JP6189611B2 - 生体細胞または培養物の調査方法およびマイクロプレートリーダー - Google Patents

生体細胞または培養物の調査方法およびマイクロプレートリーダー Download PDF

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Description

（関連特許出願）
本特許出願は、米国仮特許出願第６１／６１０６４７号、２０１２年３月１４日出願およびスイス特許出願第００３６５／１２号、２０１２年３月１４日出願の優先権を主張する。これら２つの優先権の基礎出願の内容全体は、その全てについて明示の参照により、本明細書に組み込まれる。
本発明は、マイクロプレートリーダーの生体細胞または培養物の調査方法に関する。この方法は、マイクロプレートリーダーの受取装置によって生体細胞を含むウェル（well）を有する少なくとも１つのマイクロプレートを受け取ることと、マイクロプレートリーダーの測定装置に対して、生体細胞を含むマイクロプレートのウェルを有する受取装置を位置決めすることと、少なくとも１つの測定装置よって、少なくとも１つのインテグラル（integral）信号(例えば、マイクロプレートの１つのウェルにおける全てのサンプルのルミネセンス（luminescence）)を検知することとを一般に含む。
さらに、マイクロプレートリーダーの作用源に対して、生体細胞を含むマイクロプレートのウェルを有する受取装置を位置決めすることと、これらの作用源の少なくとも１つとマイクロプレートの特定のウェル内の生体細胞との間の相互作用を作用源の少なくとも１つで引き起こして、測定可能な信号を引き起こし、または生成することと、マイクロプレートの特定のウェル内の生体細胞の中あるいは表面上で作用源によって引き起こされ、または生成された少なくとも１つインテグラル信号（例えばマイクロプレートの１つのウェル内における全サンプルの蛍光または吸光度）を検知することとを提供できる。
細胞あるいは細胞の代謝産物の蛍光測定は、先行技術から周知である。したがって、ＥＰ２２５３９８３Ａ２は、サンプルの放射された蛍光のスペクトル検知用の走査顕微鏡を開示している。このサンプルは、レーザーで励起され、異なる波長範囲に分割された散乱格子に供給されると共に、多重陽極光電子増倍管に供給される。文書ＩＴＭＩ９１２５１０Ａ１は、マイクロプレートのウェル内のサンプルが偏光、および光電子増倍管で検知される引き起こされた同様の偏光蛍光で照らされるいわゆるマイクロプレートリーダーを開示している。また、非偏光の励起光で動作するマイクロプレートリーダーも長い間知られている。
例えば公知文書であるＪＰ５８０６２５４２ＡまたはＪＰ１１０３７９２３Ａは、イメージングＣＣＤ（Charge Coupled Device；電荷結合素子）センサ、またはＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor；相補形金属酸化膜半導体）センサを備えるデジタルカメラによって、マイクロプレートのウェルの底の粒子または生体細胞の結合パターンの画像を開示している。
マイクロプレートのウェル内の細胞のルミネセンスの検知は、例えばＤＥ１０２３６０２９Ａ１により公知である。液体をマイクロプレートのウェル内のサンプルに加えることによりルミネセンスが引き起こされるディスペンサーと、上記マイクロプレートウェルの透明な底を通って現れるルミネセンスを光学システムによって撮影するＣＣＤカメラとが開示されている。
ＷＯ２００６／０３１５３７Ａ２よりマイクロプレート内の生体細胞を調査するための方法および装置が知られている。上記マイクロプレートは、ターゲット領域で照らされ、ターゲット領域から来る光はアレイ検知器にガイドされる。このアレイ検知器は、部分イメージとしてターゲット領域内におけるマイクロプレートウェル内で個別のターゲットを検知し、部分イメージを結合してマイクロプレートウェルの全イメージを形成する。この場合、細胞のマイクロアレイ、または無秩序な生体細胞を検知できる。
血球計算盤として構成された特別なスライド内の生体細胞を数えることは、光学顕微鏡で血球を数える分野で長い間知られてきた。自動細胞測定システムまたは異なるメーカーの「細胞カウンタ」も知られている。これらの細胞カウンタは、測定システム内に生体細胞を有する血球計算盤を挿入できるという点に特に特徴がある。測定システムは、計数光学を自動的に集中させて、生体細胞を数えて、数えた結果を表示する。
典型的に、マイクロプレート内の生体細胞または培養物の調査を行う研究室では、光により、または電気的に引き起こされたルミネセンスが生成される。このルミネセンスは、光電子増倍管または半導体光電子増倍管で測定されるか、イメージングカメラ（imaging camera）でイメージングされる。測定結果またはイメージを解釈するために、マイクロプレートは光学顕微鏡によって調べられ、生体細胞が正常な生理学的状態かどうか、またはそれらが異常な形態を有しているか、または死んでしまったかどうか決定される。
さらに、細胞測定装置は、市場で入手可能である (ＩｓｏＣｙｔｅレーザースキャンニングサイトメーター、モレキュラーデバイス、サニーヴェール、カリフォルニア州、米国)。この細胞測定装置は、レーザービームでマイクロプレートのウェル内の生体細胞をスキャンすると同時に、１以上の光電子増倍管によるレーザービームによって生成された蛍光あるいは離散した信号を検知する。また、細胞測定装置は、ウェル内にある生体細胞を識別すると共に数え、スキャンされたウェルのイメージを生成する。イメージプロセシングによって、各イメージ内の個別の細胞が識別され、細胞の活動がリストされる。ウェルの全てのセルの結果は、統合できる。
（本発明の目的および概要）
本発明の目的は、マイクロプレート内の生体細胞または培養物を調査するための代替方法およびこの方法の実行に適した装置を提案することである。
この目的は、マイクロプレートリーダー内の生体細胞または培養物を調査する方法によって、ここで開示されるような特徴を有する第１の局面によって解決される。この方法は、
ａ）マイクロプレートリーダーによって、生体細胞または培養物を含むウェルを有する少なくとも１つのマイクロプレートを受け取るステップと、
ｂ）マイクロプレートリーダーの測定装置に対して、生体細胞または培養物を含むマイクロプレートのウェルを有する受取装置を位置決めするステップと、
ｃ）少なくとも１つの測定装置によるマイクロプレートの特定のウェル内の生体細胞または培養物の中あるいは表面上で、少なくとも１つのインテグラル信号を検知するステップと
を備えている。
本発明に係る方法は、マイクロプレートの特定のウェル内の生体細胞または培養物がマイクロプレートリーダーの照明源によって徹照され、上記マイクロプレートのこれらの特定のウェル内の上記生体細胞または培養物の透過像は、上記マイクロプレートリーダーのイメージングカメラによって作成され、上記検知されたインテグラル信号の各々が、プロセッサーによって上記マイクロプレートの対応するウェル内の上記生体細胞または培養物の像と比較されると共に、これらの生体細胞のイメージされた数、付着、コンフルエンス（confluence）、または形態に関連付けられることを特徴としている。
この目的は、生体細胞または培養物を調査するための本発明に係る方法において使用するためのマイクロプレートリーダーによって、本明細書に開示されているような特徴を有する第２の局面によって解決される。この場合、上記マイクロプレートリーダーは、
ａ）生体細胞または培養物を含むウェルを有する少なくとも１つのマイクロプレートを受け取るため、また、マイクロプレートリーダーの測定装置に対して、上記生体細胞または培養物を含むウェルを有するマイクロプレートを位置決めするための受取装置と、
ｂ）上記マイクロプレートの特定の上記ウェル内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上に存在する、または引き起こされる、または生成される少なくとも１つのインテグラル信号を検知するための少なくとも１つの測定装置と
を備えている。
本発明に係るマイクロプレートリーダーは、さらに、照明をするための照明源と、上記マイクロプレートのこれらの特定の上記ウェル内の上記生体細胞または培養物をイメージするためのイメージングカメラと、検知された上記各インテグラル信号を上記マイクロプレートの上記対応するウェル内の上記生体細胞または培養物の像と比較するため、また、これらのインテグラル信号をこれらの生体細胞のイメージされた数、付着、コンフルエンス、または形態に関連付けるために構成されているプロセッサーとを備えることを特徴としている。
さらに、本発明に係る方法または本発明に係るマイクロプレートリーダーのさらなる進展、および本発明に係るさらなる特徴が本明細書に同様に開示されている。
本発明に係る方法または本発明に係る装置の利点は、以下のものがある。
従来の２つの異なる装置、つまりマイクロプレートリーダーおよびイメージングマイクロスコープ（imaging microscope）が、マイクロプレートリーダー内のセルパラメーター（cell parameters）の定量的な測定と、これらの培養物の状態の定性的な調査のための顕微鏡画像との組み合わせのために必要であった。本発明は、これら２つの相補的な調査を１つおよび同一の装置で実行することを可能にする。
従来、培養物を有するマイクロプレートは、マイクロプレートリーダーから取り出されて、顕微鏡に移動されなければならなかった。この煩雑なステップは、オペレーターによって実行されなければならず、調査方法の間の或る時間遅延がさらに必要である。本発明の調査は、これら２つの相補的な調査の組み合わせを１つの装置で自動化することを可能にして、特定のマイクロプレートウェル内のインテグラル信号の検知と、このマイクロプレートウェルのイメージングとの間の時間差をできる限り短くできる。
従来、マイクロプレートをマイクロプレートリーダーから顕微鏡に移動させるために、敏感な培養物は、一般的な周囲条件に頻繁にさらされ、またはこの周囲条件から不自由に守られなければならなかった。本発明は、好ましくは、これらの生体細胞の全ての定量的および定性的な調査を実行する間、培養物を有するマイクロプレートウェル内の制御された雰囲気を維持することができる。
本発明に係るマイクロプレートリーダー（本発明に係る方法を実施するのに適している）では、イメージングプロパティを有するモジュールが統合され、例えばマイクロプレートウェルの底にある生体細胞および培養物が、顕微分解能（microscopic resolution）で視覚化されうる。
好適な実施形態では、本発明に係るマイクロプレートリーダーは、マルチモードリーダーとして構成されている。また、このマイクロプレートリーダーは、マイクロプレートウェルの顕微鏡イメージングで、選択されたマイクロプレートウェル内のインテグラル信号のほぼ任意かつ好ましくは自動化された検知の組み合わせを許容している。このインテグラル信号は、例えば、蛍光、ルミネセンス、吸光度、インピーダンスまたはインピーダンス変化である。
マイクロプレートウェル内の細胞の数を測定することによって、平均細胞活性を測定でき、したがって、このマイクロプレートウェル内の変化した細胞活性と変化した細胞数との間の違いを測定できる。
マイクロプレートウェルの底の細胞または培養物の付着または固定、さらに形態も決定することで、細胞の生理学的な状態に関する結論を引き出すことができる。
蛍光、ルミネセンス、吸光度、インピーダンスまたはインピーダンス変化のようなインテグラル信号は、細胞活性の測定として役立つ。これらの信号の強度の変化は、(例えば、細胞増殖に依存する)細胞数の変化と同様に細胞活性の変化に依存する。細胞数の決定は、細胞数でインテグラル信号を正規化（ノーマライゼーション）すること、したがって細胞活性の公平で自動化された獲得、を提供する。
マイクロプレートウェルの底の細胞または培養物のコンフルエンスの決定は、このマイクロプレートウェルの依然としてフリーな底面に対する培養物によってカバーされた底面の比率を、再現する。この比率も、同様に、細胞増殖による接着細胞で、培養物と関係したインテグラル信号を、正規化すること、したがって細胞活性の公平で自動化された獲得、を許容する。
マイクロプレートリーダーの生体細胞または培養物を調査するための発明に係る方法および対応するマイクロプレートリーダーは、概略図によって詳細に説明されている。この概略図は、選択された模範的な実施形態を示し、本発明の範囲を制限することを意図していない。
図１は、遮光された態様で閉じられうるチャンバーとして好ましくは形成されるサンプルチャンバー内にマイクロプレートを挿入しているときの第１の実施形態に係るマイクロプレートリーダーを通る縦断面を示している。 図２は、遮光されると共に気密された態様で閉じられうる密閉チャンバーとして好ましくは形成されているサンプルチャンバー内の選択されたマイクロプレートウェル内のインテグラル信号を検知している間、または、マイクロプレートウェルの顕微鏡イメージングをしている間の、第２実施形態に係るマイクロプレートリーダーを通る縦断面を示している。 図３は、遮光されると共に気密された態様で閉じられうる密閉チャンバーとして好ましくは形成されたサンプルチャンバー内で、選択されたマイクロプレートウェルのインテグラル信号を検知している間の第３実施形態に係るマイクロプレートリーダーを通る縦断面を示している。 図４は、ウェル底に取り付けられた典型的な電極、およびウェル壁に取り付けられた典型的な電極接触を備えるマイクロプレートウェルの平面図を示している。 図５Ａは、マイクロプレートのウェルを通る徹照の光路の略図であって、透過光線ビーム束の概略光路で従来の徹照を示している。 図５Ｂは、マイクロプレートのウェルを通る徹照の光路の略図であって、透過光線ビーム束の概略光路で本発明の徹照を示している。 図５Ｃは、マイクロプレートのウェルを通る徹照の光路の略図であって、透過光線ビームの概略光路で従来の徹照を示している。 図５Ｄは、マイクロプレートのウェルを通る徹照の光路の略図であって、透過光線ビームの概略光路で本発明の徹照を示している。 図６Ａは、徹照されたウェルの写真であって、従来の照明の結果を示している。 図６Ｂは、徹照されたウェルの写真であって、本発明の照明の結果を示している。 図７Ａは、図６Ａの写真におけるウェルの全体の直径にわたって従来の照明の輝度の分布を示している。 図７Ｂは、図６Ｂの写真におけるウェルの全体の直径にわたって本発明の照明の輝度の分布を示している。 図８は、それぞれの場合において照明の正規化をした後の図７Ａおよび図７Ｂの２つの図の比較を示している。
図１は、マイクロプレート２をサンプルチャンバー１２内に挿入しているときの第１の実施形態に係るマイクロプレートリーダー１を通る縦断面を示している。サンプルチャンバー１２は、遮光された態様で閉じられうるチャンバーとして好ましくは形成される。このマイクロプレートリーダー１（本発明に係る方法で使用するのに特に適している）は、生体細胞または培養物を含むウェル３を有する少なくとも１つのマイクロプレート２を受け取るための受取装置４を備えている。この受取装置４は、手またはマイクロプレート搬送ロボット（両方とも図示しない）によって、この受取装置４に少なくとも１つのマイクロプレート２が挿入されうる、またはそこから取り出されうる程度に、マイクロプレートリーダーのサンプルチャンバー１２から伸縮自在であるように好ましくは構成されている。受取装置４は、既に部分的にここに挿入されている。なぜなら、特に、１つのマイクロプレート２がマイクロプレートリーダー１内に挿入されているからである。マイクロプレートを挿入または取り出しているとき、フラップ１８は、好ましくは開けられ、閉じた状態において、フラップ１８は、遮光された態様でサンプルチャンバー１２を好ましくは閉じ、検査に影響を及ぼす光は、周囲からサンプルチャンバー１２内に入ることができない。
少なくとも１つのマイクロプレート２を受け取ることに加えて、この受取装置４は、作用源５’,５”，５’’’およびマイクロプレートリーダー１の測定装置６，７，８に対して、生体細胞または培養物を含むウェル３を有するマイクロプレート２を位置決めするために使用される。
ここでさらに描かれているマイクロプレートリーダー１は、少なくとも１つの作用源５’,５”，５’’’を備えている。作用源５’,５”，５’’’は、これらの作用源５’,５”，５’’’のうちの少なくとも１つと、マイクロプレート２の特定のウェル３内の生体細胞または培養物との間の相互作用を引き起こすため、および測定可能な信号を引き起こす、または生成するためのものである。これらの作用源は、すべての当業者に知られており、これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞内または生体細胞上の蛍光を励起させるための光源５’を有するグループから好ましくは選択される。それ自体が周知の他の作用源は、この／これらのマイクロプレート（２）のウェル（３）内の生体細胞または培養物を徹照するための光源５’を有するグループから好ましくは選択される。そのような光源は、例えば、アーク灯、閃光ランプ、白熱灯（例えばハロゲンランプのようなもの）、レーザー、レーザーダイオードおよび発光ダイオード（ＬＥＤ）を有するグループから選択される。蛍光を励起させるための対応する波長、対応するフルオロフォア（fluorophors）、およびそれらの発光特性（emission character）も、当業者に知られており、本願によって選択される。さらに、吸光度を検知する細胞または培養物の非侵襲の徹照およびこの徹照のために使用される光源は、すべての当業者によく知られている。
それ自体が知られている追加の作用源は、電流源５”、ひいてはインピーダンス測定装置を有するグループから好ましくは選択される。このインピーダンス測定装置は、この／これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物の付着または再配列の機能としてインピーダンスまたはインピーダンス変化を測定するためのものである。そのような作用源、好ましくは、電束が２０Ｈｚから１００，０００Ｈｚの範囲で正弦関数に従って変化しうる交流電源であって、この交流電源が初期抵抗を有していることは、例えばギアエバー（Giaever）およびキース（Keese）の論文（「電気的に測定された哺乳類細胞の微細動作分析」（ＰＮＡＳ，１９９１年，第８８巻：７８９６−７９００）)によって当業者に知られており、この論文の全てが本明細書に組み込まれる。ウェル底１６が少なくとも部分的に電極１７’，１７”で占められている特定のウェル３を有するマイクロプレート２が好ましくは使用される。この電極１７’，１７”は、マイクロプレートリーダー１の対応する電流源５”と接触可能なように好ましくは構成されている。この接触のために、電気接点２３’，２３”は、ウェル壁の内側に取り付けることができ、電極１７’，１７”は、それらが交流電源、つまりインピーダンス測定装置５”の接触センサ２７と、このような方法で接触できるように構成されている。
それ自体が知られている同様の作用源は、この／これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物中あるいは表面上のルミネセンスを引き起こすための液体源５’’’を有するグループから好ましくは選択される。この液体源５’’’は、例えばマイクロプレート２の特定のウェル３内の生体細胞または培養物に活性化試薬を注入するための１つのインジェクタおよび複数のインジェクタを有するグループから好ましくは選択される。そのような液体源５’’’またはインジェクタ、そこで使用されるルミネセンストリガー試薬（luminescence-triggering reagents）、および例えば細胞または細胞の代謝産物によって生成されるルミネセンスの波長は、同様に当業者に知られている。さらに、例えば、ストップエージェント（stop agents）または栄養素は、細胞の成長または細胞の増殖に影響を与えるために、そのようなインジェクタによって、マイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物に加えられうる。
本発明に係るマイクロプレートリーダー１は、少なくとも１つのインテグラル信号を検知するための少なくとも１つの測定装置５”，６，７，８をさらに備える。少なくとも１つの上記インテグラル信号は、マイクロプレート２の特定のウェル３内の生体細胞中あるいは生体細胞上、または培養物中あるいは培養物上で作用源５’,５”，５’’’によって引き起こされ、または生成される。そのような測定装置は、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードおよび位相敏感ロックイン増幅器を有するグループから好ましくは選択される。測定装置６、８および光源５’またはそれらの光学的な入力および／または出力は、光ファイバーまたは光ファイバー束のような光導波路２８を介して好ましくは連結されている。図１に示すサンプルチャンバー１２は、遮光されるように構成されている。
本発明に係るマイクロプレートリーダー１は、特に、照明のための照明源９と、マイクロプレート２のこれらの特定のウェル３内の細胞または培養物をイメージングするためのイメージングカメラ１０を備えることを特徴としている。特に好ましくは、マイクロプレートリーダー１は、マイクロプレート２の特定のウェル３内の生体細胞または培養物の顕微鏡画像を生成するために光学的につながれている光学顕微鏡１９とイメージングカメラ１０とを備える。イメージングプロパティを有するモジュールが統合された本発明に係るマイクロプレートリーダー１が特に好ましい。その結果、例えばマイクロプレートウェルの底にある生体細胞および培養物が顕微鏡の分解能で視覚化されうる。このイメージングモジュールは、異なる照明の使用を許容する照明ユニットと、明視野照明、暗視野照明および斜照明のようなイメージングモードとを有する。さらに、位相差または蛍光イメージの記録を許容する追加のモードが実現可能である。イメージは、ＣＭＯＳまたはＣＣＤセンサが取り付けられているデジタルカメラを有する光学顕微鏡１９によって好ましくは記録される。
好適なイメージングシステムは、中程度の分解能を達成するために中間の絞りを使用するときイメージングカメラ１０の光軸２０の方向における受取装置４の移動が使用されうるオートフォーカス装置をさらに備える。個々の細胞および培養物の表示が好ましく、さらに小さな粒子あるいは細胞組織がイメージされうる。これらの生体細胞の数のイメージングが特に好ましく、個々の細胞の付着、つまりウェル３の内面への細胞の付着およびこれらの細胞の形態に、特に注意が払われる。マイクロプレート２のウェル３内の培養物の付着、コンフルエンス、あるいは形態のイメージングが極めて好ましく、マイクロプレートウェル３の内面上の培養物のタームコンフルエンス（term confluence）は、細胞によって占められうるこれらのマイクロプレートウェルの内面の自由表面（free surface）に対する培養物によってカバーされた表面の比率を再現する。
本発明に係るマイクロプレートリーダー１は、内部または統合されたプロセッサー１１’（図２および３参照）１１を備えるか、外部プロセッサー１１”（図１参照）に連結可能に構成されることをさらに特徴としている。したがって、そのようなプロセッサー１１’は、マイクロプレートリーダー１の電子制御装置内で統合されたマイクロプロセッサーになりえる。それはまた、供給されたパソコンのプロセッサー１１”を使用するように、あるいは供給される。プロセッサー１１’、１１”が、検知されたインテグラル信号の各々をマイクロプレート２の対応するウェル３内の生体細胞のイメージと比較するために、およびこれらの生体細胞または培養物のイメージされた数、付着、コンフルエンス、あるいは形態に、これらのインテグラル信号を関連づけるために構成されていることが重要である。好ましくは、そのようなプロセッサー１１’，１１”は、適切な画像処理ソフトウェアの起動によって、および適切な信号処理ソフトウェアの起動によって、この仕事を実行できるようになる。
生体細胞を調べるためのマイクロプレートリーダーの補助によって実行される方法は、以下のステップを備える。
マイクロプレートリーダー１の受取装置で、生体細胞または培養物を含むウェル３を有する少なくとも１つのマイクロプレート２を受け取る。通常、生分子学会（ＳＢＳ）および米国規格協会（ＡＮＳＩ）によって特定されたような標準マイクロプレートの寸法を有する１つのマイクロプレートだけが、受取装置４に挿入される。しかしながら、添付の図面における略図と異なり、２以上のマイクロプレートが、マイクロプレートリーダー１の同一のまたは異なる受取装置４によって受け取られて輸送されるか、または配置されてもよい。この場合、受取装置４は、スプリングが取り付けられた圧縮手段によって定義された位置において受信マイクロプレート２が保持されるストップを有するフレームとして好ましくは構成される。特にここでは、マイクロプレート搬送ロボットの手またはロボットアームによって、マイクロプレートの挿入または取り出しのための開位置に運ぶことができる圧縮手段が好まれる。受取装置４は、Ｘ方向に、つまり、好ましくは水平であって、フラップ１８に対して直角に、モータによって好ましくは移動可能である。
マイクロプレートリーダー１の作用源５’，５”，５’’’に対して、生体細胞または培養物を含むマイクロプレート２のウェル３を有する受取装置４を位置決めする。受取装置４上のマイクロプレート２の好ましくは画定された位置のおかげで、それぞれのウェル３は、作用源５’,５”，５’’’の１つの作動軸２１に対して、特に、およびそれぞれ整列できる。受取装置４は、Ｘ方向に、つまり、好ましくは水平であってフラップ１８に対して直角に（図１の矢印参照。これは図１から図３の全ての図の代表である。）、およびＹ方向に、つまり、好ましくは水平であってフラップ１８と平行に、モータによって好ましくは移動可能である。マイクロプレートのそれぞれのウェル３は、ほとんど全ての位置で、これら２つの方向によって予め画定されたフィールドに位置決めできる。ＸおよびＹ方向におけるこれらの動きは、マイクロプレートリーダー１の中央制御装置２２によって、好ましくはモニターされると共に制御される。
これらの作用源５’,５”，５’’’のうちの少なくとも１つと、マイクロプレート２の特定のウェル３内の生体細胞または培養物との間の相互作用を引き起こし、測定可能な信号を引き起こす、または生成する。好ましくは事前に特定されたプロトコルによれば、マイクロプレートリーダー１の中央制御装置２２は、対応する作用源５’，５”，５’’’の作動軸２１がマイクロプレート２の特定のウェル３に対応するようにマイクロプレート２の特定のウェル３が配置されたとき、対応する作用源５’，５”，５’’’を起動する。好ましくは本発明に係る方法を実行するとき、少なくとも１つの作用源５’,５”，５’’’が、
これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物の中あるいは表面上の蛍光を励起させるための光源５’と、
これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物を徹照するための光源５’と、
これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物の付着または再配列の機能としてインピーダンスまたはインピーダンス変化を測定するための電流源５”と、
これらのマイクロプレート２のウェル３内の生体細胞または培養物の中あるいは表面上のルミネセンスを引き起こすための液体源５’’’と
を有するグループから選択される。
この場合、光源５’は、アーク灯、閃光ランプ、白熱灯（例えばハロゲンランプのようなもの）、レーザー、レーザーダイオードおよび発光ダイオード（ＬＥＤ）を有するグループから好ましくは選択される。また、電流源５”は、好ましくは電束が２０Ｈｚから１００，０００Ｈｚの範囲で正弦関数に従って変化しうる交流電源であり、この交流電源は出力抵抗を有している。液体源５’’’は、関連する試薬容器および搬送ポンプと同様に１つのインジェクタおよび複数のインジェクタを有するグループから好ましくは選択される。
相互作用を引き起こす間またはその直後、生体細胞または培養物を含むマイクロプレート２のウェル３を有する受取装置４は、マイクロプレートリーダー１の測定装置６，７，８に対して配置されている。マイクロプレート２のウェル３内の生体細胞中あるいは生体細胞上の作用源５’,５”， ５’’’によって引き起こされ、または生成される少なくとも１つのインテグラル信号は、少なくとも１つの測定装置５”，６，７，８で検知される。
マイクロプレートリーダー１に挿入された少なくとも１つのマイクロプレート２の特定のウェル３内の蛍光測定の場合、蛍光を検知するための、およびインテグラル信号を記録するための対応する測定装置８が光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイおよびアバランシェダイオードを含むグループから好ましくは選択される。測定装置８は、蛍光を励起するための光源５’の作動軸２１と平行の光軸２１’を好ましくは有している。光源５’および測定装置８または測定装置８の光学的な入出力(図１参照)は、好ましくは挿入されたマイクロプレート２の上に配置され(トップ励起／トップ読み込み)、または、光源５’および測定装置８は挿入されたマイクロプレート２の下に配置されている(底励起／底読み込み)。光軸２１’からの作動軸２１の軸の小さな偏差は許容できる。
マイクロプレートリーダー１に挿入された少なくとも１つのマイクロプレート２の特定のウェル３内のルミネセンス測定の場合、ルミネセンスを検知するための、およびインテグラル信号を記録するための対応する測定装置７が光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイおよびアバランシェダイオードを含むグループから好ましくは選択される。測定装置7は、ルミネセンスを引き起こすための液体源５’’’の作動軸２１からの異なる光軸２１’を好ましくは有している。液体源５’’’は、挿入されたマイクロプレート２の上に好ましくは配置され、測定装置7も、挿入されたマイクロプレート２の上に好ましくは配置されている。
マイクロプレートリーダー１に挿入された少なくとも１つのマイクロプレート２の特定のウェル３内の吸光測定の場合、吸光度を検知するための、およびインテグラル信号を記録するための対応する測定装置６が光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイおよびアバランシェダイオードを含むグループから好ましくは選択される。測定装置６は、蛍光を励起するための光源５’の作動軸と平行の光軸２１’’’を好ましくは有している。光源５’は、挿入されたマイクロプレート２の上に好ましくは配置され、測定装置６またはその光学的な入力（図１参照）は、挿入されたマイクロプレート２の下に好ましくは配置されている。
マイクロプレートリーダー１に挿入された少なくとも１つのマイクロプレート２の特定のウェル内の生体細胞または培養物の付着または再配列によって引き起こされたインピーダンスまたはインピーダンスの変化の測定の場合および対応するインテグラル信号の検知のために、測定装置は、マイクロプレートリーダー１の電流源５”に統合され、位相敏感ロックイン増幅器を有する測定装置が好まれる。電流源５”およびインピーダンス測定装置５’’’は、挿入されたマイクロプレート２の上に好ましくは配置されている。
マイクロプレートリーダー１の生体細胞または培養物を調査するための本発明に係る方法は、マイクロプレート２の特定のウェル３内の生体細胞または培養物が、マイクロプレートリーダー１の照明源９で照らされ、インテグラル信号が事前に、またはその後に、測定装置６，７，８によって、これらの特定のウェル３内で検知されるという点に一方では特徴がある。マイクロプレートリーダー１の生体細胞または培養物を調査するための本発明に係る方法は、マイクロプレートリーダー１のイメージングカメラ１０でマイクロプレート２のこれらの特定のウェル３内の生体細胞または培養物のイメージが作成されるという点に他方では特徴がある。しかしながら、特に、マイクロプレートリーダー１の生体細胞または培養物を調査するための本発明に係る方法は、検知されたインテグラル信号の各々が、プロセッサー手段１１’，１１”によって、マイクロプレート２の対応するウェル３内の生体細胞の、事前に、またはその後に記録された画像と比較され、これらの生体細胞または培養物のイメージされた数、付着、コンフルエンス、または形態に関連しているという点に特徴がある。
図２は、遮光されると共に気密された態様で閉じられうる密閉チャンバーとして好ましくは形成されているサンプルチャンバー１２内のマイクロプレート２の選択されたウェル３内のインテグラル信号を検知するとき、または、マイクロプレートウェル３を顕微鏡イメージングしている間の、第２実施形態に係るマイクロプレートリーダー１の縦断面を示している。図１の第１実施形態では、周囲（ambient）光を乱さないようにすることだけにプライオリティがあるが、この第２実施形態は、周囲（ambient）光を乱さないようにすることに加えて、マイクロプレート２のウェル３内の細胞または培養物に特に適した雰囲気を供給するために行われる。
マイクロプレートリーダー１は、コントローラー１３を好ましくは備える。このコントローラーによって、制御された雰囲気が、密閉チャンバーとして構成されているサンプルチャンバー１２内に供給され、それによって、酸素、窒素、二酸化炭素および一酸化炭素を有するグループから選択されるガスの濃度は、規制されるか、または特定の範囲の値に保持される。このコントローラー１３は、マイクロプレートリーダー１に統合されるか、または、これが提供されるか、またはその上に配置されうる。例えば、このマイクロプレートリーダー１に挿入されたマイクロプレート２の細胞または培養物を含むウェル３のまわりのガス雰囲気の酸素含有量を測定しコントロールするためのＯ2センサおよびこのガス雰囲気の二酸化炭素含量を測定しコントロールするためのＣＯ2センサは、サンプルチャンバー１２に配置されている。好ましくは、ガス入口２４およびガス出口２５が設けられ、それはサンプルチャンバー１２の断熱壁または底を通過し、コントローラー１３に接続され、または接続されうる。ファン(図示せず)または他の混合装置は、サンプルチャンバー内に存在するガスの移動および混合および分配のために、サンプルチャンバー１２に設けられうる。
分離したコントローラー１３の場合、このコントローラー１３が、好ましくは使用されるガスのための所要の圧力シリンダに直接接続される。所要のガス接続に対応するバルブおよびスロットルが、この分離したコントローラー１３(図示せず)に取り付けられる。あるいは、ガス圧力シリンダのバルブおよびスロットルを用いることができ、これらのバルブは、好ましくは、電気的に制御された（無電流閉タイプの）電磁バルブとして制御されている。分離している、またはマイクロプレートリーダー１に組み込まれているコントローラー１３およびマイクロプレートリーダー１自体のための制御要素、表示要素および電源は、図２にとりわけ示されてはいない。
上記制御装置は、好ましくは、対応するソフトウェアを有するコンピュータ２８を備える。この場合、コンピュータ２８は、マイクロプレートリーダー１(図１参照)の中央コンピュータ２９に接続することができるか、連結可能になりえるか（例えば、分離したハウジング１７’に収容されている)、またはマイクロプレートリーダー１（図示せず）のこの中央コンピュータ２９に統合することができる。
窒素（Ｎ2）および／または二酸化炭素（ＣＯ2）がサンプルチャンバー１２内の周囲空気を置き換えるために使用されうる。そして、適切な圧力シリンダが提供される。これらの圧力シリンダは、これらのガスのために所要の分配圧力を調整するため、それ自体が周知のコントロールバルブおよびスロットルが従来通り取り付けられている。この代わりに、そのようなプロセスガスも他の出所から（例えばサービスラインから）得ることができる。窒素および二酸化炭素に加えて（サンプルチャンバー１２内で対応するガス検知器と組み合わされて）、他のガスもサンプルチャンバー内に通常行き渡っている大気のごくわずかな規定量を生成するために使用できる。適用可能な予防策に注意を払い、例えば希ガスまたは不活性ガス（例えばアルゴン）、あるいは反応的または毒ガス（例えば酸素、一酸化炭素、硫化水素あるいは二酸化硫黄）のような他のガスは、マイクロプレートリーダー１のサンプルチャンバー１２内に、導入されうる。これらの他のガスは、このマイクロプレートリーダー１に挿入されたマイクロプレート２のウェル上またはウェル３の周りのガス雰囲気の既知の構成を生成するための少なくとも１つのガス入口２４を経由して導入される。好ましくは、上記コントローラーが十分なガスラインおよびコントロールバルブを備えて、多くのガス成分を有するさらに複雑なガス組成が作られうる。
適切なＣＯ2センサを代表するものとして、スウェーデン、SE-820 60デルスボ（Delsbo）のSenseAir ABからのｓｅｎｓｏｒ ＳｅｎｓｅＡｉｒＲ ＣＯ２ ＥｎｇｉｎｅＲ ＩＣＢ（製品番号033-9-0001）のＣＯ2センサについて言及すべきだろう。適切なＯ2センサを代表するものとして、スイス、CH-8052チューリッヒのPewatron AGからのPewatron FCX-MEP2-F-CH酸素モジュールのＯ２センサについて言及すべきだろう。
好ましくは、密閉チャンバーとして構成されたサンプルチャンバー１２は、供給ラインおよび排出ラインを介してサンプルチャンバー１２に接続される空冷システムを備えている。コントローラー１３は、そのような空冷システムとして付加的に形成され、例えばペルチェ素子の形式で冷却要素を備えうる。特に好ましいマイクロプレートリーダー１では、制御された雰囲気が密閉チャンバーとして構成されたサンプルチャンバー１２内で生成されうる。温度、相対湿度および全圧力を含むグループから選択されたパラメーターは、それぞれ調整されるか、値の特定の範囲内に保持される。好ましくは、サンプルチャンバー内の表面で水蒸気の凝縮の危険がなく、細胞または培養物の乾燥がないように、相対湿度は、端部加湿領域で保持されるか調整される。
本発明に関連して、分離された、または他のある方法で得られた培養物、生体細胞蓄積、または単細胞は、細胞(これらの細胞は、動物および野菜の真核細胞と同様に微生物と菌類とを含む)として指定される。
図２では、特に、１つのウェル３が、ルミネセンス測定用の第２の測定装置７の光軸２１”の辺りに位置している。別のウェル３は、イメージングカメラ１０および照明源９の光軸２０の辺りに特に位置している。同じマイクロプレート２の別のウェル３は、吸光測定用の第１の測定装置６の光軸２１’’’の近くに特に位置している。一方、図１では、付属の光学顕微鏡１９および照明源９を備えた２つのイメージングカメラ１０が示されている。第２実施形態は、適切に取り付けられた１つだけのイメージングカメラ１０を有している。
図３は、遮光されると共に気密された態様で閉じられうる密閉チャンバーとして好ましくは形成されたサンプルチャンバー内で、選択されたマイクロプレートウェル３のインテグラル信号を検知している間の第３実施形態に係るマイクロプレートリーダー１を通る縦断面を示している。本発明に係るマイクロプレートリーダー１の第３実施形態は、ハウジング１４を有している。このハウジング内には、全作用源５’,５”，５’’’および測定装置６，７，８を有する全マイクロプレートリーダー１が収容されている。さらに、密閉チャンバーとして構成されたサンプルチャンバー１２に沿って、中央制御装置２２も最初の２つの実施形態によってカバーされるようにハウジング１４内に収容されている。
図３では、１つのウェル３が、（図１および図２にも示しているように）ダブルのインジェクタが取り付けられた液体源５’’’ の作動軸２１の辺りに、特に位置している。他のウェル３は、ルミネセンス測定用の第２の測定装置７の光軸２１’’’の辺りに特に位置している。第２の測定装置７の光軸２１”のできる限り近くに液体源５’’’の少なくとも1つのインジェクタがローカルに配置されるのが好まれる。その結果、インジェクション（ルミネセンスを引き起こすこと）とルミネセンスの検知との間のできるだけ小さな時間差で、ルミネセンスの測定を行うことができる。光学顕微鏡１９および照明源９を有するイメージングカメラ１０の光軸２０は、第２の測定装置７の光軸２１”の近くに位置している。
マイクロプレートリーダー１は、スクリーン１５を好ましくは備えている。このスクリーン１５は、動作状態、測定結果、顕微鏡画像の表示のためのものである。また、スクリーン１５は、検知されたインテグラル信号とマイクロプレート(２)のそれぞれのウェル３内の生体細胞または培養物の対応するイメージとの比較、およびこれらの生体細胞または培養物のイメージされた数、付着、コンフルエンスあるいは形態の比率によって生じる表示のためのものである。スクリーン１５は、タッチセンサ式のスクリーンまたはタッチスクリーンとして好ましくは形成されている。スクリーン１５は、マイクロプレートリーダー１の操作パラメーターを調節または変更するため、および生成された結果を処理および保存するためのインターフェースとしても使用されうる。
図４は、ウェル底１６に取り付けられた典型的な電極１７’，１７”と、ウェル壁に取り付けられた典型的な電気接点２３’，２３”とを備えるマイクロプレートウェルの平面図を示している。これらの電極１７’，１７”と電気接点２３’，２３”とは、好ましくは金または金合金で作られ、ウェル底１６または内面および好ましくはウェル縁２６に、スパッタリングまたは別の適切なコーティング法によって設けられる。特に、ウェル縁２６まで延在している電気接点２３’，２３”は、電流源５”の方へ受取装置４と共にマイクロプレート２を移動させることによって、電流源５”の接触センサ２７に比較的単純に接触することができる。それは、好ましくは、垂直Z方角(図１の矢印参照。これは図１から図３の全ての図の代表である。)に、電気接点２３’，２３”と接触する電流源５”の接触センサ２７まで対応する電動駆動で行われる。したがって、好ましくは、生体細胞または培養物を含むマイクロプレート２を有する受取装置４は、少なくとも1つの移動方向での位置決め中に移動される。この移動方向は、３次元座標系のＸ、ＹおよびＺ方向を含むグループから選択される。マイクロプレート２のウェル３内で作用源５’,５”， ５’’’の少なくとも１つと生体細胞または培養物との間の相互作用を引き起こすため、また、少なくとも１つの作用源５’,５”，５’’’または電流源５”により対応するインテグラル信号を検知するために、生体細胞または培養物を含むマイクロプレート２を有する受取装置４は、好ましくは、少なくとも1つの移動方向に移動できる。この移動方向は、３次元座標系のＸ、ＹおよびＺ方向を含むグループから選択される。
図４は、典型的な電極１７’，１７”の選択を示している。これらの電極の材料は、生体細胞または培養物の付着、コンフルエンス、あるいは形態に、できる限り、好ましくは全く影響を及ぼさない。例えば、図４に示すように、電極１７’，１７”は、同じまたは異なるように構成でき、表面を完全にカバーするか、エリアまたはアレイだけをカバーできる。
同じ参照番号および記号は、例えこれらがすべての図およびすべての参照番号のために記載されていなくても、同等の特徴を示している。記載され、および／または図示された特徴のどのような組み合わせも、本発明の範囲に属する。
本発明に関する蛍光測定として特に好ましくは、とりわけ蛍光輝度の測定であり、時間分解された蛍光測定、蛍光極性化の測定、および蛍光寿命の測定である。
蛍光輝度の測定に加えて、特に、ルミネセンスおよびルミネセンス動態の検知による、細胞および培養物の反応速度測定は、本発明に関して興味深い。
図５は、マイクロプレート２のウェル３の徹照の光路の略図を示している。図５Ａは、透過光線ビーム束２９の概略光路を有する従来の徹照を示している。明視野顕微鏡検査（microscopy）のためのこの古典的な照明は、ケーラー照明と呼ばれている。
光源５’として、ＬＥＤが使用され、このＬＥＤの光２９は、集光レンズ３１によって集められ、コンデンサーレンズ３２の焦点面内に結像される。コンデンサーレンズは、サンプル面で光２９を収束させ、オブジェクティブ（objective）３４を使用して、増加した倍率のカメラ１０のＣＣＤまたはＣＭＯＳチップ３５上に結像される小さなサンプル領域を高輝度で照らしている。発光（luminous filed）開口３３は、ウェル３のサンプル面に照らされた領域を制限し、光および熱放射によってサンプルの負荷を最小化し、かつ迷光を最小化する機能を果たす。光源５’の後に配置されている開口絞り３０は、コンデンサーレンズ３２とウェル３内のサンプル面との間の照明光円錐２９の開口数を画定する。開口絞り３０の小さな開口で、照明光円錐２９は、小さなオープニングアングルを示している。しかしながら、開口絞り３０の大きな開口で、照明光円錐２９は、大きなオープニングアングルを示している。通常、開口絞り３０は、コンデンサーレンズ３２の焦点面に配置される。しかしながら、図示された実施形態では、開口絞り３０は、光源面に配置され、それは、光学像に対して等価と見なされる。開口絞り３０の図示された配置は、電動開口ホイール(図示せず)を利用する可能性を与える。それは、異なるサイズおよび形状を有する多くの開口絞り３０を有している。
従来の顕微鏡検査サンプル(それは薄く、二次元で、２枚のガラス板（顕微鏡検査スライドと、カバースリップ）の間に配置されている)に反して、照明光２９は、ウェル３の底に位置しているサンプル面に達する前に全液体量を通過する必要がある。液体の表面は、付着効果によって相当に曲げられる。つまり、メニスカスが作られ、発散レンズのように作用する。
図５Ｃは、透過光線ビーム２９の概略光路で従来の徹照を示している。開口絞り３０（図５Ａ参照）の小さな開口を使用するとき、オブジェクティブ３４によって結像されたサンプルエリアの外部の領域を通常照らす境界ビームは、外側にそれて、ウェル底の外側の領域にぶつからず、または図示するように、オブジェクティブ３４によって捕らえることができず、イメージングチップ３５によって記録できない。したがって、結果として生じるイメージの中で、外側への劇的な輝度減少をもたらす。この輝度減少は、連続的なイメージプロセシングによって、単に部分的に数学上補償できる。結果として生じる輝度減少は、ウェルの外側の領域における細胞のコンフルエンスのカウント、または測定の信頼性低下に結びつく。
図５Ｂは、透過光線ビーム束２９の概略光路で本発明に係る徹照を示している。大きな開口数を有するこの徹照用のセットアップは、開口絞り３０の開口のサイズを除いて、通常の照明（図５Ａ参照）用のそれと同一である。ここで、開口絞り３０の開口のサイズは、照明円錐２９のオープニングアングルを大きくするためにかなり拡大される。
図５Ｄは、透過光線ビーム束２９の概略光路で本発明に係る徹照を示している。照明円錐２９の境界ビームは、液体の曲面においてより大きな角度で衝突する。それらは、外側へのより弱い偏向を受け、それにより、光２９がカメラ１０のオブジェクティブ３４に入ってもよく、また、イメージングチップ３５によって検知できる方法で、ウェル底の境界領域を照らす。これはかなり弱い輝度勾配に帰着する。コントラストは、ウェル３の外側の領域でさえ、より優れている。また、さらにウェルの外側の領域における細胞のコンフルエンスのカウント、または測定を信頼できるように行うことは可能である。
図６は、徹照されたウェル３の写真を示している。ここでは、培養物を含む１つのウェルの縫い合わされたイメージが、モザイクとして示されている。特に、イメージの明るさは露光時間に依存している。各イメージの明るさは、イメージングソフトウェアを使用して、そのコントラストにおいて最適化されている。ウェル３の底の全体的な輝度分布が各イメージの接触部位での輝度ステップとなっている。
図６Ａは、従来の照明の結果を示している。各イメージは、小さな開口絞り３０（図５Ａおよび図５Ｃ参照）で記録され、境界に向かって明るさの減少が顕著である。
図６Ｂは、本発明の照明の結果を示しており、より大きな開口絞り３０（図５Ｂおよび図５Ｄ参照）で照らされた同じウェル３を示している。評価することができる輝度値がウェルの境界まで存在することは明白である。
図７は、図６の写真におけるウェル（輝線を参照）の全体の直径にわたって輝度の分布を示している。２つのモザイクを通る輝度の横断面が示されている。ステップは、各イメージの露光時間の違いに起因している。
図７Ａは、小さな開口絞り３０（図５Ａおよび図５Ｃ参照）による従来の照明における輝度分布を示している。外側の領域における従来の照明では、カメラノイズの範囲内にある非常に低い輝度値だけを達成できることが理解されるかもしれない。
図７Ｂは、大きな開口絞り３０（図５Ｂおよび図５Ｄ参照）による本発明の照明における輝度分布を示している。勾配がかなり弱く形成されていることが明白に見える。全体的な輝度差は、露光時間を補償することによってより弱くなるので、１つのイメージから別のイメージへの輝度ステップは、はるかに小さい。
図８は、それぞれの場合において照明の正規化をした後の図７Ａおよび図７Ｂの２つの図の比較を示している。従来と本発明のイメージングの結果のこの直接比較のために、露光時間の違いが正規化されている。このグラフでは、横座標は、１ｍｍの距離内のウェル底の位置を示している。また、縦座標は対数目盛で輝度値（濃淡値）を示している。破線は従来の照明を表わしている。太線は、大きな開口絞りを有する本発明の照明を表わしている。大きな開口絞りを有する本発明の照明におけるウェル境界への輝度の消滅は、約２０フォールド（fold）になる。対照的に、通常の従来の照明におけるウェル境界への輝度の消滅は、約５００フォールドになる。このことは、大きな開口絞りを有する照明で、境界領域（通常の照明は、図示したように可能でない領域）における利用可能なシグナルに結びつく。小さい開口数と見なされるのは、１−３ｍｍの範囲の開口を有する開口絞り３０である。大きな開口数と見なされるのは、５−９ｍｍの範囲の開口を有する開口絞り３０である。特に好ましくは、最大開口数において、直径９ｍｍの開口を有する開口絞り３０である。
１ マイクロプレートリーダー
２ マイクロプレート
３ ウェル
４ 受取装置
５’,５’’,５’’’ 作用源
５’ 光源
５’’ 電流源、インピーダンス測定装置
５’’’ 液体源
６ 吸光測定用の第１の測定装置
７ ルミネセンス測定用の第２の測定装置
８ 蛍光測定用の第３の測定装置
９ 照明源
１０ イメージングカメラ
１１’ 内部プロセッサー
１１’’ 外部プロセッサー
１２ サンプルチャンバー
１３ コントローラー
１４ ハウジング
１５ スクリーン
１６ ウェル底
１７’，１７’’ 電極
１８ フラップ
１９ 光学顕微鏡
２０ １０の光学軸
２１ 作動軸
２１’ ８の光学軸
２１’’ ７の光学軸
２１’’’ ６の光学軸
２２ 中央コントロールユニット
２３’，２３’’ 電気接点
２４ ガス入口
２５ ガス出口
２６ ウェル縁
２７ 接触センサ
２８ 光導波路
２９ 光、光ビーム、光ビーム束
３０ 開口絞り
３１ 集光レンズ
３２ コンデンサーレンズ
３３ 発光開口
３４ オブジェクティブ
３５ ＣＣＤ，ＣＭＯＳチップ

Claims (21)

  1. マイクロプレートリーダー（１）の生体細胞または培養物を調査する方法であって、
    ａ）測定装置（６、７、８）と、照明源（９）及びイメージングカメラ（１０）と、受取装置（４）と、プロセッサー（１１’，１１”）と、を備えたマイクロプレートリーダー（１）を、提供するステップであって、
    上記測定装置（６、７、８）は光軸（２１’,２１”,２１’’’）を有しており、
    上記照明源（９）及びイメージングカメラ（１０）は、上記測定装置（６、７、８）の光軸（２１’,２１”,２１’’’）と平行な光軸（２０）を有しており、
    上記受取装置（４）は、少なくとも１つのマイクロプレート（２）を受け取り、及び、少なくとも、上記測定装置の光軸（２１’,２１”,２１’’’）に対して、又は、上記照明源（９）及びイメージングカメラ（１０）の光軸（２０）に対して、マイクロプレートリーダー（１）内に、挿入されたマイクロプレート（２）を位置決めする、ステップと、
    ｂ）挿入されたマイクロプレート（２）のウェル（３）を上記測定装置（６、７、８）の光軸（２１’,２１”,２１’’’）に対して上記受取装置（４）によって位置決めし、及び、上記測定装置（６、７、８）によって上記ウェル（３）内のインテグラル信号を定量的に測定する、ステップと、
    ｃ）挿入されたマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）を上記照明源（９）及びイメージングカメラ（１０）の光軸（２０）に対して上記受取装置（４）によって位置決めし、上記ウェル（３）を上記照明源（９）によって徹照し、上記ウェル（３）の底のイメージを上記イメージングカメラ（１０）によって作成する、ステップと、
    ｄ）ステップｃ）のイメージされた底にある生体細胞または培養物のコンフルエンスを決定する、ステップと、
    ｅ）ステップｂ）で測定された上記ウェル（３）の上記インテグラル信号を、ステップｄ）で決定された上記ウェル（３）内の生体細胞または培養物のコンフルエンスに、上記プロセッサー（１１’，１１”）によって関連付ける、ステップと、
    ｆ）ステップｂ）の定量的測定を、決定された上記ウェル（３）内の生体細胞または培養物のコンフルエンスで、正規化する、ステップと、
    を備えていることを特徴とする方法。
  2. 請求項１に記載の方法において、
    上記生体細胞または培養物を含む上記マイクロプレート（２）の上記ウェル（３）を有する上記受取装置（４）は、上記マイクロプレートリーダー（１）の作用源（５’,５’’’）に対して位置決めされ、これらの作用源（５’,５’’’）の少なくとも１つと上記マイクロプレート（２）の特定の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物との間の相互作用は、上記インテグラル信号を引き起こすため、または生成するために、引き起こされることを特徴とする方法。
  3. 請求項２に記載の方法において、
    少なくとも１つの上記作用源（５’,５’’’）は、
    この、または、これらのマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上の蛍光を励起させるための光源（５’）と、
    この、または、これらのマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物を徹照するための上記光源（５’）と、
    この、または、これらのマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上のルミネセンスを引き起こすための液体源（５’’’）と
    を有するグループから選択されることを特徴とする方法。
  4. 請求項１に記載の方法において、
    上記インテグラル信号は、
    上記マイクロプレートリーダー（１）に挿入された少なくとも１つの上記マイクロプレート（２）の特定の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上で励起された蛍光と、
    上記マイクロプレートリーダー（１）に挿入された少なくとも１つの上記マイクロプレート（２）の特定の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上で引き起こされ、または励起されたルミネセンスと、
    上記マイクロプレートリーダー（１）に挿入された少なくとも１つの上記マイクロプレート（２）の特定の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物によって引き起こされた吸光度と、
    を有するグループから選択されることを特徴とする方法。
  5. 請求項３に記載の方法において、
    上記光源（５’）は、アーク灯、閃光ランプ、白熱灯、レーザー、レーザーダイオードおよび発光ダイオード、つまりＬＥＤを有するグループから選択されることを特徴とする方法。
  6. 請求項３に記載の方法において、
    上記液体源（５’’’）は、１つのインジェクタおよび複数のインジェクタを有するグループから選択されることを特徴とする方法。
  7. 請求項１に記載の方法において、
    上記インテグラル信号を検知するための上記測定装置（６，７，８）は、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードおよび位相敏感ロックイン増幅器を有するグループから選択されることを特徴とする方法。
  8. 請求項１に記載の方法において、
    上記生体細胞または培養物を含む上記マイクロプレート（２）を有する上記受取装置（４）を位置決めする間、この移動方向は、３次元座標系のＸ、ＹおよびＺ方向を有するグループから選択されることを特徴とする方法。
  9. 請求項１に記載の方法において、
    上記生体細胞または培養物を含むと共に上記受取装置（４）によって受け取られる上記マイクロプレート（２）の上記ウェル（３）は、上記マイクロプレートリーダー（１）の遮光されたサンプルチャンバー（１２）内で調査されることを特徴とする方法。
  10. 請求項１に記載の方法において、
    上記生体細胞または培養物を含むと共に上記受取装置（４）によって受け取られる上記マイクロプレート（２）の上記ウェル（３）は、密閉チャンバーとして構成されている上記マイクロプレートリーダー（１）のサンプルチャンバー(１２)内で制御された雰囲気にさらされることを特徴とする方法。
  11. 請求項９に記載の方法において、
    上記生体細胞または培養物を含む上記ウェル（３）を有する受け取られた上記マイクロプレート（２）は、少なくとも上記ステップｂ）及びｃ）の実行中に上記マイクロプレートリーダー（１）の上記サンプルチャンバー(１２)内で上記受取装置（４）に保持されていることを特徴とする方法。
  12. 請求項１０に記載の方法において、
    上記生体細胞または培養物を含む上記ウェル（３）を有する受け取られた上記マイクロプレート（２）は、少なくとも上記ステップｂ）及びｃ）の実行中に上記マイクロプレートリーダー（１）の上記サンプルチャンバー(１２)内で上記受取装置（４）に保持されていることを特徴とする方法。
  13. 請求項１に記載の方法において、
    上記ウェル（３）の底をイメージングするために、大きな開口数を有する開口絞り（３０）を有する顕微鏡光学（１９）が利用されることを特徴とする方法。
  14. 請求項１に記載の方法において、
    上記方法のステップａ）からｆ）までは、１つの装置において自動化された方法で実行されることを特徴とする方法。
  15. マイクロプレートリーダー（１）であって、
    ａ）上記マイクロプレート（２）の特定の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上に存在する、または引き起こされる、または生成される少なくとも１つのインテグラル信号を検知するための少なくとも１つの測定装置（６，７，８）であって、光軸（２１’,２１”,２１’’’）を備えている上記測定装置（６，７，８）と、
    ｂ）上記測定装置（６、７、８）の光軸（２１’,２１”,２１’’’）と平行な光軸（２０）を有している、照明源（９）及びイメージングカメラ（１０）と、
    ｃ）少なくとも１つのマイクロプレート（２）を受け取り、及び、少なくとも、上記測定装置の光軸（２１’,２１”,２１’’’）に対して、又は、上記照明源（９）及びイメージングカメラ（１０）の光軸（２０）に対して、マイクロプレートリーダー（１）内に、挿入されたマイクロプレート（２）を位置決めする、受取装置（４）と、
    を備え、
    上記マイクロプレートリーダー（１）は、内部プロセッサー（１１’）を備えるか、または外部プロセッサー（１１”）に接続可能に形成されており、
    このプロセッサー（１１’，１１”）は、上記受取装置（４）によって受け取られたマイクロプレート（２）のウェル（３）のインテグラル信号を、上記照明源（９）及び上記イメージングカメラ（１０）によってイメージングされたそのウェル（３）の底のイメージ、によって決定されたそのウェル（３）内の生体細胞または培養物のコンフルエンスと、比較するように、及び、そのウェルのインテグラル信号を、決定された上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物のコンフルエンスで、正規化するように、構成されている、
    ことを特徴とするマイクロプレートリーダー。
  16. 請求項１５に記載のマイクロプレートリーダーにおいて、
    少なくとも１つの作用源（５’,５’’’）を備え、
    上記作用源（５’,５’’’）は、これらの作用源（５’,５’’’）の少なくとも１つと上記マイクロプレート（２）の特定の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物との間の相互作用を引き起こすため、および、測定可能な信号を引き起こすため、または生成するためのものであることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
  17. 請求項１５に記載のマイクロプレートリーダーにおいて、
    遮光されると共に気密されるように構成されると共に、密閉チャンバーとして構成されているサンプルチャンバー(１２)と、
    密閉チャンバーとして構成されている上記サンプルチャンバー(１２)内のガス成分、温度、および相対湿度の少なくとも１つを制御するためのコントロール装置（１３）と
    を備えることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
  18. 請求項１６に記載のマイクロプレートリーダーにおいて、
    少なくとも１つの上記作用源（５’,５’’’）は、
    これらのマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上の蛍光を励起させるための光源（５’）と、
    これらのマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物を徹照するための上記光源（５’）と、
    これらのマイクロプレート（２）の上記ウェル（３）内の上記生体細胞または培養物の中あるいは表面上のルミネセンスを引き起こすための液体源（５’’’）と
    を有するグループから選択されることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
  19. 請求項１５に記載のマイクロプレートリーダーにおいて、
    少なくとも１つの上記測定装置（６，７，８）は、光電子増倍管、フォトダイオード、フォトダイオードアレイ、アバランシェダイオードおよび位相敏感ロックイン増幅器を有するグループから選択されることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
  20. 請求項１５に記載のマイクロプレートリーダーにおいて、
    上記イメージングカメラ（１０）に光学的につながれている光学顕微鏡（１９）を備えることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
  21. 請求項２０に記載のマイクロプレートリーダーにおいて、
    上記光学顕微鏡（１９）は、大きな開口数を有する開口絞り（３０）を備えることを特徴とするマイクロプレートリーダー。
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