FR2873445A1 - Dispositif de detection de la fluorescence emise par des elements chromophores dans des puits d'une plaque a puits multiples - Google Patents

Abstract

Dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores contenus dans des puits d'une plaque à puits multiples, ce dispositif comprenant des moyens placés ou intégrés dans des puits (12) de la plaque (10) pour limiter la longueur de pénétration dans les puits d'un faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores (38) fixés sur le fond (14) de chaque puits.

Description

DISPOSITIF DE DETECTION DE LA FLUORESCENCE

EMISE PAR DES ELEMENTS CHROMOPHORES

DANS DES PUITS D'UNE PLAQUE A PUITS MULTIPLES L'invention concerne un dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores contenus dans des puits d'une plaque à puits multiples du type utilisé en biologie et en pharmacologie.

Ces plaques normalisées comprennent un nombre important de puits à disposition matricielle et sont manipulables par des robots qui y déposent des quantités prédéterminées de liquides pour des réactions de dosage d'échantillons, d'hybridation d'ADN, etc. Les cellules ou les molécules d'intérêt biologique contenues dans ces puits peuvent être spécifiquement marquées par des éléments chromophores qui émettent une fluorescence sur une bande étroite de longueurs d'onde en réponse à une excitation lumineuse sur une autre bande étroite de longueurs d'onde, la fluorescence émise permettant de mettre en évidence les cellules ou molécules marquées ou certaines de leurs propriétés. On peut par exemple détecter un anticorps à la surface de cellules qui sont sélectionnées à partir de la quantité de marqueurs fluorescents qu'elles ont capturés (technique du criblage). On peut aussi hybrider des brins d'ADN marqués sur des brins complémentaires connus fixés au fond des puits d'une plaque à puits multiples. Dans tous les cas, il faut déterminer une quantité de marqueurs fluorescents fixés au fond des puits.

Pour cela, dans une technique connue, les fonds des puits sont réalisés en matière transparente, ce qui permet d'exciter les marqueurs fluorescents au moyen d'un faisceau lumineux qui passe à travers les fonds des puits et on utilise un microscope confocal à balayage pour exciter un point du fond d'un puits et de capter la fluorescence émise par ce point, avec une très faible profondeur de champ qui isole ce point des points voisins dans le puits.

Le balayage permet de construire point par point une image de la surface interne du fond du puits ou d'une zone centrale de cette surface. Les marqueurs fluorescents présents en grand nombre dans le liquide contenu dans le puits déterminent un niveau de fond de l'image, par rapport auquel les marqueurs fluorescents des cellules ou molécules fixées au fond du puits forment des taches ponctuelles facilement identifiables.

Cette technique de microscopie confocale à balayage permet de séparer sélectivement les marqueurs des cellules ou molécules fixées sur le fond des puits des marqueurs en suspension dans le liquide contenu dans les puits, mais elle est coûteuse et très lente.

L'invention a pour objet un dispositif de détection de la fluorescence émise par des marqueurs ou éléments chromophores fixés sur une paroi transparente des puits d'une plaque à puits multiples, par exemple sur les fonds transparents des puits, ce dispositif ne présentant pas les inconvénients de coût et de lenteur de la microscopie confocale à balayage tout en conservant ses avantages de sélectivité.

Elle propose à cet effet un dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores contenus dans des puits d'une plaque à puits multiples, ce dispositif comprenant des moyens pour exciter les éléments chromophores par un faisceau lumineux passant à travers des parois transparentes des puits et des moyens pour capter à travers ces parois la fluorescence émise par les éléments chromophores en réponse à cette excitation, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens placés ou intégrés dans les puits de la plaque pour limiter la zone traversée dans chaque puits par le faisceau lumineux d'excitation à une couche mince située sur la paroi transparente du puits, afin d'exciter seulement les éléments chromophores présents dans cette couche mince.

Cette limitation de la zone traversée dans chaque puits par le faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores permet d'exciter les éléments chromophores qui sont fixés sur la paroi transparente du puits et de ne pas exciter ceux qui se trouvent à distance de cette paroi, et donc de ne détecter que la fluorescence émise par les éléments chromophores d'intérêt sans être gêné par les autres éléments chromophores.

Selon une autre caractéristique de l'invention, les moyens pour capter la fluorescence émise par les éléments chromophores excités comprennent un ensemble de photodétecteurs du type CCD, CMOS ou analogue, et des moyens de formation d'image montés entre la plaque et l'ensemble de photodétecteurs pour former sur cet ensemble l'image des parois transparentes d'une pluralité de puits.

Le champ des moyens de formation d'image et la taille de l'ensemble de photodétecteurs peuvent être de quelques centimètres, ce qui permet de reconstituer l'image de toute une plaque à puits multiples à partir de quelques images fournies par l'ensemble de photodétecteurs. Cette reconstitution nécessite l'utilisation d'une mécanique de faible précision pour assurer le positionnement de la plaque à puits multiples par rapport à l'ensemble de photodétecteurs et le recouvrement des images. La résolution et la précision des images ne dépendent que de la précision et des performances de l'ensemble de photodétecteurs. Par ailleurs, cet ensemble et les moyens associés de formation d'image peuvent avantageusement être constitués par le système imageur d'un appareil photographique numérique d'un type classique disponible dans le commerce ou d'une caméra numérique scientifique.

Les moyens de captation de la fluorescence émise peuvent également comprendre un ensemble de faisceau de fibres optiques s'étendant entre les parois transparentes des puits de la plaque et les moyens de formation d'image, chaque faisceau de fibres optiques de cet ensemble ayant une première extrémité placée en regard d'une paroi transparente d'un puits et une seconde extrémité placée en regard des moyens de formation d'image, les secondes extrémités des faisceaux de fibres optiques étant rassemblées entre elles pour former un faisceau unique en regard des moyens de formation d'image.

Chaque faisceau de fibres peut comporter quelques centaines de fibres couvrant une surface de quelques millimètres carrés. En utilisant un nombre de faisceaux de fibres suffisant, on peut former directement sur l'ensemble de photodétecteurs une image composite des parois transparentes de tous les puits d'une plaque à puits multiples. En variante, on forme sur l'ensemble de photodétecteurs l'image d'une partie des puits de la plaque et on déplace la plaque par rapport à l'ensemble de photodétecteurs pour reconstituer une image complète à partir de plusieurs images différentes juxtaposées.

Dans tous les cas, l'acquisition des images des parois transparentes des puits d'une plaque à puits multiples est bien plus rapide que dans la technique antérieure à microscopie confocale à balayage.

De préférence, les parois transparentes précitées des puits sont les fonds des puits.

Dans une première forme de réalisation de l'invention, les moyens qui sont placés ou intégrés dans les puits de la plaque pour limiter la zone traversée par le faisceau d'excitation des éléments chromophores, sont des moyens opaques à ce faisceau d'excitation.

Ces moyens opaques peuvent être formés par exemple par le liquide qui est contenu dans les puits de la plaque et qui limite la longueur de pénétration du faisceau d'excitation à une valeur typiquement inférieure à 100pm et par exemple comprise entre 1 et 10pm.

Ce liquide peut être rendu opaque par addition d'un composé liquide opaque ou bien d'un composé soluble ou encore d'un composé formant une suspension ou une émulsion opaque avec le liquide précité ou encore d'un composé solide pulvérulent qui forme par décantation une couche opaque déposée sur les fonds des puits.

Le composé utilisé peut être du lait, qui a l'avantage d'être biocompatible avec les contenus des puits de la plaque, ou une peinture ou une encre, il peut également être composé de sable fin, de poudre très fine de silice ou d'alumine, de noir de carbone, de microbilles de verre ou d'un colloïde.

De façon générale, ce composé qui s'oppose à la pénétration du faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores, peut être blanc, c'est-àdire non absorbant, ou coloré, par exemple pour absorber spécifiquement la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores ou bien la longueur d'onde sur laquelle est émise la fluorescence des éléments chromophores en réponse à l'excitation, ou bien il peut être noir pour absorber tous les rayonnements lumineux.

Lorsque ce composé est blanc, la rétrodiffusion par ce composé du faisceau lumineux d'excitation se traduit par une augmentation de l'excitation des éléments chromophores et par une augmentation de la fluorescence émise, celle-ci étant elle-même rétrodiffusée vers les moyens précités de captation.

Lorsque le composé est coloré ou noir, on veille à ce que l'absorption du rayonnement lumineux d'excitation des éléments chromophores ne se traduise pas par une émission parasite par le composé à la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores, afin de ne pas fausser les mesures.

Dans une autre forme de réalisation, les moyens opaques qui limitent la pénétration du faisceau lumineux d'excitation des éléments chromophores peuvent comprendre un écran qui est disposé ou déposé sur le fond de chaque puits et qui recouvre au moins une partie de ce fond.

Avantageusement, cet écran est associé à des moyens permettant de le déplacer dans le puits entre une position active et une position inactive, les différents écrans étant par exemple portés par un couvercle de la plaque à puits multiples.

De façon pratique, chaque écran peut comporter une plaque pleine, ou bien un treillis ou un maillage tridimensionnel de fils ou de fibres d'une matière opaque, telle par exemple qu'une matière plastique qui peut être blanche, colorée ou noire.

Dans encore une autre forme de réalisation, le fond transparent de chaque puits de la plaque comporte sur sa face interne, un guide d'onde dont le coeur contient des composants émettant, en réponse à une excitation lumineuse, un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores précités.

Dans ce cas, les fonds des puits sont éclairés par un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des composants émetteurs du guide d'onde, ce rayonnement étant dirigé vers le guide d'onde à travers les fonds transparents des puits.

Le rayonnement lumineux d'excitation des éléments chromophores est émis par les composants précités du guide d'onde et se propage dans un mode guidé qui est très sélectif spatialement et qui n'excite que les éléments chromophores situés au voisinage immédiat du guide d'onde.

Avantageusement, une partie périphérique du guide d'onde dans chaque puits est recouverte d'une couche opaque et une couche de matière transparente est interposée entre le guide d'onde et cette couche opaque.

De préférence, la partie centrale du guide d'onde dans chaque puits est dépourvue des composants précités émettant le rayonnement lumineux d'excitation des éléments chromophores.

Les indices de réfraction des différentes couches utilisées sont choisis pour que l'indice de réfraction du fond transparent de chaque puits soit de préférence inférieur à l'indice de réfraction du liquide contenu dans le puits, le coeur du guide d'onde ayant nécessairement un indice de réfraction supérieur à ces deux indices mais suffisamment bas pour assurer une bonne pénétration de l'onde guidée dans le liquide.

Dans cette forme de réalisation, les différents éléments sont réalisables en matière plastique ou par voie sol-gel. Les composants inclus dans le guide d'onde pour émettre à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores peuvent être des molécules organique telles que celles utilisées dans les lasers à colorant et les diodes électroluminescentes organiques, ou les fluorophores usuels en biologie.

On peut également utiliser pour ces composants émetteurs des matériaux inorganiques tels que des boîtes quantiques ou des terres rares.

La fabrication de ces fonds de puits de microplaques peut être faite par gravure, embossage, estampage, pressage, moulage ou usinage des couches précitées. Dans le cas où la zone centrale du guide d'onde dans chaque puits ne comprend pas de molécules organiques formant les composants émetteurs, on peut partir d'un guide d'onde contenant ces molécules organiques sur toute sa surface et l'éclairer localement en lumière ultraviolette ou en lumière intense pour détruire les molécules organiques se trouvant dans les zones centrales des fonds des puits.

L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels: - la figure 1 est une vue schématique de dessus d'une plaque à puits multiples d'un type normalisé ; - la figure 2 est une vue schématique à plus grande échelle et en coupe d'une partie de cette plaque; - les figures 3 et 4 représentent schématiquement deux modes de réalisation des moyens de captation de la fluorescence émise par des éléments chromophores situés sur les fonds des puits de la plaque précitée; - la figure 5 représente schématiquement diverses formes de réalisation de moyens opaques placés dans les puits de la plaque pour limiter la longueur de pénétration du rayonnement d'excitation des éléments chromophores; - les figures 6 et 7 représentent schématiquement deux formes de réalisation d'autres moyens placés dans les puits pour limiter la longueur de pénétration du rayonnement d'excitation des éléments chromophores.

On a représenté schématiquement aux figures 1 et 2 une plaque 10 à puits multiples d'un type normalisé, utilisée de façon très courante en biologie et en pharmacologie, cette plaque 10 étant réalisée en plastique moulé et comportant un grand nombre de puits 12 à disposition matricielle qui sont fermés à leur extrémité inférieure par une plaque rapportée 14 en matériau transparent, par exemple en matériau plastique, en verre ou en quartz.

En variante, la plaque 10 peut être moulée d'une seule pièce en matériau plastique transparent.

Dans l'exemple représenté, la plaque 10 comprend 96 puits qui ont typiquement, selon les réalisations, un diamètre interne compris entre 5 et 8 millimètres, une profondeur comprise entre 1 et 10 millimètres et qui sont séparés les uns des autres d'une distance égale à 2,25 ou 4,5 ou 9 millimètres, les puits 12 étant cylindriques ou légèrement tronconiques comme représenté schématiquement en figure 2.

Ces plaques normalisées sont manipulées par des robots qui déposent dans les puits 12 des quantités prédéterminées de liquides (échantillons, réactifs, solutions de lavage et de rinçage, etc.) pour réaliser des réactions de dosage enzymatique ou immunologique, des hybridations d'ADN, etc. Les cellules ou les molécules d'intérêt biologique contenues dans les puits 12 sont fixées sur les fonds de ces puits, c'est-à-dire sur la plaque transparente 14 et sont repérables par excitation de marqueurs fluorescents qu'elles comportent ou qui sont fixés sur ces cellules ou molécules. Ces marqueurs peuvent être de différents types et seront désignés dans ce qui suit par l'appellation générique d' éléments chromophores .

Dans la pratique, on se contente en général de détecter et de dénombrer les éléments chromophores qui se trouvent sur une zone centrale du fond de chaque puits 12, cette zone centrale ayant typiquement un rayon de l'ordre du millimètre.

L'excitation des éléments chromophores d'intérêt est réalisée par éclairage à une longueur d'onde déterminée à travers les fonds transparents des puits 12. Il faut détecter et capter la fluorescence émise par les éléments chromophores d'intérêt, sans prendre en compte celle qui est émise par la très grande quantité d'éléments chromophores en suspension dans le liquide contenu dans les puits 12, cette détection et cette captation devant donc être particulièrement sélectives.

Pour assurer cette sélectivité, et pour permettre des mesures rapides sur l'ensemble des fonds des puits 12 d'une plaque 10, l'invention propose les moyens qui sont représentés aux figures 3 et suivantes de la présente demande de brevet.

Les moyens de détection et de captation représentés schématiquement en figure 3 comprennent un ensemble 16 de photodétecteurs du type CCD, CMOS ou analogue, qui sont de préférence à disposition matricielle et qui sont placés sous le fond transparent 14 de la plaque 10, l'ensemble 16 de photodétecteurs ayant des dimensions qui sont par exemple de quelques centimètres carrés et étant associé à des moyens 18 de formation d'image permettant de former sur l'ensemble 16 de photodétecteurs l'image de plusieurs fonds de puits 12 de la plaque 10. Un filtre optique 20 est agencé dans les moyens 18 de formation d'image pour ne laisser passer vers l'ensemble de photodétecteurs 10 qu'une bande étroite de longueurs d'onde centrée sur la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores fixés sur les fonds transparents des puits 12.

Avantageusement, l'ensemble 16 de photodétecteurs et les moyens 18 de formation d'image sont ceux d'un appareil photographique numérique classique, disponible dans le commerce ou d'une caméra numérique scientifique.

Le groupe de fonds transparents des puits 12 dont l'image est formée sur l'ensemble 16 de photodétecteurs, est éclairé à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores par un faisceau lumineux 22 généré par une source 24 telle qu'un laser, une diode laser, une diode électroluminescente ou tout autre générateur approprié.

De préférence, la source 24, l'ensemble 16 de photodétecteurs et les moyens optiques 18, 20 de formation d'image sont montés à poste fixe tandis que la plaque 10 est portée par un support approprié non représenté, qui est mobile horizontalement dans deux directions perpendiculaires pour déplacer les fonds des puits 12 au-dessus des moyens de détection et de captation de fluorescence, de façon à pouvoir reconstituer une image complète des fonds des puits 12 de la plaque à partir de quelques images fournies par l'ensemble de photodétecteurs 16.

Avantageusement, un logiciel permet de sélectionner dans les images fournies par l'ensemble 16 de photodétecteurs les zones correspondant aux parties centrales des fonds transparents des puits 12 et de ne traiter que les images de ces zones centrales.

Le système représenté schématiquement en figure 3 présente l'avantage de ne pas dépendre du type et du format de la plaque 10 utilisée et de permettre une acquisition très rapide des images des parties intéressantes des fonds transparents des puits 12 d'une plaque.

Les moyens utilisés pour déplacer la plaque 10 par rapport à l'ensemble 16 de photodétecteurs peuvent être automatisés de façon simple et peuvent fonctionner avec une précision faible, de l'ordre d'un millimètre. Ils sont donc de réalisation simple et peu coûteuse.

Dans une forme de réalisation représentée schématiquement en figure 4, on associe à l'ensemble 16 de photodétecteurs et aux moyens 18, 20 de formation d'image placés sous la plaque 10, un ensemble de faisceaux 26 de fibres optiques dont les premières extrémités 28 sont séparées et orientées vers les fonds transparents des puits 12 de la plaque 10 et dont les secondes extrémités sont rassemblées en un faisceau unique orienté vers les moyens 18, 20 de formation d'image et l'ensemble 16 de photodétecteurs. Chaque faisceau 26 de fibres optiques peut comprendre quelques milliers de fibres optiques dont les premières extrémités sont espacées les unes des autres d'une distance faible, par exemple comprise entre 5 et 50 pm, et réparties dans une surface de quelques millimètres carrés. Ainsi, chaque extrémité 28 d'un faisceau de fibres optiques peut être alignée sur une zone centrale d'un fond transparent d'un puits 12 de la plaque 10 pour former une image de cette zone sur une partie de l'ensemble 16 de photodétecteurs. Des lentilles de focalisation 32 sont agencées entre les fonds des puits 12 et les premières extrémités 28 des faisceaux 26 des fibres optiques.

Dans cette réalisation, l'éclairage des fonds transparents des puits 12 pour l'excitation des éléments chromophores d'intérêt est assuré par un faisceau lumineux 22 que l'on fait passer par les faisceaux 26 de fibres optiques, au moyen d'une lame séparatrice 34 placée dans les moyens 18 de formation d'image, entre le filtre 20 et les secondes extrémités 30 des faisceaux 26 de fibres optiques.

Le nombre de faisceaux 26 de fibres optiques peut être suffisant pour former directement et en une seule fois sur l'ensemble 16 de photodétecteurs une image complète des fonds transparents des puits 12 de la plaque 10.

En variante, au moyen de l'ensemble de faisceaux 26 de fibres optiques, on ne forme sur l'ensemble 16 de photodétecteurs que l'image d'une partie des fonds transparents des puits 12 de la plaque 10 et on déplace cette plaque horizontalement au-dessus des faisceaux 28 de fibres optiques comme déjà décrit pour le mode de réalisation de la figure 3, afin de reconstituer une image complète des fonds des puits 12 de la plaque à partir de plusieurs images fournies par l'ensemble 16 de photodétecteurs. Comme représenté en figure 3, les fonds des puits sont alors éclairés par un faisceau lumineux 22 extérieur aux faisceaux 28 de fibres optiques.

On a représenté en figure 5 plusieurs formes de réalisation de moyens qui peuvent être placés dans les puits 12 pour y limiter la longueur de pénétration du faisceau 20 d'excitation des éléments chromophores.

Dans une première forme de réalisation, c'est le liquide 36 contenu dans le puits 12a de la plaque 10 qui est rendu opaque au faisceau 22 d'excitation des éléments chromophores 38, par addition à ce liquide d'un composé approprié, qui peut prendre des formes très diverses.

Ce composé peut être liquide ou soluble, inerte ou biocompatible avec les cellules ou les brins d'ADN contenus dans le puits 12a, et il est ajouté dans le puits en même temps que les éléments chromophores 38. Il peut former une suspension ou une émulsion dans le liquide 36.

II est par exemple constitué d'une encre, d'une peinture, d'un hydrolisat de proteines ou de lait, la concentration et les caractéristiques du composé étant déterminées pour que la longueur d'onde de pénétration du faisceau d'excitation 22 dans le liquide 36 depuis le fond transparent 14 du puits 12a soit inférieure à 100 dam environ et de préférence de l'ordre de 5pm pour n'exciter que les éléments chromophores 38 d'intérêt qui sont fixés sur le fond transparent du puit 12a. Par exemple, une concentration de 10 à 100g par litre de lait écrémé en poudre ou de noir de carbone est appropriée.

Le liquide 36 rendu opaque par ce composé peut être blanc, c'est-à-dire non absorbant, ou coloré, pour absorber spécifiquement une longueur d'onde correspondant à l'excitation des éléments chromophores 38 ou à l'émission de fluorescence par ces éléments chromophores, ou encore noir pour absorber toutes les longueurs d'onde.

Comme la longueur d'onde de pénétration du faisceau d'excitation 22 dans le liquide est très faible et par exemple du même ordre de grandeur que l'épaisseur d'une cellule (environ 1 pm), les éléments chromophores contenus dans le liquide 36 au-dessus du fond transparent du puits 12a ne sont pas excités et les moyens de captation de la fluorescence à travers le fond transparent 14 ne reçoivent que la fluorescence émise par les éléments chromophores des cellules ou des molécules d'intérêt fixées sur le fond du puits.

Dans une autre forme de réalisation, on ajoute au liquide 36 contenu dans le puits 12b un composé solide pulvérulent qui ne se dissout pas et qui descend sur le fond du puit par décantation, jusqu'à former une couche opaque recouvrant partiellement ou complètement les cellules fixées sur le fond du puit.

Ce composé peut être du sable fin, une poudre très fine de silice ou d'alumine, du noir de carbone, un colloïde, des microbilles de verre ou analogues. Il peut être diffusant ou coloré ou réfléchissant.

Lorsque ce composé est blanc, la rétrodiffusion de la lumière 22 d'excitation des éléments chromophores se traduit par une augmentation de cette excitation et donc par une augmentation de la fluorescence émise, qui est elle-même rétrodiffusée vers les moyens précités de captation.

Lorsque le composé est coloré ou noir, on veille à ce que l'absorption de la lumière 22 d'excitation ne se traduise pas par une émission parasite à la longueur d'onde de la fluorescence émise par les éléments chromophores 38.

Dans une autre forme de réalisation, c'est un treillis, un fritté de verre ou de métal ou un maillage tridimensionnel 42 de fils ou de fibres d'une matière opaque qui est déposé sur le fond transparent du puits 12c pour limiter la longueur de pénétration de la lumière 22 d'excitation des éléments chromophores 38. Le treillis, fritté ou maillage 42 permet une circulation du liquide 36 tout en formant un écran opaque à la propagation de la lumière d'excitation 22. Le treillis ou le maillage est réalisé de préférence en une matière plastique qui peut être blanche, noire ou colorée.

Ce treillis, fritté ou maillage 42 est avantageusement relié par une tige rigide 44 à un couvercle 46 posé sur le dessus de la plaque 10.

Dans une autre forme de réalisation, les moyens placés dans le puits 12d pour limiter la propagation de la lumière d'excitation 22 sont formés par un piston 48 dont la tige 50 est fixée au couvercle 46 précité et dont la surface inférieure opaque peut être blanche pour rétrodiffuser la lumière ou bien noire ou encore réfléchissante grâce à l'intégration d'un miroir, constitué par exemple par une couche métallique protégée par une couche de matière plastique ou diélectrique, le miroir pouvant également être réalisé par un empilement de couches diélectriques ou encore par une couche de matière plastique. L'extrémité inférieure du piston 48 comporte des doigts ou des saillies formant entretoise et permettant de placer la face inférieure du piston à une distance prédéterminée du fond transparent du puits 12d, cette distance étant par exemple de l'ordre de 10pm.

Dans encore une autre forme de réalisation, les moyens placés dans le puits 12e sont formés par un cylindre 52 porté par le couvercle 46 et dont l'extrémité inférieure comporte des moyens d'appui ponctuels ou quasi ponctuels sur le fond transparent du puits 12e, pour laisser subsister une couche mince de liquide entre l'extrémité inférieure du cylindre 52 et le fond transparent 14 du puits 12e, cette couche mince ayant par exemple une épaisseur de 10pm environ.

Comme déjà décrit pour le piston 48, la face inférieure du cylindre 52 qui est opaque à la lumière d'excitation 22, peut être blanche, colorée, noire ou réfléchissante.

Les figures 6 et 7 représentent des moyens intégrés dans les fonds des puits 12 pour limiter la longueur de pénétration à l'intérieur de ces puits de la lumière d'excitation des éléments chromophores.

Dans la forme de réalisation de la figure 6, la plaque transparente 14 formant les fonds des puits 12 comporte, sur sa face située à l'intérieurdes puits, un guide d'onde 54 dont le coeur contient des composants chromophores 56 différents des éléments chromophores 38 servant au marquage des cellules ou des molécules. Ces composants 56 ont une longueur d'onde d'excitation qui est inférieure à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38 précités et ils ont une longueur d'onde d'émission qui est égale à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38 qui émettent eux-mêmes une fluorescence à une longueur d'onde supérieure.

Ainsi, lorsque le fond transparent 14 du puits 12 en figure 6 est éclairé par une lumière 58 à la longueur d'onde d'excitation des composants 56 du coeur du guide d'onde 54, ces composants 56 émettent sur la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38. Cette émission est en partie dirigée directement vers le liquide 36 contenu dans le puits 12 comme indiqué par la flèche E en traits pointillés, et en partie guidée dans le guide d'onde 14, cette émission guidée étant très sélective et n'excitant que les éléments chromophores 38 qui sont sur le guide d'onde 54 ou à son voisinage immédiat, c'est-à-dire à une distance inférieure à 1 pm, en fonction de la pénétration de l'onde guidée dans le liquide 36.

Le mode guidé correspond à une fraction notable de l'émission lumineuse par les composants 56, cette fraction étant en général supérieure à 10%.

De façon avantageuse, on prévoit que la partie centrale du guide d'onde 54 dans le puits 12 ne contient pas de composants émetteurs 56, cette partie centrale ayant typiquement un rayon de l'ordre de 1 millimètre. L'émission directe E à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores 38 n'intéresse donc que la partie périphérique du guide d'onde dans le puits 12 et n'éclaire que marginalement la zone centrale du puits, tandis que l'onde guidée dans le guide d'onde 54 parvient dans la zone centrale de ce guide d'onde et excite les éléments chromophores 38 qui sont fixés sur cette partie centrale ou qui en sont immédiatement voisins.

Dans la forme de réalisation de la figure 7, la surface périphérique du guide d'onde 54 dans le puits 12 est masquée par une couche annulaire 60 de matière opaque qui arrête l'émission lumineuse directe par les composants émetteurs 56 contenus au coeur du guide d'onde. Une couche transparente 62 sépare le guide d'onde 54 de la couche annulaire opaque 60 pour ne pas absorber l'onde guidée.

Le guide d'onde 54, la couche transparente 62 et la couche opaque sont de préférence en matériaux plastiques ou sont réalisés par voie sol-gel. Les composants émetteurs 56 peuvent être des molécules organiques telles que celles utilisées dans les lasers à colorant (rhodamine, coumarin), dans les diodes électroluminescentes organiques (copolymères tels que AIg3), ou les fluorophores usuels tels que Cyanine-3, Cyanine-5 ou Alexa. On peut aussi utiliser pour les composants émetteurs 56 des matériaux inorganiques tels que des boîtes quantiques ou des terres rares.

L'indice de réfraction du fond transparent 14 est de préférence inférieur à celui du liquide 36 et le coeur du guide d'onde 54 doit avoir un indice supérieur à ceux du fond 14 et du liquide 36. II faut par ailleurs que cet indice de réfraction soit relativement bas pour assurer une bonne pénétration de l'onde guidée dans le liquide 36. L'indice effectif est choisi pour obtenir une pénétration optimale correspondant à l'épaisseur d'une cellule (environ 1 pm) ou d'une molécule (épaisseur inférieure à 0, 1 pm).

L'épaisseur de la couche guidante est d'environ 1 pm et est choisie pour assurer une bonne absorption de la lumière d'excitation 58 et pour constituer un guide à faible nombre de modes, et de préférence à un seul mode.

Les diverses couches précitées peuvent être gravées, embossées, 15 estampées, pressées, moulées ou usinées.

Pour que la zone centrale du guide d'onde 54 dans chaque puits 12 ne comprenne pas de composants émetteurs, il est avantageux d'utiliser des molécules organiques comme composants émetteurs et de les éliminer localement du guide d'onde 54 par exposition à une lumière ultraviolette ou une lumière intense.

Le mode de réalisation de la figure 7 peut avantageusement être réalisé avec des plaques à puits multiples dont les fonds sont opaques et comportent chacun une ouverture d'un diamètre par exemple de l'ordre de 2 millimètres. II suffit alors de coller sur les fonds des puits un film plastique composite qui contient le guide d'onde avec des composants émetteurs formés par des molécules organiques, puis d'éclairer les puits en lumière ultraviolette pour détruire les composants émetteurs qui sont à l'intérieur des trous des fonds des puits.

Dans un mode de réalisation particulier, l'indice de réfraction du fond transparent 14 des puits est égal à 1,3, celui du liquide 36 est égal à 1, 35 et celui du coeur du guide d'onde 54 est égal à 1,4. Dans une variante, l'indice de réfraction du fond 14 est égal à 1,4, celui du liquide 36 à 1,35 et celui du coeur du guide d'onde à 1,45. La plaque à puits multiples est en polystyrène, en polypropylène, en chlorure de polyvinyle ou en polymère acrylique. Le composite multicouches utilisable dans les formes de réalisation des figures 6 et 7 est en verre, en quartz, ou en matériaux transparents diélectriques ou en matériaux plastique tels que du polystyrène, du polypropylène, du chlorure de polyvinyle, un polymère acrylique, du polyéthylène, un polycarbonate ou une polyoléfine en général.

Claims (20)

REVENDICATIONS

1. Dispositif de détection de la fluorescence émise par des éléments chromophores (38) contenus dans des puits (12) d'une plaque (10) à puits multiples, ce dispositif comprenant des moyens pour exciter les éléments chromophores par un faisceau lumineux passant à travers des parois transparentes (14) des puits (12), et des moyens pour capter à travers ces parois la fluorescence émise par les éléments chromophores (38) en réponse à cette excitation, caractérisé en ce qu'il comprend également des moyens placés ou intégrés dans les puits (12) de la plaque (10) pour limiter la zone traversée dans chaque puits par le faisceau lumineux (22) d'excitation à une couche mince située sur la paroi transparente (14) du puits, afin d'exciter seulement les éléments chromophores (38) présents dans cette couche mince.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que les moyens de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores (38) comprennent un ensemble (16) de photodétecteurs du type CCD, CMOS ou analogue et des moyens (18) de formation d'image montés entre la plaque (10) et l'ensemble de photodétecteurs (16) pour former sur cet ensemble l'image des parois transparentes d'une pluralité de puits (12).

3. Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que les moyens précités de captation comprennent également un ensemble de faisceaux (26) de fibres optiques s'étendant entre les parois transparentes des puits (12) et les moyens (18) de formation d'image et dans lequel chaque faisceau (26) de fibres optiques a une première extrémité (28) placée en regard de la paroi transparente d'un puits (12) et une seconde extrémité (30) placée en regard des moyens de formation d'image (18), ces secondes extrémités (30) des faisceaux (26) étant rassemblées en un faisceau unique.

4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que les extrémités des fibres optiques de chaque faisceau (26) sont séparées les unes des autres à la première extrémité (28) du faisceau et sont écartées entre elles d'une distance faible, par exemple comprise entre 5 et 50 pm.

5. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche mince précitée a une épaisseur déterminée pour assurer uniquement ou presque uniquement l'excitation des éléments chromophores (38) posés ou fixés sur les parois transparentes (14) des puits (12).

6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce 10 que l'épaisseur de la couche mince précitée est inférieure à 100pm et par exemple comprise entre 1 et 10pm.

7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les parois transparentes des puits (12) sont les fonds (14) des puits

8. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les moyens placés ou intégrés dans les puits (12) pour limiter la zone traversée par le faisceau lumineux d'excitation (22) sont des moyens opaques à ce faisceau d'excitation.

9. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdits moyens opaques sont formés par du liquide (36) contenu dans les puits (12) et limitant la longueur de pénétration du faisceau d'excitation (22) à une valeur inférieure à 100pm et par exemple comprise entre 1 et 10pm.

10. Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que le liquide (36) est rendu opaque par addition d'un composé liquide opaque ou d'un composé soluble ou d'un composé formant une suspension ou une émulsion opaque avec le liquide contenu dans le puits (12) ou d'un composé solide pulvérulent formant par décantation une couche opaque (40) sur les fonds des puits (12).

11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que ledit composé est constitué de lait, d'une peinture ou d'une encre, de sable fin, de poudre de silice ou d'alumine, de noir de carbone, de microbilles de verre ou d'un colloïde.

12. Dispositif selon la revendication 8, caractérisé en ce que lesdits moyens opaques comprennent un écran solide disposé ou déposé sur le fond (14) de chaque puits (12) et recouvrant au moins une partie de ce fond.

13. Dispositif selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il comprend des moyens pour déplacer lesdits écrans dans les puits (12).

14. Dispositif selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce que les écrans sont portés par un couvercle (46) de la plaque (10) à puits multiples.

15. Dispositif selon l'une des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que chaque écran comporte une plaque pleine (48), un treillis, un fritté de verre ou de métal ou un maillage tridimensionnel (42) de fils ou de fibres de matière opaque, par exemple de matière plastique.

16. Dispositif selon la revendication 7, caractérisé en ce que le fond transparent (14) de chaque puits (12) comporte sur sa face interne un guide d'onde (54) dont le coeur contient des composants (56) émettant en réponse à une excitation lumineuse un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores (38) précités et en ce que les moyens d'excitation précités émettent un rayonnement à la longueur d'onde d'excitation des composants (56) du guide d'onde, ce rayonnement étant dirigé vers le guide d'onde à travers le fond transparent (14) du puits (12).

17. Dispositif selon la revendication 16, caractérisé en ce que la longueur d'onde d'excitation des composants (56) du guide d'onde (54) est inférieure à la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores (38) précités.

18. Dispositif selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que l'indice de réfraction du coeur du guide d'onde (54) est supérieur aux indices de réfraction du fond (14) du puits et du liquide (36).

19. Dispositif selon l'une des revendications 16 à 18, caractérisé en ce qu'une partie périphérique du guide d'onde (54) dans chaque puits (12) est recouverte d'une couche opaque annulaire (60) et d'une couche (62) de matière transparente interposée entre le guide d'onde et la couche annulaire (60).

20. Dispositif selon la revendication 19, caractérisé en ce que la 5 partie centrale du guide d'onde (54) dans chaque puits est dépourvue des composants émetteurs (56) précités.