WO2004017055A2 - Dispositif de support d'elements chromophores - Google Patents

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WO2004017055A2
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Henri Benisty
Hervé Arditty
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Definitions

  • the invention relates to a device for supporting chromophoric elements.
  • the chromophoric elements are chemical or biological molecules which are generally fixed on a substrate after a hybridization or affinity reaction in a liquid, or else elements dyes added or grafted to these molecules or certain types of nanostructures semiconductor such as son or quantum boxes, each chromophore element being adapted to emit light spontaneously (it is the or bio- or chemiluminescence) or in response to a light excitation (this is fluorescence) over a determined wavelength which depends on the nature of this chromophore element.
  • Support devices for chromophoric elements are described in particular in application WO-A-02/16912 in the names of Claude WEISBUCH and Henri BENISTY and include means making it possible to reinforce the light intensity of excitation of the chromophoric elements and to increase the light intensity emitted by these elements, by interference effects produced by stacks of layers of judiciously chosen materials and by effects of light extraction guided by lateral structures having dimensions of the same order of magnitude as the wavelength of guided light, such as photonic crystals.
  • the chromophoric elements are fixed on areas of the substrate (called “spots” in English terminology) separated from each other and arranged regularly, in particular in rows and columns. These ranges have dimensions, for example of a few tens or hundreds of ⁇ m approximately, which are clearly greater than the wavelengths considered.
  • the ranges where the chromophoric elements are fixed for example during the hybridization step are delimited for example by a deposition technique of the "spotting" type which comprises a physicochemical treatment of the surface of the overall substrate, the "spot” then being determined by the area wetted by the fluid deposition, or by a selective spatial treatment for example by selective silanization, the "spot” being determined by this treatment.
  • the ranges can comprise chromophoric elements of different types, in general two, for example Cy3 and Cy5 which emit on different wavelengths.
  • the signals emitted are picked up by suitable photodetectors, in particular by arrays or arrays of photodetectors of the CCD type which also pick up an overall background noise formed by an excitation light which is incompletely filtered, by a fluorescence coming from chromophoric elements of ranges. neighbors according to grazing or guided rays, etc., this background noise being difficult to eliminate with precision for each wavelength considered and can represent a significant part of the intensity of the signals picked up.
  • the information carried by the light emitted by the chromophores can be read, depending on the type of apparatus used, on one side or the other of the support.
  • the measurement can be made on dried biological material or else in the liquid phase, for which the chromophoric elements carrying the information are those specifically hung on pads of the support, the liquid comprising in its volume a certain quantity of chromophores in non-informative suspension and forming a source of background noise at the emission wavelengths of chromophores as well as diffusing particles, also sources of background noise.
  • the object of the present invention is in particular to provide a simple and effective solution to the problem of determining and eliminating this background noise.
  • the invention also aims to optimize the structure of the substrate for its use at several different wavelengths corresponding to different types of chromophores.
  • a device for supporting chromophoric elements which allows a reliable, precise and automatic determination of the above-mentioned background noise.
  • a device for supporting chromophoric elements capable of emitting light by chemiluminescence or by fluorescence in response to a light excitation, the wavelength emitted by each chromophore element depending on the nature of this element, these chromophoric elements being fixed on areas separated from each other, characterized in that the surface of the support is structured in several zones having different optical properties in amplitude and in phase of the reflectivity and in transmission, these properties resulting from the presence or the absence, on the substrate areas, of at least one set of layers chosen from the following:
  • At least one layer absorbing at least partially at least one of the emission and / or excitation wavelengths, - at least one layer transparent to all the emission and excitation wavelengths, said layers being determined to produce at least one of the following effects:
  • the device according to the invention therefore comprises different optical environments, which will mix the useful signal differently with the background noise, which makes it possible, thanks to appropriate digital processing, to reconstruct the useful signal.
  • a first type of zone can produce the measurement
  • Measurement (1) ai " Signal + b1 " noise (A) while a second type of zone will produce the measurement
  • Measure (2) a2vSignal + b2 » noise
  • B the coefficients ai and b1 being the transfer parameters of zone 1 at the wavelength considered, a2 and b2 being those of zone 2. These parameters are known by construction or by calibration. It then suffices to solve the system of two equations with two unknowns (A, B) to deduce therefrom the sought after values "Signal” and "noise".
  • the value of the coefficients ai and a2 can be varied by using, for example, amplifier layers for the emitted light and / or the excitation light, as described in application WO-A-02/16912 in the names of Claude WEISBUCH and Henri BENISTY, on the basis of destructive or constructive interference effects.
  • the dimensions of these zones can, depending on the applications, be greater, less than or equal to those of the above-mentioned ranges. In the case where the zone is smaller than the range, the resolution of the Signal-Noise system is done locally on the same range including the different zones. Otherwise, the Signal-Noise system is resolved by comparing the measurements made on different ranges located in different areas.
  • the background noise corresponding to the liquid phase can have an intensity of the same order of magnitude as that of the useful signal, or even greater. This is one of the reasons why measurements in the presence of the liquid phase are not usually made.
  • the invention makes it possible to effectively solve this problem, which in this case represents more than a simple improvement in performance and corresponds to a new type of measurement and apparatus.
  • This solution also makes it possible to provide a temporal resolution to the measurement since the process of attachment or hybridization of the chromophoric elements can thus be analyzed throughout its course.
  • the structuring of the support can be carried out by usual techniques of lift-off lithography and / or dry or wet etching.
  • a particular embodiment corresponds to a relatively simple structure (no absorption layer) produced by modulating the thickness of a transparent layer located above a reflective layer.
  • the device comprises a plane mirror covered with a layer of material transparent to the lengths of emitted waves and on which the chromophoric elements are distributed in ranges separated from each other and having lateral dimensions greater than the wavelengths of the emitted fluorescence, characterized in that said layer of transparent material has a thickness of the same order of magnitude as the wavelengths of the fluorescence emitted and comprises, for each range of chromophoric elements, at least two zones having different thicknesses, the thickness of a first of these zones being determined to generate by a phenomenon d 'destructive interference a minimum intensity of the fluorescence emitted over a wavelength by chromophoric elements of said zone.
  • the fluorescence emitted on the surface of this zone is at a minimum value which is zero or substantially zero. Consequently, the light signal picked up on the surface of this zone represents the overall noise at the wavelength considered.
  • the two above conditions are close and correspond to thicknesses which typically differ by less than 30 nm, at any intermediate condition between the two above conditions.
  • the two effects can also coincide if the angle of incidence of the excitation light is chosen for this purpose.
  • the transparent material layer comprises, at least one other zone having a thickness different from that of the first zone, such as the difference of the optical paths in these two zones for a wavelength considered is equal to about an odd multiple of a quarter of this wavelength.
  • This zone allows maximum amplification of the fluorescence emitted.
  • the wavelength considered for determining the difference in thickness between the two zones can be, as indicated above, either the wavelength of the fluorescence emitted, the excitation wavelength, or both the wavelength of the emitted fluorescence and the excitation wavelength (to obtain a maximum of excitation intensity and a maximum of emitted fluorescence intensity on said other zone), i.e. a further intermediate condition when the thicknesses of the two regions calculated for the two wavelengths are very "close to one another.
  • the light signal picked up on the surface of this other zone corresponds to the sum of the maximum intensity of the fluorescence emitted at the first length of wave on the surface of this other area and overall background noise.
  • the layer of transparent material comprises, for each range of chromophoric elements, a plurality of the aforementioned zones of different thicknesses, making it possible to sample between a minimum value and a maximum value the intensity of the fluorescence emitted on said first wavelength by chromophoric elements of said range
  • - the layer of transparent material comprises, for each range chromophoric elements, a plurality of the aforementioned zones of different thicknesses, making it possible to vary the intensity of the fluorescence emitted on different wavelengths by chromophoric elements of different types from said range.
  • said zones are arranged in lines or in strips parallel to the surface of said layer of transparent material.
  • these zones may have a matrix arrangement in rows and columns on the surface of the layer of transparent material. This then comprises, over its entire surface, a plurality of zones of different thicknesses with preferably regular distribution which form a structure of the paving type or the like.
  • these zones of different height can be formed on the aforementioned reflecting layer or on an intermediate layer of different index interposed between the transparent layer and the reflecting layer.
  • the means for capturing the fluorescence emitted by the chromophoric elements can be located above the device for supporting these chromophoric elements, or even below, as already described in the aforementioned international application WO-A-02/16912.
  • these capture means may comprise a matrix of photodetectors of the CCD or CMOS type which is fixed under the device, the latter comprising a first layer of material highly reflecting at the excitation wavelength and a second layer of material selectively absorbing the excitation radiation, the first layer being deposited on the second, so that the emitted fluorescence easily reaches the detectors, but not the excitation radiation.
  • the reflection of the excitation radiation on the first layer can then possibly provide the aforementioned effect of reinforcing the emitted fluorescence.
  • a weakly resonant cavity is formed between the lens on the upper surface of the layer carrying the chromophoric elements and said first reflective layer (at the excitation wavelength) when the latter also has a non-negligible reflectivity at length. of the fluorescence emitted. This effect can be used to increase the intensity of the fluorescence channeled to the photodetectors.
  • the upper layer of this device is made of a material with a high refractive index. This promotes the formation of said weakly resonant cavity and therefore good detection of fluorescence by the photodetectors fixed under the device.
  • the accuracy of the measurement can also be improved. performed following the resolution of the system of equations (A) and (B) above.
  • the device can be designed to have the same useful signal level on the two types of zone.
  • the background noise at the emission wavelength is negligible.
  • Measure (2) a * Signal + noise (ex.)
  • the useful signal free of noise due to excitation light can be easily found by subtracting the measurement carried out on the first type of zone from twice the measurement carried out on the second:
  • One zone maximizes the emission of a first type of chromophore and the other zone minimizes this emission.
  • the first type of chromophore is treated in a targeted manner, the second type of chromophore being treated generically; or one zone maximizes the emission of a first chromophore and the other zone maximizes the emission of a second type of chromophore.
  • the two types of chromophores are processed in a targeted manner for the signal, the noise being processed generically.
  • the invention also applies to chemiluminescent compounds.
  • the structuring of the surface of the support only takes into account the emission wavelengths.
  • the invention also applies also to the format of microplates ("SBS" format) (for example 24, 96, 384 or 1536 wells), the structure of the surface of the support then being adapted to the geometry wells of the microplates so as to present one or more zones per well.
  • SBS format of microplates
  • the structured support constitutes the bottom common to all the wells of a microplate. In another embodiment, individual supports are deposited at the bottom of each well of a monolithic microplate.
  • the invention also applies to microplates in the format of microscope slides with micro-wells produced by depositing a layer with a thickness of several tens of microns with orifices forming these wells (for example HTC treatment of "Teflon” type Cel-Line brand sold by Erie Scientific Corp., Portsmouth, NH).
  • the different wells can be used as separate hybridization zones for different test samples.
  • each well may include one or more areas where the chromophoric elements are fixed.
  • FIG. 1 is a schematic representation from above of a part of a device according to the invention.
  • FIG. 2 is a partial view on a larger scale of Figure 1;
  • FIG. 3A, 3B and 3C are views corresponding to Figure 2, for alternative embodiments of the invention;
  • FIG. 4 is a partial schematic perspective view of another alternative embodiment
  • FIGS. 5A and 5B are partial schematic sectional views of two embodiments of a device according to the invention.
  • - Figure 6 is an enlarged view of part of the section shown in Figure 5A;
  • FIG. 7 is a graph schematically representing the intensities of the fluorescence emitted on the surface of three different zones of the device of Figure 6;
  • the device shown diagrammatically in FIG. 1 comprises a support 10 of generally rectangular shape, the upper face 12 of which comprises a plurality of pads 14 on which chromophoric elements are fixed, these pads 14 forming an assembly where they are distributed in regular lines and in columns for example.
  • the dimensions of the areas 14 are of the order of 30 to 400 ⁇ m, and the spacing D between adjacent areas is of the order of 40 to 500 ⁇ m. As indicated above, the dimensions of the ranges are determined by a fluid deposition or by a selective spatial treatment.
  • the support can be made of glass, silicon, silicon carbide, sapphire (AI203), metal or plastic.
  • the upper part of the support 10 comprises a layer 12 of a material which is transparent to the wavelengths of the fluorescence emitted by the chromophoric elements of the pads 14 in response to a light excitation, the layer 12 comprising at least dielectric material such for example a semiconductor material, an oxide, a glass, a nitride, a fluoride, a chalcogenide, an organic polymer or a mineral or organometallic compound obtained by sol-gel route.
  • This material preferably has a relatively high refractive index and is for example formed of TiO2 having a refractive index of between 2.2 and 2.5 depending on the crystalline form used.
  • the layer 12 is made of SiO 2 to optimize the quality of the chemical functionalization of the surface of the support.
  • the transparent layer (12) can also be made of organic polymer with a flat or rough surface ("3-D" effect). In the latter case, the 3-D effect increases the effective surface of the device.
  • the transparent layer (12) can also be porous.
  • This layer 12 has a thickness which is of the same order of magnitude as the wavelengths of the fluorescence emitted by the chromophoric elements and covers a plane mirror which can be reflective for the excitation wavelength, this plane mirror being above all reflecting for the wavelengths of the fluorescence emitted.
  • the free surface or upper surface of the layer 12 is structured for example as shown diagrammatically in FIGS. 2, 3 and 4.
  • this layer 12 comprises a plurality of parallel bands 16 of different thicknesses, these bands having a width in the plane of the layer 12 which is greater than the wavelengths of the fluorescence emitted by the chromophoric elements and less than dimensions in the plane of the ranges 14.
  • the thicknesses of the different bands 16 are determined so that one of these thicknesses produces, in each range 14, a destructive interference effect on the surface of the layer 12 for a wavelength excitation and / or for a given wavelength of the fluorescence emitted by the chromophoric elements.
  • the other bands 16 have different thicknesses, one of which corresponds to a constructive interference effect on the upper surface of the layer 12, for the excitation wavelength and / or for the fluorescence wavelength issued.
  • the bands 16 of different thicknesses are formed alternately in the layer 12, their thicknesses being determined to produce the aforementioned effects of destructive interference and constructive interference for one or preferably for several wavelengths emitted by the different elements chromophores present in ranges 14 and / or for the corresponding excitation wavelengths. It is therefore possible, considering a given wavelength emitted by chromophoric elements of a range 14, to determine two thicknesses corresponding to the two aforementioned interference effects and one or more intermediate thicknesses, which makes it possible to sample the light intensity emitted at this wavelength between a minimum value and a maximum value.
  • each area 14 comprises a plurality of adjacent plates 20 of square or rectangular shape which have different heights.
  • the dimensions of these plates 20 at the upper surface of the layer 12 can be identical from one plate to another or different.
  • the structuring of the support can also be carried out as shown diagrammatically in FIGS. 3B and 3C with zones 16 having dimensions greater than those of the pads 14 of chromophoric elements.
  • the layer 12 of transparent material carrying the chromophoric elements C is formed on a plane mirror 22 which is highly reflective at least for fluorescence emitted by the chromophoric elements.
  • the plane mirror is formed from one or more layers of a reflecting metal or a dielectric material such as for example a semiconductor material, an oxide or a glass, a nitride, a fluoride, a chalcogenide. organic or a compound obtained by sol-gel route from mineral or organometallic compounds.
  • the plane mirror 22 is made of silicon.
  • the plane mirror 22 comprises at least one metallic layer deposited on the support and for example aluminum, gold, silver or chrome.
  • Metallic mirrors are generally completely opaque in the visible range of the light spectrum.
  • this plane mirror comprises at least two layers of oxides such as, for example, SiO2 and TiO2.
  • TiO2 can be replaced by Nb2O5, Ta205 or Hf2O5.
  • the plane mirror 22 comprises at least one layer of SiO2 and at least one layer of amorphous silicon.
  • the determination of the thicknesses of the bands 16 leading to constructive and destructive interference respectively must take account of the length of penetration (and therefore of the phase change at reflection) of the excitation or fluorescence at the length of wave considered in the mirror 22, as well as the reflectivity of this mirror and the index of the transparent layer 12.
  • the mirror 22 can for example be a dielectric mirror (Bregg mirror), well known to those skilled in the art, characterized by a reflectivity greater than 70% and by a Bragg wavelength (on which the Bragg mirror is centered).
  • the Bragg mirror can thus be centered on the excitation wavelength or on the emission wavelength of a type of chromophoric element or else on a wavelength intermediate between these wavelengths .
  • the Bragg mirror can be centered around 655nm.
  • the mirror can be centered on an intermediate wavelength between the emission and / or excitation wavelengths of the different types of chromophores.
  • the length of centering wave of the mirror can be chosen at 605nm.
  • a stack of the dielectric layers Si02 and TiO2 or else SiO2 and Nb205 is used, having particularly high index differences.
  • the reflective layer 22 is an optical microcavity which comprises two mirrors (dielectric or metallic) separated by a transparent layer ("the cavity") having an optical thickness 2 * n * ⁇ c / 4, where n is an integer and the wavelength ⁇ c is chosen in the spectral range where the reflectivity of the two mirrors is high.
  • the structuring of the device can be obtained for example by the modulation of the thickness between different zones of the transparent layer covering the stack or else by the modulation of the thickness of the layer of the cavity.
  • the reflective layer 22 is a structure with multiple optical microcavities, for example having three mirrors and two cavities.
  • Bragg mirrors or microcavity structures are generally semi-transparent stacks in the visible range of the spectrum.
  • the signals which can be picked up above the zones of different thicknesses of a range 14 have been shown diagrammatically in FIG. 7, the intensity I being represented on the ordinate and a dimension in the plane in the layer 12 being represented by abscissa.
  • the curve of FIG. 7 comprises a first part 24 of minimum intensity corresponding to a destructive interference effect, a part 26 of maximum intensity corresponding to a constructive interference effect, and a part 28 of average intensity which corresponds for example to the signal which would be obtained in the absence of plane mirror 22, that is to say say in the absence of any interference phenomenon.
  • a variant of the invention consists in structuring the mirror 22 into zones by eliminating the reflective layer in certain zones, that is to say by creating orifices in this layer.
  • pairs of signals 26 and 28, or else 24 and 28, will be used as modulation of the signal to be detected, depending on the thickness chosen for layer 12, with a flat upper face.
  • FIG. 8 shows an alternative embodiment of the invention, in which a set of photodetectors 30 of the CCD type or the like is located under the support 10, on the face opposite to that which carries the chromophoric elements C.
  • This embodiment has the advantage of not requiring an image forming objective on the photodetectors 30.
  • the different layers (transparent, reflective and / or absorbent) of the support can be deposited on a matrix of CCD elements.
  • the emission of fluorescence downwards towards the photodetectors 30 is modulated by the same interference effects as those described above, but the amplitude of these effects is determined by a different physical mechanism and is in lower general: this is multi-wave interference linked to the fact that the layer
  • the layer 12 forms a weakly resonant cavity, one of the mirrors of which is formed by the diopter with the air or the surrounding medium on the upper surface of the layer 12 and the other mirror of which is formed of a layer 32 which is semi reflecting at the fluorescence wavelength which it is desired to detect and which is very reflecting for the excitation wavelength of the chromophoric elements.
  • the strength of the resonance of such a cavity and the amplitude of the modulation of the collected fluorescent signals are all the stronger the higher the product of the amplitude reflectivities of the two mirrors. It is therefore advantageous to use an upper layer 12 of high index, for example of TiO2 having an index of between 2.2 and
  • the amplitude reflectivity of the TiO2 / air diopter is approximately 0.4.
  • the radiative emission towards the medium on which the chromophoric elements are found is all the more favored the higher the index of this medium.
  • a photodetector 30 is located under each zone or strip 16 of height different from a range 14. It is therefore known directly which photodetector 30 is located opposite a particular zone or strip 16 corresponding to a maximum or a minimum resignation. Of course, several photodetectors 30 can be provided under each zone or strip 16 of different height.
  • the upper layer 12 of transparent material has a flat upper surface and the mirror 22 is formed on a structured upper face 34 of the support 10.
  • the abrupt discontinuities between the zones can form parasitic channels for the excitation wavelengths and possibly for the fluorescence emitted.
  • a more continuous variation (with a triangular or wavy profile for example) of the thickness of the substrate overcomes this drawback.
  • the zones are defined by the fact that the desired interference condition is substantially achieved there.
  • the substrate 10 of the device comprises a plane mirror 22 and a planar upper layer 12 ′ , with an intermediate layer 35 of different index, which is structured with zones of different thickness, corresponding to the zones 16 above and giving rise to variations in intensity of fluorescence by phase shift.
  • the device comprises one or more upper layers deposited on a transparent intermediate layer 37 to form a waveguide 36 for the excitation radiation, for example with propagation along the above-mentioned bands formed by the mirror 22, so as not to bring out the excitation radiation by the discontinuities between bands and diffuse it undesirably towards the photodetectors. It is also possible, to avoid this drawback, to give a sufficiently large thickness to the layer of material which covers the structured mirror 22, which makes it possible to distance the profile of the guided mode and its evanescent part of the structured surface of the mirror 22.
  • Another variant of the invention consists in depositing in holes formed in the mirror 22 at least one layer of another material, reflecting, transparent or else absorbent.
  • a variant of the invention consists in structuring in zones not the transparent layer carrying the chromophoric elements but the intermediate layer 37 by changing its thickness or even eliminating it in certain zones (FIG. 11B).
  • the orifices thus created can then be deposited in a transparent layer 37 ′ of a material other than that of the layer 37 in which the orifices were created (FIG. 11C).
  • the device comprises an opaque layer 38, 40 respectively, for example metallic, which limits to the useful surfaces (corresponding to the areas 14) the lighting by the excitation radiation or the transmission of fluorescence towards photodetectors.
  • this opaque layer 38 covers the layer 12 of transparent material and has orifices corresponding to the pads 14.
  • this opaque layer 38 is inside the layer 12, between the upper face of the latter and the reflective layer 22 and its orifices are aligned with the pads 14 or with the aforementioned zones 16.
  • the opaque layer 40 is located inside the substrate 10 and has orifices facing the photodetectors 30 fixed under the substrate.

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Abstract

Dispositif de support d'éléments chromophores, comprenant un miroir plan recouvert d'une couche (12) de matière transparents aux longueurs d'ondes à détecter, cette couche (12) comportant un ensemble de plage (14) sur lesquelles sont fixés les éléments chromophores, les plages (14) étant subdivisées en une pluralité de zones (20) d'épaisseurs différentes permettant de faire varier, par interférence destructive ou constructive respectivement, l'intensité de la fluorescence émise par les éléments chromophores.

Description

DISPOSITIF DE SUPPORT D'ELEMENTS CHROMOPHORES
L'invention concerne un dispositif de support d'éléments chromophores.
Dans les dispositifs de ce type, qui sont communément appelés "biopuces", les éléments chromophores sont des molécules chimiques ou biologiques qui sont en général fixées sur un substrat après une réaction d'hybridation ou d'affinité dans un liquide, ou bien des éléments colorants ajoutés ou greffés à ces molécules ou certains types de nanostructures sémi-conductrices tels que des fils ou des ' boîtes quantiques, chaque élément chromophore étant propre à émettre de la lumière spontanément (il s'agit de la ou bio- ou chémiluminescence) ou en réponse à une excitation lumineuse (il s'agit de fluorescence) sur une longueur d'onde déterminée qui dépend de la nature de cet élément chromophore.
Des dispositifs de support d'éléments chromophores sont décrits notamment dans la demande WO-A-02/16912 aux noms de Claude WEISBUCH et Henri BENISTY et comprennent des moyens permettant de renforcer l'intensité lumineuse d'excitation des éléments chromophores et d'augmenter l'intensité lumineuse émise par ces éléments, par des effets d'interférence produits par des empilements de couches de matières judicieusement choisies et par des effets d'extraction de la lumière guidée par des structures latérales ayant des dimensions du même ordre de grandeur que la longueur d'onde de la lumière guidée, telles notamment que des cristaux photoniques.
Dans ces biopuces, les éléments chromophores sont fixés sur des plages du substrat (appelées "spots" en terminologie anglaise) séparées les unes des autres et disposées régulièrement, notamment en rangées et en colonnes. Ces plages ont des dimensions, par exemple de quelques dizaines ou centaines de μm environ, qui sont nettement supérieures aux longueurs d'ondes considérées.
Les plages où les éléments chromophores se fixent par exemple lors de l'étape d'hybridation sont délimitées par exemple par une technique de dépôt du type "spotting" qui comprend un traitement physicochimique de la surface du substrat global, le "spot" étant alors déterminé par l'aire mouillée par le dépôt fluide, ou par un traitement spatial sélectif par exemple par silanisation sélective, le "spot" étant déterminé par ce traitement. Les plages peuvent comprendre des éléments chromophores de types différents, en général deux, par exemple Cy3 et Cy5 qui émettent sur des longueurs d'ondes différentes. Les signaux émis sont captés par des photodétecteurs appropriés, notamment par des barrettes ou des matrices de photodétecteurs du type CCD qui captent également un bruit de fond global formé par une lumière d'excitation incomplètement filtrée, par une fluorescence provenant d'éléments chromophores de plages voisines selon des rayons rasants ou guidés, etc., ce bruit de fond étant difficile à éliminer avec précision pour chaque longueur d'onde considérée et pouvant représenter une part importante de l'intensité des signaux captés. La lecture de l'information portée par la lumière émise par les chromophores peut se faire, en fonction du type d'appareillage utilisé, sur une face ou sur l'autre du support.
La mesure peut se faire sur matériel biologique séché ou bien en phase liquide, pour laquelle les éléments chromophores portant l'information sont ceux spécifiquement accrochés sur des plages du support, le liquide comportant dans son volume une certaine quantité de chromophores en suspension non informatifs et formant une source de bruit de fond aux longueurs d'ondes d'émission des chromophores ainsi que des particules diffusantes, également sources de bruit de fond. La présente invention a notamment pour but d'apporter une solution simple et efficace au problème de la détermination et de l'élimination de ce bruit de fond.
L'invention a aussi pour but d'optimiser la structure du substrat pour son utilisation à plusieurs longueurs d'ondes différentes correspondant à des types de chromophores différents.
Elle a en particulier pour objet un dispositif de support d'éléments chromophores, qui permette une détermination fiable, précise et automatique du bruit de fond précité. Elle propose, à cet effet, un dispositif de support d'éléments chromophores propres à émettre une lumière par chémiluminescence ou par fluorescence en réponse à une excitation lumineuse, la longueur d'onde émise par chaque élément chromophore dépendant de la nature de cet élément, ces éléments chromophores étant fixés sur des plages séparées les unes des autres, caractérisé en ce que la surface du support est structurée en plusieurs zones présentant des propriétés optiques différentes en amplitude et en phase de la réflectivité et en transmission, ces propriétés résultant de la présence ou de l'absence, sur les zones du substrat, d'au moins un ensemble de couches choisies parmi les suivantes :
- au moins une couche formant miroir à réflexion totale ou partielle,
- au moins une couche absorbant de manière au moins partielle au moins une des longueurs d'onde d'émission et/ou d'excitation, - au moins une couche transparente à toutes les longueurs d'ondes d'émission et d'excitation, lesdites couches étant déterminées pour produire au moins l'un des effets suivants :
- une interférence destructive ou constructive à au moins une longueur d'onde d'émission, pour générer des valeurs différentes d'intensité de lumière émise par les éléments chromophores, - une interférence destructive ou constructive à au moins une longueur d'onde excitation pour générer des valeurs différentes d'intensité de fluorescence émise par les éléments chromophores,
- une absorption sur l'excitation et/ou l'émission, pour générer des valeurs différentes d'intensité lumineuse transmise par le substrat.
Le dispositif selon l'invention comporte donc des environnements optiques différents, qui vont mélanger de manière différente le signal utile avec le bruit de fond, ce qui permet, grâce à un traitement numérique approprié, de reconstituer le signal utile. Par exemple, pour une longueur d'onde donnée, un premier type de zone peut produire la mesure
Mesure (1 ) = ai «Signal+b1 «bruit (A) alors qu'un second type de zone produira la mesure
Mesure (2) = a2vSignal+b2»bruit (B) les coefficients ai et b1 étant les paramètres de transfert de la zone 1 à la longueur d'onde considérée, a2 et b2 étant ceux de la zone 2. Ces paramètres sont connus par construction ou bien par étalonnage. Il suffit ensuite de résoudre le système des deux équations à deux inconnues (A, B) pour en déduire les valeurs recherchées "Signal" et "bruit". On peut faire varier la valeur des coefficents ai et a2 en utilisant par exemple des couches amplificatrices pour la lumière émise et/ou la lumière d'excitation, comme décrit dans la demande WO-A-02/16912 aux noms de Claude WEISBUCH et Henri BENISTY, sur la base d'effets d'interférences destructives ou constructives.
La reconstruction du signal est simplifiée notamment dans les cas : • d'une structure pour laquelle ai s'annule ; dans ce cas la résolution du système de deux équations à deux inconnues (A, B) devient particulièrement simple. • quand b1 = b2=1 : dans ce cas, le bruit est éliminé en soustrayant (B) de (A). Les dimensions de ces zones peuvent selon les applications être supérieures, inférieures ou égales à celles des plages précitées. Dans le cas où la zone est plus petite que la plage, la résolution du système Signal-Bruit se fait localement sur une même plage comprenant les différentes zones. Dans le cas contraire, la résolution du système Signal-Bruit se fait en comparant les mesures effectuées sur différentes plages situées sur différentes zones.
Dans le cas d'une mesure à travers le support, on peut rajouter un paramètre qui est l'absorption aux diverses longueurs d'ondes. En général, le bruit de fond correspondant à la phase liquide peut avoir une intensité du même ordre de grandeur que celle du signal utile, voire supérieure. C'est une des raisons pour lesquelles des mesures en présence de la phase liquide ne se font habituellement pas. L'invention permet de résoudre efficacement ce problème, ce qui représente dans ce cas plus qu'une simple amélioration de performances et correspond à un nouveau type de mesure et d'appareillage. Cette solution permet, par ailleurs, de fournir une résolution temporelle à la mesure puisque le processus d'accrochage ou d'hybridation des éléments chromophores peut ainsi être analysé tout au long de son déroulement. La structuration du support peut être réalisée par des techniques habituelles de lithographie lift-off et/ou de gravure sèche ou humide. Ces techniques permettent notamment de créer des orifices dans une ou plusieurs couches. Par la suite, il est possible de déposer dans ces orifices une ou plusieurs couches de matériaux différents de ceux des couches dans lesquelles les orifices ont été réalisés. Un mode de réalisation particulier correspond à une structuration relativement simple (pas de couche d'absorption) réalisée par une modulation de l'épaisseur d'une couche transparente située au-dessus d'une couche réfléchissante. De plus, on peut simplier la reconstitution du signal en réalisant une structure ou une type de zone dans laquelle le signal utile s'annule (a1=0). Dans ce mode de réalisation, le dispositif comprend un miroir plan recouvert d'une couche de matière transparente aux longueurs d'ondes émises et sur laquelle les éléments chromophores sont répartis en plages séparées les unes des autres et ayant des dimensions latérales supérieures aux longueurs d'ondes de la fluorescence émise, caractérisé en ce que ladite couche de matière transparente a une épaisseur du même ordre de grandeur que les longueurs d'ondes de la fluorescence émise et comprend, pour chaque plage d'éléments chromophores, au moins deux zones ayant des épaisseurs différentes, l'épaisseur d'une première de ces zones étant déterminée pour générer par un phénomène d'interférence destructive un minimum d'intensité de la fluorescence émise sur une longueur d'onde par des éléments chromophores de ladite zone.
Dans ce dispositif, si l'épaisseur de la première zone est correctement réglée, la fluorescence émise à la surface de cette zone est à une valeur minimale qui est nulle ou sensiblement nulle. En conséquence, le signal lumineux capté à la surface de cette zone représente le bruit global à la longueur d'onde considérée.
L'annulation de la fluorescence dans la zone précitée est due :
- soit à un trajet optique aller-retour jusqu'au miroir, qui est égal à un multiple impair de la demi-longueur d'onde de la fluorescence émise, en tenant compte du déphasage à la réflexion sur le miroir et/ou de la pénétration de l'onde dans le miroir,
- soit à un trajet optique sur un aller-retour jusqu'au miroir, qui est égal à un multiple impair de la demi-longueur d'onde d'excitation, en tenant compte du déphasage à la réflexion sur le miroir et/ou de la pénétration de l'onde dans le miroir,
- soit à une combinaison des deux cas mentionnés ci-dessus,
- soit, quand les deux conditions ci-dessus sont proches et correspondent à des épaisseurs qui diffèrent typiquement de moins de 30 nm, à une condition quelconque intermédiaire entre les deux conditions ci-dessus. Les deux effets peuvent aussi coïncider si l'angle d'incidence de la lumière d'excitation est choisi à cet effet.
Selon une autre caractéristique de l'invention, la couche de matière transparente comporte, au moins une autre zone ayant une épaisseur différente de celle de la première zone, telle que la différence des chemins optiques dans ces deux zones pour une longueur d'onde considérée est égale à environ un multiple impair du quart de cette longueur d'onde. Cette zone permet une amplification maximale de la fluorescence émise. La longueur d'onde considérée pour la détermination de la différence d'épaisseur entre les deux zones peut être, comme indiqué ci- dessus, soit la longueur d'onde de la fluorescence émise, soit la longueur d'onde d'excitation, soit à la fois la longueur d'onde de la fluorescence émise et la longueur d'onde d'excitation (pour obtenir sur ladite autre zone un maximum d'intensité d'excitation et un maximum d'intensité de fluorescence émise), soit encore une condition intermédiaire quand les épaisseurs des deux zones calculées pour les deux longueurs d'onde sont très' proches l'une de l'autre.
La fluorescence émise par ladite autre zone ayant alors une intensité maximale ou voisine d'une valeur maximale, le signal lumineux capté à la surface de cette autre zone correspond à la somme de l'intensité maximale de la fluorescence émise à la première longueur d'onde sur la surface de cette autre zone et du bruit de fond global. En soustrayant de ce signal le bruit de fond que l'on a obtenu par captation du signal à la surface de la première zone, on obtient une valeur d'intensité correspondant approximativement à l'intensité maximale de la fluorescence émise, sur la première longueur d'onde, à la surface de ladite autre zone.
Selon d'autres caractéristiques de ce mode de réalisation qui visent à généraliser les caractéristiques précitées : - la couche de matière transparente comporte, pour chaque plage d'éléments chromophores, une pluralité de zones précitées d'épaisseurs différentes, permettant d'échantillonner entre une valeur minimale et une valeur maximale l'intensité de la fluorescence émise sur ladite première longueur d'onde par des éléments chromophores de ladite plage, - la couche de matière transparente comporte, pour chaque plage d'éléments chromophores, une pluralité de zones précitées d'épaisseurs différentes, permettant de faire varier l'intensité de la fluorescence émise sur des longueurs d'ondes différentes par des éléments chromophores de types différents de ladite plage. Ainsi, avec une série de zones d'épaisseurs différentes connues dans chaque plage d'éléments chromophores, on peut disposer d'une combinaison linéaire des signaux significatifs émis par les différents éléments chromophores présents et du bruit de fond.
Selon encore d'autres caractéristiques de l'invention, lesdites zones sont agencées en lignes ou en bandes parallèles à la surface de ladite couche de matière transparente.
En variante, ces zones peuvent avoir une disposition matricielle en lignes et en colonnes à la surface de la couche de matière transparente. Celle-ci comporte alors, sur toute sa surface, une pluralité de zones d'épaisseurs différentes à répartition de préférence régulière qui forment une structure du type pavage ou analogue.
En variante, ces zones de hauteur différentes peuvent être formées sur la couche réfléchissante précitée ou sur une couche intermédiaire d'indice différent interposée entre la couche transparente et la couche réfléchissante.
Les moyens de captation de la fluorescence émise par les éléments chromophores peuvent se trouver au-dessus du dispositif de support de ces éléments chromophores, ou bien au-dessous, comme déjà décrits dans la demande internationale précitée WO-A-02/16912. Dans ce cas, ces moyens de captation peuvent comprendre une matrice de photodétecteurs du type CCD ou CMOS qui est fixée sous le dispositif, celui-ci comprenant une première couche de matière hautement réfléchissante à la longueur d'onde d'excitation et une seconde couche de matière absorbant sélectivement la radiation d'excitation, la première couche étant déposée sur la seconde, de telle sorte que la fluorescence émise parvienne aisément aux détecteurs, mais non la radiation d'excitation. La réflexion de la radiation d'excitation sur la première couche peut alors assurer, éventuellement, l'effet précité de renforcement de la fluorescence émise.
Il se forme une cavité faiblement résonante entre le dïoptre à la surface supérieure de la couche portant les éléments chromophores et ladite première couche réfléchissante (à la longueur d'onde d'excitation) lorsque celle-ci a aussi une réflectivité non négligeable à la longueur d'onde de la fluorescence émise. Cet effet peut être mis à profit pour augmenter l'intensité de la fluorescence canalisée vers les photodétecteurs.
De préférence, la couche supérieure de ce dispositif est en une matière à indice de réfraction élevé. Cela favorise la formation de ladite cavité faiblement résonante et donc une bonne détection de la fluorescence par les photodétecteurs fixés sous le dispositif.
Il est de plus connu que l'émission radiative vers le milieu sur lequel est posé un élément chromophore est favorisée d'autant plus que l'indice de ce milieu est élevé.
Par ailleurs, en faisant varier entre les différentes zones le niveau d'absorption de la lumière d'excitation (par variation de l'épaisseur et/ou du coefficient d'absorption de la couche absorbante) on peut aussi améliorer la précision de la mesure réalisée suite à la résolution du système d'équations (A) et (B) précitées.
Par exemple, on peut réaliser un support d'éléments chromophores fonctionnant par transmission avec une couche absorbante structurée de façon à avoir deux types de zones aux dimensions inférieures à celles des plages d'éléments chromophores, et tels que la transmission de la lumière d'excitation est deux fois plus élevées sur un premier type de zone que sur le second. En même temps, le dispositif peut être conçu pour avoir le même niveau de signal utile sur les deux types de zone. Par ailleurs, nous supposons ici que le bruit de fond à la longueur d'onde d'émission est négligeable. Dans ce cas, le système d'équations (A) et (B) précitées s'écrit comme suit :
Mesure (1 ) = a*Signal + 2*bruit (exe.)
Mesure (2) = a*Signal + bruit (exe.) Le signal utile débarrassé du bruit dû à la lumière d'excitation peut être aisément trouvé en soustrayant la mesure effectuée sur le premier type de zone du double de la mesure effectuée sur le second :
A*Signal = 2*Mesure (2) - Mesure (1 )
Quand on travaille sur deux longueurs d'ondes simultanément et si l'on n'a que deux types de zones différentes (ce qui est la solution la plus simple à réaliser de manière industrielle), on peut choisir deux types d'architecture simple, présentant chacun ses avantages.
Une zone maximise l'émission d'un premier type de chromophore et l'autre zone minimise cette émission. Dans ce cas, le premier type de chromophore est traité de manière ciblée, le second type de chromophore étant traité de manière générique ; ou une zone maximise l'émission d'un premier chromophore et l'autre zone maximise l'émission d'un second type de chromophore. Dans ce cas, les deux types de chromophores sont traités de manière ciblée pour le signal, le bruit étant traité de manière générique.
L'invention s'applique également aux composés chémiluminescents. Dans ce cas, la structuration de la surface du support ne prend en compte que les longueurs d'onde d'émission.
L'invention s'applique par ailleurs aussi au format des micro- plaques (format "SBS") (par exemple de 24, 96, 384 ou 1536 puits), la structuration de la surface du support étant alors adaptée à la géométrie des puits des micro-plaques de façon à présenter une ou plusieurs zones par puits.
Dans une réalisation, le support structuré constitue le fond commun à tous les puits d'une microplaque. Dans une autre réalisation, des supports individuels sont déposés au fond de chaque puits d'une microplaque monolithique.
L'invention s'applique aussi aux micro-plaques au format des lames de microscope avec des micro-puits réalisés par dépôt d'une couche d'une épaisseur de plusieurs dizaines de microns avec des orifices formant ces puits (par exemple traitement HTC de type "Teflon" marque Cel-Line commercialisé par Erie Scientific Corp., Portsmouth, NH). Les différents puits peuvent être utilisés comme des zones d'hybridation séparées destinées à des échantillons de tests différents.
Dans ces applications, le fond de chaque puits peut comprendre une ou plusieurs plages où sont fixés les éléments chromophores.
L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 est une représentation schématique de dessus d'une partie d'un dispositif selon l'invention ;
- la figure 2 est une vue partielle à plus grande échelle de la figure 1 ; - les figures 3A, 3B et 3C sont des vues correspondant à la figure 2, pour des variantes de réalisation de l'invention ;
- la figure 4 est une vue partielle schématique en perspective une autre variante de réalisation ;
- les figures 5A et 5 B sont des vues schématiques partielles en coupe de deux modes de réalisation d'un dispositif selon l'invention ; - la figure 6 est une vue à plus grande échelle d'une partie de la coupe représentée en figure 5A ;
- la figure 7 est un graphe représentant schématiquement les intensités de la fluorescence émise à la surface de trois zones différentes du dispositif de la figure 6 ;
- les figures 8 à 13 sont des vues schématiques en coupe d'autres variantes de réalisation du dispositif selon l'invention.
Le dispositif représenté schématiquement en figure 1 comprend un support 10 de forme générale rectangulaire, dont la face supérieure 12 comporte une pluralité de plages 14 sur lesquelles sont fixés des éléments chromophores, ces plages 14 formant un ensemble où elles sont réparties de façon régulière en lignes et en colonnes par exemple.
Typiquement, les dimensions des plages 14 (leur diamètre d) sont de l'ordre de 30 à 400 μm, et l'entraxe D entre plages adjacentes est de l'ordre de 40 à 500 μm. Comme indiqué plus haut, les dimensions des plages sont déterminées par un dépôt de fluide ou par un traitement spatial sélectif.
Le support peut être réalisé en verre, en silicium, en carbure de silicium, en saphir (AI203), en métal ou en plastique. La partie supérieure du support 10 comprend une couche 12 d'une matière qui est transparente aux longueurs d'ondes de la fluorescence émise par les éléments chromophores des plages 14 en réponse à une excitation lumineuse, la couche 12 comprenant au moins de matière diélectrique telle par exemple qu'une matière semi-conductrice, un oxyde, un verre, un nitrure, un fluorure, un chalcogénure, un polymère organique ou un composé minéral ou organométallique obtenu par voie sol- gel. Cette matière a de préférence un indice de réfraction relativement élevé et est par exemple formée de TiO2 ayant un indice de réfraction compris entre 2,2 et 2,5 selon la forme cristalline utilisée. En variante, la couche 12 est en Si02 pour optimiser la qualité de la fonctionnalisation chimique de la surface du support. La couche transparente (12) peut être également réalisée en polymère organique avec une surface plane ou rugueuse (effet "3-D"). Dans le dernier cas, l'effet 3-D augmente la surface effective du dispositif. La couche transparente (12) peut être également poreuse. Cette couche 12 a une épaisseur qui est du même ordre de grandeur que les longueurs d'ondes de la fluorescence émise par les éléments chromophores et recouvre un miroir plan pouvant être réfléchissant pour la longueur d'onde d'excitation, ce miroir plan étant surtout réfléchissant pour les longueurs d'onde de la fluorescence émise. La surface libre ou surface supérieure de la couche 12 est structurée par exemple comme représenté schématiquement dans les figures 2, 3 et 4.
En figure 2, cette couche 12 comporte une pluralité de bandes parallèles 16 d'épaisseurs différentes, ces bandes ayant une largeur dans le plan de la couche 12 qui est supérieure aux longueurs d'ondes de la fluorescence émise par les éléments chromophores et inférieure aux dimensions dans le plan des plages 14. Les épaisseurs des différentes bandes 16 sont déterminées pour que l'une de ces épaisseurs produise, dans chaque plage 14, un effet d'interférence destructive à la surface de la couche 12 pour une longueur d'onde d'excitation et/ou pour une longueur d'onde donnée de la fluorescence émise par les éléments chromophores. Les autres bandes 16 ont des épaisseurs différentes dont l'une correspond à un effet d'interférence constructive à la surface supérieure de la couche 12, pour la longueur d'onde d'excitation et/ou pour la longueur d'onde de la fluorescence émise. Les bandes 16 d'épaisseurs différentes sont formées en alternance dans la couche 12, leurs épaisseurs étant déterminées pour produire les effets précités d'interférence destructive et d'interférence constructive pour une ou de préférence pour plusieurs longueurs d'ondes émises par les différents éléments chromophores présents dans les plages 14 et/ou pour les longueurs d'onde d'excitation correspondantes. On peut donc, considérant une longueur d'onde donnée émise par des éléments chromophores d'une plage 14, déterminer deux épaisseurs correspondant aux deux effets d'interférences précités et une ou plusieurs épaisseurs intermédiaires, ce qui permet d'échantillonner l'intensité lumineuse émise à cette longueur d'onde entre une valeur minimale et une valeur maximale.
On peut également déterminer d'autres épaisseurs de bandes 16 qui correspondent à des effets d'interférences destructives et constructives pour une autre ou pour plusieurs autres longueurs d'ondes émises par les éléments chromophores et/ou pour les longueurs d'onde d'excitation correspondantes.
On peut encore comme représenté schématiquement en figure 3A, former dans la couche 12 des bandes 16, 18 d'épaisseurs différentes, qui s'étendent dans deux directions perpendiculaires. Les bandes 16 parallèles entre elles et d'épaisseurs différentes sont des bandes transversales, et sont coupées à angle droit par des bandes longitudinales 18, qui sont parallèles entre elles et ont des épaisseurs différentes.
On obtient alors, au niveau de chaque plage 14, une structure telle que celle qui est représentée schématiquement en perspective en figure 4 et où chaque plage 14 comprend une pluralité de plateaux 20 adjacents de forme carrée ou rectangulaire qui ont des hauteurs différentes. Les dimensions de ces plateaux 20 à la surface supérieure de la couche 12 peuvent être identiques d'un plateau à l'autre ou différentes. La structuration du support peut être également réalisée comme représenté schématiquement sur les figures 3B et 3C avec des zones 16 ayant des dimensions supérieures à celles des plages 14 d'éléments chromophores.
Comme on le voit aux figures 5 et 6, la couche 12 de matière transparente portant les éléments chromophores C est formée sur un miroir plan 22 qui est hautement réfléchissant au moins pour la fluorescence émise par les éléments chromophores. Le miroir plan est formé d'une ou plusieurs couches d'un métal réfléchissant ou d'une matière diélectrique telle par exemple qu'une matière semi-conductrice, un oxyde ou un verre, un nitrure, un fluorure, un chalcogénure.un polymère organique ou un composé obtenu par voie sol-gel à partir de composés minéraux ou organométalliques. Dans un mode de réalisation particulier, le miroir plan 22 est en silicium.
Dans une variante de réalisation, le miroir plan 22 comprend au moins une couche métallique déposée sur le support et par exemple en aluminium, en or, en argent ou en chrome. Les miroirs métalliques sont en général totalement opaques dans le domaine visible du spectre lumineux.
Dans encore une autre variante de réalisation, ce miroir plan comprend au moins deux couches d'oxydes tels par exemple que SiO2 et TiO2. Le TiO2 peut être remplacé par du Nb2O5, Ta205 ou Hf2O5. Dans une autre variante, le miroir plan 22 comprend au moins une couche de SiO2 et au moins une couche de silicium amorphe.
En pratique, la détermination des épaisseurs des bandes 16 conduisant à des interférences constructives et destructives respectivement doit tenir compte de la longueur de pénétration (et donc du changement de phase à la réflexion) de l'excitation ou de la fluorescence à la longueur d'onde considérée dans le miroir 22, ainsi que de la réflectivité de ce miroir et de l'indice de la couche transparente 12.
Le miroir 22 peut être par exemple, un miroir diélectrique (miroir de Bregg), bien connu de l'homme de métier, caractérisé par une réflectivité supérieure à 70 % et par une longueur d'onde de Bragg (sur laquelle le miroir de Bragg est centré). Le miroir de Bragg peut être ainsi centré sur la longueur d'onde d'excitation ou sur la longueur d'onde d'émission d'un type d'éléments chromophores ou bien sur une longueur d'onde intermédiaire entre ces longueurs d'onde. Par exemple, dans le cas de l'utilisation d'un chromophore Cy5 ayant un maximum d'émission à 670 nm et excité par un laser He-Ne à 633nm, le miroir de Bragg peut être centré vers 655nm. Dans le cas de l'utilisation de plusieurs types d'éléments chromophores, le miroir peut être centré sur une longueur d'onde intermédiaire entre les longueurs d'ondes d'émission et/ou d'excitation des différents types de chromophores. Par exemple, dans le cas de l'utilisation des chromophores Cy3 (l'excitation à 542 nm et l'émission vers 570 nm) et Cy5 (l'excitation à 633 nm et l'émission vers 670 nm), la longueur d'onde de centrage du miroir peut être choisie à 605nm.
Dans une réalisation préférée pour former un miroir de Bragg, on utilise un empilement des couches diélectriques Si02 et TiO2 ou bien SiO2 et Nb205, ayant des différences d'indice particulièrement élevées.
Dans une autre variante de réalisation particulièrement intéressante, la couche réfléchissante 22 est une microcavité optique qui comprend deux miroirs (diélectriques ou métalliques) séparés par une couche transparente ("la cavité") ayant une épaisseur optique 2*n*λc/4, où n est entier et la longueur d'onde λc est choisie dans la plage spectrale où la réflectivité des deux miroirs est élevée. La structuration du dispositif peut être obtenue par exemple par la modulation de l'épaisseur entre différentes zones de la couche transparente recouvrant l'empilement ou bien par la modulation de l'épaisseur de la couche de la cavité. En variante, la couche réfléchissante 22 est une structure à microcavités optiques multiples, ayant par exemple trois miroirs et deux cavités.
Les miroirs de Bragg ou les structures à microcavité sont en général des empilements semi-transparents dans le domaine visible du spectre.
On a schématisé en figure 7 les signaux que l'on peut capter au-dessus des zones d'épaisseurs différentes d'une plage 14, l'intensité I étant représentée en ordonnée et une dimension dans le plan dans la couche 12 étant représentée en abscisse. La courbe de la figure 7 comprend une première partie 24 d'intensité minimale correspondant à un effet d'interférence destructive, une partie 26 d'intensité maximale correspondant à un effet d'interférence constructive, et une partie 28 d'intensité moyenne qui correspond par exemple au signal que l'on obtiendrait en l'absence de miroir plan 22, c'est- à-dire en l'absence de tout phénomène d'interférence. Il est clair, pour l'homme du métier, que l'on peut, pour chaque longueur d'onde considérée de la fluorescence émise par des éléments chromophores, prendre en compte les valeurs minimale 24 et maximale 26 d'intensité captée et faire leur différence pour éliminer le bruit de fond global, qui comprend aussi bien un bruit local qu'un bruit d'arrière-plan qui ne provient pas de la zone considérée.
La connaissance de la structure de la couche supérieure 12, c'est-à-dire des emplacements des bandes 16 qui correspondent à des effets d'interférence destructive pour une ou plusieurs longueurs d'ondes et de ceux des bandes 16 qui correspondent à un effet d'interférence constructive pour cette ou ces longueurs d'ondes, permet de prendre en compte directement les signaux d'intensité minimale et les signaux d'intensité maximale et simplifie beaucoup l'analyse. Si l'on utilise une matrice de photodétecteurs CCD pour capter la fluorescence émise, il n'est plus nécessaire de savoir quel photodétecteur de la matrice est associé à telle ou telle zone d'une plage 14, car l'analyse de l'image elle-même, associée à la connaissance de la structure de la surface de la couche 12, permet de repérer et d'identifier les zones d'intensité minimale et maximale.
Une variante de l'invention consiste à structurer en zones le miroir 22 en supprimant la couche réfléchissante dans certaines zones, c'est-à-dire en créant des orifices dans cette couche. Dans ce cas, on utilisera des paires de signaux 26 et 28, ou bien 24 et 28, comme modulation du signal à détecter, suivant l'épaisseur choisie pour la couche 12, à face supérieure plane.
On a représenté en figure 8 une variante de réalisation de l'invention, dans laquelle un ensemble de photodétecteurs 30 du type CCD ou analogue se trouve sous le support 10, sur la face opposée à celle qui porte les éléments chromophores C. Cette réalisation présente l'avantage de ne pas nécessiter d'objectif de formation d'image sur les photodétecteurs 30. De plus, les différentes couches (transparentes, réfléchissantes et/ou absorbantes) du support peuvent être déposées sur une matrice d'éléments CCD.
Dans cette réalisation, l'émission de fluorescence vers le bas en direction des photodétecteurs 30 est modulée par les mêmes effets d'interférence que ceux décrits ci-dessus, mais l'amplitude de ces effets est déterminée par un mécanisme physique différent et est en général plus faible : il s'agit d'interférences à ondes multiples liées au fait que la couche
12 forme une cavité faiblement résonnante, dont l'un des miroirs est formé par le dioptre avec l'air ou le milieu environnant à la surface supérieure de la couche 12 et dont l'autre miroir est formé par une couche 32 qui est semi-réfléchissante à la longueur d'onde de fluorescence que l'on souhaite détecter et qui est très réfléchissante pour la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores. La force de la résonance d'une telle cavité et l'amplitude de la modulation des signaux fluorescents collectés sont d'autant plus fortes que le produit des réflectivités en amplitude des deux miroirs est élevé. Il est donc intéressant d'utiliser une couche supérieure 12 d'indice élevé, par exemple de TiO2 ayant un indice compris entre 2,2 et
2,5 suivant sa forme cristalline. La réflectivité en amplitude du dioptre TiO2/air vaut environ 0,4. En outre, il est connu que l'émission radiative vers le milieu sur lequel se trouvent les éléments chromophores est d'autant plus favorisée que l'indice de ce milieu est élevé. Ces deux effets se combinent donc et favorisent une bonne détection des signaux par les photodétecteurs 30.
Dans l'exemple représenté, un photodétecteur 30 se trouve sous chaque zone ou bande 16 de hauteur différente d'une plage 14. On sait donc directement quel photodétecteur 30 se trouve en face d'une zone ou bande 16 particulière correspondant à un maximum ou un minimum d'émission. Bien entendu, on peut prévoir plusieurs photodétecteurs 30 sous chaque zone ou bande 16 de hauteur différente.
Dans la variante de réalisation de la figure 9, la couche supérieure 12 de matière transparente est à surface supérieure plane et le miroir 22 est formé sur une face supérieure structurée 34 du support 10.
C'est cette surface 34 qui porte les zones 16, 18, 20 précédemment décrites de la couche 12 des modes de réalisation précédents.
Quand, comme représenté au dessin, l'épaisseur de la couche réfléchissante 22 est constante dans chaque zone, les discontinuités abruptes entre les zones peuvent former des canaux parasites pour les longueurs d'onde d'excitation et éventuellement pour la fluorescence émise. Une variation plus continue (à profil triangulaire ou ondulé par exemple) de l'épaisseur du substrat permet de pallier cet inconvénient. Dans ce cas, les zones sont définies par le fait que la condition d'interférence souhaitée y est sensiblement réalisée.
Dans une autre variante représentée en figure 10, le substrat 10 du dispositif comprend un miroir plan 22 et une couche supérieure plane 12', avec une couche intermédiaire 35 d'indice différent, qui est structurée avec des zones d'épaisseur différente, correspondant aux zones 16 précitées et donnant lieu aux variations d'intensité de la fluorescence par déphasage.
Dans une autre variante représentée en figure 11 A, le dispositif comprend une ou plusieurs couches supérieures déposées sur une couche intermédiaire 37 transparente pour former un guide d'onde 36 pour la radiation d'excitation, par exemple avec propagation le long des bandes précitées formées par le miroir 22, afin de ne pas faire sortir la radiation d'excitation par les discontinuités entre bandes et la diffuser de façon indésirable vers les photodétecteurs. On peut aussi, pour éviter cet inconvénient, donner une épaisseur suffisamment importante à la couche de matière qui recouvre le miroir structuré 22, ce qui permet d'éloigner le profil du mode guidé et sa partie évanescente de la surface structurée du miroir 22.
Une autre variante de l'invention consiste à déposer dans des orifices formés dans le miroir 22 au moins une couche d'un autre matériau, réfléchissant, transparent ou bien absorbant.
Une variante de l'invention consiste à structurer en zones non pas la couche transparente portant les éléments chromophores mais la couche intermédiaire 37 en changeant son épaisseur voire en la supprimant dans certaines zones (figure 11B). On peut ensuite dépose ans les orifices ainsi créés une couche transparente 37' d'un autre matériau que celui de la couche 37 dans laquelle les orifices ont été créés (figure 11C).
Dans les variantes de réalisation des figures 12 et 13, le dispositif comprend une couche opaque 38, 40 respectivement, par exemple métallique, qui limite aux surfaces utiles (correspondant aux plages 14) l'éclairage par la radiation d'excitation ou la transmission de la fluorescence vers les photodétecteurs.
En figure 12, cette couche opaque 38 recouvre la couche 12 de matière transparente et comporte des orifices correspondant aux plages 14.
En variante, cette couche opaque 38 est à l'intérieur de la couche 12, entre la face supérieure de celle-ci et la couche réfléchissante 22 et ses orifices sont alignés avec les plages 14 ou avec les zones 16 précitées. En figure 13, la couche opaque 40 se trouve à l'intérieur du substrat 10 et comporte des orifices en regard des photodétecteurs 30 fixés sous le substrat.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Dispositif de support d'éléments chromophores propres à émettre une lumière par bioluminescence ou chemiluminescence ou par fluorescence en réponse à une excitation lumineuse, la longueur d'onde émise par chaque élément chromophore dépendant de la nature de cet élément, ces éléments chromophores étant fixés sur des plages (14) de la surface du support séparées les unes des autres, caractérisé en ce que la surface du support est structurée en plusieurs zones (16) présentant des propriétés optiques différentes en amplitude et en phase de réflectivité et en transmission, ces propriétés résultant de la présence ou l'absence dans lesdites zones d'au moins un ensemble de couche choisies parmi les suivantes :
- au moins une couche formant un miroir à réflexion totale ou partielle,
- au moins une couche absorbant de manière au moins partielle au moins une des longueurs d'ondes d'émission et/ou d'excitation.
- au moins une couche transparente à toutes les longueurs d'ondes d'émission et d'excitation, lesdites couches étant déterminées pour produire au moins l'un des effets suivants :
• une interférence destructive ou constructive à au moins une longueur d'onde d'émission pour générer des valeurs différentes d'intensité de lumière émise par les éléments chromophores, • une interférence destructive ou constructive à au moins une longueur d'onde d'excitation pour générer des valeurs différentes d'intensité de fluorescence émise par les éléments chromophores,
• une absorption d'au moins une longueur d'onde d'excitation et/ou d'émission pour générer des valeurs différentes d'intensité lumineuse transmise par le substrat. 2/ Dispositif selon la revendication 1 , caractérisé en ce que lesdites zones (16) ont des dimensions, dans le plan du support, qui sont supérieures aux longueurs d'ondes émises par les éléments chromophores. 3/ Dispositif selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les zones précitées (16, 20) présentent des caractéristiques différentes (épaisseurs, amplitude et phase de la réflectivité, absorption) permettant d'obtenir au moins deux valeurs différentes, pour au moins un type d'élément chromophore, d'intensité de la fluorescence émise par les éléments chromophores sd adite plage (14) et/ou de la fluorescence transmise, et/ou de l'excitation réfléchie, et/ou de l'excitation transmise.
4/ Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que les deux valeurs différentes sont une valeur minimale et une valeur maximale d'intensité de la fluorescence émise ou de la fluorescence transmise ou de l'excitation réfléchie ou de l'excitation transmise.
5/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdits effets se produisent pour des éléments chromophores de types différents situés sur ladite plage (14).
6/ Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que chaque zone correspond à un maximum de l'intensité d'émission pour une longueur d'onde de fluorescence déterminée, correspondant à un type donné d'élément chromophore.
Il Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les plages (14) sont agencées en lignes et/ou colonnes sur ledit support.
8/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites zones sont agencées en lignes (16) et/ou en colonnes (18) sur ledit support.
9/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les zones (20) forment une structure régulière telle par exemple qu'un pavage. 10/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites zones (16) ont des dimensions dans le plan qui sont supérieures à celles desdites plages (14).
11/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites zones (16) ont des dimensions dans le plan inférieures ou égales à celles desdites plages (14).
12/ Dispositif selon l'une des revendications 9 à 10, caractérisé en ce que le support est en verre, en silicium, en carbure de silicium, en saphir (AI203), en métal ou en plastique. 13/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, comprenant une couche réfléchissante (22) recouverte d'une couche (12) de matière transparente aux longueurs d'ondes émises par les éléments chromophores, caractérisé en ce que ladite couche (12) de matière transparente comprend, au moins deux zones (16) ayant des épaisseurs différentes, les épaisseurs de ces zones étant déterminées pour générer, par interférence optique constructive ou destructive, des valeurs différentes d'intensité de fluorescence émise par des éléments chromophores se trouvant sur la plage (14).
14/ Dispositif selon la revendication 9, caractérisé en ce que ladite couche (12) de matière transparente comporte au moins deux types de zones (16) ayant une épaisseur différente telles que la différence des chemins optiques dans ces zones est égale à un multiple impair du quart de la longueur d'onde d'émission d'au moins un type d'éléments chromophores et/ou d'une longueur d'onde d'excitation correspondante. 15/ Dispositif selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend un miroir de Bragg centré sur une longueur d'onde d'excitation, sur une longueur d'onde d'émission ou sur une longueur d'onde intermédiaire entre les longueurs d'onde d'excitation et d'émission d'au moins un type d'élément chromophore, ou sur une longueur d'onde intermédiaire entre les longueurs d'onde d'émission ou d'excitation de différents types d'éléments chromophores. 16/ Dispositif selon la revendication 13 ou 14, caractéisé en ce que la couche réfléchissante comprend au moins une microcavité optique formée d'une couche transparente intercalée entre deus couches réflchissantes et ayant une épaisseur optique égale à un multiple pair du quart d'une longueur d'onde considérée pour laquelle la réflectivité des deux couches réfléchissantes précitées est élevée.
17/ Dispositif selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend un miroir (22) formé d'au moins une couche de matière réfléchissante aux longueurs d'ondes émises par les éléments chromophores, par exemple de métal réfléchissant, ou d'une ou plusieurs couches de matière diélectrique telle par exemple qu'une matière semi-conductrice, un oxyde, un verre, un nitrure, un fluorure, un chalcogénure, un polymère organique ou un composé minéral ou organométallique obtenu par voie sol-gel. 18/ Dispositif selon l'une des revendications 13 à 17 caractérisé en ce que le miroir (22) est entièrement opaque dans le domaine visible du spectre.
19/ Dispositif selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que le miroir (22) est semi-transparent dans le domaine visible du spectre.
20/ Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que la couche réfléchissante (22) est en silicium .
21/ Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que le miroir plan (22) comprend une ou plusieurs couches métalliques par exemple d'aluminum, de chrome, d'argent ou d'or.
22/ Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que la couche réfléchissante (22) comprend au moins deux couches d'oxydes par exemple de Si02 , Ti02, Nb205, Ta205 ou Hf02.
23/ Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que le miroir plan (22) comprend au moins deux couches diélectriques par exemple Si02 et Si3N4. 24/ Dispositif selon la revendication 17, caractérisé en ce que le moiroir plan (22) comprend au moins deux couches de Si02 et de silicium amorphe.
25/ Dispositif selon des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche transparente (12) comprend au moins une couche de matière diélectrique telle par exemple qu'une matière semi- conductrice, un oxyde, un verre, un nitrure, un fluorure, un polymère organique ou un composé minéral ou organométallique obtenu par voie sol- gel. 26/ Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que la couche transparente portant les éléments chromophores est en Si02.
27/ Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que la couche transparente portant les éléments chromophores est en un polymère organique. 28/ Dispositif selon la revendication 25, caractérisé en ce que la surface de ladite couche transparente est rugueuse avec une rugosité inférieure à la longueur d'onde considérée.
29/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est associé à des moyens de captation des signaux lumineux émis par les éléments chromophores et à des moyens d'élimination d'un bruit de fond par traitement numérique des signaux lumineaux captés à deux niveaux différents d'intensité, pour une longueur d'onde donnée.
30/ Dispositif selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'au moins une des zones correspond à une interférence destructive, annulant le signal lumineux émis dans ladite zone.
31/ Dispositif selon la revendication 29 ou 30, caractérisé en ce que les moyens de captation sont en regard de la couche (12) de matière transparente. 32/ Dispositif selon la revendication 29 ou 30, caractérisé en ce que les moyens de captation sont du côté opposé à la couche (12) de matière transparente et comprennent une matrice de photodétecteurs (30) du type CCD ou CMOS fixée sous le dispositif, celui-ci comprenant une couche (32) de matière réfléchissante à la longueur d'onde d'excitation et une couche de matière absorbante à cette longueur d'onde d'excitation. 33/ Dispositif selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'une cavité faiblement résonante est formée entre ladite couche réfléchissante (32) et le dioptre à la surface supérieure de la couche (12) portant les éléments chromophores.
34/ Dispositif selon la revendication 32 ou 33, caractérisé en ce que ladite couche réfléchissante (32) comporte une pluralité de couches déposées sur une pluralité de couches de matière absorbant sélectivement la longueur d'onde d'excitation.
35/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes 13 à 34, caractérisé en ce que la couche supérieure (12) du substrat est en une matière à indice de réfraction élevé, telle par exemple que du Ti02.
36/ Dispositif selon l'une des revendications 13 à 35, caractérisé en ce que lesdites zones (16) sont formées par des variations de l'épaisseur de la couche transparente (12) portant les éléments chromophores ou de la couche réfléchissante (22) précitée ou d'une couche intermédiaire (35) d'indice différent entre la couche transparente et la couche réfléchissante.
37/ Dispositif selon l'une des revendications 13 à 35, caractérisé en ce que lesdites zones (16) sont formées par des variations de la hauteur du miroir (22) précité, la surface de la couche transparente (12) étant sensiblement plane.
38/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites zones (16) sont formées dans la couche transparente (12) ou dans une couche intermédiaire (37) ou dans la couche réfléchissante (22) ou sont formées par des orifices de ces couches. 39/ Dispositif selon la revendication 38, caractérisé en ce que dans lesdits orifices sont déposées une ou plusieurs couches d'un ou de matériaux différents de ceux des couches (12, 22, 37) dans lesquelles sont formés les orifices.
40/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une couche supérieure formant un guide d'onde (36) pour la radiation d'excitation.
41/ Dispositif selon l'une des revendications 32 à 40, caractérisé en ce qu'il comprend une couche opaque, par exemple métallique, comportant des ouvertures correspondant aux plages précitées ou aux photodétecteurs (30) fixés sous le substrat (10) ou aux zones (16) précitées.
42/ Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est réalisé au format de micro-plaques connues comportant une pluralité de puits, la surface du support étant structurée de façon à présenter une ou plusieurs zones précitées par puits. 43/ Dispositif selon l'une des revendications 1 à 41 , caractérisé en ce que la surface structurée du support est recouverte d'une couche de matière ayant une épaisseur de plusieurs dizaines de microns, comportant des orifices formant des micro-puits destinés à recevoir des échantillons. 44/ Utilisation d'un dispositif selon l'une des revendications précédentes dans un milieu liquide contenant des éléments chromophores en suspension et des particules diffusantes qui génèrent un bruit de fond, l'épaisseur du milieu liquide au-dessus du dispositif étant supérieure aux longueurs d'onde considérées, ce dispositif portant des éléments chromophores fixés sur les plages précitées et émettant des signaux lumineux qui sont captés et séparés du bruit de fond par un traitement numérique des signaux captés à deux niveaux d'intensité différents, pour une ou chaque longueur d'onde considérée.
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