JP2007316133A

JP2007316133A - 観察装置

Info

Publication number: JP2007316133A
Application number: JP2006142724A
Authority: JP
Inventors: Fumitomo Hayano; 史倫早野
Original assignee: Nikon Corp
Current assignee: Nikon Corp
Priority date: 2006-05-23
Filing date: 2006-05-23
Publication date: 2007-12-06

Abstract

【課題】位相差顕微鏡において、位相差板の位置を選択的に切り替えただけでは１つの位相差情報しか取得できないので、不均一な厚みの細胞を有する試料を良好に観察できないという問題を解決する。
【解決手段】ガラス素子の光透過部８ａと、回折光１４の位相をπ／２ずらすことができるように薄膜を蒸着させた位相差部８ｂとが交互に等間隔でＸ軸方向に配列されている縞状位相差板８が細胞１０に対して結像側の瞳位置に配置される。縞状位相差板８が駆動部１６によりＸＹ平面上をＸ軸方向へ移動して、細胞１０に対する縞状位相差板８の光透過部８ａと位相差部８ｂとのＸ軸方向の位置関係が変化する。したがって、縞状位相差板８の移動の前後において、光透過部８ａを透過した回折光１４と、位相差部８ｂを透過した回折光１４との干渉状態が変化するので、結像面上で位相差が強められたり弱められたりする位置、すなわち像のコントラストがつく位置が変化して、像の揺らぎを観察できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、光透過性物体を観察するための観察装置に関する。

下記特許文献１には、位相差板で試料からの回折光に位相差を与え、これらの回折光が結像面で干渉し合って像を形成することにより試料を観察する位相差顕微鏡が開示されている。さらに、この位相差顕微鏡では、位相差板をピッチ方向に移動自在にして、ブライトコントラストあるいはダークコントラストを使用者の好みに応じて選択できる。
特開２０００−１００１３号公報

半導体ウエハの所定の高さの段差を観察するものであることから、位相差板を移動して観察に適したコントラストを選択しているだけである。しかし、細胞などの高さの不均一な試料を観察する場合には、単に位相差板の位置を選択的に切り替えるだけでは良好な観察状態を得ることができない。すなわち、位相差板の位置を選択的に切り替えただけでは、１つの位相差情報しか取得できないので、不均一な厚みの細胞を有する試料を良好に観察できない。

請求項１の発明による観察装置は、試料に光を照射する照明手段と、照明手段の瞳近傍位置に設置される部分的遮光板と、部分的遮光板を通った照明手段からの光により照明された試料からの光を観察部に導く観察光学系と、観察光学系の瞳位置近傍に設置され、縞状あるいは輪帯状のスリットを有する位相差板と、観察光学系の光軸の垂直方向に位相差板を往復移動させる移動手段とを備えることを特徴とする。
請求項２の発明による観察装置は、試料に光を照射する照明手段と、照明手段の瞳近傍位置に設置される部分的遮光板と、試料から射出された光束を観察部へ導く光学系と、光学系の瞳位置近傍に設置される位相差板と、試料から射出された光束と位相差板との相対位置を変更する変更手段と、試料から射出された光束に基づいて光学系で形成された顕微鏡像を撮像する撮像手段と、撮像手段で取得した画像であって、光束の位相差板に対する位相分布の変更前における画像と変更後における画像とを用いて試料を強調する強調手段とを備えることを特徴とする。
請求項３に記載の発明は、請求項２に記載の観察装置において、強調手段は、位相分布の変更前における画像と変更後における画像との差分に基づいた差分画像を生成することを特徴とする。
請求項４に記載の発明は、請求項２に記載の観察装置において、強調手段は、位相分布の変更前における画像と変更後における画像を合成することを特徴とする。
請求項５に記載の発明は、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の観察装置において、位相差板は、試料から射出された光束の位相をπ／２ずらす縞状の位相差部を有し、変更手段は、位相差板を光路と垂直な面内において位置変化させることを特徴とする。
請求項６に記載の発明は、請求項５に記載の観察装置において、縞状の位相差部の間隔が異なる複数種類の位相差板を有し、変更手段は、複数種類の位相差板を交換する交換手段を含むことを特徴とする。
請求項７に記載の発明は、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の観察装置において、試料から射出された光束の位相をπ／２ずらす位相差部が同心円状であり、位相差部の同心円の径の異なる複数種類の位相差板を有し、変更手段は、位相差板を交換する交換手段を含むことを特徴とする。
請求項８に記載の発明は、請求項２乃至４のいずれか一項に記載の観察装置において、変更手段は、試料から射出された光束の位相差板への入射位置を変更する光束偏位手段を含むことを特徴とする。
請求項９に記載の発明は、請求項８に記載の観察装置において、光束偏位手段は、光束を位相差板に設けられた縞状の位相差部が並ぶ方向へ移動させることを特徴とする。
請求項１０の発明による観察装置は、試料に光を照射する照明手段と、照明手段の瞳近傍位置に設置される部分的遮光板と、試料から射出された光束を観察部へ導く光学系と、光学系の瞳位置近傍に設置される位相差板と、試料から射出された光束と位相差板との相対位置を変更する変更手段と、試料から射出された光束に基づいて光学系で形成された顕微鏡像を撮像する撮像手段と、撮像手段で取得した画像であって、光束の位相差板に対する位相分布の変化を時系列で表示する表示手段とを備えることを特徴とする。

本発明によれば、試料から射出される光束と位相差板との相対位置を変更して、試料から種々の情報を得ることができる。

以下、図面を参照しながら本発明における実施の形態を説明する。図１は本発明の実施の形態による位相差顕微鏡の概略を示す全体構成図である。
本実施の形態の位相差顕微鏡１００は、次の各光学素子を備える。すなわち、ハロゲンランプや水銀ランプなどで構成される光源１と、集光レンズ２および３と、集光レンズ２と３との間に設けられる縞状スリット４と、載置台５と、第一の対物レンズ６と、第二の対物レンズ７と、第一の対物レンズ６と第二の対物レンズ７との間に設けられる縞状位相差板８と、ＣＣＤなどで構成される撮像素子９とを備える。載置台５上には、光透過性を有する試料である細胞１０を培地１１とともに収容可能な培地容器１２が載置される。なお、紙面の水平方向をＸ軸、紙面と垂直方向をＹ軸、光軸方向をＺ軸としたとき、縞状位相差板８は駆動部１６によりＸ軸方向、すなわち光軸の垂直方向に往復移動可能である。光透過性を有する試料としては、半導体露光用の位相シフトマスクや、半導体露光用マスク上に付着したレジスト等の液体、さらには一般のエポキシ樹脂なども挙げられる。

光源１から発せられた照明光１３は、集光レンズ２および３と縞状スリット４を通して試料１０を照射する。図２に示すように、縞状スリット４は平行平面のガラス板であり、ガラス素子の光透過部４ａとクロムなどが蒸着された遮光部４ｂとが交互に等間隔でＸ軸方向に配列されている。縞状スリット４は細胞１０に対して光源１側の瞳位置に配置されているので、照明光１３が細胞１０へ縞状に照射されることはない。

照明光１３の照射により細胞１０から発生した回折光１４は、第一の対物レンズ６、縞状位相差板８および第二の対物レンズ７を介して撮像素子９に顕微鏡像を結像する。図３に示すように、縞状位相差板８は平行平面のガラス板であり、ガラス素子の光透過部８ａと、回折光１４の位相をπ／２ずらすことができるように薄膜を蒸着させた位相差部８ｂとが交互に等間隔でＸ軸方向に配列されている。なお、縞状位相差板８は細胞１０に対して結像側の瞳位置に配置され、縞状位相差板８と縞状スリット４とは共役な位置関係になるので、縞状スリット４と同様に縞状位相差板８は撮像素子９上に結像しない。また、縞状位相差板８の縞間隔は、縞状スリット４の縞間隔と共役関係であり、相似なピッチとなっている。すなわち、縞状位相差板８の光透過部８ａ、位相差部８ｂのピッチは、縞状スリット４の光透過部４ａと遮光部４ｂのピッチと、光学的倍率に応じて相似になっている。

細胞は、空気とは異なる屈折率をもち、また、細胞の構造によって屈折率に差があり、厚みも異なる。しかし、光透過性であるため、その屈折率差や厚みは観察しにくい。位相差観察法は、このような光透過性の試料を観察する手法として有効であり、位相のずれを可視化するものである。位相のずれは、屈折率差と光路長差（厚みムラ）で生じる。以下において、本発明の原理を説明する。
図４（ａ）に示すように、光透過性の細胞１０の比較的厚みのない部分に照明光Ａを照射したときと、厚みのある部分Ｂを照射したときの回折光を、それぞれ１４Ａ、１４Ｂとする。回折光１４Ａと１４Ｂのそれぞれの回折角度をθＡ、θＢとすると、回折角θＡとθＢは細胞１０の屈折率や厚みの違いにより異なる。回折光１４Ａ、１４Ｂは、観察光学系の結像側瞳面上に設けられた、縞状位相差板８を透過するときに、光透過部８ａ１を透過する回折光と、位相差部８ｂ１により位相がπ／２ずれて透過する回折光とに分けられる。これらの回折光が撮像素子９の結像面上で干渉して、細胞１０の屈折率や厚みの違いにより生じた位相差が強められたり弱められたりするので、細胞１０の顕微鏡像のコントラストが観察可能になる。なお、図４は細胞１０と縞状位相差板８との位置関係を模式的に示す図である。

図４（ｂ）に示すように、駆動部１６により縞状位相差板８をＸ軸方向に移動させると、回折光１４Ａ、１４Ｂに対する縞状位相差板８の位相差部８ｂ１との位置関係がＸ軸方向に変化する。したがって、図４（ａ）の状態において、回折光１４Ａ、１４Ｂが縞状位相差板８を透過した後の回折光１４Ａ１、１４Ｂ１と、図４（ｂ）の状態において、回折光１４Ａ、１４Ｂが縞状位相差板８を透過した後の回折光１４Ａ２、１４Ｂ２とは、異なった位相状態になる。このため、回折光１４Ａ２、１４Ｂ２の結像面上における干渉状態が、回折光１４Ａ１と１４Ｂ１の干渉状態とは異なるものになる。図４では、照明光Ａ、Ｂは、光軸方向に入射するものとしたが、縞状スリット４は、前述したように、照明光学系の瞳位置に配置されているため、光軸に対し角度をもって細胞１０に入射する光もある（図４では不図示）。しかし、縞状スリット４と縞状位相差板８は共役な位置関係にあるため、細胞１０を直進する光（０次回折光）と回折光θＡ、θＢで回折される光の全てに対して、上述した位相変化が起こる。さらに、縞状位相差板８をＸ軸方向に移動させた場合の効果についても上述の通りである。その結果、細胞１０の顕微鏡像の位相差が干渉により強めあったり弱めあったりする位置、すなわち顕微鏡像のコントラストの位置が変化する。たとえば、図５（ａ）に縞状位相差板８の移動前の細胞１０の顕微鏡像を、図５（ｂ）に縞状位相差板８の移動後の細胞１０の顕微鏡像を示す。図５（ａ）、（ｂ）において、実線部分がコントラストのついた位置であり、線幅が太くなるほどコントラストが強い位置を示す。また、破線部分は干渉で打ち消しあってコントラストが弱い位置である。縞状位相差板８を移動すると、図５（ａ）に示すように細胞１０のコントラストがついた状態から、図５（ｂ）に示すようにコントラストがついた状態に遷移する。コントラストがついた位置が変化することにより、光透過性の細胞１０の顕微鏡像は「揺らぎ」として観察される。

上述の細胞１０の揺らぎを観察する観察像処理系を、図６を用いて説明する。
観察像処理系は、縞状位相差板８を移動させる駆動部１６と、撮像素子９で撮像された顕微鏡像に対して画像処理を施す画像処理部２０と、画像処理の結果を顕微鏡像として表示する液晶モニタなどで構成される表示部２３と、パソコンなどの制御部２２とを備える。制御部２２から出力される移動指示信号に応じて駆動部１６が駆動され、縞状位相差板８がＸ軸方向へ移動する。縞状位相差板８の移動量は、駆動部１６に連結したエンコーダなどの測長器で計測され、移動量信号として制御部２２を介して画像処理部２０へ入力される。また、撮像素子９から出力される細胞１０の画像信号も画像処理部２０へ入力される。

画像処理部２０は、入力された移動量信号に基づいて、縞状位相差板８の移動前後における撮像素子１３からの画像信号の差分から画像を生成する。すなわち、撮像素子９から図５（ａ）に示す1枚の画像を取得した後、縞状位相差板８を移動し、図５（ｂ）に示す次の1枚の画像を取得して両画像の差分をとって、図５（ｃ）に示す差分画像を取得する。この画像は制御部２２を介して表示部２３に表示されることにより、縞状位相差板８の移動によってコントラストが変化した部分（差分）だけを抽出し、強調して観察することができる。本実施の形態においては、これを強調手段として実現する。

以上で説明した実施の形態によれば以下の作用効果が得られる。
（１）縞状位相差板８を回折光１４の光軸Ｌと垂直な面内で位置変化させて、回折光１４の光束と縞状位相差板８との相対位置を変更するようにした。したがって、試料の厚みや屈折率により異なる複数の位相情報を取得することができるので、試料を正確に観察することができる。

（２）縞状位相差板８をＸ軸方向（位相差部８ｂの縞の並び方向）へ位置変化させるようにした。したがって、試料の顕微鏡像においてコントラストのつく位置が変化して、顕微鏡像に揺らぎが生じるので、光透過性の試料を観察することができる。

（３）さらに、顕微鏡像に生じた揺らぎにより光透過性の試料を観察することができるので、径が１０ｍｍを超えるような広い視野で観察可能な光学系を用いることができる。

（４）縞状位相差板８の移動前における画像と移動後における画像とを用いて表示部２３により可視化するようにした。したがって、試料の顕微鏡像をコントラストのついた画像として強調して観察することができる。

以上の実施の形態の観察装置を以下のように変形することができる。
（１）光透過部８ａと位相差部８ｂのピッチを変えたり、光透過部８ａと位相差部８ｂとの幅の比を変えた複数種類の縞状位相差板８のうち、試料の厚さや屈折率に応じて、コントラストが最も強調されるピッチや幅の比を有する縞状位相差板８を選択して使用してもよい。この場合、複数種類の縞状位相差板８が駆動部１６により順次交換される。これにより、縞状位相差板８を透過するとき位相がずれる回折光１４の位置が変化するので、試料の顕微鏡像のコントラストがつく位置が変化する。このとき、縞状スリット４の縞間隔は、縞状位相差板８の縞間隔と共役関係にするために、複数種類の縞状位相差板８とそれぞれ相似なピッチの縞状スリット４を複数種類用意し、複数種類の縞状位相差板８の交換にあわせて、相似なピッチの縞状スリット４に不図示の駆動部により交換するようにしてもよい。

（２）縞状位相差板８に代えて、光透過部と位相差部とを光軸Ｌを中心とした輪帯状に設けたリング位相差板を用いてもよい。たとえば、図７（ａ）に示すように、位相差部の同心円の半径が異なるものや、図７（ｂ）に示すように光透過部と位相差部の幅や間隔の異なる複数種のリング位相差板が駆動部１６によって交換されることで、試料の揺らぎが観察される。

（３）光束と位相差板とを相対移動する手段として種々の形態が採用可能である。縞状位相差板８をＸＹ平面内でＸ軸方向に移動させる代わりに、図８に示すように、試料からの回折光１４を移動させるものでもよい。図８は図１の縞状位相差板８の付近のみを示す要部構成図であり、これ以外の構成は図１と同様である。対物レンズ６と縞状位相差板８との間に、ガラス等の平行平面板３０を設ける。平行平面板３０がＸＹ平面内にある場合は、試料からの回折光１４は実線で示す１４ｃとなる。平行平面板３０を破線３１で示すようにＹ軸を中心としてＺ軸方向へ傾けると、屈折作用により回折光１４が図８の一点鎖線で示す１４ｄのようにシフトする。この結果、縞状位相差板８に対して、入射する回折光１４ｄの相対位置が位相差部８ｂの縞の並ぶ方向へ変化するので、上述の実施の形態と同様に試料の揺らぎが観察される。

（４）観察部として撮像素子９を用いる代わりに、接眼レンズを結像面後方に設けて、目視で観察できるようにしてもよい。この場合、観察者が接眼レンズで試料を観察しながら、マイクロメータなどを用いて縞状位相差板８を動かすようにしてもよい。

（５）実施の形態においては、縞状位相差板８がＸＹ平面上をＸ軸方向にのみ移動するものとして説明したが、ＸＹ平面上において光軸Ｌを中心として回転するものでもよい。このとき、縞状位相差板８の縞方向と縞状スリット４の縞方向が合致するように、縞状位相差板８の回転に同期して、縞状スリット４を不図示の駆動部で回転させることが好ましい。

（６）別の強調手段として、画像処理部２０において、差分画像を生成する代わりに、縞状位相差板８の移動前後における撮像素子９からの画像信号を合成して、細胞１０の顕微鏡像の全体を表示部２３に表示させてもよい。

（７）これまでは、強調手段として、画像処理部２０において、縞状位相差板８の移動前後における撮像素子９からの画像信号を差分または合成する技術を示した。しかし、本発明においては、縞状位相差板８の移動位置を限定するものではなく、縞状位相差板８と回折光１４との相対位置が変化した状態であれば、顕微鏡像においてコントラストがつく位置が変化するので、光透過性の位相物体の認識が可能となる。したがって、画像処理部２０で処理する画像は、縞状位相差板８が１０箇所の位置で移動した場合において、１０個の画像を順次差分処理する、または合成処理するように強調してもよい。すなわち、強調手段として位相差板８の複数の移動位置に応じた顕微鏡像を用いてもよい。
なお、強調手段によって強調された差分または合成画像は、表示部２３に表示するときに赤や緑等の色をつけて表示することにより、より認識し易くできる。特に、撮像素子９として白黒ＣＣＤを用いた場合や、単色の照明光を用いた場合などには有効である。

（８）強調手段を用いない場合は、縞状位相差板８の移動に応じて、顕微鏡像を動画として表示部２３に表示させてもよい。すなわち、縞状位相差板８の移動毎に取得される画像を表示部２３に順次表示させることで、試料の揺らぎの様子が動画として表示部２３に表示される。この場合は、縞状位相差板８の移動ごとに取得される画像を不図示のメモリー等の記憶部に記憶させ、移動が完了した後に、順次記憶した画像を呼び出し、表示部２３で時系列的に表示させる。
（９）撮像素子９としてビデオカメラを用いるものでもよい。この場合は、縞状位相差板８の移動に伴う試料の揺らぎが表示部２３によりリアルタイムに観察することができる。

また、本発明の特徴を損なわない限り、本発明は上記実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の形態についても、本発明の範囲内に含まれる。

本発明の実施の形態による観察装置の要部構成を説明する図である。縞状スリットを説明する図である。縞状位相差板を説明する図である。縞状位相差板と回折光との関係とを説明する図である。揺らぎを説明する図であり、（ａ）は縞状位相差板の移動前におけるコントラストの強調された位置を示し、（ｂ）は縞状位相差板の移動後におけるコントラストの強調された位置を示す。本発明の実施の形態による観察装置の観察像処理系を説明するブロック図である。位相差板の位相差部を同心円状に配した場合を説明する図であり、（ａ）は半径の異なるものを示し、（ｂ）は位相差部の幅や間隔の異なるものを示す。回折光の位置を移動させる場合の構成を説明する図である。

符号の説明

１光源４縞状スリット
６対物レンズ８縞状位相差板
９撮像素子１０細胞
１６駆動部２２制御部
２３表示部

Claims

試料に光を照射する照明手段と、
前記照明手段の瞳近傍位置に設置される部分的遮光板と、
前記部分的遮光板を通った前記照明手段からの光により照明された前記試料からの光を観察部に導く観察光学系と、
前記観察光学系の瞳位置近傍に設置され、縞状あるいは輪帯状のスリットを有する位相差板と、
前記観察光学系の光軸の垂直方向に前記位相差板を往復移動させる移動手段とを備えることを特徴とする観察装置。
試料に光を照射する照明手段と、
前記照明手段の瞳近傍位置に設置される部分的遮光板と、
前記試料から射出された光束を観察部へ導く光学系と、
前記光学系の瞳位置近傍に設置される位相差板と、
前記試料から射出された光束と前記位相差板との相対位置を変更する変更手段と、
前記試料から射出された光束に基づいて前記光学系で形成された顕微鏡像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段で取得した画像であって、前記光束の前記位相差板に対する位相分布の変更前における画像と変更後における画像とを用いて試料を強調する強調手段とを備えることを特徴とする観察装置。
請求項２に記載の観察装置において、
前記強調手段は、前記位相分布の変更前における画像と変更後における画像との差分に基づいた差分画像を生成することを特徴とする観察装置。
請求項２に記載の観察装置において、
前記強調手段は、前記位相分布の変更前における画像と変更後における画像を合成することを特徴とする観察装置。
請求項２乃至４のいずれか一項に記載の観察装置において、
前記位相差板は、前記試料から射出された光束の位相をπ／２ずらす縞状の位相差部を有し、
前記変更手段は、前記位相差板を光路と垂直な面内において位置変化させることを特徴とする観察装置。
請求項５に記載の観察装置において、
前記縞状の位相差部の間隔が異なる複数種類の位相差板を有し、
前記変更手段は、前記複数種類の位相差板を交換する交換手段を含むことを特徴とする観察装置。
請求項２乃至４のいずれか一項に記載の観察装置において、
前記試料から射出された光束の位相をπ／２ずらす位相差部が同心円状であり、前記位相差部の同心円の径の異なる複数種類の前記位相差板を有し、
前記変更手段は、前記位相差板を交換する交換手段を含むことを特徴とする観察装置。
請求項２乃至４のいずれか一項に記載の観察装置において、
前記変更手段は、前記試料から射出された光束の前記位相差板への入射位置を変更する光束偏位手段を含むことを特徴とする観察装置。
請求項８に記載の観察装置において、
前記光束偏位手段は、前記光束を前記位相差板に設けられた縞状の位相差部が並ぶ方向へ移動させることを特徴とする観察装置。
試料に光を照射する照明手段と、
前記照明手段の瞳近傍位置に設置される部分的遮光板と、
前記試料から射出された光束を観察部へ導く光学系と、
前記光学系の瞳位置近傍に設置される位相差板と、
前記試料から射出された光束と前記位相差板との相対位置を変更する変更手段と、
前記試料から射出された光束に基づいて前記光学系で形成された顕微鏡像を撮像する撮像手段と、
前記撮像手段で取得した画像であって、前記光束の前記位相差板に対する位相分布の変化を時系列で表示する表示手段とを備えることを特徴とする観察装置。