JP5018194B2

JP5018194B2 - 観察装置

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Publication number: JP5018194B2
Application number: JP2007100859A
Authority: JP
Inventors: 宏之塚本
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2007-04-06
Filing date: 2007-04-06
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2027-04-06
Also published as: JP2008256610A

Description

本発明は、細胞などの透明な位相物体を広い視野で観察する観察装置に関する。

従来、細胞の培養に際して、培養状況や培養容器中の細胞の分布や量を確認するための観察が行われている。その際、細胞は多くの場合吸収のほとんどない位相物体のため、通常の観察では細胞の有無を観察するのは困難であり、光学顕微鏡による観察に際して暗視野観察または位相差観察により細胞透過による位相変化を明暗変化に変換して観察が行われる（例えば、非特許文献１、２参照）。
小松啓，「光学顕微鏡の基礎と応用（３）」，応用物理，第６０巻，第１９号，１９９１年，ｐ１０３２−ｐ１０３４小松啓，「光学顕微鏡の基礎と応用（４）」，応用物理，第６０巻，第１１号，１９９１年，ｐ１１３６−ｐ１１３８

しかしながら、顕微鏡の視野は数ｃｍ以上のサイズを持つ培養容器に比べて小さいため、被観察物の全体を見るためには視野を多数回移動させる必要があり、観察時間が掛かってしまう。また、視野の大きな観察装置を作成しようとすると、被観察物を照明する照明装置が大掛かりになる上、細胞の培養容器の端部付近では培養容器の側壁が障害となって観察が難しくなるという問題がある。

上記課題を解決するため、本願発明は、
明部と暗部とが周期的に配置された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段と、
前記面光源と前記被観察物との間に遮光部と開口部とが周期的に配置された遮光手段と、を有し、
以下の条件を満足することを特徴とする観察装置を提供する。
ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ _０
ｂ＜（ｈ／ｄ）×Ｐ＋（１−（ｈ／ｄ））×ａ
但し、
ａ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部の幅
ｂ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記遮光部の幅
Ｐ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部及び前記遮光部の周期
ｄ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｈ：前記面光源と前記遮光手段との距離
ｓｉｎθ _０：前記結像光学系の開口数
また、本発明は、
明部と暗部とが周期的に配置された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段と、
前記面光源と前記被観察物との間に遮光部と開口部とが周期的に配置された遮光手段と、を有し、
以下の条件を満足することを特徴とする観察装置を提供する。
ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ _０
ｂ＜２×（１−（ｈ／ｄ））×Ｐ
但し、
ａ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部の幅
ｂ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記遮光部の幅
Ｐ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部及び前記遮光部の周期
ｄ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｈ：前記面光源と前記遮光手段との距離
ｓｉｎθ _０：前記結像光学系の開口数
また、本発明は、
明部と暗部とが周期的に配置された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段と、
前記面光源と前記被観察物との間に遮光部と開口部とが周期的に配置された遮光手段と、を有し、
以下の条件を満足することを特徴とする観察装置を提供する。
ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ _０
ｂ＜Ｍｉｎ（ｂ１、ｂ２）
但し、
ｂ１＝２×（１−（ｈ／ｄ））×Ｐ
ｂ２＝（ｈ／ｄ）×Ｐ＋（１−（ｈ／ｄ））×ａ
Ｍｉｎ（ｂ１、ｂ２）は、ｂ１、ｂ２の小さい方の値
ａ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部の幅
ｂ、ｂ１、ｂ２：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記遮光部の幅
Ｐ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部及び前記遮光部の周期
ｄ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｈ：前記面光源と前記遮光手段との距離
ｓｉｎθ _０：前記結像光学系の開口数

本発明によれば、位相物体の分布を高速・簡便に把握することが可能な観察装置を提供することができる。

以下、本発明の一実施の形態にかかる観察装置について図面を参照しつつ説明する。

図１は、実施の形態にかかる観察装置の全体構成図である。図２は、観察装置の光学系部分の作用を説明する概念図である。図３は、図２に示す照明部分を拡大して示した図である。

図１において、観察装置１は、バックライト付きの透過型液晶パネル１４と、被観察物１０を載置するステージ（標本台）１３と、透過型液晶パネル１４とステージ１３との間に配設された遮光部材２０と、被観察物１０の像を結像する結像光学系１２と、結像光学系１２で結像された被観察物１０の像を撮像する撮像素子１１と、透過型液晶パネル１４の明るさや位置を制御するコントローラ１５と、遮光部材２０の位置を制御する遮光部材コントローラ２１と、撮像素子１１からの画像の画像処理やコントローラ１５、２１の制御等を行うコンピュータ１６（以後、ＰＣと記す）と、ＰＣ１６で画像処理された被観察物１０の画像やコントローラ１５の制御情報等を表示するモニター１７などから構成されている。なお、コントローラ１５と遮光部材コントローラ２１は、共用するように構成することも可能である。

ステージ１３に載置されている被観察物１０は、例えば、無染色の細胞が収められた透明な培養容器（例えば、径９０ｍｍのシャーレなど）である。また、ステージ１３は、透過型液晶パネル１４で照明された被観察物１０の略全域を観察可能にするために、被観察物１０を載置する領域が照明光を遮らないように、例えば、ガラス等の透明部材で構成されている。なお、培養容器が細胞領域に比べ大きい場合には、観察する領域を中空とし培養容器の周辺を支持するように構成しても良い。

結像光学系１２の視野は十分に大きく、被観察物１０の略全域から射出した光は、結像光学系１２によって捉えられ、撮像素子１１の撮像面上に結像する。撮像素子１１は、ＰＣ１６からの指示に応じて撮像面上の画像（輝度分布）を取得する。その画像は、ＰＣ１６へ取り込まれ、ＰＣ１６に設けられた画像処理部１８で画像処理が施されモニター１７上へ表示される。

なお、ＰＣ１６は、撮像素子１１で撮像された被観察物１０の画像処理前の画像や画像処理後の画像を不図示のメモリに必要に応じて保存することができる。また、画像処理前後の画像を必要に応じてモニター１７へ表示することができる。

また、コントローラ１５は、ＰＣ１６からの指示に応じて、透過型液晶パネル１４で明部と暗部との周期パターンを表示する。透過型液晶パネル１４は各種の明部と暗部の周期パターンを形成可能であるが、ここでは、明部と暗部とが互いに平行に形成されたストライプパターンを用いた場合を代表として説明する。このとき、透過型液晶パネル１４によって、ストライプ状の面光源１４が形成される。また、コントローラ１５は、ＰＣ１６からの指示に基づき透過型液晶パネル１４を光学系の光軸に対して垂直な面内でシフトすることが可能である。

また、遮光部材２０は、面光源１４と同様の透過型液晶パネルで透明な開口部２０ａと遮光部２０ｂからなる周期Ｐの周期パターンを形成する。なお、遮光部材２０は、透過型液晶パネル以外の構成であっても良い。例えば、ガラス基板に金属薄膜で遮光部２０ｂを形成したものでも良いし、金属薄板に開口部２０ａを設けたものでも良い。また、遮光部材コントローラ２１は、ＰＣ１６からの指示に基づき遮光部材２０を光学系の光軸に対して垂直な面内でシフトすることが可能である。

図２に示すように、透過型液晶パネル１４で形成される面光源１４の明部１４ｂと遮光部材２０の遮光部２０ｂのピッチＰは、同一であり観察対象である例えば細胞などの位相物体のサイズ（１０〜１５μｍ）と比較して十分に大きい。ここで、ｈは、面光源１４と遮光部材２０との間隔である。

また、面光源１４の明部１４ｂの数十ピッチが結像光学系１２の視野内に存在し、面光源１４の明部１４ｂの幅と暗部１４ｄの比がほぼ１対１（デューティー比）である。また、結像光学系１２の焦点は、物体面１０ａに合っており、撮像素子１１上では面光源１４の像と遮光部材２０の像はボケている。なお、面光源１４には、明部１４ｂ、暗部１４ｄの二値のパターンあるいはグレースケールパターンの何れも採用できるが、以下の説明では明部１４ｂ、暗部１４ｄの二値のパターンを用いた場合について説明する。

また、図３に示すように、面光源１４の明部１４ｂの中心と遮光部材２０の遮光部２０ｂの中心は、結像光学系１２の主光線（光軸）に一致するように配置されている。この、遮光部材２０は、明暗の周期的な照明光を用いて位相物体を観察する際に、位相物体からの散乱光に対するバックグラウンド光の影響を排除し、位相物体の検出効率を向上させるために配置されたものである。

バックグラウンド光の影響を減らすためには、通常の暗視野照明のように、物体を通過する際に散乱作用を受けずに直進する光が像面に到達しないようにすればよい。そのため、面光源１４と被観察物１０との間に面光源１４と同様の周期を有する遮光部２０ｂを配置し、照明光の直進成分を遮断する構成が望ましい。

図３では、結像光学系１２がテレセントリックであり、面光源１４の明部１４ｂの周期と遮光部材２０の遮光部２０ｂの周期が同じ周期Ｐである。また、図３に示すように、面光源１４の明部１４ｂの幅をａ、遮光部材２０の遮光部２０ｂの幅をｂ、面光源１４と遮光部材２０との距離をｈ、面光源１４と被観察物１０との距離をｄ、結像光学系１２の開口数をｓｉｎθ_０とする。

図３から判るように、物体面１０ａに到達する光線のうち最も角度の小さい光線は、明部１４ｂと遮光部２０ｂの両者の端を通る光線ＡＢ、ＣＤのどちらか、およびこれらを何周期分かシフトした光線である。よって、ＡＢおよびＣＤが、結像光学系１２の開口数ｓｉｎθ_０で規定されるよりも大きな角度で物体面１０ａに入射すれば、物体面１０ａの全面で暗視野照明観察が可能になる。

一般的には、ＡＢとＣＤの両者が結像光学系１２の主光線に対して同一の角度をなす必要はないが、物体面１０ａ上での光量を確保し、感度を上げるためには両者が同一であることが好ましい。これは、結像光学系１２の主光線となる光線が、明部１４ｂの中心と遮光部２０ｂの中心を通ることで達成できる。

このように、明部１４ｂと遮光部２０ｂの中心が一致する場合、光線ＡＢ、および光線ＣＤが結像光学系１２に入射しないことが暗視野照明となるのに必要な条件である。これは、以下の条件式（１）を満足すれば実現できる。
（１）ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ_０

ここで、結像光学系１２の物体側開口数ｓｉｎθ_０が十分に小さい場合、ｔａｎθ_０≒θ_０と置き換えることができ、条件式（１）を、ｂ＞ａ＋２×ｈ×θ_０としても良い。

条件式（１）を満足しない場合には、結像光学系１２に明部１４ｂからの直進光線が入射するため、良好な暗視野照明を達成することができず、位相物体の良好な観察が困難となる。条件式（１）を満足することで、良好な暗視野照明が可能になる。

また、被観察物１０の全域を隙間無く測定するためには、条件式（１）に加えて、被観察物１０が隙間無く照明されていることが必要である。光源が周囲的に多数存在するためこれは多くの場合自動的に満たされる。

しかし、一般的に細胞などの位相物体による散乱は、散乱角が大きくなると散乱光の強度が急速に減少してしまう。そこで、十分な量の散乱光を得るためには、直進光が遮蔽されている範囲で、被観察物１０を照らす光線が結像光学系１２の主光線となす角度ができる限り小さいことが望ましい。

従って、明部１４ｂの任意の点から最も近い開口部２０ａを通過した光によって被観察物１０の全域が照明されることが望ましい。よって、以下の条件式（２）を満足することが望ましい。
（２）ｂ＜２×（１−（ｈ／ｄ））×Ｐ

条件式（２）を満足しない場合には、照明むらが発生し好ましくない。条件式（２）を満足することで、被観察物１０が良好に照明され、かつ散乱光の強度を十分確保できる。

また、最も近い開口部２０ａとは、例えば図３の点Ｃから発せられた光を考える場合は、Ｂ〜Ｄの領域（開口部２０ａ）を通過する光を指す。そのためには、図３で点Ｏが明部１４ｂの中心である点Ｅからの光によって照らされ、ＡＢがＣＤより左側で物体面１０ａに到達すればよい。よって、以下の条件式（３）を満足することが望ましい。
（３）ｂ＜（ｈ／ｄ）×Ｐ＋（１−（ｈ／ｄ））×ａ

条件式（３）を満足しない場合には、照明むらが発生し好ましくない。条件式（３）を満足することで、被観察物１０が良好に照明され、かつ散乱光の強度を十分確保できる。

なお、上述の説明では、結像光学系１２がテレセントリックな場合について説明したが、非テレセントリックな光学系においても同様に成り立つものである。但し、非テレセントリックな光学系の場合は、面光源１４の明部１４ｂおよび遮光部材２０の遮光部２０ｂそれぞれの周期Ｐ、光源である明部１４ｂの幅ａ、および遮光部２０ｂの幅ｂは、結像光学系１２の主光線を物体面１０ａから面光源１４に延長した直線を基準として、それぞれ物体面１０ａ上で測定した値を用いることが必要である。

次に、本実施の形態のシミュレーション結果について図３、図４を参照しつつ説明する。図４は、シミュレーションによる解析結果の一例である。

図３に示すように、結像光学系１２はテレセントリックとし、面光源１４からの光の波長５００ｎｍ、物体面１０ａと面光源１４との間隔ｄ＝２５ｍｍ、面光源１４と遮光部材２０との間隔ｈ＝ｄ／２、結像光学系１２の開口数ｓｉｎθ_０＝０．００５、面光源１４の明部１４ｂと遮光部材２０の遮光部２０ｂの周期Ｐ＝２ｍｍ、明部１４ｂの幅ａ＝Ｐ／３、遮光部２０ｂの幅ｂ＝Ｐ／２とする。これらの値は前述の条件式（１）から（３）を満足している。

また、明部１４ｂおよび遮光部２０ｂの周期方向をｘ方向としｘ＝０に明部１４ｂと遮光部２０ｂの中心があるものとする。

なお、面光源１４にはフラットパネルディスプレイ、遮光部材２０にはガラスなどの透明基板上に金属による遮光膜を周期的に付けたものを利用することが可能である。

この条件下で、光線追跡によるシミュレーションを行い、検出される光強度の解析を行った。被観察物１０は物体面１０ａ上に一様に存在するものとし、散乱特性は、以下の（４）式のＨｅｎｙｅｙ／Ｇｒｅｅｎｓｔｅｉｎ関数を利用した。
（４）ｐ（ｃｏｓθ）＝（１／２）×（（１−ｇ^２）／（１＋ｇ^２−２×ｇ×ｃｏｓθ）^３／２）

ここで、θが散乱角を示す。果方性を示すパラメータｇの値は、散乱しやすい時の値としてｇ＝０．９７、中程度の散乱時の値としてｇ＝０．９９、散乱しにくい時の値としてｇ＝０．９９５の三種類を用い、各々について（４）式による散乱解析を行った。

結果を図４に示す。図４において、横軸はｘ方向の位置を、縦軸は散乱強度を示す。横軸の±０．６７付近で強度変化率が不連続に変化するのは、これらの点が図３のＡＢやＣＤが物体面１０ａと交差する位置に相当し、異なる位置の明部１４ｂにより照明されるためである。

図４から分かるように、検出強度は散乱特性により大きく変化するが、バックグラウンドの小さな暗視野照明であるので、検出強度の絶対値の変化自体は許容できるものである。一方、光強度が最高の部分（横軸の±１付近）と最低の部分（横軸のゼロ付近）の比率はｇ＝０．９７の場合で１．９倍、ｇ＝０．９９５の場合で２．９倍程度となっている。この値は比較的小さいため、一回の測定画像から視野全体で位相物体の有無を判断することができる。

また、被観察物１０の散乱特性が既知であれば、被観察物１０の密度を定量的に測定することも原理的には可能である。また、散乱特性により感度ムラがそれほど変化しないことから、同一の構成により、多様な散乱特性を持つ位相物体の測定が可能であることがわかる。

以上述べたように、本実施の形態にかかる観察装置１によれば、広範囲に亘る位相物体の良好な検出が可能となる。

なお、上記実施の形態では、面光源として透過型液晶パネルを示したが、これに限らず種々設計可能であり、例えばストライプパターンをマスクとして背面から均一な光を照射して面光源とすることも可能である。また、面光源はストライプパターン以外の、市松状パターン、同心円状パターンなどであっても同様の効果を奏することができる。当然、遮光部材の形態は、面光源の形態にあわせて形成されたものを配置する必要があることは言うまでも無い。

また、上記実施の形態では、観察装置は透過型観察装置の場合について説明したが、反射型観察装置でも同様の効果を奏することが可能である。

なお、上述の実施の形態は例に過ぎず、上述の構成や形状に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。

実施の形態にかかる観察装置の全体構成図である。観察装置の光学系部分の作用を説明する概念図である。図２に示す照明部分を拡大して示した図である。シミュレーションによる解析結果の一例である。

符号の説明

１観察装置
１０被観察物
１１撮像素子
１２結像光学系
１３ステージ
１４透過型液晶パネル（面光源）
１５コントローラ
１６パーソナルコンピュータ
１７モニター
１８画像処理部
２０遮光部材

Claims

明部と暗部とが周期的に配置された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段と、
前記面光源と前記被観察物との間に遮光部と開口部とが周期的に配置された遮光手段と、を有し、
以下の条件を満足することを特徴とする観察装置。
ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ _０
ｂ＜（ｈ／ｄ）×Ｐ＋（１−（ｈ／ｄ））×ａ
但し、
ａ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部の幅
ｂ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記遮光部の幅
Ｐ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部及び前記遮光部の周期
ｄ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｈ：前記面光源と前記遮光手段との距離
ｓｉｎθ _０：前記結像光学系の開口数
明部と暗部とが周期的に配置された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段と、
前記面光源と前記被観察物との間に遮光部と開口部とが周期的に配置された遮光手段と、を有し、
以下の条件を満足することを特徴とする観察装置。
ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ _０
ｂ＜２×（１−（ｈ／ｄ））×Ｐ
但し、
ａ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部の幅
ｂ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記遮光部の幅
Ｐ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部及び前記遮光部の周期
ｄ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｈ：前記面光源と前記遮光手段との距離
ｓｉｎθ _０：前記結像光学系の開口数
明部と暗部とが周期的に配置された面光源と、
前記面光源で照明された被観察物からの光を結像する結像光学系と、
前記結像光学系を介して前記被観察物の像を撮像する撮像手段と、
前記面光源と前記被観察物との間に遮光部と開口部とが周期的に配置された遮光手段と、を有し、
以下の条件を満足することを特徴とする観察装置。
ｂ＞ａ＋２×ｈ×ｔａｎθ _０
ｂ＜Ｍｉｎ（ｂ１、ｂ２）
但し、
ｂ１＝２×（１−（ｈ／ｄ））×Ｐ
ｂ２＝（ｈ／ｄ）×Ｐ＋（１−（ｈ／ｄ））×ａ
Ｍｉｎ（ｂ１、ｂ２）は、ｂ１、ｂ２の小さい方の値
ａ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部の幅
ｂ、ｂ１、ｂ２：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記遮光部の幅
Ｐ：前記結像光学系の主光線を前記面光源方向に延長した直線を基準としたときの前記被観察物面上における前記明部及び前記遮光部の周期
ｄ：前記面光源と前記被観察物との距離
ｈ：前記面光源と前記遮光手段との距離
ｓｉｎθ _０：前記結像光学系の開口数
前記結像光学系の主光線上に前記面光源の明部の中心と前記遮光部の中心とが配置されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の観察装置。
請求項１から４のいずれか１項に記載の観察装置において、
前記結像光学系は、前記被観察物の全領域を一度に観察可能であることを特徴とする観察装置。