CN101305275A - 观察设备 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种观察设备，适于以宽视野观察透明样本。为此，根据本发明的观察设备特征在于，配备了：成像光学系统(12)，其构成由样本(10)发出的光的图像；成像单元(11)，其拍摄由成像光学系统(12)所形成的样本(10)的图像；以及照明单元(14、15)，其以面光源照亮样本(10)，在所述面光源中交替设置亮区和暗区。如果适当地设定面光源的位置和亮暗反差的间距，则样本(10)的每一个部分区域都由面光源的每一个亮区以小角度倾斜的照亮。因此，成像单元(11)可以获得每一个部分区域的暗视野观察图像。

Description

观察设备

技术领域

本发明涉及一种观察设备，用于观察透明样本。

背景技术

为了观察透明样本，例如培养容器中的细胞，适当的使用了相差观察(phase contrast observation)(例如，参见非专利文献1和2)，其能够显现它的折射率分布。为了观察不能用肉眼观察的透明样本，必须使用显微镜或其它光学系统，即使是观察仅是想要概略的检查整个样本。

非专利文献1：Hiroshi Komatsu，”Fundamentals and Applications of OpticalMicroscopes(3)”，Applied Physics，Vol.60，No.19，pp.1,032-1,034，1991

非专利文献2：Hiroshi Komatsu，”Fundamentals and Application of OpticalMicroscopes(4)”，Applied Physics，Vol.60，No.11，pp.1,136-1,138，1991

发明内容

本发明解决的问题

然而，不存在这样的相差显微镜：其具有广视野，以便能够一次观察培养容器的整个区域。如果想要实现这样的相差显微镜，其成本是很高的，因为必需要有用于相差观察的很大的成像光学系统和很大的带状(zonal)照明光学系统。

为了仅概略地观察整个样本，一个选择是执行暗视野观察，而不是相差观察。在暗视野观察中，由样本中的折射率跳跃所产生的微弱衍射光(散射光)被检测到，并且仅使用衍射光来形成观察图像。

然而，如果暗视野显微镜的视野被加宽，则照明角度被增大，观察图像仅能够由以很大角度从样本射出的非常微弱的衍射光来形成。因此，观察图像的亮度非常低。而且，在照明角度很大的情况下，会发生由培养容器边缘、底部等所产生的强光进入成像光学系统并妨碍观察的情况。

因此，本发明的目的是提供一种观察设备，适于以宽视野观察透明样本。

解决问题的手段

根据本发明的一种观察设备包括：照明单元，其以面光源照亮样本，在面光源中交替设置亮区和暗区；成像光学系统，其形成穿过被所述照明单元照亮的样本的光的图像；以及成像单元，其拍摄由所述成像光学系统所形成的所述图像。

希望在面光源与样本之间的距离d以及面光源的亮暗间距P满足不等式：

$\frac{P}{d}\≤\sqrt{2(1-0.02/{\mathrm{NA}}^2)}$

在此，NA是成像光学系统的物体侧的数值孔径。

希望在面光源与样本之间的距离d及面光源的亮暗间距P满足不等式：

$\frac{P}{d}\≤2\·{\mathrm{NA}}^{\′}$

在此，NA’是成像光学系统的图像侧的数值孔径。

此外，希望在面光源与样本之间的距离d及面光源的亮暗间距P满足不等式：

$\frac{\mathrm{\λ}}{2\·a\·\mathrm{NA}}\≤\frac{P}{d}$

在此，NA是成像光学系统的物体侧的数值孔径，λ是面光源的波长，a是在成像光学系统的图像侧主平面与成像单元之间的距离。

照明单元可以包括：面光源，其以近似均匀亮度分布来发光；以及遮挡，布置在所述面光源上，其中交替设置孔径区域与遮挡区域。

照明单元可以包括液晶空间光调制器。

根据本发明的观察设备还可以包括图像处理单元，其从成像单元所获取的样本图像中消除面光源的图像成分。

根据本发明的观察设备还可以包括用于改变面光源的亮暗相位的单元。

根据本发明的观察设备还可以包括用于改变面光源的亮暗间距的单元。

此外，根据本发明的观察设备还可以包括用于改变面光源的亮暗占空比的单元。

发明的优点

本发明实现了一种适于以宽视野观察透明样本的观察设备。

附图说明

图1显示了观察设备的整体结构。

图2是示出观察设备的光学系统部分的操作的概念图。

图3显示了图像I₁。

图4显示了图像I₂。

图5示出了由第一实施例中的计算机16执行的图像处理的过程。

图6示出了由第二实施例中的计算机16执行的图像处理的过程。

图7示出了条件1、2和3。

图8显示了根据一种变型例的面光源的亮/暗图案。

图9显示了根据另一个变型例的面光源的亮/暗图案。

具体实施方式

【第一实施例】

以下将说明第一实施例。该实施例是观察设备的一个实施例。

图1显示了该观察设备的整体结构。如图1所示，该观察设备配备了具有背光的透射型液晶面板14、试料台(样本的平台)13、成像光学系统12，成像传感器11、透射型液晶面板的控制器15，计算机16、显示器17等。

透明观察对象10放置在试料台13上。例如，观察对象10是包含未污染细胞的透明培养容器(例如，直径35mm的有盖培养皿)。

透射型液晶面板14几乎照亮了观察对象10的整个区域。为了不妨碍照明光，试料台13的放置了观察对象10的部分由透明材料(例如玻璃)构成或形成空洞。

成像光学系统12具有足够宽的视野，从观察对象10的几乎整个区域射出的光由成像光学系统12所收集并且在成像传感器11的成像平面上形成图像。图像传感器11根据来自计算机16的指令在成像平面上拍摄图像(亮度分布)。图像由计算机16接收，并在经过了图像处理之后显示在显示器17上。

当有必要时，计算机16可以存储经过或未经过图像处理的图像。当有必要时，可以在显示器17上显示未经过图像处理的图像。

根据来自计算机16的指令，控制器15在透射型液晶面板14显示亮区和暗区交替设置的图案。在该实施例中，该图案是条纹型图案。此时，在透射型液晶面板14上形成条纹型面光源。

该面光源的亮暗间距P与作为观察物体的相位对象(细胞)的尺寸(10到15μm)相比足够长，且在面光源与观察对象10之间的距离d适当的长，以便面光源在成像光源系统12的景深之外。将间距P与距离d之间关系设定为满足以下三个条件。

(条件1)观察对象10上的、面光源上的暗区所正对着的部分区域处、由该暗区两侧的亮区所张开的角度足够小。

(条件2)面光源的亮区和暗区确定无疑的存在于成像光学系统12的视野中。

(条件3)可以在成像传感器11上可靠地辨认出面光源的亮区和暗区的存在。

稍后将说明条件1-3的细节。

具体的，在该实施例中，假定面光源的亮区和暗区存在于成像光学系统12的视野中的数十个间距中，且面光源的亮区宽度/暗区宽度比率(占空比)是50％。还假定在成像传感器11上的面光源图像模糊到适当的程度，并且假设面光源图像在间距方向上的亮度分布曲线呈现正弦曲线。就是说，面光源图像在观察平面10a上的照度近似是均匀的。在透射型液晶面板14上的显示图案可以是二进制图案或者是灰度图案。

图2是示出该观察设备的光学系统部分的操作的概念图。图2概念性的显示了该观察设备的光学系统部分。

首先，将注意力集中到面光源上的特定暗区14A和观察对象10上与该暗区14A正对的部分区域10A来做出说明。

从与该暗区14A相邻的两个单独的亮区14B和14C射出的光束LB和LC照亮该部分区域10A。没有来自暗区14A的光束照在该部分区域10A上。因此，部分区域10A由光束LB和LC倾斜的照亮。

尽管部分入射光束LB和LC按其原样不变地穿过部分区域10A，就是说没有被衍射，但受到该部分区域10A中的折射率跳跃的影响，光束LB和LC的其它部分被衍射(或散射)。仅穿过该部分区域10A的未衍射的光束LB和LC不进入成像光学系统12的光瞳。另一方面，由该部分区域10A所产生的衍射(或散射)光束Lb和Lc进入成像光学系统12的光瞳。

此时，在与部分区域10A共轭的成像传感器11上的区域11A中，以叠加方式形成暗区14A的图像和存在于部分区域10A中的相位对象的轮廓图像(以下称为“观察图像”)。就是说，形成部分区域10A的暗视野图像。

在部分区域10A上由两个亮区14B和14C所张开的角度足够小。因此，光束LB和LC照亮区域10A的角度也足够小。此时，以小角度射出的高亮度衍射光Lb和Lc产生了部分区域10A的观察图像。因此，部分区域10A的观察图像足够亮。

以上所述的还用于与观察对象10的、与相应暗区正对的每一个区域。因此，如图3所示，由成像传感器11所获取的图像I₁是这样的：观察图像被叠加到条纹型暗背景上。尽管在图3中，在面光源图像的亮部分与暗部分之间的边界被描绘为清晰线，实际上它们是模糊的。

通过由计算机16在显示器17上显示图像I₁，用户可以容易地观察观察对象10。

然而，图像I₁仅包括约占观察对象10总面积的一半的区域的观察图像(即，仅是与暗区正对的区域的观察图像)。而且，观察图像的对比度很低，因为观察图像的背景不是完全暗背景，且具有正弦曲线亮度分布。

因此，该观察设备的计算机16执行以下的处理，以便以高对比度观察观察对象10的几乎整个区域。

(步骤1)在透射型液晶面板14上显示条纹型面光源(占空比：50％)，并在该状态中获取如图3所示的图像I₁。

(步骤2)将面光源的亮暗相位移动π，并在该状态中获取如图4所示的图像I₂。图像I₂包括与图像I₁区域不同的观察图像。图5(a)概念性的显示了在亮暗间距方向上图像I₁和I₂的亮度分布。

(步骤3)如图5(a)和5(b)所示，在图像I₁和I₂上分别执行空间傅里叶变换，从而获得数据D₁和数据D₂，数据D₁表示图像I₁的空间频率成分，数据D₂表示图像I₂的空间频率成分。在每一个数据D₁和D₂中，在低频侧的大峰值是面光源图像的成分，在高频侧的多个小峰值是观察图像的成分。

(步骤4)如图5(b)和5(c)所示，从每一个数据D₁和D₂中移走面光源图像的成分，从而获得数据D₁’和D₂’。

(步骤5)如图5(c)和5(d)所示，分别对数据D₁’和D₂’上执行傅里叶逆变换，从而获得图像I₁’和I₂’。每一个图像I₁’和I₂’都仅包括观察图像，就是说，其不包括面光源图像。

(步骤6)如图5(d)和5(e)所示，将图像I₁’和I₂’合并在一起，从而获得单一图像I。将图像I显示在显示器17上。

图像I包括观察对象10几乎整个区域的观察图像，且其背景是黑的。因此，用户可以以高对比度观察作为暗视野图像的、观察对象10的几乎整个区域。

【第二实施例】

以下将说明第二实施例。将仅说明与第一实施例的区别。区别存在于由计算机16执行的处理的过程中。根据该实施例的处理如下。

(步骤1)在透射型液晶面板14上显示条纹型面光源(占空比：50％)，并在该状态中获取如图6(a)所示的图像I₁。

(步骤2)将面光源的亮暗相位移动2π/3，并在该状态中获取如图6(b)所示的图像I₂。

(步骤3)将面光源的亮暗相位再移动2π/3，并在该状态中获取如图6(c)所示的图像I₃。

(步骤4)通过在逐个像素基础上，将图像I₁、I₂和I₃代入以下计算公式(1)来获得如图6(d)所示的单一图像I。

$I=\sqrt{{(I_1-I_2)}^2+{(I_2-I_3)}^2+{(I_3-I_1)}^2}\·\·\·\left(1\right)$

图像I包括观察对象10几乎整个区域的观察图像，且其背景亮度是均匀的。为了使背景是黑的，计算机16从图像I移走其空间频率是0的成非(第0个成分)。计算机16在显示器17上显示生成的图像。

所得到的图像，即删除了第0个成分的图像，包括观察对象10几乎整个区域的观察图像，且其背景是黑的。因此，用户可以以高对比度来观察作为暗视野图像的、观察对象10的几乎整个区域。

在该实施例中，更简单的计算公式(1’)可以用来代替计算公式(1)：

I＝I₁+I₂+I₃     …(1′)

【条件1，2和3】

以下将说明上述条件1，2和3的细节。

图7示出了上述条件1，2和3。在图7中，参考标记11a表示成像传感器11的成像平面，标记10a表示成像光学系统12的聚焦平面(即，观察平面)，标记14a表示在其上形成了面光源的平面(即，光源平面)。

(条件1)

首先，以θ来表示在观察平面10a上一点处由暗区14A和亮区14C所张开的角度。角度θ与照在观察平面10a上的两个光束LC和LB的入射角相对应。

自观察平面10a起并能够进入成像光学系统12光瞳的衍射光Lc和Lb的衍射角是角度ξ，该角度同时满足以下所有公式(2)、(3)和(4)：

0≤ρ≤NA…(3)

字符NA表示成像光学系统12物体侧的数值孔径，且通过将其视为足够小而可以得到近似值。

依据公式(2)-(4)，衍射光Lc和Lb光量与照在观察平面10a上的光束LC和LB的光量的比值R由以下等式(5)给出：

$=\frac{1}{2}\·{\mathrm{NA}}^2\·\cos \mathrm{\θ}\·\·\·\left(5\right)$

如果该光量比值R足够大，就会给予观察图像足够的亮度。为此，该光量比值R至少需要满足以下不等式(6)：

R≥0.01…(6)

通过将等式(5)代入不等式(6)来获得不等式(7)：

$\frac{1}{2}\·{\mathrm{NA}}^2\·\cos \mathrm{\θ}\≥0.01\·\·\·\left(7\right)$

给出角度θ由以下等式(8)，其包括从光源平面14a到观察平面10a的距离d，和面光源亮暗间距P。通过将θ视为足够小来得到近似值。

$\mathrm{\θ}=\left(\frac{P}{2}\right)/d\·\·\·\left(8\right)$

通过将等式(8)代入不等式(7)来获得不等式(9)。通过将θ视为足够小来得到近似值(使用了逼近公式

)

$\frac{P}{d}\≤\sqrt{2(1-0.02/{\mathrm{NA}}^2)}\·\·\·\left(9\right)$

不等式(9)是对应于条件1的条件公式。

(条件2)

首先，由等式(10)给出在光源平面14a中的与成像光学系统12的视野相符的区域的宽度Z：

Z＝2·NA′×d  …(10)

在此，NA’是成像光学系统12的图像侧的数值孔径。

对于存在于在光源平面14a中具有宽度Z的区域中的一个或多个间距的亮区和暗区，需要满足不等式(11)：

P≤Z    …(11)

通过将等式(10)代入不等式(11)来获得不等式(12)：

$\frac{P}{d}\≤2\·{\mathrm{NA}}^{\′}\·\·\·\left(12\right)$

不等式(12)是对应于条件2的条件公式。

(条件3)

首先，对于要在成像平面11a中将在光源平面14a中的亮区和暗区分辨出，成像光学系统12的放大倍数M和光源波长λ需要满足不等式(13)：

$P\·M\≥\frac{\mathrm{\λ}}{2\·\mathrm{NA}}\·\·\·\left(13\right)$

由以下等式(14)给出成像光学系统12的放大倍数M：

$M=\frac{a}{b+d}\·\·\·\left(14\right)$

在此，a是从成像光学系统12的图像侧主平面到成像平面11a的距离，b是由成像光学系统12的图像侧主平面到观察平面10a的距离。

由于d＞＞b，因此等式(14)可以被重写入等式(15)：

$M=\frac{a}{d}\·\·\·\left(15\right)$

通过将等式(15)代入不等式(13)来获得不等式(16)：

$\frac{\mathrm{\λ}}{2\·a\·\mathrm{NA}}\≤\frac{P}{d}\·\·\·\left(16\right)$

不等式(16)是对应于条件3的条件公式。

【对各个实施例的修改】

尽管各个实施例都采用了控制器和具有背光的透射型液晶面板来产生面光源，但也可以使用其它设备，只要它们能够产生类似的面光源。

例如，准备许多小光源，例如LED，并以阵列形式密集排列，从而形成以近似均匀亮度分布发光的面光源。将具有条纹型孔径的遮挡部件布置在面光源上。结果，形成条纹型面光源。附带地，通过在亮暗间距方向上偏移遮挡部件可以偏移面光源的亮暗反差相位。也可以不偏移遮挡部件，而是准备并切换具有不同孔径图案的多个遮挡部件。

尽管在各个实施例中面光源的亮暗间距都是固定的，但所述间距也可以根据作为观察物体的相位对象(细胞)的尺寸来改变。这使得有可能正确地观察具有不同尺寸的相位对象(细胞)。

尽管在各个实施例中，面光源的亮暗占空比是固定的，但可以根据作为观察主体的相位对象(细胞)的折射率来改变占空比。例如，当相位对象(细胞)的折射率较大，而在这样情况下衍射光的亮度较高时，暗区的比例可以增大(例如到70％或80％)，从而减小图像获取的次数。这是由于当暗区比例较高时，在同一图像中的观察图像占据更大的面积。另一方面，当相位对象(细胞)的折射率较小时，可以减小暗区比例(例如到30％)，并从而增大图像获取的次数。

尽管在各个实施例中，面光源的明/暗图案是条纹型图案，但也可以采用其它亮区和暗区交替设置的图案。例如，可以采用如图8所示的方格型图案。也可以采用如图9所示的同心型图案。在两种情况下，都可以通过在使亮区和暗区对换的方向上改变图案(同心图案的情况下是在径向上)，来偏移亮暗相位。

条纹型图案(图1)或方格型图案(图8)的使用是优选的，因为其简化了相移处理和图像处理。

【实例1】

NA≥0.14286

P＝6mm

d＝30mm

这些数值满足条件1(不等式(9))。

【实例2】

NA’≥0.1

P＝6mm

d＝30mm

这些数值满足条件2(不等式(12))。

【实例3】

NA≥0.003

P＝6mm

d＝30mm

a＝5mm

λ＝550nm＝550×10^-4mm

这些数值满足条件3(不等式(16))。

【实例4】

NA≥0.14286

P＝6mm

d＝30mm

NA’≥0.1

a＝5mm

λ＝550nm＝550×10^-4mm

这些数值满足全部条件1(不等式(9))、条件2(不等式(12))和条件3(不等式(16))。

Claims (10)

1、一种观察设备，包括：

照明单元，其以面光源照亮样本，在所述面光源中交替设置亮区和暗区；

成像光学系统，其构成穿过所述照明单元所照亮的所述样本的光的图像；以及

成像单元，其拍摄由所述成像光学系统所形成的所述图像。

2、根据权利要求1的观察设备，其中，在所述面光源与所述样本之间的距离d及所述面光源的亮暗间距P满足不等式：

$\frac{P}{d}\≤\sqrt{2(1-0.02/{\mathrm{NA}}^2)}$

在此，NA是所述成像光学系统的物体侧的数值孔径。

3、根据权利要求1或2的观察设备，其中，在所述面光源与所述样本之间的距离d及所述面光源的亮暗间距P满足不等式：

$\frac{P}{d}\≤2\·{\mathrm{NA}}^{\′}$

在此，NA’是所述成像光学系统的图像侧的数值孔径。

4、根据权利要求1到3任何一项的观察设备，其中，在所述面光源与所述样本之间的距离d及所述面光源的亮暗间距P满足不等式：

$\frac{\mathrm{\λ}}{2\·a\·\mathrm{NA}}\≤\frac{P}{d}$

在此，NA是所述成像光学系统的物体侧的数值孔径，λ是所述面光源的波长，a是在所述成像光学系统图像侧主平面与所述成像单元之间的距离。

5、根据权利要求1到4任何一项的观察设备，其中，所述照明单元包括：

面光源，其以近似均匀的亮度分布发光；以及

遮挡，布置在所述面光源上，其中，孔径区域与遮挡区域交替设置。

6、根据权利要求1到4任何一项的观察设备，其中，所述照明单元包括液晶空间光调制器。

7、根据权利要求1到6任何一项的观察设备，还包括图像处理单元，其从所述成像单元所获取的所述样本的所述图像中移走所述面光源图像的成分。

8、根据权利要求1到7任何一项的观察设备，还包括用于改变所述面光源的亮暗相位的单元。

9、根据权利要求1到8任何一项的观察设备，还包括用于改变所述面光源的亮暗间距的单元。

10、根据权利要求1到9任何一项的观察设备，还包括用于改变所述面光源的亮暗占空比的单元。

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