｚ軸は鉛直軸を表し、より詳しくは（－Ｚ）方向が鉛直下向き方向を表している。
　ウェルプレートＷＰは、創薬や生物科学の分野において一般的に使用されているものであり、平板状のプレートの上面に、断面が略円形の筒状に形成され底面が透明で略平坦なウェルＷが複数設けられている。１つのウェルプレートＷＰにおけるウェルＷの数は任意であるが、例えば９６個（１２×８のマトリクス配列）のものを用いることができる。各ウェルＷの直径および深さは代表的には数ｍｍ程度である。なお、この撮像装置１が対象とするウェルプレートのサイズやウェルの数はこれらに限定されるものではなく任意であり、例えば一般的に使用されている１２ないし３８４穴のものが利用可能である。また、複数ウェルを有するウェルプレートに限らず、例えばディッシュと呼ばれる平型の容器で培養された生試料の撮像にも、この撮像装置１を使用することが可能である。
　ウェルプレートＷＰの各ウェルＷには、培地Ｍとしての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞が、この撮像装置１における被撮像物となる。培地Ｍは適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でウェルＷに投入された後ゲル化するものであってもよい。常用される一般的な液量は、５０ないし２００マイクロリットル程度である。
　なお、ウェルＷ内で培養され撮像対象となる生試料としては、孤立した細胞のほか、多数の細胞が培地Ｍ内で二次元的に広がるように分布した細胞コロニーなどを適用可能である。また、撮像装置１を用いて、生体から摘出された組織や細菌などの生試料を撮像することも可能である。以下、被撮像物となるこれらを総称して「細胞等」ということがある。
　撮像装置１は、ウェルプレートＷＰを保持するホルダ１１と、ホルダ１１の上方に配置される照明部１２と、ホルダ１１の下方に配置される撮像部１３と、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する制御部１４とを備えている。ホルダ１１は、細胞等を培地Ｍとともに各ウェルＷに担持するウェルプレートＷＰの下面周縁部に当接して、ウェルプレートＷＰを略水平姿勢に保持する。
　照明部１２は、ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰに向けて照明光（例えば白色光）を出射する。より具体的には、照明部１２は、下向きの方向成分を有する拡散光を出射する面光源１２１と、面光源１２１とウェルプレートＷＰとの間に配置された遮光プレート１２２とを備えている。遮光プレート１２２は、複数の開口が一定ピッチで二次元配列された平板状部材である。面光源１２１から出射される拡散光のうち、遮光プレート１２２の開口を通過した光成分がウェルプレートＷＰに照射される。言い換えれば、照明部１２では、遮光プレート１２２の開口の各々がウェルプレートＷＰに向けて拡散光を出射する。
　ホルダ１１により保持されたウェルプレートＷＰの下方に、撮像部１３が設けられる。撮像部１３では、ウェルプレートＷＰの直下位置に対物レンズを含む撮像光学系１３１が配置されており、撮像光学系１３１の光軸ＡＸは鉛直方向（Ｚ方向）に向けられている。図において撮像光学系１３１は代表的に１つの対物レンズとして示されるが、レンズ等の光学素子が複数組み合わされたものでもよい。
　撮像部１３により、ウェルＷ内の生試料が撮像される。具体的には、照明部１２から出射されウェルＷの上方から培地Ｍに入射した光が被撮像物である細胞等を照明し、ウェルＷ底面から下方へ透過した光が、撮像光学系１３１を介して撮像素子１３２の受光面に入射する。撮像光学系１３１により撮像素子１３２の受光面に結像する被撮像物の像が、撮像素子１３２により撮像される。撮像素子１３２としては例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができ、二次元イメージセンサおよび一次元イメージセンサのいずれであってもよい。
　撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ制御部１４６によりＸＹＺ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ制御部１４６が、ＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき撮像部１３をＸ方向およびＹ方向に移動させることにより、撮像部１３がウェルＷに対し水平方向に移動する。また撮像部１３のＺ方向への移動によりフォーカス調整がなされる。メカ制御部１４６は、撮像対象となるウェルＷの直下位置に撮像部１３を水平方向に位置決めする。撮像部１３の撮像素子が一次元イメージセンサである場合には、イメージセンサの長手方向と直交する方向に撮像部１３を走査させることにより二次元画像を撮像することができる。このような撮像方法では、被撮像物である細胞等に対し非接触、非破壊かつ非侵襲で撮像を行うことができ、撮像による細胞等へのダメージを抑えることができる。
　撮像部１３の撮像素子１３２から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４３に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき適宜画像処理を実行する。制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４４と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４５とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。ＣＰＵ１４１は、メモリ１４５に記憶された制御プログラムを実行することにより、後述する各種の演算処理を行う。
　その他に、制御部１４には、インターフェース（ＩＦ）部１４２が設けられている。インターフェース部１４２は、ユーザからの操作入力の受け付けや、ユーザへの処理結果等の情報提示を行うほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。なお、制御部１４は、上記したハードウェアを備えた専用装置であってもよく、またパーソナルコンピュータやワークステーション等の汎用処理装置に、後述する処理機能を実現するための制御プログラムを組み込んだものであってもよい。すなわち、この撮像装置１の制御部１４として、汎用のコンピュータ装置を利用することが可能である。汎用処理装置を用いる場合、撮像装置１には、撮像部１３等の各部を動作させるために必要最小限の制御機能が備わっていれば足りる。
　図２は照明部の構成をより詳細に示す図である。照明部１２は、面光源１２１の下方に遮光プレート１２２が近接配置された構造を有している。遮光プレート１２２は、遮光性材料により形成された平板状部材に、Ｘ方向およびＹ方向にそれぞれ一定ピッチで複数の開口１２２ａが設けられた構造を有する。遮光プレート１２２の外形サイズは、面光源１２１の平面サイズと同じまたはこれよりも大きい。なお、図１および図２に示す例では面光源１２１と遮光プレート１２２との間に隙間があるが、これらが密着していてもよい。照明部１２では、光源１２１に対し遮光プレート１２２が着脱自在であることが好ましい。
　開口１２２ａは、撮像部１３から遮光プレート１２２の下面を見たときに、撮像部１３の撮像視野ＦＶ内に、Ｘ方向およびＹ方向のそれぞれにおいて複数の開口１２２ａが含まれるように配置される。また、Ｘ方向およびＹ方向のそれぞれにおいて、撮像視野ＦＶの両端部よりも外側にもそれぞれ少なくとも１つの開口１２２ａが設けられる。具体的な寸法例については後述する。
　面光源１２１から出射される光は遮光プレート１２２により遮光されるが、開口１２２ａに入射した光は遮光プレート１２２を通過してウェルプレートＷＰ側に出射される。なお、開口１２２ａは面光源１２１からの出射光を部分的に通過させる機能を有するものであり、同様の機能を有するものであれば遮光プレートは他の構造であってもよい。例えば、開口部に透明窓が設けられた構造でもよい。また、透明な平板状部材に遮光性材料によるマスクパターンが設けられ、該マスクパターンに光を通過させる透過部が規則的に配置された構造であってもよい。
　また、遮光プレートは、ウェルプレートＷＰに対向し開口が配列された面が概略平面状となっていればよく、全体の形状は板状のものに限定されない。例えば面光源を収容するケースの底面に開口が設けられ、該底面が遮光プレートとしての機能を有するものであってもよい。
　上記のように構成された照明部１２では、遮光プレート１２２の下面が、照明光を出射する「光出射面」として機能している。すなわち、遮光プレート１２２に一定ピッチで設けられた開口１２２ａがそれぞれ照明光としての拡散光を出射する実効的な「光出射部」となっており、各開口１２２ａは擬似的な点光源と見なすことができる。「擬似的な」と形容する理由は、開口１２２ａが有限の開口サイズを有する点で理想的な点光源とは異なるからである。そして、このような光出射部が遮光プレート１２２の下面に規則的に配列されて、該下面が光出射面となっている。このことから、以下の説明においては、照明部１２を「光出射面に複数の点光源が一定ピッチでマトリクス配置されたもの」として模式的に表すことがある。
　図３Ａおよび図３Ｂはこの実施形態における照明部の作用を示す図である。より具体的には、図３Ａは照明部１２と撮像部１３との位置関係を示す図である。また図３Ｂは撮像部１３により受光される透過光の光量分布を示す図である。図３Ａでは、照明部１２が水平な光出射面１２３に複数の点光源１２４が配列されたものとして表されている。撮像部１３の焦点は、被撮像物である細胞等が分布する位置に合わせられる。すなわち、撮像光学系１３１の被写界深度ＤＯＦ内に被撮像物が収まるように焦点調整がなされ、このとき撮像光学系１３１の焦点面ＦＰは概ねウェルＷの底面近傍にある。
　一方、照明部１２は撮像部１３から見て被撮像物よりも遠くに配置され、光出射面１２３は撮像光学系１３１の被写界深度ＤＯＦから十分遠くにある。光出射面１２３では、撮像部１３の撮像視野ＦＶ内に複数の点光源１２４が配置されている。このため、各点光源１２４からの出射光の一部が撮像部１３の撮像光学系１３１に直接入射し、撮像される画像には撮像視野ＦＶ内にある点光源１２４の像が含まれる。ただし、光出射面１２３が撮像光学系１３１の被写界深度ＤＯＦよりも十分に遠いため、点光源１２４の像はデフォーカスされたものとなっている。したがって、図３Ｂに示すように、撮像部１３に入射する光は、点光源１２４の配列ピッチに応じた周期で明暗が緩やかに変化するような光量分布を有している。
　図３Ｂにおいて点線は、実質的に一様な拡散光を出射する面光源、つまり点光源が十分近接して配列されたのと等価な光源を有する照明部により照明された場合の光量分布を示している。この場合、撮像部１３に入射する光の光量分布は概ね一様である。これに対して、本実施形態の照明部１２による照明下では、光源が分散しているため全体的に光量が小さく、また空間的には光量分布が周期的な変動を有している。
　図４Ａおよび図４Ｂは焦点面付近に細胞が存在するときの光の分布を示す図である。より具体的には、図４Ａはこのときの光線図の例を示す図であり、図４Ｂは撮像部１３により受光される透過光の光量分布を示す図である。細胞Ｃは概ね透明で、その屈折率と培地の屈折率との差は非常に小さい。そのため、特にウェルＷ底面に沿って薄く広がる細胞Ｃの場合、拡散照明下では背景の培地との光学濃度の差異が少ない。ただし、細胞Ｃを上からまたは下から見たときの周縁部に当たる部分では細胞Ｃ表面の曲率が大きいため、この部分では光の屈折が比較的大きくなる。
　このため、図４Ａに符号Ｌ２、Ｌ３で示すように、いずれかの点光源１２４から出射される光のうち細胞Ｃがなければ撮像部１３には入射しない光が、細胞Ｃの周縁部で屈折し進行方向が変わることで撮像部１３に入射するという現象が生じる。図では屈折光が点線矢印で示されている。細胞Ｃの中央部に入射する光Ｌ４は細胞Ｃを透過して撮像部１３に入射するため、光量は細胞がない場合と大きく変わらない。細胞の外部の背景部分も同様である。
　このことは、細胞Ｃの周縁部から撮像部１３に入射する光が選択的に強められ、結果として、撮像される画像において細胞Ｃの輪郭が明るく強調される効果があることを意味する。すなわち、図４Ｂに示すように、撮像部１３に受光される光は、細胞が存在しない場合と同様の周期的な光量変動を有する背景に、細胞Ｃの周縁部に対応する位置に局所的な高光量のピークが重畳された光量分布となる。
　照明部が一様な面光源である場合、焦点面ＦＰ上の各点に対し種々の方向から照明光が入射し一様な明るさの画像が得られる。このため、細胞周縁部での屈折光が背景に紛れてしまい輪郭を強調する効果は小さい。本実施形態では、光出射面１２３に離隔して点在する点光源１２４から照明光を入射させているため、焦点面ＦＰ上の各点への直接光の入射方向が離散的である。そのため、画像全体の平均的な明るさは一様光源の場合より低下するが、点光源１２４から細胞周縁部に入射する直接光が屈折して撮像部１３に入射する場合の光量の増加がより顕著となる。これにより、輪郭の強調効果も顕著である。
　図４Ｂに示すように、撮像された画像には、点光源１２４の離散的な分布に起因する周期的な背景輝度の変動が現れる。しかしながら、点光源１２４の配列ピッチが既知であるため、この変動周期も事前に把握することが可能である。被撮像物である細胞Ｃのサイズに対し変動周期が十分に大きければ、得られた画像から当該変動周期に対応する空間周波数成分を除去する画像処理を行って変動成分を事後的に消去し、輪郭部分の明るさが強調された細胞Ｃの画像を得ることが可能である。
　次に、照明部１２における点光源１２４の配列ピッチについて説明する。上記したように、画像処理によって照明光の変動成分を除去するためには、撮像される画像において、被撮像物である細胞や細胞コロニーのサイズよりも光源の配列ピッチが大きいことが望ましい。この場合、被撮像物の実サイズと光源の配列ピッチとが直接比較されるのではなく、画像内での被撮像物のサイズと画像内における背景光の変動周期とが対比される。撮像倍率や視野角、被撮像物および光出射面１２３の対物レンズからの距離によって画像内での見かけの大きさが変化するからである。多くの場合、被撮像物である細胞等のサイズは数十μｍ程度である。したがって、例えば点光源の配列ピッチを数ｍｍとすることで上記条件を満足させることは比較的容易であると考えられる。
　また、背景輝度の周期的な変動が事後的に除去されるとの前提の下、一定周期での背景輝度の変動が許容される。その一方で、被撮像物がどの位置にあっても照明条件が極端に変わらないようにする。このために、撮像部１３の撮像視野ＦＶ内に複数の点光源１２４が含まれることが望ましい。より詳しくは、図２に示したように、光出射面１２３のうち撮像部１３の撮像視野ＦＶに含まれる領域において二次元的に、つまり異なる２方向のそれぞれで複数の点光源１２４（図２では開口１２２ａ）が配置されていることが望ましい。
　さらに、被撮像物が撮像部１３の撮像視野ＦＶ内のどの位置にあっても輪郭の強調効果が得られるための条件について考える。このために必要とされる条件は、「少なくとも１つの点光源から細胞の周縁部に入射する光が、細胞のない状態では撮像部１３に入射せず、細胞による屈折があるときのみ撮像部１３に入射する」という状態が、被撮像物がどの位置にあっても成立することである。この条件が成立するとき、細胞の輪郭を強調するような屈折光を生じさせる点光源が少なくとも１つ存在することになる。
　図５Ａないし図５Ｃは点光源と細胞の周縁部との位置関係を示す図である。具体的には、図５Ａは点光源１２４と細胞Ｃの周縁部との水平距離Ｄｈが比較的小さい状態を示し、図５Ｂは点光源１２４と細胞Ｃの周縁部との水平距離Ｄｈが比較的大きい状態を示している。また、図５Ｃは点光源１２４と細胞Ｃの周縁部との水平距離Ｄｈが、図５Ａに示す状態と図５Ｂに示す状態との中間の値である状態を示している。
　図５Ａに示すように、点光源１２４と細胞Ｃの周縁部との水平距離Ｄｈが比較的小さい場合、細胞Ｃの周縁部での屈折がない場合（図に実線矢印で示す）、屈折がある場合（図に点線矢印で示す）のいずれにおいても、細胞Ｃの周縁部を透過した光は撮像光学系１３１の集光範囲（図に破線で示す）に入る。また、点光源１２４と細胞Ｃとの水平距離Ｄｈが十分大きいとき、図５Ｂに示すように、点光源１２４から出射され細胞Ｃの周縁部に入射する光がたとえ屈折したとしても、撮像光学系１３１の集光範囲には入らない。したがってこれらの場合、細胞Ｃの輪郭を強調する効果はなく、当該点光源１２４は単に背景の明るさを増加させるだけである。
　これに対し、点光源１２４と細胞Ｃとの水平距離Ｄｈが中程度の適度な距離である場合、図５Ｃに実線矢印で示すように焦点面ＦＰ付近に細胞がなければ撮像光学系１３１に入射しない光が、細胞Ｃの周縁部で屈折することで、点線矢印で示すように撮像光学系１３１の集光範囲（図に破線で示す）に入るようになる。このような光は、撮像される画像において細胞Ｃの輪郭を明るく光らせ強調する作用を有する。
　このように、１つの点光源１２４が細胞Ｃの輪郭を強調する効果を挙げるためには、当該輪郭部分と点光源１２４との水平距離が適切な範囲に入っている必要がある。言い換えれば、この範囲内に少なくとも１つの点光源１２４が常に存在するように点光源１２４を配置すれば、撮像視野ＦＶ内でどの位置に細胞Ｃが存在したとしても、細胞周縁部での光の屈折による輪郭の強調効果が得られることになる。
　図６は細胞がどの位置にあっても輪郭の強調効果が得られるための条件を示す図である。点光源１２４ａから細胞Ｃの周縁部の位置に向かう光Ｌ５は、細胞Ｃの周縁部での屈折があれば撮像光学系１３１に入射し、屈折がなければ撮像光学系１３１に入射しない。すなわち図５Ｃに示す状態である。このとき点光源１２４ａは細胞Ｃのうち図において左側の周縁部の輪郭を強調する作用を有する。
　特に図６に示される点光源１２４ａは、上記条件が満たされる範囲内で図中最も左寄りの位置にある。つまり、点光源１２４ａが図に示される位置よりも僅かでも左にあれば（細胞Ｃが僅かに右にあると考えても等価である）、図５Ａに示すように、点光源１２４ａから細胞Ｃの周縁部の位置に向かう光は屈折の有無によらず撮像光学系１３１に入射し、細胞Ｃの輪郭を強調する効果は失われる。この意味で、図６における細胞Ｃに対する点光源１２４ａの位置は、点光源１２４ａが細胞Ｃの輪郭を強調する作用を有するための臨界的な位置である。
　細胞Ｃがどの位置にあっても輪郭の強調効果を得られるようにするためには、細胞Ｃが図６に示す位置より僅かに右側にずれて点光源１２４ａによる輪郭強調作用が得られなくなったとしても、他の点光源から同様の作用が得られるようにすればよい。図６に示す点光源１２４ｂは、点光源１２４ａに隣接する位置であってこのような条件を満たす最も右寄りの位置にある。すなわち、図６の点光源１２４ｂの位置は、当該点光源１２４ｂから細胞Ｃの周縁部の位置に向かう光Ｌ６が細胞Ｃの周縁部で屈折することで撮像光学系１３１に入射するようになる位置のうち、最も右寄りの位置である。これよりも僅かに右側に点光源１２４ｂがあれば、細胞Ｃの周縁部で屈折する光Ｌ６は撮像光学系１３１に入射しなくなり、輪郭の強調効果は得られない。
　これらのことから、図６に示す点光源１２４ａ，１２４ｂの位置関係が、許容される両者間の最大間隔を表していると言える。最近接位置にある２つの点光源の間隔がこれより大きいとき、細胞Ｃの位置によっては輪郭の強調効果が得られない場合が生じ得る。一方、２つの点光源の間隔が上記最大間隔より小さくなっても、細胞Ｃの周縁部から撮像光学系１３１に入射する光量を増加させるという作用は損なわれない。しかし、光源の密度が高くなることによって背景輝度が上昇したり、細胞Ｃの周縁部に種々の方向から光が入射することで輪郭部分の幅が強調されたりすることで、細胞Ｃの輪郭を選択的に強調するという効果が却って低下することもあり得る。よって、点光源１２４の配列ピッチとしては、上記した最大間隔の値、またはこれよりも若干小さい値が選ばれることが好ましい。特に、細胞の光学的特性のばらつきを考慮すると、最大間隔の値よりも小さめの配列ピッチとすることでより確実に輪郭の強調効果を得ることが可能である。
　上記した最大間隔、つまり点光源の配列ピッチの最大値の導出を試みる。計算のために、点光源１２４ｂから細胞Ｃの周縁部に対する光Ｌ６の入射角をθ１、該光Ｌ６の下方（撮像光学系１３１側）への出射角を符号θ２により表す。また、点光源１２４ａから細胞Ｃの周縁部に対する光Ｌ５の入射角を符号θ３により表す。
　上記条件および図６から明らかなように、点光源１２４ａの位置は、当該点光源１２４ａから細胞Ｃの周縁部に入射する光Ｌ５の入射角θ３が、撮像光学系１３１の集光範囲の半角θｏと一致するような位置である。また、点光源１２４ｂの位置は、当該点光源１２４ｂから細胞Ｃの周縁部で屈折して下方（撮像光学系１３１側）へ出射する光Ｌ６の出射角θ２が撮像光学系１３１の集光範囲の半角θｏと一致するような位置である。ここで、撮像光学系１３１の集光範囲の半角θｏは撮像光学系１３１のＮＡ（開口数）に依存する値である。ここで述べた関係から、半角θｏを介して、θ２＝θ３であることがわかる。
　図６に示すように、２つの点光源の配列ピッチの最大値を符号Ｐにより表す。また、光出射面１２３と焦点面ＦＰとの間隔を符号Ｈにより表す。また、細胞Ｃの直径を符号φ、細胞Ｃと点光源１２４ａとの水平方向の中心間距離を符号Ｌにより表す。これらより、以下の式：
　　Ｈ・ｔａｎθ１＝Ｌ＋φ／２　　　…　（式１）
　　Ｈ・ｔａｎθ３＝Ｌ－Ｐ＋φ／２　…　（式２）
が得られる。
　ここで、細胞Ｃをレンズと見なし、その焦点距離を符号ｆにより表すこととする。細胞Ｃが他の各部の寸法より十分薄くて小さければ近軸光学が適用可能であり、この場合、レンズの公式を用いて次式：
　　１／｛（φ／２）／ｔａｎθ１｝－１／｛（φ／２）／ｔａｎθ２｝＝１／ｆ
　　　　　…　（式３）
が得られる。また（式３）を変形して次式：
　　ｔａｎθ１－ｔａｎθ２＝φ／２ｆ　…　（式４）
が得られる。
　（式４）に（式１）を代入してｔａｎθ１の項を消去すると、次式：
　　（Ｌ＋φ／２）／Ｈ＝ｔａｎθ２＋φ／２ｆ　…　（式５）
が得られる。一方、（式２）にθ２＝θ３を適用して変形すると、次式：
　　（Ｌ－Ｐ＋φ／２）／Ｈ＝ｔａｎθ２　…　（式６）
が得られる。（式５）から（式６）を差し引き変形すると、次式：
　　Ｐ＝Ｈ・φ／２ｆ　…　（式７）
が得られる。
　以上より、照明部１２における点光源１２４の好ましい配列ピッチの最大値Ｐは、被撮像物である細胞Ｃのサイズおよび当該細胞Ｃをレンズと見なしたときの焦点距離に依存することがわかる。本願発明者の知見では、典型的な細胞における直径φは２０μｍ程度、これをレンズと見なしたときの焦点距離ｆは０．１ｍｍ程度である。このような細胞の場合、光出射面１２３と焦点面ＦＰとの距離Ｈを例えば１５ｍｍとすれば、（式７）より配列ピッチＰの値は１．５ｍｍ程度となる。
　図７は細胞をレンズと見なす場合の焦点距離の求め方を示す図である。細胞Ｃをレンズと見なしたときの焦点距離ｆについては、例えば以下のようにして実験的に求めることが可能である。まず評価用試料が準備される。評価用試料は、例えばディッシュ等の適宜の試料容器Ｄｓに、撮像対象であるウェルＷに注入される培地Ｍと同じ培地Ｍｓと、被撮像物と同種の細胞Ｃｓとが担持されたものである。培地が異なると屈折率が異なるため、細胞のレンズ作用を適切に評価することができなくなる場合がある。
　試料容器Ｄｓの上方に、下向きに平行光Ｌｐを出射する光源ＬＳが配置され、下方にカメラ（例えば顕微鏡カメラ）ＣＭが配置される。平行照明下で、カメラＣＭにより評価用試料を観察しながらカメラＣＭを上下方向（Ｚ方向）に移動させると、細胞Ｃｓのレンズ作用により照明光が収束されてなるスポットの大きさが変化する。このスポットが最も小さくなるとき、細胞Ｃｓのレンズとしての焦点位置と、カメラＣＭの焦点位置とが上下方向において一致していると言える。したがって、このときのカメラＣＭの焦点位置から細胞Ｃｓまでの距離を、細胞Ｃｓのレンズとしての焦点距離ｆとすることができる。
　上記計算式を検証するための実験例について説明する。上記計算に基づき、本願発明者は、図２に示す遮光プレート１２２において各開口１２２ａを１辺０．５ｍｍの正方形とし、またその配列ピッチを１．５ｍｍとしたものを準備した。そして、被撮像物として３Ｔ３細胞を用いて撮像を行い、遮光プレート１２２の効果を確認した。
　図８Ａないし図８Ｄは撮像結果の例を示す図である。図８Ａは遮光プレート１２２を用いない拡散照明下での撮像結果の例を示している。画像中には、概ね一様な背景中に細胞に起因する高濃度の像が多数分布しているが、それぞれの形状はわかりにくい。図８Ｂは上記寸法の遮光プレート１２２を設置して撮像された画像の例であり、各々の細胞の輪郭部分が明るく光って形状がより視認しやすくなっていることがわかる。ただし、各開口１２２ａを通過して入射する直接光の影響により、背景に周期的な明暗が現れている。照明部１２は撮像光学系１３１の被写界深度より十分遠くにあるため、開口１２２ａの像が明瞭に現れるわけではなく、大きくデフォーカスされて明暗の変動として画像に現れている。
　図８Ｃは、図８Ｂに示す画像に二次元フィルタリング処理を行い、背景の周期成分に対応する比較的低い空間周波数成分を除去した画像である。背景の周期的な明暗の変化が大きく低減されており、各細胞の輪郭部分が明るく強調された画像が得られていることがわかる。このような画像は、細胞の輪郭が明瞭になっているため、細胞の形状、サイズ、個数等を目視によりまたは自動的に計測するのに好適なものとなっている。また、細胞内部のテクスチャ情報も比較的良好に保存されている。
　図８Ｄは、図８Ｃに示す画像に対し公知のエッジ強調処理を実施することで細胞の輪郭部分をさらに強調した画像の例である。図８Ｃに示す画像においては細胞の輪郭部分が選択的に明るく現れている。このため、必要に応じて適宜のエッジ強調処理を施すことで、図８Ｄに示すように、細胞の輪郭がより強調された画像を作成することも可能となる。また、エッジ強調処理を行うことで細胞の輪郭が選択的かつ適切に強調されるという事実からも、本実施形態の撮像方法が細胞の輪郭を明瞭に表した画像を得るのに適した方法であることが示される。
　遮光プレート１２２においては、各開口１２２ａの開口面積が大きいほど照明光の光量が大きくなり画像は明るくなる。しかしながら、一様な拡散光源に近づくため細胞の輪郭の強調効果は薄れる。開口１２２ａの開口面積が小さくなれば輪郭部分とその他の部分との明るさの比は大きくなるが、画像自体は暗くなる。この場合、面光源１２１からの出射光量を増加させることができれば、画像の明るさを改善することが可能である。これらのことから、目的に応じて画像品質を最適化するために、開口１２２ａの配列ピッチが同一で開口面積が異なる複数の遮光プレートが用意されてもよい。
　上記したように、点光源１２４の好ましい配列ピッチは、被撮像物の種類や状態によって異なる。このため、各種の被撮像物に対して良好に撮像を行うためには、照明部１２における点光源１２４の配列ピッチを被撮像物に応じて変化させることが望ましい。これを可能とする第１の方法は、以下のようなものである。この方法では、遮光プレート１２２が照明部１２から着脱可能に構成されるとともに、開口１２２ａの配列ピッチが互いに異なる複数種類の遮光プレート１２２が用意される。そして、目的に応じて遮光プレート１２２が取り換えられる。被撮像物の特性から（式７）により求められた値Ｐは、好ましい配列ピッチの上限を与えるものであり、光源の配列ピッチを厳密にこの値Ｐに設定することを求めるものではない。したがって、用意された複数の遮光プレート１２２のうち、開口１２２ａの配列ピッチが求められた値Ｐ以下で最も大きいものを選択すればよい。
　図９Ａおよび図９Ｂは点光源の配列ピッチを変更可能な照明部の他の構成例を示す図である。図９Ａに示す例において、照明部１２ａは、下向きに一様な拡散光を出射する面光源１２５と、面光源１２５の下面に沿って設けられた例えば液晶シャッターからなるシャッター部材１２６とを備えている。照明部１２ａが使用されるとき、制御部１４には照明部１２ａを制御する照明制御部１４７が設けられる。照明制御部１４７は、シャッター部材１２６を制御して、シャッター部材１２６の上面側から下面側へ透過する光の透過パターンを設定する。照明部１２ａとしては、例えば液晶シャッターとバックライトとが一体化された液晶表示パネルを好適に使用可能である。
　シャッター部材１２６による透過パターンが図２の遮光プレート１２２における透過パターンを模したものとされ、光を透過しない非透過部１２６ｂの内部に光を透過する透過部１２６ａが一定ピッチで配列されたものとされる。これにより、各透過部１２６ａが点光源１２４としての機能を果たすことになる。照明制御部１４７がシャッター部材１２６の透過パターンを種々に変更設定することで、点光源１２４の配列ピッチやサイズを種々に変化させることが可能である。
　図９Ｂに示す例においては、照明部１２ｂは、水平面に沿ってマトリクス配置された微小な多数の発光素子１２７を備えている。例えば、発光素子１２７としての発光ダイオード（ＬＥＤ）を有するマトリクスアレイを照明部１２ｂとして用いることが可能である。また、制御部１４には各発光素子１２７の点灯を個別に制御する照明制御部１４８が設けられる。照明部１２ｂに設けられた多数の発光素子１２７の全てまたは所定のピッチで選択された一部を点灯させることにより、点灯する発光素子１２７を点光源１２４として機能させることが可能である。点灯する発光素子１２７の組み合わせを照明制御部１４８が変更設定することにより、点光源１２４の配列ピッチを種々に変化させることが可能である。各発光素子１２７の光量を変更可能であることがより好ましい。
　図１０はこの撮像装置の動作例を示すフローチャートである。上記のように構成された撮像装置１の動作例について、図１０を参照しながら説明する。ここで説明する動作は、装置に搬入されたウェルプレートＷＰの各ウェルＷを撮像し、各ウェルＷ内の被撮像物の輪郭を強調した画像を作成する処理である。ウェルプレートＷＰに代えてディッシュ内に被撮像物が担持されている場合でも、基本的に同様の方法で撮像を行うことが可能である。この処理は、制御部１４に設けられたＣＰＵ１４１が、メモリ１４５に予め記録されている制御プログラムを実行して装置各部に所定の動作を行わせることにより実現される。
　生試料を培地Ｍとともに担持するウェルプレートＷＰが撮像装置１のホルダ１１にセットされると（ステップＳ１０１）、生試料に応じて点光源１２４の配列ピッチ（光源ピッチ）が設定される（ステップＳ１０２）。具体的には、複数種の遮光プレート１２２の中から、試料内の被撮像物である細胞に応じて（式７）に基づき算出された配列ピッチＰに対応するものが選択され、撮像装置１にセットされる。照明部の構成が図９Ａまたは図９Ｂに示すものである場合にも、照明制御部１４７または１４８により、被撮像物に応じて光源ピッチが適宜に設定される。
　このようにして設定された照明条件下で、撮像部１３によりウェルＷが撮像される（ステップＳ１０３）。ウェルプレートＷＰに設けられた全てのウェルＷについて撮像が行われてもよく、また特定のウェルＷについてのみ撮像が行われてもよい。得られた画像に対するトリミング加工により、ウェルＷに対応する部分がウェル画像として切り出され（ステップＳ１０４）、ウェル以外の余白部分が除去される。
　こうして得られたウェル画像では、図８Ｂに示すように、ウェルＷ内の細胞の輪郭が明るく強調されているが、離散的に分布する光源に起因する背景輝度の周期的な変動が含まれている。フィルタリング処理により、このような背景の明暗が除去される（ステップＳ１０５）。フィルタリング処理では、ウェル画像における明暗の変動周期に対応する空間周波数成分を阻止域に含むように遮断周波数が設定され、低域除去処理が実行される。
　画像における明暗の変動周期は、照明部１２における点光源１２４の配列ピッチ（光源ピッチ）と必ずしも同じではない。撮像倍率や撮像光学系１３１の視野角、焦点面ＦＰから光出射面１２３までの距離等が画像内での変動周期に反映される。これらの条件は既知であるから、点光源１２４の配列ピッチから画像における明暗の変動周期を求めることができる。また、除去すべき空間周波数成分についても決定することができる。
　点光源１２４の配列ピッチが可変である場合、背景の変動周期も変化するので、厳密にはフィルタリング処理における遮断周波数も変更する必要がある。しかしながら、画像中の細胞に対応する信号と背景に対応する信号とが明確に分離可能であれば、配列ピッチに応じて遮断周波数を細かく変更する必要は必ずしもない。例えば光源の配列ピッチに対応して変化する背景輝度の変動周期の最小値が、画像における細胞のサイズよりも十分に大きい場合を考える。このとき、当該周期成分を除去することができるように遮断周波数を設定することで、より長周期の（空間周波数の低い）変動成分についても除去することができる。そのため、遮断周波数の変更は不要である。
　フィルタリング処理により、図８Ｃに示す画像が得られる。必要であれば、この画像に対しエッジ強調処理を実行することで（ステップＳ１０６）、図８Ｄに示すように、細胞の輪郭部分がより強調された画像が得られる。すなわち、ステップＳ１０６の実行は必須でなく任意である。なお、画像の撮像と画像処理とは、異なる装置によって実行されてもよい。
　以上のように、この実施形態においては、暗視野撮像装置のような複雑な装置構成を用いることなく、より簡単な装置構成でありながら、被撮像物の輪郭が明るく強調された画像を得ることが可能である。
　以上説明したように、この実施形態においては、ウェルプレートＷＰが本発明の「試料容器」に相当し、これを保持するホルダ１１が本発明の「保持手段」として機能している。また、照明部１２が本発明の「照明手段」として機能し、面光源１２１および遮光プレート１２２がそれぞれ本発明の「面光源」および「遮光部」として機能している。また前述したように、遮光プレート１２２の各開口１２２ａが本発明の「窓部」に相当し、さらに本発明の「光出射部」に相当する。また、撮像部１３が本発明の「撮像手段」として機能し、ＣＰＵ１４１が本発明の「画像処理手段」として機能している。
　また、図９Ａに示す態様では、照明部１２ａが本発明の「照明手段」として機能し、このうち面光源１２５およびシャッター部材１２６が、それぞれ本発明の「面光源」および「液晶シャッター」に相当している。また、図９Ｂに示す態様では、多数の発光素子１２７を有する照明部１２ｂが本発明の「照明手段」として機能し、照明制御部１４８が本発明の「点灯制御手段」に相当する。
　なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記した照明部１２、１２ａ、１２ｂでは、複数の点光源１２４をＸ方向およびＹ方向のそれぞれにおいて一定ピッチで二次元マトリクス配置した構成としているが、点光源の配置はこれに限定されない。例えば次のような配置としてもよい。
　図１１は点光源の配置の他の例を示す図である。図１１Ａに示す例では、Ｙ方向に一定ピッチＰ１で配列された点光源１２４の列が、Ｘ方向にも同じピッチＰ１で、ただし、Ｙ方向にピッチＰ１の半分だけ位置を異ならせて配置される。また、図１１Ｂに示す例では、１つの点光源１２４を中心とした正六角形の各頂点に他の点光源１２４が配置されている。したがって、１つの点光源１２４の周囲には６つの点光源１２４が等距離かつ等角度間隔で配置されている。これらの配置を有する照明部を用いることによっても、上記と同様に被撮像物の輪郭部分を強調した画像を撮像することが可能である。なお、これらの場合、離散的な点光源に起因する画像中の背景輝度の変動の現れ方が異なる。これに対応するため、フィルタリング処理の方向や遮断周波数に関してさらなる変更が加えられてもよい。
　また、上記実施形態では撮像された画像に対しフィルタリング処理が実行され、背景輝度の周期的変動に対応する空間周波数成分が除去されている。しかしながら、単に輪郭が強調された画像を得るという目的においては、フィルタリング処理が省かれてもよい。例えばエッジ抽出処理等によって細胞の輪郭を検出し画像中の細胞の個数を自動的に計数する目的であれば、細胞の輪郭が明確になっていれば背景の輝度変動は問題にならない。このような場合、フィルタリング処理を省くことが可能である。
　また、上記実施形態における遮光プレート１２２は断面形状が正方形の開口１２２ａを有するものである。しかしながら、開口形状はこれに限定されるものではなく任意である。また、開口１２２ａの内部空間が光透過性のある材料により充填されていてもよい。
　以上、具体的な実施形態を例示して説明してきたように、この発明にかかる撮像装置および撮像方法は、例えば、照明手段が試料容器に対し、配置ピッチに対応する周期的な明暗を有する照明光を入射させる構成であってもよい。このような構成によれば、画像に周期的な明暗が現れることになるが、その周期は既知である。このため、必要であれば例えば画像処理により事後的に除去することが可能である。このような背景の変動が許容されることで、被撮像物の周縁部をより効果的に強調した画像を得ることが可能となる。
　また例えば、光出射部の配置ピッチが変更可能であってもよい。このような構成によれば、被撮像物に応じて照明パターンを最適化することで、被撮像物の周縁部の強調効果をより向上させることが可能となる。
　また例えば、被撮像物が細胞であり、細胞の直径をφ、細胞をレンズと見なしたときの焦点距離をｆ、平面と焦点面との距離をＨ、配置ピッチをＰとしたとき、
　　Ｐ≦Ｈ・φ／（２ｆ）
の関係が成立する構成であってもよい。これは、細胞がどの位置にあっても、複数配置された点光源の少なくとも１つが被撮像物の周縁部を明るく光らせる作用を発揮するための条件である。この条件が満たされるとき、被撮像物の周縁部が明るく強調された画像を得ることができる。
　また例えば、照明手段は、試料容器に向けて拡散光を出射する面光源と、面光源と試料容器との間に焦点面と平行に配置される遮光性の平板に、光透過性の窓部が配置ピッチで複数設けられた遮光部とを有する構成であってもよい。このような構成によれば、複数の窓部のそれぞれから拡散光が出射されることで、窓部が光出射部として機能し、本発明の効果を得ることができる。
　この場合さらに、遮光部が着脱可能に構成され、配置ピッチが互いに異なる複数の遮光部を選択的に装着可能であるように構成されてもよい。このような構成によれば、目的に応じて光出射部の配置ピッチを変化させることができる。
　また例えば、照明手段は、平面内に二次元配置された複数の発光素子を有する構成であってもよい。このような構成によれば、発光素子の各々が光出射部として機能することで、上記のような発明の効果を得ることが可能である。
　この場合さらに、発光素子の点灯を制御し、発光素子のうち点灯するものと消灯するものとの組み合わせを変更可能な点灯制御手段が設けられてもよい。このような構成によれば、点灯させる発光素子の組み合わせを変えることにより、光出射部の配置ピッチを変化させることが可能である。
　また例えば、照明手段は、試料容器に向けて拡散光を出射する面光源と、面光源と試料容器との間に配置された液晶シャッターとを有する構成であってもよい。このような構成によれば、液晶シャッターが所定の透過パターンを実現することで、上記のように光出射部が離散的に分布する照明手段を構成することができる。
　また例えば、撮像された画像に対し、配置ピッチに対応する空間周波数成分を除去するフィルタ処理が実行されてもよい。このような構成によれば、離散的に配置される光出射部に起因する画像の背景輝度の変動が除去された画像を得ることができる。
　また、本発明にかかる撮像方法は、被撮像物に応じて配置ピッチを設定する工程をさらに備えるものであってもよい。このような構成によれば、光出射部の配置ピッチを変更することで、種々の被撮像物に対して適切な照明条件で撮像を行い、その周縁部が強調された画像を得ることが可能である。
　また例えば、配置ピッチは、画像において背景輝度の変動周期が被撮像物のサイズよりも大きくなるように設定されてもよい。このような構成によれば、背景に対応する比較的低い空間周波数成分に、被撮像物に対応する高い空間周波数成分が重畳された画像が得られる。そのため、背景と被撮像物とを空間周波数によって明確に分離することができる。
　以上、特定の実施例に沿って発明を説明したが、この説明は限定的な意味で解釈されることを意図したものではない。発明の説明を参照すれば、本発明のその他の実施形態と同様に、開示された実施形態の様々な変形例が、この技術に精通した者に明らかとなるであろう。故に、添付の特許請求の範囲は、発明の真の範囲を逸脱しない範囲内で、当該変形例または実施形態を含むものと考えられる。
　本発明は、例えば培地中で二次元培養された細胞または細胞コロニーのように、拡散光照明下では十分なコントラストを得ることができない被撮像物を、特にその輪郭部分を明瞭に撮像することが求められる用途に好適である。
　１　撮像装置
　１１　ホルダ（保持手段）
　１２，１２ａ，１２ｂ　照明部（照明手段）
　１３　撮像部（撮像手段）
　１２１，１２５　面光源
　１２２　遮光プレート（遮光部）
　１２２ａ　開口（窓部、光出射部）
　１２３　光出射面
　１２４　点光源（光出射部）
　１２６　シャッター部材（液晶シャッター）
　１２７　発光素子（光出射部）
　１３１　撮像光学系
　１３２　撮像素子
　１４１　ＣＰＵ（画像処理手段）
　１４８　照明制御部（点灯制御手段）
　Ｃ　細胞（被撮像物）
　ＷＰ　ウェルプレート（試料容器）

Claims (15)

  1. 　被撮像物である生試料を担持する試料容器を保持する保持手段と、
    　前記試料容器を照明する照明手段と、
    　前記照明手段から出射され前記試料容器を透過する透過光を受光して前記被撮像物の透過像を撮像する撮像素子、および、前記試料容器と前記撮像素子との間に配置されて前記透過光を前記撮像素子に結像させる撮像光学系を有する撮像手段と
    を備え、
    　前記照明手段は、前記撮像光学系の焦点面に平行な平面に沿って互いに離隔して一定の配置ピッチで二次元配置されて各々が前記試料容器に向けて拡散光を出射する複数の光出射部を有し、
    　前記平面は、前記撮像手段から見て前記撮像光学系の被写界深度の範囲よりも遠く、該平面のうち前記撮像手段の視野を含み該視野よりも広い領域内に、前記複数の光出射部が配置されている撮像装置。
  2. 　前記照明手段は、前記試料容器に対し、前記配置ピッチに対応する周期的な明暗を有する照明光を入射させる請求項１に記載の撮像装置。
  3. 　前記光出射部の配置ピッチが変更可能である請求項１または２に記載の撮像装置。
  4. 　前記被撮像物が細胞であり、前記細胞の直径をφ、前記細胞をレンズと見なしたときの焦点距離をｆ、前記平面と前記焦点面との距離をＨ、前記配置ピッチをＰとしたとき、
    　　Ｐ≦Ｈ・φ／（２ｆ）
    の関係が成立する請求項１ないし３のいずれかに記載の撮像装置。
  5. 　前記照明手段は、
    　前記試料容器に向けて拡散光を出射する面光源と、
    　前記面光源と前記試料容器との間に前記焦点面と平行に配置される遮光性の平板に、光透過性の窓部が前記配置ピッチで複数設けられた遮光部と
    を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
  6. 　前記遮光部が着脱可能に構成され、前記配置ピッチが互いに異なる複数の前記遮光部を選択的に装着可能である請求項５に記載の撮像装置。
  7. 　前記照明手段は、前記平面内に二次元配置された複数の発光素子を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
  8. 　前記発光素子の点灯を制御し、前記発光素子のうち点灯するものと消灯するものとの組み合わせを変更可能な点灯制御手段を備える請求項７に記載の撮像装置。
  9. 　前記照明手段は、
    　前記試料容器に向けて拡散光を出射する面光源と、
    　前記面光源と前記試料容器との間に配置された液晶シャッターと
    を有する請求項１ないし４のいずれかに記載の撮像装置。
  10. 　前記撮像手段により撮像された画像に対し、前記配置ピッチに対応する空間周波数成分を除去するフィルタ処理を実行する画像処理手段を備える請求項１ないし９のいずれかに記載の撮像装置。
  11. 　被撮像物である生試料を担持する試料容器を照明手段が照明する工程と、
    　前記照明手段から出射され前記試料容器を透過する透過光を受光して前記被撮像物の透過像を撮像する撮像素子、および、前記試料容器と前記撮像素子との間に配置されて前記透過光を前記撮像素子に結像させる撮像光学系を有する撮像手段が前記被撮像物の画像を取得する工程と
    を備え、
    　前記照明手段は、前記撮像光学系の焦点面に平行な平面に沿って互いに離隔して一定の配置ピッチで二次元配置されて各々が前記試料容器に向けて拡散光を出射する複数の光出射部を有し、
    　前記平面は、前記撮像手段から見て前記撮像光学系の被写界深度の範囲よりも遠く、該平面のうち前記撮像手段の視野を含み該視野よりも広い領域内に、前記複数の光出射部が配置される撮像方法。
  12. 　前記照明手段から前記試料容器に入射する光が前記配置ピッチに対応する周期的な明暗を有する請求項１１に記載の撮像方法。
  13. 　被撮像物に応じて前記配置ピッチを設定する工程を備える請求項１１または１２に記載の撮像方法。
  14. 　前記配置ピッチは、前記画像において背景輝度の変動周期が前記被撮像物のサイズよりも大きくなるように設定される請求項１１ないし１３のいずれかに記載の撮像方法。
  15. 　撮像された前記画像に対し、前記配置ピッチに対応する空間周波数成分を除去するフィルタ処理を実行する工程を備える請求項１１ないし１４のいずれかに記載の撮像方法。
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