JP6985966B2 - 撮像方法および撮像装置 - Google Patents

Description

この発明は、試料容器に設けられた窪部に液体と共に担持された試料を撮像する撮像方法および撮像装置に関するものである。

医学や生物学の実験においては、例えば、ウェルと称される窪部を多数配列して設けたプレート状の試料容器（例えばマイクロプレート、マイクロタイタープレート等と呼ばれる）の各ウェルに液体（例えば培養液等）を注入し、ここで細胞等を培養したものを試料として観察、計測するために撮像装置が近年利用されている。この撮像装置では、ＣＣＤカメラ等で試料を撮像してデータ化し、該画像データに種々の画像処理技術を適用して観察や分析に供している。

ところが、このような撮像装置において、例えば試料の上方から照明光を入射させ、容器底面から透過してくる光を受光して撮像を行う場合、注入された液体表面のメニスカスにより照明光が屈折することで、画像の明るさが位置により異なる。そこで、開口絞りの位置を調整することでメニスカスにより進路が曲げられた外側に進む光を開口絞りを通過させて撮像素子に入射させ、明るい画像を得ている。

特開２０１５−１１８０３６号公報

試料容器としては、マイクロプレートなど以外に、シャーレ、ディッシュ等と称される浅皿型のものがある。この浅皿型の試料容器では、撮像装置の撮像視野内に試料が収まりきらないため、撮像位置を変えて複数回撮像を行うことで試料全体の撮像を行う。しかしながら、メニスカスの影響の現れ方は使用する試料容器、培養液の種類や液量に応じて異なる。したがって、メニスカスの影響による明るさのムラを抑えて良好な画像を取得するためには、少なくともメニスカスの影響を受ける撮像位置では、その撮像位置に応じて開口絞りの位置を柔軟に適正化するのが望ましい。しかしながら、このような考慮がなされた撮像技術は存在していなかった。

この発明は上記課題に鑑みなされたものであり、液体と共に試料を担持する窪部を有する試料容器に対して窪部よりも狭い撮像視野を有する撮像部を相対的に移動させて試料を撮像する撮像装置において、メニスカスの影響による明るさのムラを抑えた画像を得ることのできる技術を提供することを目的とする。

この発明の一態様は、撮像方法であって、液体と共に試料を担持する窪部を有する試料容器に対して窪部よりも狭い撮像視野を有する撮像部を相対移動させて位置決めする毎に、撮像部において窪部から出射される光を開口絞りを介して撮像素子で受光して試料の部分画像を取得する画像取得工程と、画像取得工程により得られた複数の部分画像を合成して試料の全体画像を取得する合成工程とを備え、画像取得工程は、撮像視野に窪部の周縁部が含まれる位置に撮像部が位置決めされた周縁撮像状態で部分画像を取得する前に、開口絞りの位置を合成工程に適した最適絞り位置に調整する絞り位置調整工程を有し、絞り位置調整工程では、周縁撮像状態で試料容器と撮像素子との間の光路上で開口絞りを互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に撮像部により撮像された部分画像の階調値を求め、複数の階調値に基づき最適絞り位置を決定し、開口絞りを最適絞り位置に移動させて位置決めすることを特徴としている。

また、この発明の他の態様は、試料容器に設けられた窪部に液体と共に担持された試料を撮像する撮像装置であって、窪部から出射される光を開口絞りを介して撮像素子で受光して窪部よりも狭い撮像視野で試料の部分画像を取得する撮像部と、試料容器に対して撮像部を相対移動させて位置決めする位置決め機構と、試料容器と撮像素子との間の光路に沿って開口絞りを移動させる絞り移動機構と、位置決め機構により試料容器に対して撮像部を互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に撮像部により試料の部分画像を取得し、複数の部分画像を合成して試料の全体画像を取得する制御部とを備え、制御部は、撮像視野に窪部の周縁部が含まれる位置に撮像部が位置決めされた周縁撮像状態で試料容器と撮像素子との間の光路上で開口絞りを互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に撮像部により撮像された部分画像の階調値を取得する階調取得部と、複数の階調値に基づき部分画像の合成に適した光路上における開口絞りの位置を決定する絞り位置決定部と、開口絞りを絞り位置決定部により決定された位置に移動させて調整する絞り位置調整部を有することを特徴としている。

上記のように構成された発明では、撮像部により試料の部分画像を取得するが、撮像部の撮像視野は窪部よりも狭いため、試料全体を撮像することができず、撮像部は試料の部分画像を取得する。特に、周縁撮像状態で部分画像を取得する場合には、注入された液体表面のメニスカスの影響を受ける。しかしながら、上記撮像を行う前に、周縁撮像状態で試料容器と撮像素子との間の光路上で開口絞りを互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に撮像部により撮像された部分画像の階調値を求め、複数の階調値に基づき最適絞り位置を決定し、開口絞りを最適絞り位置に移動させて位置決めする。その結果、メニスカスの影響で暗くなる試料の周縁部については、開口絞りの位置調整により入射光量を増加させる。

この発明によれば、周縁撮像状態で撮像するときの開口絞りの位置調整によりメニスカスの影響を抑え、試料の全体画像において明るさのムラを抑えることができる。

本発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。 図１に示す撮像装置による画像作成処理を示すフローチャートである。 画像作成処理で実行される撮像処理を示すフローチャートである。 試料を複数の部分画像に分割する際の分割方法を示す模式図である。 撮像部を周縁撮像位置に位置させた周縁撮像状態で撮像される試料の部分画像および部分画像を構成する画素の階調特性を模式的に示す図である。

図１は本発明にかかる撮像装置の一実施形態の概略構成を示す図である。この撮像装置１は、試料容器であるディッシュＤの上面に形成された窪部に液体が注入されてなる試料を撮像する装置である。以下、各図における方向を統一的に示すために、図１に示すようにＸＹＺ直交座標軸を設定する。ここでＸＹ平面が水平面、Ｚ軸が鉛直軸を表す。より詳しくは、（＋Ｚ）方向が鉛直上向き方向を表している。

ディッシュＤは、底面が平坦かつ透明で上向きに開口する、平面視が略円形で浅皿型の容器であり、その直径は例えば数十ミリメートル程度である。ディッシュＤ内には培地Ｍとしての液体が所定量注入され、この液体中において所定の培養条件で培養された細胞あるいは細菌等が培養されて、この撮像装置１の撮像対象となる試料が予め作製されている。培地Ｍは適宜の試薬が添加されたものでもよく、また液状でディッシュＤに注入された後ゲル化するものであってもよい。

撮像装置１は、試料を担持するディッシュＤの下面周縁部に当接してディッシュＤを略水平姿勢に保持するホルダ１１と、ホルダ１１の上方に配置される照明部１２と、ホルダ１１の下方に配置される撮像部１３と、これら各部の動作を制御するＣＰＵ１４１を有する制御部１４とを備えている。

照明部１２は、ホルダ１１により保持されたディッシュＤに向けて拡散度の低い照明光、例えば平行光を出射する。また、照明部１２の光源としては、例えば白色ＬＥＤ（Light Emitting Diode）用いることができる。照明部１２により、ディッシュＤに担持された試料が上方から照明される。

ホルダ１１により保持されたディッシュＤの下方に、撮像部１３が設けられる。撮像部１３では、ディッシュＤの直下位置に対物レンズ１３１が配置されている。対物レンズ１３１の光軸は鉛直方向（Ｚ方向）に向けられており、対物レンズ１３１の光軸ＯＡに沿って上から下に向かって順に、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４がさらに設けられている。対物レンズ１３１、開口絞り１３２および結像レンズ１３３は、それぞれの中心が鉛直方向（Ｚ方向）に沿って一列に並ぶように配置されている。なお、この例では撮像部１３を構成する各部が鉛直方向に一列に配列されているが、各部間の距離（光路長）が所定の関係を満たす限りにおいて、反射鏡等により光路が折り返されていてもよい。

撮像部１３は、制御部１４に設けられたメカ駆動部１４６によりＸＹＺ方向に移動可能となっている。具体的には、メカ駆動部１４６が、ＣＰＵ１４１からの制御指令に基づき、撮像部１３を構成する対物レンズ１３１、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４を一体的にＸ方向およびＹ方向に移動させることにより、撮像部１３がディッシュＤに対し水平方向に相対移動する。ディッシュＤに対し撮像部１３が水平方向における所定位置に位置決めされた状態で、撮像部１３によるディッシュＤ内の試料の撮像が行われる。

また、メカ駆動部１４６は、撮像部１３をＺ方向に移動させることにより、撮像対象物に対する撮像部のフォーカス合わせを行う。具体的には、撮像対象物たる試料が存在するディッシュＤの内底面に対物レンズ１３１の焦点が合うように、メカ駆動部１４６が、対物レンズ１３１、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４を一体的に上下動（Ｚ方向移動）させる。

さらに、メカ駆動部１４６は、対物レンズ１３１とは独立して、開口絞り１３２を上下動可能となっている。すなわち、この実施形態では対物レンズ１３１と開口絞り１３２とのＺ方向距離が可変となっている。その可変範囲Ｒｚは、対物レンズ１３１の焦点ＦＰのＺ方向位置Ｚｆを含み、かつ、それより（−Ｚ）方向、つまり撮像デバイス１３４に近い側へ広がっている。可変範囲Ｒｚが焦点ＦＰよりも（＋Ｚ）方向、つまり対物レンズ１３１に近い側を含むか否かは任意である。以下では開口絞り１３２のＺ方向位置（絞り位置）を符号Ｚｓにより表す。

対物レンズ１３１に対し開口絞り１３２が上下動するとき、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４も開口絞り１３２と一体的に上下動する。すなわち、開口絞り１３２と結像レンズ１３３との距離、および結像レンズ１３３と撮像デバイス１３４との距離はいずれも結像レンズ１３３の焦点距離に固定されている。したがって、開口絞り１３２、結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４によるテレセントリック光学系が、対物レンズ１３１に対し上下動する。このように開口絞り１３２を対物レンズ１３１に対し移動させる理由については後述する。

撮像部１３により、ディッシュＤ内の生物試料が撮像される。具体的には、照明部１２から出射されディッシュＤの上方から培地Ｍに入射した光が撮像対象物を照明し、ディッシュＤ底面から下方へ透過した光が対物レンズ１３１により集光され、開口絞り１３２、結像レンズ１３３を介して最終的に撮像デバイス１３４の受光面に撮像対象物の像が結像し、これが撮像デバイス１３４の受光素子１３４１により受光される。受光素子１３４１は二次元イメージセンサであり、その表面に結像した撮像対象物の二次元画像を電気信号に変換する。受光素子１３４１としては、例えばＣＣＤセンサまたはＣＭＯＳセンサを用いることができる。

本実施形態では、ディッシュＤ内の試料の水平方向（ＸＹ方向）の広がり範囲が撮像部１３の撮像視野よりも大きいため、メカ駆動部１４６によりディッシュＤに対する観察光学系１３０の水平方向位置（撮像位置）を多段階に変更しながら、その都度撮像部１３が撮像を行うことにより、試料の全体を複数の部分画像に分割して記録する。

受光素子１３４１から出力される画像信号は、制御部１４に送られる。すなわち、画像信号は制御部１４に設けられたＡＤコンバータ（Ａ／Ｄ）１４３に入力されてデジタル画像データに変換される。ＣＰＵ１４１は、受信した画像データに基づき適宜画像処理を実行する。例えば、上記したように複数に分割して撮像された部分画像を合成して、試料全体に対応する合成画像を作成する処理を実行する。

制御部１４はさらに、画像データを記憶保存するための画像メモリ１４４と、ＣＰＵ１４１が実行すべきプログラムやＣＰＵ１４１により生成されるデータを記憶保存するためのメモリ１４５とを有しているが、これらは一体のものであってもよい。そして、ＣＰＵ１４１は上記プログラムにしたがって装置各部を制御することで周縁撮像状態でディッシュＤと撮像デバイス１３４との間の光路上で開口絞り１３２を互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に撮像部１３により撮像された部分画像の階調値を求め、複数の階調値に基づき最適絞り位置を決定し、開口絞り１３２を最適絞り位置に移動させて位置決めする。このように、本実施形態では、ＣＰＵ１４１は本発明の「階調取得部」、「絞り位置決定部」および「絞り位置調整部」として機能する。なお、その他に、制御部１４には、インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４２が設けられている。インターフェース１４２は、ユーザーからの操作入力を受け付けたり、ユーザーへの処理結果等の情報提示を行うほか、通信回線を介して接続された外部装置との間でのデータ交換を行う。

次に、上記のように構成された撮像装置１の動作について図２ないし図５を参照しつつ説明する。図２は図１に示す撮像装置による画像作成処理を示すフローチャートである。また、図３は画像作成処理で実行される撮像処理を示すフローチャートである。この画像作成処理は、ＣＰＵ１４１がメモリ１４５に予め記憶された制御プログラムを実行し、装置各部に所定の動作を行わせることにより実現される。

最初に、外部から試料を担持するディッシュＤが撮像装置１に搬入され、ホルダ１１にセットされる（ステップＳ１）。次に、インターフェース１４２を介してユーザーまたは外部のホスト装置から与えられる試料に関する情報を受け付ける（ステップＳ２）。試料の情報は、例えば、ディッシュＤのサイズ、培地Ｍの種類および注入量、培養される細胞の種類等である。

これらの情報および参照テーブルとして予めメモリ１４５に記憶されている情報とに基づき、ＣＰＵ１４１は、撮像位置の割り付けや撮像順序、撮像分解能、照明条件等の組み合わせからなる撮像スケジュールを作成する（ステップＳ３）。このような撮像スケジュールを作成するのは、次のような考えに基づくものである。すなわち、撮像部１３の撮像視野よりも平面サイズの大きい試料を撮像し試料全体に対応する画像を作成するためには、以下の手順（１）〜（３）を実行するのが好適である。つまり、
（１）撮像位置を変更しながら複数回撮像を行い、試料を複数の部分画像に分割して撮像する、
（２）撮像視野にメニスカスが含まれる場合には、撮像時に開口絞り１３２の位置を調整することで光量低下を抑制する、
（３）撮像後の画像処理により、各部分画像からメニスカスの影響の少ない部分を抽出して合成し、試料全体を表す画像を作成する、
というものである。

図４は試料を複数の部分画像に分割する際の分割方法を示す模式図である。同図に示すように、この例ではディッシュＤの内部を２９枚の部分画像に分割して撮像する。隣接する部分画像の撮像範囲は、画像の欠落、つまりどの部分画像にも含まれない試料の領域が生じるのを防止するために、互いに一部が重複するように配置される。なお、各部分画像の撮像範囲の実際の形状は矩形であるが、図４では、部分画像の重なりを見やすくするために隅を丸めた矩形として示している。また、部分画像の枚数や配置はディッシュのサイズや形状により適宜変更可能である。

実線で示される撮像範囲Ｒｃ１（９箇所）は、撮像部１３の撮像視野にディッシュＤに形成された窪部Ｄａの中央部が含まれる位置に撮像部１３が位置決めされた中央撮像状態で撮像部１３により撮像された範囲を示している。つまり、撮像範囲Ｒｃ１はディッシュＤの周縁部よりも十分内側に配置されており、メニスカス（図１中の符号ＭＳ）の影響を考慮する必要がなく、開口絞り１３２は対物レンズ１３１の焦点位置に配置される（Ｚｓ＝Ｚｆ）。これらの撮像範囲Ｒｃ１をそれぞれ撮像することで、試料の中央部分の画像情報を含む部分画像（以下「中央部分画像」という）が得られる。

点線で示される撮像範囲Ｒｃ２（１６箇所）は、撮像範囲Ｒｃ１の周りを囲むように配置され、それぞれディッシュＤに形成される窪部の周縁部の一部を含む。これらの撮像範囲Ｒｃ２の撮像時には、メニスカスＭＳの影響の大きさに応じた絞り位置調整がなされる。ただし、ディッシュＤ内で生じるメニスカスＭＳの形状および当該メニスカスＭＳにより偏る照明光の主光線の傾きを予測し、メニスカスＭＳによる影響を抑えて上記合成処理に適した部分画像を得るために絞り位置（以下「最適絞り位置」という）を予め設定することは難しい。そこで、本実施形態では、画像取得処理（ステップＳ４）において撮像範囲Ｒｃ２について部分画像を撮像するために撮像部１３を周縁撮像位置（ディッシュＤ周縁部の直下位置）に位置決めしたときには、部分画像を撮像する前に絞り位置Ｚｓを多段階に変更して最適絞り位置を求め、開口絞り３２の位置調整を柔軟に行っている。なお、破線で示される撮像範囲Ｒｃ３（４箇所）は、画像品質向上のために補助的に撮像される部分画像の範囲である。ディッシュＤ中央部分に設定される撮像範囲Ｒｃ１にはメニスカスの影響は現れないが、例えば撮像部１３において対物レンズ１３１、開口絞り１３２や結像レンズ１３３によるケラレや収差等により、部分画像の周縁部において画像品質が低下する場合がある。より画像品質の良好な撮像範囲の中央部分の画像情報を利用するために、ディッシュＤ中央部の撮像範囲Ｒｃ１間の境界部分を覆うように撮像範囲Ｒｃ３が設定される。撮像範囲Ｒｃ３の撮像時にも、開口絞り１３２は対物レンズ１３１の焦点位置に配置される。

図２に戻って説明を続ける。撮像スケジュールの作成が完了する（ステップＳ３）と、当該撮像スケジュールに基づき、撮像位置、絞り位置等を順次変更設定しながら撮像部１３が複数回撮像を実行し、これにより複数枚の部分画像が取得される（ステップＳ４：画像取得処理）。以下、図３ないし図５を参照しつつ画像取得処理（ステップＳ４）について詳述する。

この画像取得処理においては、ディッシュＤに対して撮像部１３を位置決めして撮像する回数を示すカウント値ｍを初期化した（ステップＳ４０１）後で、最大カウント値ｍmaxだけ部分画像の取得（ステップＳ４０２〜Ｓ４１４）を繰り返す。なお、本実施形態では、撮像範囲を２９個に区画しているため、最大カウント値ｍmaxは「２９」に設定されている。

次に、カウント値ｍに応じた撮像位置Ｐ（ｍ）に撮像部１３を移動して位置決めする（ステップＳ４０２）。ここで、撮像位置Ｐ（ｍ）には大きく分けてメニスカスの影響を受けないものと、メニスカスの影響を受けるものとの２種類が存在する。すなわち、メニスカスの影響を受けない撮像範囲Ｒｃ１、Ｒｃ３を撮像する際には、ディッシュＤ中央部の直下位置（以下「中央撮像位置」という）に撮像部１３を移動して位置決めする。一方、メニスカスの影響を受ける撮像範囲Ｒｃ２を撮像する際には、ディッシュＤ周縁部の直下位置、つまり周縁撮像位置に撮像部１３を移動して位置決めする。

そこで、本実施形態では、撮像位置Ｐ（ｍ）が中央撮像位置であると判定した（ステップＳ４０３で「ＮＯ」）ときには、開口絞り１３２を一般的な位置、つまり対物レンズ１３１の焦点ＦＰに対応する位置（すなわち、Ｚｓ＝Ｚｆ）に位置させる（ステップＳ４０３）。一方、撮像位置Ｐ（ｍ）が周縁撮像位置であると判定した（ステップＳ４０３で「ＹＥＳ」）ときには、開口絞り１３２をＺ方向に多段階に位置決めする毎に撮像範囲Ｒｃ２を撮像して上記合成処理に適した部分画像を得ることができる開口絞り１３２の位置、つまり最適絞り位置を決定し、最適絞り位置に開口絞り１３２を位置させる（ステップＳ４０５〜Ｓ４１１）。より詳しくは、以下の動作が実行される。

ステップＳ４０５では、位置決め・撮像動作（撮像部１３を周縁撮像位置に位置させたまま開口絞り１３２を結像レンズ１３３および撮像デバイス１３４とともにＺ方向に移動して位置決めして撮像する動作）の回数を示すカウント値ｎを初期化する。そして、最大カウント値ｎmaxだけステップＳ４０６〜４０９を繰り返す。この点について、図５を参照しつつ説明する。

図５は撮像部を周縁撮像位置に位置させた周縁撮像状態で撮像される試料の部分画像および部分画像を構成する画素の階調特性を模式的に示す図である。同図中の（ａ）では、周縁撮像状態で撮像されたディッシュＤ周縁部の画像ＩＤと、試料の周縁部の画像ＩＳとが図示されている。また、符号ＰＸ（０，０）は試料の部分画像を構成する画素の一つを示しており、当該画素ＰＸ（０，０）の階調値が（ｂ）〜（ｄ）中の階調値Ｖ（０，０）である。さらに、同図中の（ｂ）〜（ｄ）は画素ＰＸ（０，０）からＸ方向に進んだ画素の階調値をプロットしたものであり、それぞれ「カウント値ｎ＝１」、「カウント値ｎ＝２」、「カウント値ｎ＝ｎmax」での階調値の変化を模式的に示している。なお、階調値がＸ方向に進むにしたがって小さくなっているのはメニスカス（図１中の符号ＭＳ）による影響であり、次に説明するように階調特性の変化は開口絞り１３２の位置の変化に伴うものである。

ステップＳ４０６でカウント値ｎに応じた絞り位置Ｚｓ（ｎ）に開口絞り１３２を位置させる。本実施形態では、図５に示すように、カウント値ｎ＝１では開口絞り１３２を対物レンズ１３１の焦点ＦＰに対応する位置（すなわち、Ｚｓ（１）＝Ｚｆ）に位置させている。また、図１に示すように下に凸のメニスカスが形成されていることからカウント値ｎが進むにしたがって、開口絞り１３２を対物レンズ１３１の焦点ＦＰよりも撮像デバイス１３４に近い側、つまり（−Ｚ）側に位置決めしている。つまり、可変範囲Ｒｚ内で
Ｚｓ（１）＜Ｚｓ（２）＜…＜Ｚｓ(ｎmax−１）＜Ｚｓ(ｎmax）
が満足されるように開口絞り１３２が位置決めされる。こうして、物体側ハイパーセントリック特性を有する光学系を形成している。

そして、開口絞り１３２の位置決め後に撮像部１３により試料を撮像して例えば図５（ａ）に示すような部分画像を取得し、画像メモリ１４４に記憶する。また、当該部分画像の階調値Ｖ（ｘ、ｙ）を取得する（ステップＳ４０７）。それに続いて、それらの階調値Ｖ（ｘ、ｙ）の平均値、つまり平均階調値Ｖａｖ（ｎ）を導出し、そのときの絞り位置Ｚｓ（ｎ）と関連付けてメモリ１４５に記憶する（ステップＳ４０５）。その後でカウント値ｎが最大カウント値ｎmaxを超えているか否かを判定し（ステップＳ４０９）、このステップＳ４０９で「ＮＯ」と判定している間、カウント値ｎを「１」だけインクリメントした（ステップＳ４１０）後でステップＳ４０６に戻って上記処理（ステップＳ４０６〜Ｓ４０８）を繰り返す。一方、所定回数ｎmaxだけ上記処理（ステップＳ４０６〜Ｓ４０８）が繰り返されて平均階調値Ｖａｖ（１）、Ｖａｖ（２）、…、Ｖａｖ（ｎmax）が取得されたことを確認する（ステップＳ４０９で「ＹＥＳ」と判定する）と、それらの平均階調値Ｖａｖ（１）、Ｖａｖ（２）、…、Ｖａｖ（ｎmax）に基づいて最適絞り位置を決定し、その最適絞り位置に開口絞り１３２を位置決めする（ステップＳ４１１）。より具体的には、本実施形態では撮像部１３を中央撮像位置に位置決めした中央撮像状態で撮像部１３により撮像された部分画像の平均階調値Ｖｃｔを記憶しておき、図５（ｂ）〜（ｄ）に示すように平均階調値Ｖｃｔと平均階調値Ｖａｖ（ｎ）との差Ｄ（ｎ）が最も小さいときの絞り位置Ｚｓを最適絞絞り位置として決定している。

上記のようにして開口絞り１３２の位置決めが完了すると、撮像部１３により部分画像を撮像し、画像メモリ１４４に記憶する（ステップＳ４１２）。その後でカウント値ｍが最大カウント値ｍmaxを超えているか否かを判定し（ステップＳ４１３）、このステップＳ４１３で「ＮＯ」と判定している間、カウント値ｍを「１」だけインクリメントした（ステップＳ４１４）後でステップＳ４０２に戻って上記処理（ステップＳ４０２〜Ｓ４１３）を繰り返す。一方、所定回数ｍmaxだけ上記処理（ステップＳ４０２〜Ｓ４１３）が繰り返されて全ての撮像範囲Ｒｃ１、Ｒｃ２、Ｒｃ３について部分画像が撮像されると、画像取得処理を終了し、次のステップＳ５に進む。

こうして得られた複数の部分画像に基づき、ＣＰＵ１４１が画像処理を行うことにより、試料の全体像に対応する画像が作成される。具体的には、図２に示すように各部分画像から有効領域に対応する部分画像が抽出され（ステップＳ５）、それらを合成した合成画像が作成される（ステップＳ６：合成工程）。ただし、得られた合成画像では、異なる部分画像から抽出された部分画像の継ぎ目において画像要素の連続性が損なわれていることがある。そこで、スムージング処理によって継ぎ目の不連続性が解消される（ステップＳ７）。そして、こうして作成された合成画像が画像メモリ１４４に保存されるともに、出力画像として外部装置に出力される（ステップＳ８）。

以上のように、本実施形態によれば、作成された出力画像では、メニスカスの影響による周縁部での光量低下が最適絞り位置への開口絞り１３２の位置調整によって補正されており、上記した画像作成処理によって、ディッシュＤ内の全体において光量ムラの少ない画像が得られる。

また、最適絞り位置を導出するために周縁撮像状態でディッシュＤと撮像デバイス１３４との間の光路上で開口絞り１３２を互いに異なる複数の絞り位置Ｚｓ（ｎ）に移動させて位置決めする毎に撮像部１３により撮像された部分画像の平均階調値Ｖａｖ（ｎ）を求め、それらに基づき最適絞り位置を決定している。このため、ディッシュＤ、培養液の種類や液量に応じてメニスカスＭＳの影響の現れ方は相互に異なったとしても、それに応じた最適絞り位置に開口絞り１３２を位置させることができる。その結果、使用するディッシュＤ、培養液の種類や液量に応じてメニスカスの影響が相違したとしても、明るさのムラを抑えて良好な画像を取得することができる。

以上説明したように、この実施形態においては、ディッシュＤが本発明の「試料容器」の一例に相当しており、撮像デバイス１３４が本発明の「撮像素子」として機能している。また、メカ駆動部１４６が本発明の「位置決め機構」および「絞り移動機構」としての機能を有している。また、画像取得処理（ステップＳ４）が本発明の「画像取得工程」の一例に相当し、画像取得処理のステップＳ４０５〜Ｓ４１１で実行される一連の工程が本発明の「絞り位置調整工程」の一例に相当している。

なお、本発明は上記した実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない限りにおいて上述したもの以外に種々の変更を行うことが可能である。例えば、上記実施形態では、差Ｄ（ｎ）が最も小さいときの絞り位置Ｚｓを最適絞絞り位置として決定しているが、平均階調値Ｖａｖ（ｎ）が最も高いときの絞り位置Ｚｓを最適絞絞り位置として決定してもよい。

また、上記実施形態では、最適絞り位置の決定のために平均階調値Ｖａｖ（ｎ）を本発明の「階調値」として用いているが、例えば積算階調値を用いてもよい。また、試料の周縁部の画像ＩＳの階調値のみに基づいて平均階調値や積算階調値などを用いてもよい。

また、上記実施形態の撮像部１３では、二次元イメージセンサである受光素子１３４１を用いて撮像を行っているが、一方向に延びるリニアイメージセンサをこれと直交する方向に走査移動させて二次元画像の撮像を行う撮像部を用いても、上記と同様の効果を得ることが可能である。

また、上記実施形態の撮像装置１は、ホルダ１１に保持されたディッシュＤに対し撮像部１３を移動させる構成であるが、撮像部１３を固定してディッシュＤを移動させるようにしても技術的には等価である。また、フォーカス合わせの方法についても、上記のように撮像部１３全体を上下動させる構成に代えて、例えば複数のレンズからなる光学系のレンズ間距離を調整するものを適用してもよい。

この発明は、例えば医学・生物学分野で用いられるディッシュのような、例えば細胞を含む試料の撮像を必要とする分野に特に好適に適用することができるが、その応用分野は医学・生物学分野に限定されない。

１ 撮像装置
１３ 撮像部
１４ 制御部
１３２ 開口絞り
１３４ 撮像デバイス（撮像素子）
Ｄ ディッシュ（試料容器）
ＦＰ 焦点
Ｒｚ （絞り位置Ｚｓの）可変範囲
Ｚｆ 焦点位置
Ｚｓ 絞り位置

Claims (4)

1. 液体と共に試料を担持する窪部を有する試料容器に対して前記窪部よりも狭い撮像視野を有する撮像部を相対移動させて位置決めする毎に、前記撮像部において前記窪部から出射される光を開口絞りを介して撮像素子で受光して前記試料の部分画像を取得する画像取得工程と、
   前記画像取得工程により得られた前記複数の部分画像を合成して前記試料の全体画像を取得する合成工程とを備え、
   前記画像取得工程は、前記撮像視野に前記窪部の周縁部が含まれる位置に前記撮像部が位置決めされた周縁撮像状態で前記部分画像を取得する前に、前記開口絞りの位置を前記合成工程に適した最適絞り位置に調整する絞り位置調整工程を有し、
   前記絞り位置調整工程では、前記周縁撮像状態で前記試料容器と前記撮像素子との間の光路上で前記開口絞りを互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に前記撮像部により撮像された部分画像の階調値を求め、前記複数の階調値に基づき前記最適絞り位置を決定し、前記開口絞りを前記最適絞り位置に移動させて位置決めすることを特徴とする撮像方法。
2. 請求項１に記載の撮像方法であって、
   前記絞り位置調整工程は、前記階調値と、前記撮像視野に前記窪部の中央部が含まれる位置に前記撮像部が位置決めされた中央撮像状態で前記撮像部により撮像された部分画像の階調値との差が最も小さいときの前記光路上での前記開口絞りの位置を前記最適絞り位置として決定する撮像方法。
3. 請求項１に記載の撮像方法であって、
   前記絞り位置調整工程は、前記周縁撮像状態で前記開口絞りを前記光路に沿って移動させて位置決めする毎に前記撮像部により撮像された画像の階調値の平均値を求め、前記複数の平均値を比較して前記最適絞り位置を決定する撮像方法。
4. 試料容器に設けられた窪部に液体と共に担持された試料を撮像する撮像装置であって、
   前記窪部から出射される光を開口絞りを介して撮像素子で受光して前記窪部よりも狭い撮像視野で前記試料の部分画像を取得する撮像部と、
   前記試料容器に対して前記撮像部を相対移動させて位置決めする位置決め機構と、
   前記試料容器と前記撮像素子との間の光路に沿って前記開口絞りを移動させる絞り移動機構と、
   前記位置決め機構により前記試料容器に対して前記撮像部を互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に前記撮像部により前記試料の部分画像を取得し、前記複数の部分画像を合成して前記試料の全体画像を取得する制御部とを備え、
   前記制御部は、
   前記撮像視野に前記窪部の周縁部が含まれる位置に前記撮像部が位置決めされた周縁撮像状態で前記試料容器と前記撮像素子との間の光路上で前記開口絞りを互いに異なる複数の位置に移動させて位置決めする毎に前記撮像部により撮像された部分画像の階調値を取得する階調取得部と、
   前記複数の階調値に基づき前記部分画像の合成に適した前記光路上における前記開口絞りの位置を決定する絞り位置決定部と、
   前記開口絞りを前記絞り位置決定部により決定された位置に移動させて調整する絞り位置調整部を有する
   ことを特徴とする撮像装置。

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