TWI641824B - 攝像裝置及攝像方法 - Google Patents

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TWI641824B
TWI641824B TW105133936A TW105133936A TWI641824B TW I641824 B TWI641824 B TW I641824B TW 105133936 A TW105133936 A TW 105133936A TW 105133936 A TW105133936 A TW 105133936A TW I641824 B TWI641824 B TW I641824B
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Abstract

本發明係提供一種利用簡單之裝置構成而獲得被攝像物之輪廓清晰之圖像的攝像裝置及攝像方法。利用具有以一定間距離散地配置之複數個光出射部124的照明機構12照明被攝像物C，利用攝像機構13進行透射攝像。被攝像物C之周緣部使入射光折射，藉此若沒有被攝像物則不入射之光L2、L3將入射至攝像機構13。因此，可獲得被攝像物C之輪廓被明亮地強調之圖像。

Description

攝像裝置及攝像方法
本發明係關於一種將擔載於樣本容器之活體樣本在照明下予以攝像之技術，特別係關於其照明。
在醫療及生化學等領域，為了觀察或分析包含細胞或細菌等之活體樣本等，用於攝像該等活體樣本之裝置被實用化。由於培養液中之細胞近乎透明，故在例如被攝像物為沿容器之底面具有二維擴展性之細胞的情形下，有在通常之明視場攝像中難以獲得充分之對比度之情形。在如此之被攝像物之攝像中係使用暗視場攝像技術或相位差顯微鏡，但由於照明及攝像光學系之構造為特殊，故特別在對寬廣視場予以攝像之情形下，裝置構成變得大型且高價。
針對此問題，在例如日本特開2008-256610號公報所記載之觀察裝置中，係使用了在明部與暗部為週期性配置之週期光源上，組合有以與此相反之相位而設置有遮光部與開口部之遮光機構的照明。根據如此之構成，由於從光源直接朝向攝像機構之光被遮光機構遮光，而僅有在被攝像物處折射或散射等之光入射至攝像機構，故可獲得與暗視場攝像相同之攝像結果。
在上述先前技術中，有必要相應於攝像光學系之集光特性而改變照明之構成。例如若攝像光學系為具有遠心特性者，則可將光源及遮光機構之週期間距設為一定。然而，視場寬廣之遠心光學系不適宜小型化且容易造成高成本。又，例如，若攝像光學系為具有非遠心特性者，則為了適合其集光特性，需要有週期間距為不均等之光源及遮光機構。進而，為了使照明與攝像光學系之相位匹配，亦有必要使二者之相對位置不變。
在如包含多個作為被攝像物之細胞之寬廣視場下的攝像，有以計測分佈於樣本內之細胞之數目及尺寸為目的而進行之情形。在如此之情形下，需要與各個細胞之內部組織相比，各細胞之輪廓清晰地顯現之圖像。上述先前技術未必一定適合如此之需求。
本發明係鑒於上述課題而完成者，其目的在於，提供一種可利用簡單之裝置構成而獲得被攝像物之輪廓清晰的圖像之技術。
本發明之一個態樣係一種攝像裝置，其為了達成上述目的而具備：保持機構，其將擔載作為被攝像物之活體樣本之樣本容器予以保持；照明機構，其照明前述樣本容器；及攝像機構，其具有接受從前述照明機構出射而透射前述樣本容器之透射光並攝像前述被攝像物之透射像的攝像元件、及配置於前述樣本容器與前述攝像元件之間且使前述透射光於前述攝像元件結像的攝像光學系。
又，本發明之另一態樣係一種攝像方法，其為了達成上述目的而具備：照明機構對擔載作為被攝像物之活體樣本之樣本容器予以照明的工序；及攝像機構獲取前述被攝像物之圖像的工序，該攝像機構具有接受從 前述照明機構出射而透射前述樣本容器之透射光並攝像前述被攝像物之透射像的攝像元件、及配置於前述樣本容器與前述攝像元件之間且使前述透射光於前述攝像元件結像的攝像光學系。
在該等發明中，前述照明機構具有沿與前述攝像光學系之焦點面平行之平面彼此隔開並以一定之配置間距二維配置，且分別朝向前述樣本容器出射擴散光之複數個光出射部，前述平面從前述攝像機構觀察較前述攝像光學系之景深之範圍更遠，在該平面中之包含前述攝像機構之視場且較該視場更寬廣之區域內，配置有前述複數個光出射部。根據如此之構成，可利用簡單之裝置構成而獲得對比度良好、特別是被攝像物之輪廓清晰之圖像。其理由係如以下所述。
在本發明中，在從攝像機構觀察照明機構時之視場內，包含以一定間距而配置之複數個光出射部。因此，從複數個光出射部出射之光直接入射至攝像元件，在圖像中包含光出射部之像。由於配置有光出射部之平面位於較攝像光學系之景深更遠處，故在所攝像之圖像中，光出射部之像散焦。因此，只要光出射部配置於充分遠處，圖像中就不會顯現光出射部之鮮明之像，而僅顯現與光出射部之配置間距相對應的具有週期性且緩和的明暗變動。
已知悉：活體樣本中之細胞等之被攝像物近乎透明，細胞如透鏡般作用，特別是入射至細胞之周緣部的光因折射而行進方向發生變化。因此，即便為在沒有被攝像物之情形下不入射至攝像機構之光，亦有因被攝像物折射，而在入射至攝像機構之方向上行進路徑被彎曲之情形。特別是在被攝像物之周緣部此傾向強烈，此情形會選擇性地使被攝像物之周緣部變亮。
即便為通常之擴散光源亦會發生如此之折射現象。然而，即便在被攝 像物內部及其外側之背景部，由於光從各種方向入射，故圖像整體變亮，而細胞周緣部之對比度之提高效果有所限定。另一方面，在本發明中，與以在視場內獲得大致相同之光量分佈為目的之擴散照明不同，擴散光從離散地配置之光出射部之各者出射。藉此，在被攝像物之背景部產生週期性之明暗變動。因此，背景部之平均亮度與使用相同之照明、亦即光出射部無縫隙地配置之照明之情形相比降低。然而，與直接光被完全地遮光之暗視場攝像技術及專利文獻1所記載之技術相比，背景部更明亮。
因此，起因於折射之被攝像物之周緣部的亮度相對於背景部被相對地加強。因此，在所攝像之圖像中，被攝像物之輪廓部分被強調。作為結果，所獲得之圖像係成為包含輪廓部分被強調之被攝像物之像與對應於光出射部之配置間距而顯現之背景部之週期性之明暗者。由於背景部之明暗變動之週期為已知，故將如此之空間頻率成分從圖像中除去會比較容易。藉由從圖像中減去背景部之週期性之明暗變動，而可獲得由亮度變化少之背景與輪廓部分被強調之被攝像物之像構成之圖像。
在本發明中，從被攝像物出射之光之光量分佈其本身係在被攝像物之輪廓部分光量被加強者。因此，可不依靠攝像光學系之集光特性而獲得相同之效果。
如上述般，在本發明中，在利用出射擴散光之複數個光出射部為沿較攝像光學系之景深更遠之平面而以一定間距配置的照明機構之照明下，被攝像物被透射攝像。根據如此之構成，即便為簡單之裝置構成，仍可獲得被攝像物之輪廓清晰之圖像。
本發明之前述以及其他之目的與新穎的特徵，只要參照附圖且閱讀以 下之詳細說明，即可更完全地明確。惟，圖式係專門用於解說者，並不限定本發明之範圍。
1‧‧‧攝像裝置
11‧‧‧保持器
12‧‧‧照明部
12a‧‧‧照明部
12b‧‧‧照明部
13‧‧‧攝像機構
14‧‧‧控制部
121‧‧‧面光源
122‧‧‧遮光板
122a‧‧‧開口
123‧‧‧光出射面
124‧‧‧光出射部
124a‧‧‧點光源
124b‧‧‧點光源
125‧‧‧面光源
126‧‧‧快門構件
126a‧‧‧透射部
126b‧‧‧非透射部
127‧‧‧發光元件
131‧‧‧攝像光學系
132‧‧‧攝像元件
141‧‧‧CPU
142‧‧‧介面(IF)部
143‧‧‧AD轉換器(A/D)
144‧‧‧圖像記憶體
145‧‧‧記憶體
146‧‧‧機械控制部
147‧‧‧照明控制部
148‧‧‧照明控制部
AX‧‧‧光軸
C‧‧‧被攝像物/細胞
CM‧‧‧照相機
Cs‧‧‧細胞
Dh‧‧‧水平距離
DOF‧‧‧景深
Ds‧‧‧樣本容器
f‧‧‧焦距
FP‧‧‧焦點面
FV‧‧‧攝像視場
H‧‧‧間隔/距離
L‧‧‧中心間距
L1‧‧‧光
L2‧‧‧光
L3‧‧‧光
L4‧‧‧光
L5‧‧‧光
L6‧‧‧光
Lp‧‧‧平行光
LS‧‧‧光源
M‧‧‧培養基
Ms‧‧‧培養基
P‧‧‧配置間距
P1‧‧‧間距
W‧‧‧孔
WP‧‧‧孔板
θO‧‧‧半角
θ1‧‧‧光L6之入射角
θ2‧‧‧光L6之出射角
θ3‧‧‧光L5之入射角
‧‧‧細胞C之直徑
圖1係顯示本發明之攝像裝置及攝像方法之一個實施方式的圖。
圖2係更詳細地顯示照明部之構成的圖。
圖3A係顯示該實施方式之照明部之作用的第1個圖。
圖3B係顯示該實施方式之照明部之作用的第2個圖。
圖4A係顯示在焦點面附近存在細胞時之光之分佈的第1個圖。
圖4B係顯示在焦點面附近存在細胞時之光之分佈的第2個圖。
圖5A係顯示點光源與細胞之周緣部之位置關係的第1個圖。
圖5B係顯示點光源與細胞之周緣部之位置關係的第2個圖。
圖5C係顯示點光源與細胞之周緣部之位置關係的第3個圖。
圖6係顯示無論細胞位於何一位置，皆可獲得輪廓之強調效果之條件的圖。
圖7係顯示在將細胞視為透鏡之情形下之焦距之求法的圖。
圖8A係顯示攝像結果之例的第1個圖。
圖8B係顯示攝像結果之例的第2個圖。
圖8C係顯示攝像結果之例的第3個圖。
圖8D係顯示攝像結果之例的第4個圖。
圖9A係顯示可變更點光源之排列間距之照明部之另一例的第1個圖。
圖9B係顯示可變更點光源之排列間距之照明部之另一例的第2個圖。
圖10係顯示該攝像裝置之動作例的流程圖。
圖11A係顯示點光源之配置之又一例的第1個圖。
圖11B係顯示點光源之配置之又一例的第2個圖。
圖1係顯示本發明之攝像裝置及攝像方法之一個實施方式的圖。在該實施方式中，在注入於形成於孔板WP之上表面之被稱為孔W之凹窪部的液體中所培養之細胞等之活體樣本，係利用攝像裝置1而被攝像。在圖1中，XY平面表示水平面。又，Z軸表示鉛垂軸，更詳細而言，(-Z)方向表示鉛垂朝下方向。
孔板WP係在藥物開發及生物科學之領域被普遍使用者，在平板狀之板之上表面，設置有複數個剖面形成為大致圓形之筒狀並且底面為透明且大致平坦的孔W。1個孔板WP上之孔W之數目為任意，可使用例如96個(12×8之矩陣排列)者。各孔W之直徑及深度典型的是數mm程度。另外，作為該攝像裝置1之對象之孔板之尺寸及孔之數目不限定於該等而可為任意，例如可利用被普遍使用之12至384孔的孔板。又，不限定於具有複數個孔之孔板，例如在被稱為皿之平型之容器所培養之活體樣本的攝像中，亦可使用該攝像裝置1。
在孔板WP之各孔W中，作為培養基M之液體被以特定量注入，在該液體中，於特定之培養條件下被培養之細胞係成為該攝像裝置1之被攝像物。培養基M可為添加有適當之試劑者，或亦可為以液狀投入至孔W後凝膠化者。常用之一般液量為50至200微升左右。
另外，作為於孔W內培養且成為攝像對象之活體樣本，除適用孤立之細胞以外，亦可適用多個細胞在培養基M內以二維展開之方式分佈的細胞群落等。又，亦可使用攝像裝置1攝像從生物體摘出之組織或細菌等之活體樣本。以下，有將此等成為被攝像物者統稱為「細胞等」之情形。
攝像裝置1具備：保持器11，其將孔板WP予以保持；照明部12，其配置於保持器11之上方；攝像部13，其配置於保持器11之下方；及控制部14，其具有控制該等各部之動作的CPU 141。保持器11與將細胞等和培養基M一起擔載於各孔W之孔板WP之下表面周緣部抵接，而將孔板WP以大致水平姿勢予以保持。
照明部12朝向由保持器11保持之孔板WP出射照明光(例如白色光)。更具體而言，照明部12具備：面光源121，其出射具有朝下之方向成分之擴散光；及遮光板122，其配置於面光源121與孔板WP之間。遮光板122係複數個開口以一定間距被二維排列之平板狀構件。從面光源121出射之擴散光之中，通過遮光板122之開口的光成分照射至孔板WP。換言之，在照明部12中，遮光板122之各個開口朝向孔板WP出射擴散光。
在由保持器11保持之孔板WP之下方，設置有攝像部13。在攝像部13中，在孔板WP之正下方位置配置有包含物鏡之攝像光學系131，攝像光學系131之光軸AX係朝向鉛垂方向(Z方向)。在圖中攝像光學系131係代表性地以1個物鏡而顯示，但亦可為透鏡等之光學元件經複數個組合者。
利用攝像部13，孔W內之活體樣本被攝像。具體而言，從照明部12出射，自孔W之上方入射至培養基M之光對作為被攝像物之細胞等予以照明，從孔W底面朝下方透射之光經由攝像光學系131而入射至攝像元件132之受光面。利用攝像光學系131而在攝像元件132之受光面結像之被攝像物之像係由攝像元件132攝像。作為攝像元件132，可使用例如CCD(Charge Coupled Device；電荷耦合元件)感測器或CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor；互補金氧半導體)感測器，二維圖像感測器及一維圖像感測器之任一者皆可。
攝像部13可利用設置於控制部14之機械控制部146而在XYZ方向上移動。具體而言，藉由機械控制部146基於來自CPU 141之控制指令使攝像部 13在X方向及Y方向上移動，藉此攝像部13相對於孔W在水平方向上移動。又，藉由攝像部13之朝Z方向之移動而進行對焦調整。機械控制部146將攝像部13在水平方向上定位成位於攝像對象之孔W之正下方位置。在攝像部13之攝像元件為一維圖像感測器之情形下，藉由使攝像部13在與圖像感測器之長度方向正交之方向上掃描，可攝像二維圖像。在如此之攝像方法中，可在對作為被攝像物之細胞等不接觸、不破壞且不侵襲之下進行攝像，而可抑制因攝像造成之對細胞等之損傷。
從攝像部13之攝像元件132輸出之圖像信號被給送至控制部14。亦即，圖像信號被輸入至設置於控制部14之AD轉換器(A/D)143而變換為數位圖像資料。CPU 141基於所接收之圖像資料而執行適當圖像處理。控制部14進一步具有用於記憶保存圖像資料之圖像記憶體144、及用於記憶保存CPU 141應執行之程式及由CPU 141生成之資料的記憶體145，但該等亦可一體化。CPU 141藉由執行記憶於記憶體145之控制程式來進行後述之各種演算處理。
另外，在控制部14設置有介面(IF)部142。介面部142除進行來自使用者之操作輸入之受理及對使用者之處理結果等之資訊提示之外，還進行與經由通信線路而連接之外部裝置之間的資料交換。另外，控制部14可為具備上述之硬體之專用裝置，又可為在個人電腦或工作站等之泛用處理裝置中，組入用於實現後述之處理機能之控制程式者。亦即，作為該攝像裝置1之控制部14，可利用泛用之電腦裝置。在使用泛用處理裝置之情形下，為了使攝像部13等之各部動作，於攝像裝置1只要具備必要最小限度之控制機能就足夠。
圖2係更詳細地顯示照明部之構成的圖。照明部12具有在面光源121 之下方接近配置有遮光板122之構造。遮光板122具有在由遮光性材料形成之平板狀構件上，於X方向及Y方向上分別以一定間距而設置有複數個開口122a之構造。遮光板122之外形尺寸與面光源121之平面尺寸相同或較其更大。另外，在圖1及圖2所示之例中，面光源121與遮光板122之間係具有間隙，但該等亦可密接。在照明部12中，較佳的是遮光板122相對於光源121固定脫離自如。
在從攝像部13觀察遮光板122之下表面時，開口122a係以在攝像部13之攝像視場FV(Field of View；視場)內，於X方向及Y方向之各者中包含複數個開口122a之方式而配置。又，在X方向及Y方向之各者中，較攝像視場FV之兩端部更外側處亦分別設置有至少1個開口122a。針對具體之尺寸例將在後文敘述。
從面光源121出射之光係被遮光板122遮光，但入射至開口122a之光係通過遮光板122而被出射至孔板WP側。另外，開口122a係具有使來自面光源121之出射光部分性通過之機能者，只要具有相同之機能，遮光板亦可為其他之構造。例如，可為在開口部設置有透明窗之構造。又，亦可為在透明之平板狀構件上設置由遮光性材料製成之遮罩圖案，在該遮罩圖案上規則地配置有使光通過之透射部的構造。
又，遮光板只要是對向於孔板WP而排列有開口之面為概略平面狀即可，整體之形狀並不限定於板狀。例如，亦可為在收容面光源之盒體之底面設置開口，該底面具有作為遮光板之機能者。
在如上述般構成之照明部12中，遮光板122之下表面作為出射照明光之「光出射面」而發揮機能。亦即，以一定間距設置於遮光板122之開口122a分別成為出射作為照明光之擴散光的有效之「光出射部」，而可將各開口122a視為模擬之點光源。形容為「模擬之」的理由係由於開口122a在 具有有限之開口尺寸此點上與理想之點光源不同。並且，如此之光出射部在遮光板122之下表面規則地排列，該下表面成為光出射面。因此，在以下之說明中，有將照明部12作為「在光出射面以一定間距而矩陣配置有複數個點光源者」而示意性地顯示之情形。
圖3A及圖3B係顯示該實施方式之照明部之作用的圖。更具體而言，圖3A係顯示照明部12與攝像部13之位置關係的圖。又，圖3B係顯示由攝像部13接受之透射光之光量分佈的圖。在圖3A中，照明部12係作為在水平之光出射面123上排列有複數個點光源124者而表示。攝像部13之焦點與作為被攝像物之細胞等所分佈之位置對準。亦即，以在攝像光學系131之景深DOF(Depth of Field；景深)內納入被攝像物之方式進行焦點調整，此時攝像光學系131之焦點面FP(Focal Plane；焦點面)大致位於孔W之底面附近。
另一方面，照明部12係配置於從攝像部13觀察較被攝像物更遠處，光出射面123位於距離攝像光學系131之景深DOF充分遠處。在光出射面123上，於攝像部13之攝像視場FV內配置有複數個點光源124。因此，來自各點光源124之出射光之一部分直接入射至攝像部13之攝像光學系131，在所攝像之圖像中包含位於攝像視場FV內之點光源124之像。惟，由於光出射面123較攝像光學系131之景深DOF充分遠，故點光源124之像成為散焦者。因此，如圖3B所示，入射至攝像部13之光具有以相應於點光源124之排列間距之週期而明暗為緩和地變化之光量分佈。
在圖3B中，虛線係表示在利用出射實質上相同之擴散光的面光源、亦即具有與點光源充分接近而排列者等價之光源的照明部而照明之情形下的光量分佈。在此情形下，入射至攝像部13之光之光量分佈大致相同。與此相對，在利用本實施方式之照明部12之照明下，由於光源分散故整體上光 量為小，且在空間上光量分佈具有週期性變動。
圖4A及圖4B係顯示在焦點面附近存在細胞時之光之分佈的圖。更具體而言，圖4A係顯示此時之光線圖之例的圖，圖4B係顯示由攝像部13接受之透射光之光量分佈的圖。細胞C係大致透明，其折射率與培養基之折射率的差非常小。因此，特別是在沿孔W底面薄薄地擴展之細胞C之情形下，在擴散照明下，與背景之培養基之光學濃度之差異為小。然而，由於在自上或自下觀察細胞C時之相當於周緣部之部分，細胞C表面之曲率為大，故在該部分光之折射比較上變大。
因此，如圖4A中符號L2、L3所示般，發生從任一者之點光源124出射之光之中，若沒有細胞C則不入射至攝像部13之光藉由在細胞C之周緣部折射而行進方向發生變化從而入射至攝像部13此現象。圖中，折射光以虛線箭頭表示。由於入射至細胞C之中央部之光L4透射細胞C而入射至攝像部13，故光量與沒有細胞之情形相比變化不大。細胞之外部之背景部分亦相同。
此係意味著，從細胞C之周緣部入射至攝像部13之光被選擇性增強，作為結果，有在所攝像之圖像中細胞C之輪廓明亮地被強調之效果。亦即，如圖4B所示般，由攝像部13接受之光在具有與細胞不存在之情形相同之週期性光量變動的背景上，成為在對應於細胞C之周緣部之位置局部性高光量之峰值重疊之光量分佈。
在照明部為相同之面光源之情形下，相對於焦點面FP上之各點，照明光從各種方向入射，而獲得相同之亮度之圖像。因此，細胞周緣部之折射光混雜於背景，而強調輪廓之效果為小。在本實施方式中，由於使照明光從與光出射面123隔開而散佈存在之點光源124入射，故朝焦點面FP上之各 點之直接光之入射方向為離散。因此，圖像整體之平均亮度較相同光源之情形降低，但在自點光源124入射至細胞周緣部之直接光折射而入射至攝像部13之情形下，光量之增加更為顯著。藉此，輪廓之強調效果亦為顯著。
如圖4B所示般，在所攝像之圖像上，出現起因於點光源124之離散分佈的週期性之背景亮度之變動。然而，由於點光源124之排列間距為已知，故亦可事前把握該變動週期。若變動週期相對於作為被攝像物之細胞C之尺寸充分大，則可進行從所獲得之圖像除去對應於該變動週期之空間頻率成分的圖像處理，將變動成分在事後消除，而獲得輪廓部分之亮度被強調之細胞C之圖像。
以下，針對照明部12之點光源124之排列間距予以說明。如上述般，為了利用圖像處理而除去照明光之變動成分，較佳的是在所攝像之圖像中，與作為被攝像物之細胞或細胞群落之尺寸相比，光源之排列間距更大。在此情形下，並非直接比較被攝像物之實際尺寸與光源之排列間距，而是對比圖像內之被攝像物之尺寸與圖像內之背景光之變動週期。此係由於：根據攝像倍率及視場角、被攝像物及光出射面123距離物鏡的距離，圖像內之表觀之大小發生變化所致。在多數情形下，作為被攝像物之細胞等之尺寸為數十μm程度。因此，可考量藉由例如將點光源之排列間距設為數mm，而比較容易地滿足上述條件。
又，在背景亮度之週期性變動在事後被除去之前提之下，容許一定週期之背景亮度之變動。另一方面，使得無論被攝像物位於何一位置，照明條件皆不會極端地變化。因此，較佳的是在攝像部13之攝像視場FV內包含複數個點光源124。更詳細而言，較佳的是如圖2所示般，光出射面123之中，在攝像部13之攝像視場FV所包含之區域二維地、亦即在不同之2方向 之各者上配置有複數個點光源124(圖2中為開口122a)。
進而，針對用於無論被攝像物位於攝像部13之攝像視場FV內之何一位置，皆可獲得輪廓之強調效果的條件進行考量。為此視為必要之條件係：「從至少1個點光源入射至細胞之周緣部之光，在沒有細胞之狀態下不入射至攝像部13，僅於存在有因細胞引起之折射時入射至攝像部13」此狀態，無論被攝像物位於何一位置皆成立。在該條件成立時，將至少存在1個使如強調細胞之輪廓般之折射光產生之點光源。
圖5A至圖5C係顯示點光源與細胞之周緣部之位置關係的圖。具體而言，圖5A顯示點光源124與細胞C之周緣部之水平距離Dh為比較小之狀態，圖5B顯示點光源124與細胞C之周緣部之水平距離Dh為比較大之狀態。又，圖5C顯示點光源124與細胞C之周緣部之水平距離Dh為圖5A所示之狀態與圖5B所示之狀態之中間之值的狀態。
如圖5A所示，在點光源124與細胞C之周緣部之水平距離Dh為比較小之情形下，不論在沒有細胞C之周緣部之折射之情形下(圖中以實線箭頭表示)、有折射之情形下(圖中以虛線箭頭表示)之任一者下，透射細胞C之周緣部之光皆進入攝像光學系131之集光範圍(圖中以虛線表示)。又，在點光源124與細胞C之水平距離Dh為充分大時，如圖5B所示般，從點光源124出射而入射至細胞C之周緣部之光即便發生折射，亦不會進入攝像光學系131之集光範圍。因此在該等情形下，沒有強調細胞C之輪廓之效果，該點光源124僅使背景之亮度增加。
相對於此，在點光源124與細胞C之水平距離Dh為中等程度之適度之距離的情形下，如圖5C中實線箭頭所示，若焦點面FP附近沒有細胞則不入射至攝像光學系131之光係藉由在細胞C之周緣部折射而如以虛線箭頭所 示般進入攝像光學系131之集光範圍(圖中以虛線表示)。如此之光具有在所攝像之圖像中使細胞C之輪廓明亮地發光而將其予以強調之作用。
如上述般，為了實現1個點光源124強調細胞C之輪廓之效果，該輪廓部分與點光源124之水平距離有必要進入適當之範圍內。換言之，若以在該範圍內至少隨時存在1個點光源124之方式配置點光源124，則無論細胞C在攝像視場FV內存在於何一位置，皆可獲得因在細胞周緣部之光之折射所致之輪廓之強調效果。
圖6係顯示用於無論細胞位於何一位置，皆可獲得輪廓之強調效果之條件的圖。從點光源124a朝向細胞C之周緣部之位置之光L5，若存在有在細胞C之周緣部之折射，則入射至攝像光學系131，若沒有折射，則不入射至攝像光學系131。亦即為圖5C所示之狀態。此時，點光源124a具有強調細胞C之中圖中左側之周緣部之輪廓的作用。
特別是圖6所示之點光源124a位於在滿足上述條件之範圍內圖中最靠左之位置。亦即，若點光源124a較圖示之位置更靠左，即便只有稍許(考量細胞C稍許靠右下亦等價)，如圖5A所示，從點光源124a朝向細胞C之周緣部之位置之光無關於折射之有無而入射至攝像光學系131，失去強調細胞C之輪廓之效果。在此意義上，圖6之相對於細胞C之點光源124a之位置，係點光源124a為了具有強調細胞C之輪廓之作用的臨界之位置。
為了使無論細胞C位於何一位置，皆可獲得輪廓之強調效果，即便細胞C較圖6所示之位置稍許向右側偏移而無法獲得利用點光源124a之輪廓強調作用，只要使自其他之點光源可獲得相同之作用即可。圖6所示之點光源124b位於滿足如與點光源124a相鄰之位置此般之條件的最靠右之位置。亦即，圖6之點光源124b之位置係從該點光源124b朝向細胞C之周緣部 之位置之光L6可藉由在細胞C之周緣部折射而入射至攝像光學系131之位置之中最靠右之位置。若點光源124b位於較此位置稍許靠右側，則在細胞C之周緣部折射之光L6將不再入射至攝像光學系131，而無法獲得輪廓之強調效果。
出於該等原因，可謂圖6所示之點光源124a、124b之位置關係表示被容許之兩者間之最大間隔。在位於最接近位置之2個點光源之間隔較此更大時，根據細胞C之位置而可能產生無法獲得輪廓之強調效果之情形。另一方面，即便2個點光源之間隔較上述最大間隔小，亦無損使從細胞C之周緣部入射至攝像光學系131之光量增加此一作用。然而，亦可能有因光源之密度變高而造成背景亮度上升，或藉由在細胞C之周緣部光從各種方向入射而輪廓部分之寬度被強調，因此選擇性強調細胞C之輪廓此效果反而降低之情形。為此，作為點光源124之排列間距，較佳的是選擇上述之最大間隔之值，或較此稍小之值。特別是，若考量細胞之光學特性之不一致，則藉由採用較最大間隔之值偏小之排列間距，可更確實地獲得輪廓之強調效果。
嘗試上述之最大間隔、亦即點光源之排列間距之最大值之導出。為了計算，將自點光源124b相對於細胞C之周緣部之光L6之入射角以θ1表示、將該光L6之朝下方(攝像光學系131側)之出射角以符號θ2表示。又，將自點光源124a相對於細胞C之周緣部之光L5之入射角以符號θ3表示。
如由上述條件及圖6而明確化般，點光源124a之位置係自該點光源124a入射至細胞C之周緣部之光L5之入射角θ3與攝像光學系131之集光範圍之半角θO為一致之位置。又，點光源124b之位置係自該點光源124b在細胞C之周緣部折射而朝下方(攝像光學系131側)出射之光L6之出射角θ2與攝像光學系131之集光範圍之半角θO為一致之位置。此處，攝像光學系131 之集光範圍之半角θO係依存於攝像光學系131之NA(開口數)之值。從此處所敘述之關係中，可知悉介以半角θO，θ2=θ3。
如圖6所示，將2個點光源之排列間距之最大值以符號P表示。又，將光出射面123與焦點面FP之間隔以符號H表示。又，將細胞C之直徑以符號、將細胞C與點光源124a之水平方向之中心間距以符號L表示。由該等得到以下之式：
此處，將細胞C視為透鏡，將其之焦距以符號f表示。若細胞C與其他各部之尺寸相比充分薄且小，則可適用近軸光學，在此情形下，利用透鏡之公式可得到下式： 。又，將(式3) 變形可得到下式：
若將(式1)代入(式4)並消去tanθ1之項，則可得到下式： 。另一方面，將θ2=θ3適用於(式 2)而變形，可得到下式： 。自(式5)減去(式6)而變形，可得到 下式：
根據以上可知，照明部12之點光源124之較佳排列間距之最大值P，係依存於作為被攝像物之細胞C之尺寸及將該細胞C視為透鏡時之焦距。根據本申請案發明者之見解，典型之細胞之直徑為20μm左右，將其視為透鏡 時之焦距f為0.1mm左右。在如此之細胞之情形下，若將光出射面123與焦點面FP之距離H設為例如15mm，則根據(式7)，排列間距P之值為1.5mm左右。
圖7係顯示在將細胞視為透鏡之情形下之焦距之求法的圖。對於將細胞C視為透鏡時之焦距f，可例如以下般由實驗而求取。首先準備評估用樣本。評估用樣本係在例如皿等之適當之樣本容器Ds中，擔載有與注入於作為攝像對象之孔W的培養基M相同之培養基Ms、及與被攝像物同種之細胞Cs者。由於若培養基不同則折射率不同，故有無法適當地評估細胞之透鏡作用之情形。
在樣本容器Ds之上方，配置有朝下出射平行光Lp之光源LS，在下方配置有照相機(例如顯微鏡照相機)CM。在平行照明下，若一邊利用照相機CM觀察評估用樣本一邊使照相機CM在上下方向(Z方向)上移動，則利用細胞Cs之透鏡作用而照明光被收斂成之光點之大小發生變化。在該光點變成最小時，細胞Cs之作為透鏡之焦點位置與照相機CM之焦點位置可謂在上下方向上一致。因此，可將此時之自照相機CM之焦點位置直至細胞Cs之距離設為細胞Cs之作為透鏡之焦距f。
針對用於驗證上述計算式之實驗例予以說明。基於上述計算，本申請案發明者準備在圖2所示之遮光板122上將各開口122a設為1邊為0.5mm之正方形，且將其之排列間距設為1.5mm者。其後，使用3T3細胞作為被攝像物進行攝像，而確認遮光板122之效果。
圖8A至圖8D係顯示攝像結果之例的圖。圖8A顯示在不使用遮光板122之擴散照明下之攝像結果之例。在圖像中，在大致相同之背景中分佈有多個起因於細胞之高濃度之像，但各個像之形狀難以辨識。圖8B係設置上 述尺寸之遮光板122而攝像之圖像之例，可知各個細胞之輪廓部分明亮地發光，形狀更加易於視認。惟，由於通過各開口122a而入射之直接光之影響，於背景顯現有週期性之明暗。由於照明部12位於較攝像光學系131之景深充分遠處，故開口122a之像不是清晰地顯現，而是大幅散焦而以明暗之變動顯現於圖像。
圖8C係對圖8B所示之圖像進行二維濾波處理，將對應於背景之週期成分之比較低之空間頻率成分除去後之圖像。由圖可知，可獲得背景之週期性之明暗之變化被大幅降低、而各細胞之輪廓部分被明亮地強調之圖像。如此之圖像由於細胞之輪廓變得清晰，故成為適宜於利用目視或自動地計測細胞之形狀、尺寸、個數等者。又，細胞內部之組織資訊亦被比較良好地保存。
圖8D係藉由對圖8C所示之圖像實施周知之邊緣強調處理而進一步強調細胞之輪廓部分之圖像之例。在圖8C所示之圖像中，細胞之輪廓部分選擇性地明亮地顯現。因此，藉由相應於需要施以適當之邊緣強調處理，如圖8D所示般，可製作細胞之輪廓被進一步強調之圖像。又，基於藉由進行邊緣強調處理，而細胞之輪廓被選擇性且適當地強調此事實，亦顯示本實施方式之攝像方法係適宜於獲得清晰地表示細胞之輪廓之圖像的方法。
在遮光板122上，各開口122a之開口面積越大，照明光之光量越大，圖像越明亮。然而，由於靠近相同之擴散光源，故細胞之輪廓之強調效果減弱。若開口122a之開口面積變小，則輪廓部分與其他部分之亮度之比變大，但圖像自身會變暗。在此情形下，若可使來自面光源121之出射光量增加，則可改善圖像之亮度。出於該等原因，為了相應於目的而使圖像品質最佳化，可準備開口122a之排列間距相同而開口面積不同之複數個遮光板。
如上述般，點光源124之較佳之排列間距，係根據被攝像物之種類及狀態而不同。因此，為了對各種被攝像物良好地進行攝像，較佳的是相應於被攝像物而使照明部12之點光源124之排列間距發生變化。可實現其之第1方法係如以下所述者。在此方法中，遮光板122係構成為可從照明部12固定脫離，且準備開口122a之排列間距互不相同之複數種之遮光板122。如是，相應於目的而替換遮光板122。根據被攝像物之特性且利用(式7)所求得之值P，係賦予較佳之排列間距之上限者，而並非追求將光源之排列間距嚴密地設置為該值P。因此，在所準備之複數個遮光板122之中，只要選擇開口122a之排列間距在所求取之值P以下為最大者即可。
圖9A及圖9B係顯示可變更點光源之排列間距之照明部之另一構成例的圖。在圖9A所示之例中，照明部12a具備：面光源125，其朝下出射相同之擴散光；及快門構件126，其沿面光源125之下表面而設置且包含例如液晶快門。在使用照明部12a時，於控制部14設置有控制照明部12a之照明控制部147。照明控制部147控制快門構件126，設定從快門構件126之上表面側朝下表面側透射之光之透射圖案。作為照明部12a，可適宜地使用例如液晶快門與背光源被一體化之液晶顯示面板。
快門構件126之透射圖案係模仿圖2之遮光板122之透射圖案者，在不透射光之非透射部126b之內部，透射光之透射部126a以一定間距排列。藉此，各透射部126a發揮作為點光源124之機能。藉由照明控制部147將快門構件126之透射圖案予以各種變更設定，而可使點光源124之排列間距及尺寸作各種變化。
在圖9B所示之例中，照明部12b具備沿水平面矩陣配置之微小之多個發光元件127。例如，可將具有作為發光元件127之發光二極體(LED)的矩 陣陣列作為照明部12b而使用。又，在控制部14設置有個別地控制各發光元件127之點燈的照明控制部148。藉由使設置於照明部12b之多個發光元件127之全體或以特定之間距而被選擇之一部分點燈，可使點燈之發光元件127作為點光源124而發揮機能。藉由照明控制部148將所點燈之發光元件127之組合予以變更設定，可使點光源124之排列間距發生各種變化。更佳的是可使各發光元件127之光量變更。
圖10係顯示該攝像裝置之動作例的流程圖。針對如上述般構成之攝像裝置1之動作例，一邊參照圖10一邊予以說明。此處所說明之動作，係攝像被搬入於裝置的孔板WP之各孔W，並進行製作強調各孔W內之被攝像物之輪廓之圖像的處理。代替孔板WP而在皿內擔載有被攝像物之情形下亦然，可利用基本上相同之方法進行攝像。該處理係藉由設置於控制部14之CPU141執行預先記錄於記憶體145之控制程式而於裝置各部進行特定之動作而實現。
若將活體樣本與培養基M一起擔載之孔板WP設置於攝像裝置1之保持器11(步驟S101)，則相應於活體樣本，點光源124之排列間距(光源間距)被設定(步驟S102)。具體而言，從複數種遮光板122之中，選擇與相應於作為樣本內之被攝像物之細胞、基於(式7)而算出之排列間距P對應者，並將其設置於攝像裝置1。在照明部之構成為圖9A或圖9B所示之情形下亦然，利用照明控制部147或148，相應於被攝像物而適當地設定光源間距。
在如此般設定之照明條件下，利用攝像部13而攝像孔W(步驟S103)。可針對設置於孔板WP之全部之孔W進行攝像，且亦可僅針對特定之孔W進行攝像。藉由對所獲得之圖像之修整加工，對應於孔W之部分作為孔圖像被切出(步驟S104)，孔以外之餘白部分被除去。
在如此般獲得之孔圖像中，如圖8B所示，孔W內之細胞之輪廓被明亮地強調，但包含有起因於離散地分佈之光源的背景亮度之週期性變動。藉由濾波處理，如此之背景之明暗被除去(步驟S105)。在濾波處理中，以在阻止域中包含對應於孔圖像之明暗之變動週期的空間頻率成分之方式設定遮斷頻率，執行低頻除去處理。
圖像之明暗之變動週期與照明部12之點光源124之排列間距(光源間距)並不一定相同。攝像倍率及攝像光學系131之視場角、從焦點面FP直至光出射面123之距離等將會反應於圖像內之變動週期。由於該等條件為已知，故可自點光源124之排列間距求取圖像之明暗之變動週期。又，亦可決定應當除去之空間頻率成分。
在點光源124之排列間距為可變之情形下，由於背景之變動週期亦發生變化，故嚴格來講，亦有變更濾波處理之遮斷頻率之必要。然而，若對應於圖像中之細胞之信號與對應於背景之信號可明確地分離，則並非一定需要相應於排列間距而微細地變更遮斷頻率。可考量例如對應於光源之排列間距而變化之背景亮度之變動週期之最小值與圖像之細胞之尺寸相比充分大之情形。此時，藉由以可除去該週期成分之方式設定遮斷頻率，更長週期之(空間頻率低之)變動成分亦可除去。因此，不需要遮斷頻率之變更。
藉由濾波處理，可獲得圖8C所示之圖像。若有必要，則藉由對該圖像執行邊緣強調處理(步驟S106)，如圖8D所示般，可獲得細胞之輪廓部分被進一步強調之圖像。亦即，步驟S106之執行不是必須而是任意的。另外，圖像之攝像與圖像處理可利用不同之裝置而執行。
如以上般，在本實施方式中，在不使用如暗視場攝像裝置之複雜之裝置構成之下，即便為更簡單之裝置構成，仍可獲得被攝像物之輪廓被明亮 地強調之圖像。
如以上所說明般，在本實施方式中，孔板WP相當於本發明之「樣本容器」，將其予以保持之保持器11作為本發明之「保持機構」而發揮機能。又，照明部12作為本發明之「照明機構」而發揮機能，面光源121及遮光板122分別作為本發明之「面光源」及「遮光部」而發揮機能。又，如前述般，遮光板122之各開口122a相當於本發明之「窗部」，進而相當於本發明之「光出射部」。又，攝像部13相當於本發明之「攝像機構」而發揮機能，CPU 141相當於本發明之「圖像處理機構」而發揮機能。
並且，在圖9A所示之態樣中，照明部12a作為本發明之「照明機構」而發揮機能，其中面光源125及快門構件126分別相當於本發明之「面光源」及「液晶快門」。又，在圖9B所示之態樣中，具有多個發光元件127之照明部12b作為本發明之「照明機構」而發揮機能，照明控制部148相當於本發明之「點燈控制機構」。
另外，本發明並非限定於上述之實施方式，在不脫離其主旨之範圍內，除了上述之實施方式以外還可進行各種變更。例如，在上述之照明部12、12a、12b中，雖採用將複數個點光源124在X方向及Y方向之各者上以一定間距而二維矩陣配置之構成，但點光源之配置不限定於此。例如，亦可採用如以下之配置。
圖11係顯示點光源之配置之又一例的圖。在圖11A所示之例中，在Y方向上以一定間距P1排列之點光源124之列，在X方向上亦以相同間距P1而配置，惟，在Y方向上以間距P1之一半使位置不同而作配置。又，在圖11B所示之例中，在以1個點光源124為中心之正六角形之各頂點上配置有其他點光源124。因此，在1個點光源124之周圍，6個點光源124以等距離 且以等角度間隔而配置。藉由使用具有該等配置之照明部，亦可攝像出與上述相同地強調被攝像物之輪廓部分之圖像。另外，在該等情形下，起因於離散之點光源的圖像中之背景亮度之變動之顯現方式不同。為了對應於此，關於濾波處理之方向及遮斷頻率可施加進一步之變更。
又，在上述實施方式中，對所攝像之圖像執行濾波處理，對應於背景亮度之週期性變動之空間頻率成分被除去。然而，單就獲得輪廓被強調之圖像此目的而言，濾波處理也可省略。若為例如藉由邊緣抽出處理等檢測出細胞之輪廓而自動地計數圖像中之細胞之個數的目的，只要細胞之輪廓變明確，則背景之亮度變動不會成為問題。在如此之情形下，可省略濾波處理。
另外，上述實施方式中之遮光板122係具有剖面形狀為正方形之開口122a者。然而，開口形狀並不限定於此，而是任意。又，開口122a之內部空間可利用具有透光性之材料而充填。
以上，如將具體的實施方式例示並說明般，本發明之攝像裝置及攝像方法可為以下構成，即例如照明機構使具有對應於配置間距之週期性明暗的照明光對樣本容器入射。根據如此之構成，在圖像中顯現週期性明暗，其週期為已知。因此，若有必要，可藉由例如圖像處理而將其事後除去。藉由容許如此之背景之變動，可獲得更有效地強調被攝像物之周緣部之圖像。
又，例如，光出射部之配置間距也可為可變更。根據如此之構成，藉由相應於被攝像物將照明圖案最適化，可進一步提高被攝像物之周緣部之強調效果。
又，例如在被攝像物為細胞，將細胞之直徑設為、將細胞視為透鏡 時之焦距設為f、平面與焦點面之距離設為H、配置間距設為P時，亦可為P≦H‧/(2f)之關係成立之構成。此係為了無論細胞位於何一位置，複數個配置之點光源之至少1個皆可發揮使被攝像物之周緣部明亮地發光之作用的條件。在滿足該條件時，可獲得被攝像物之周緣部被明亮地強調之圖像。
又，例如照明機構可為以下構成，即具有：面光源，其朝向樣本容器出射擴散光；及遮光部，其在面光源與樣本容器之間、與焦點面平行而配置之遮光性之平板上，以配置間距設置有複數個透光性之窗部。根據如此之構成，藉由從複數個窗部之各者出射擴散光，窗部作為光出射部發揮機能，可獲得本發明之效果。
在此情形下，進而可構成為遮光部可固定脫離地構成，可選擇性安裝配置間距互不相同之複數個遮光部。根據如此之構成，可相應於目的而使光出射部之配置間距變化。
又，例如照明機構亦可為具有二維配置於平面內之複數個發光元件之構成。根據如此之構成，藉由發光元件之各者作為光出射部發揮機能，可獲得如上述之發明之效果。
在此情形下，進而可設置有點燈控制機構，其控制發光元件之點燈，且可變更發光元件之中點燈者與滅燈者之組合。根據如此之構成，藉由改變使點燈之發光元件之組合，可使光出射部之配置間距變化。
又，例如照明機構亦可為以下構成，即具有：面光源，其朝向樣本容器出射擴散光；及液晶快門，其配置於面光源與樣本容器之間。根據如此之構成，藉由液晶快門實現特定之透射圖案，可構成如上述般光出射部離散地分佈之照明機構。
又，例如，可對所攝像之圖像執行除去對應於配置間距之空間頻率成分的濾波處理。根據如此之構成，可獲得起因於離散地配置之光出射部之圖像之背景亮度之變動被除去之圖像。
又，本發明之攝像方法可為進一步具備相應於被攝像物而設定配置間距之工序者。根據如此之構成，藉由變更光出射部之配置間距，可對各種被攝像物在適宜之照明條件下進行攝像，獲得其周緣部被強調之圖像。
又，例如配置間距可以圖像中背景亮度之變動週期較被攝像物之尺寸更大之方式而設定。根據如此之構成，可獲得在對應於背景之較低之空間頻率成分上，重疊有對應於被攝像物之高空間頻率成分的圖像。因此，可將背景與被攝像物根據空間頻率明確地分離。
以上，係根據特定之實施例說明了本發明，但此一說明並非意圖以限定之意義被解釋者。參照本發明之說明，如同本發明之其他實施方式，被揭示之實施方式之各種變化例對精通此項技術者而言應是不言可喻。因此可認為，附加之申請專利之範圍係在不脫離本發明之真正範圍之範圍內包含該變化例或實施方式者。
[產業上之可利用性]
本發明係適用於以下用途：即追求將例如在培養基中被二維培養之細胞或細胞群落般，在擴散光照明下無法獲得充分之對比度的被攝像物，特別是其輪廓部分清晰地予以攝像之用途。

Claims (13)

  1. 一種攝像裝置，其具備：保持機構，其將擔載作為被攝像物之活體樣本之樣本容器予以保持；照明機構，其照明前述樣本容器；及攝像機構，其具有接受從前述照明機構出射而透射前述樣本容器之透射光並攝像前述被攝像物之透射像的攝像元件、及配置於前述樣本容器與前述攝像元件之間且使前述透射光於前述攝像元件結像的攝像光學系；且前述照明機構係具有作為出射擴散光支點光源之複數個光出射部，該等係沿與前述攝像光學系之焦點面平行並較前述攝像光學系之景深之範圍更遠之平面，且在該平面中之包含前述攝像機構之視場且較該視場更寬廣之區域內，彼此隔開並以一定之配置間距二維配置，且分別朝向前述樣本容器出射擴散光；且使具有對應於前述配置間距之週期性明暗的照明光對前述樣本容器入射。
  2. 如請求項1之攝像裝置，其中前述光出射部之配置間距為可變更。
  3. 如請求項1之攝像裝置，其中在前述被攝像物為細胞，將前述細胞之直徑設為、將前述細胞視為透鏡時之焦距設為f、前述平面與前述焦點面之距離設為H、前述配置間距設為P時，P≦H‧/(2f) 之關係成立。
  4. 如請求項1至3中任一項之攝像裝置，其中前述照明機構具有：面光源，其朝向前述樣本容器出射擴散光；及遮光部，其在前述面光源與前述樣本容器之間、與前述焦點面平行而配置之遮光性之平板上，以前述配置間距設置有複數個透光性之窗部。
  5. 如請求項4之攝像裝置，其中前述遮光部可固定脫離地構成，可選擇性安裝前述配置間距互不相同之複數個前述遮光部。
  6. 如請求項1至3中任一項之攝像裝置，其中前述照明機構具有二維配置於前述平面內之複數個發光元件。
  7. 如請求項6之攝像裝置，其中具備點燈控制機構，其控制前述發光元件之點燈，且可變更前述發光元件之中點燈者與滅燈者之組合。
  8. 如請求項1至3中任一項之攝像裝置，其中前述照明機構具有：面光源，其朝向前述樣本容器出射擴散光；及液晶快門，其配置於前述面光源與前述樣本容器之間。
  9. 如請求項1至3中任一項之攝像裝置，其中具備圖像處理機構，其對利用前述攝像機構而攝像之圖像，執行除去對應於前述配置間距之空間頻率成分的濾波處理。
  10. 一種攝像方法，其具備：照明機構對擔載作為被攝像物之活體樣本之樣本容器予以照明的工序；及攝像機構獲取前述被攝像物之圖像的工序，該攝像機構具有接受從前述照明機構出射而透射前述樣本容器之透射光並攝像前述被攝像物之透射像的攝像元件、及配置於前述樣本容器與前述攝像元件之間且使前述透射光於前述攝像元件結像的攝像光學系；且前述照明機構係具有作為出射擴散光支點光源之複數個光出射部，該等係沿與前述攝像光學系之焦點面平行並較前述攝像光學系之景深之範圍更遠之平面，且在該平面中之包含前述攝像機構之視場且較該視場更寬廣之區域內，彼此隔開並以一定之配置間距二維配置，且分別朝向前述樣本容器出射擴散光；且從前述照明機構入射至前述樣本容器之光具有對應於前述配置間距之週期性明暗。
  11. 如請求項10之攝像方法，其中具備相應於被攝像物而設定前述配置間距之工序。
  12. 如請求項10之攝像方法，其中前述配置間距係設定為前述圖像中背景亮度之變動週期較前述被攝像物之尺寸更大。
  13. 如請求項10之攝像方法，其中具備對所攝像之前述圖像，執行除去對應於前述配置間距之空間頻率成分的濾波處理之工序。
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