CN102660457A - 无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置及方法 - Google Patents

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王玉
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Abstract

本发明公开了一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置及方法，涉及血细胞检测和计数技术。其具有无透镜的简单结构，且视野广，可实现小型化，能够实时监测成千上万个不同浓度的细胞。本发明技术方案为：该装置包括用于放置样本的载玻片和置于载玻片之上的盖玻片，以及在载玻片的下方设有CCD或CMOS芯片，在盖玻片上方设有光源；在光源与盖玻片之间设有小孔，小孔设在光源的出光路线上。该方法包括：将血细胞样本置于载玻片与盖玻片之间压好，调整光源在盖玻片的上方，并调整感光芯片在载玻片的下方位置；使光源发出的光穿过小孔，并垂直入射到盖玻片上，位于载玻片下方的CCD或CMOS芯片记录光通过血细胞样本后的干涉成像。

Description

无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置及方法
 
技术领域
本发明涉及一种血细胞检测和计数技术，包括血细胞检测和计数装置和方法。
背景技术
在发展中国家，对简单低成本的一次性的用于HIV检测的诊断工具具有巨大需求。每毫升血液包含的T淋巴细胞亚群CD4+数目小于200被临床诊断为AID，这一技术面临很大挑战，其要求同时监测或计数成千上万的微目标。使用现场检测技术，从全部血液中计数CD4淋巴细胞面临2个主要的问题：以大的吞吐量在整个血液中获取细胞，以及快速计数获取的细胞。
常用的大尺度的射流方法需要预处理，荧光标记过程耗时。另外，计数过程用荧光显微镜下在机械过滤器中多个位置获取图像，多个位置的计数平均为最后的计数值。这基于标记的细胞计数方法不适合现场应用。
常用的无标记的CD4细胞监测技术采用表面化学技术的微流通道捕获细胞，其计数仍然在常规的显微镜下实行，很耗时。例如，中国专利申请号为200810179322.1、名称为“血细胞分析仪及分析方法”的公开文件中就记载了一种需要用到显微镜的细胞分析计数装置。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其具有无透镜的简单结构，且视野广，可实现小型化。
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置的方法，该方法易于操作，且观察细胞的视野广，能够实时监测成千上万个不同浓度的细胞。
为了解决上述第一个技术问题，本发明提出一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，包括用于放置样本的载玻片和置于载玻片之上的盖玻片，以及在所述载玻片的下方设有CCD芯片或CMOS芯片（感光芯片），在所述盖玻片上方设有光源；
在光源与盖玻片之间设有小孔装置，小孔装置上有小孔，小孔设在光源的出光路线上。
优选地：所述小孔的直径为80~120微米。所述光源位于所述盖玻片的正上方，光源发出的光穿过小孔能够垂直入射在盖玻片上。垂直入射是为了减弱玻片的折射带来的不良影响。
优选地：所述CCD芯片或CMOS芯片包括感光面，所述载玻片与所述感光面的距离为4~6厘米，例如为5cm。感光面的面积大于所述载玻片的面积投影在其上的阴影面积。大的感光面可以充分捕捉到载玻片上的每个细节，避免遗漏和误差，提高效果。
在不采用小孔的技术方案中，如果使用CCD数码相机拍摄，由于数码相机存在镜头，该镜头会使载玻片上影像与数码相机上的CCD芯片或CMOS芯片隔离，这样就会发生不清楚的情况，如果在数码相机与载玻片之间设置一个物镜，可以起到放大载玻片上细节的作用，此时，载玻片与数码相机上的CCD相距很大。事实上，使CCD芯片或CMOS芯片直接面对载玻片，而不使用物镜，如果CCD芯片或CMOS芯片与载玻片相距太大，会造成影响不清楚。这个距离的远近，取决于CCD的精度。所以一般情况下，保持CCD芯片或CMOS芯片的感光面与载玻片的底面贴合在一起。而本发明采用了小孔衍射技术，在衍射光在穿过载玻片后，鉴于成像的清晰度，需要将CCD或CMOS芯片放置在载玻片下方的一定距离的位置上，例如上述5cm。
所述CCD芯片或CMOS芯片与所述载玻片平行设置。如果CCD芯片或CMOS芯片与载玻片不是平行的，会导致较大误差。
优选地：所述载玻片和盖玻片的厚度为100~150微米。两个玻片的厚度对光的透射有一定的影响，它们会产生折射和反射现象。为了避免这种干扰，玻片的厚度不宜太厚，但是过薄的玻片易碎，成本高。
优选地：所述光源为单色相干光源。
优选地：所述相干光源的波长范围为350~1000纳米。
优选地：所述样本为直径为1微米以及以上的细胞。这个细胞为血细胞。
优选地：所述载玻片为圆片。一般的玻片为方形的，所用到的玻片的形状并不受到限定。
对于本发明的改进，所述CCD芯片或CMOS芯片包括感光面，在所述载玻片与所述CCD芯片或CMOS芯片之间有一层透明体，该透明体的面积不小于所述感光面。所述透明体为薄膜或硬质石英薄片，也可以采用蓝宝石衬底，例如，对人造2英寸蓝宝石衬底切割后的薄片，蓝宝石衬底相比石英，具有较好的硬度支撑，不易碎。这样的设置，为避免血液样本流入CCD芯片或CMOS芯片上。一般血液样本不会溢出玻片外面，但是由于血液浓度不定，有些较稀的血液会在两个玻片压紧的过程中溢出，或者在光源点亮后，血液发生热膨胀，导致从玻片中溢出。血液样本溢出会污染CCD或CMOS感光面。一般除污布不能很好清除这种污染，这种污染轻则导致CCD或CMOS灵敏度下降，重则浸入芯片内部损坏芯片。如果清理这些污物需要时间，导致设备使用效率下降。位于载玻片与CCD或CMOS之间的透明体，例如薄膜，可以阻止这种现象发生，如果有血液溢出，透明体可以承接这种溢出物，进而保护了CCD或CMOS，保证了操作高效、准确地进行。透明体一般放置在CCD或CMOS芯片上，包覆CCD或CMOS芯片的表面。
对于类似上述的CCD芯片或CMOS芯片保护结构，还有另外一种结构：在所述载玻片的四周侧边的外缘设有吸水材料物。所述吸水材料物粘在胶带上，胶带粘在所述载玻片的四周侧边的侧壁上。当血液从玻片中溢出的时候，吸水材料物吸附这些溢出液体。吸水材料物为吸水材料粘在粘胶带上制成的带状物，吸水材料可以是竹炭粉这样疏松多孔的物质，或密度较大的纤维材料，也可以是一些吸水晶体材料，例如一些矾类物质。这些带状物粘在玻片四周，在发生侧漏后，扯下这些带状物即可。
为了解决上述第二个技术问题，本发明提出一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的方法，其包括：
将血细胞样本置于载玻片与盖玻片之间，压好，调整光源在盖玻片的上方，并且调整CCD芯片或CMOS芯片在载玻片的下方位置；
开启光源，使光源发出的光穿过小孔，并垂直入射到盖玻片上，位于载玻片下方的CCD芯片或CMOS芯片记录光通过血细胞样本后的干涉成像，并输出记录信息。
调整CCD芯片或CMOS芯片在载玻片的下方位置可以采用用真空笔将夹有样本的两个玻片置于CCD或CMOS芯片的上方。
优选地，在所述载玻片与所述CCD芯片或CMOS芯片之间设置一层面积不小于所述感光面的透明体。透明体如果贴附在载玻片的背面，在压好前或后，均完成贴附透明体操作。透明体如果贴附在CCD或CMOS的感光面上，则应该在载玻片与感光面距离定位之前完成。另外，如果在所述载玻片的四周侧边的外缘设吸水材料物。则这个操作可以在压片之前完成，即将粘胶带粘在载玻片的侧面；或者在压片之后完成，即在载玻片与感光面距离定位完成后，在它们侧壁环绕粘一圈。用完后扯下粘带即可。
本发明的有益效果：
与现有方法相比，本发明提供一种无透镜的基于全息衍射成像的大视野的细胞监测技术方案，其记录每个细胞在光电传感器阵列（即指CCD芯片或CMOS芯片）上的阴影图像。这种无透镜的光学方法数倍（一般为2倍）地增加了传统光学显微镜的视野，可以实时监测成千上万个不同浓度的细胞。本发明的装置不需要透镜即可对大视场的大量细胞监测计数。
本发明技术方案设计合理、制作简单、成本低廉、易于操作，其无需透镜，可实现小型化。
附图说明
图1是发明装置的结构示意图。
具体实施方式
本发明提出一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，包括用于放置样本的载玻片和置于载玻片之上的盖玻片，在所述载玻片的下方设有CCD芯片或CMOS芯片，在所述盖玻片上方设有光源；在光源与盖玻片之间设有小孔装置，小孔装置上有小孔，小孔设在光源的出光路线上。
在一个实施方式中：所述光源位于所述盖玻片的正上方，光源发出的光能够垂直入射在盖玻片上。
在一个实施方式中：所述CCD芯片或CMOS芯片包括感光面，载玻片与感光面的距离为4~6厘米。
在一个实施方式中：所述CCD芯片或CMOS芯片与所述载玻片平行设置。
在一个实施方式中：所述小孔的直径为80~120微米。
在一个实施方式中：所述载玻片和盖玻片的厚度为100~150微米。
在一个实施方式中：所述光源为单色相干光源。所述相干光源的波长范围为350~1000纳米。
在一个实施方式中：所述样本为直径为1微米以及以上的细胞。这个细胞为血细胞。
在一个实施方式中：所述载玻片为圆片或方片。
在一个实施方式中:所述CCD芯片或CMOS芯片包括感光面，在所述载玻片与所述CCD芯片或CMOS芯片之间有一层透明体，该透明体的面积不小于所述感光面。所述透明体为薄膜或硬质石英薄片。
在一个实施方式中:对于类似上述的CCD芯片或CMOS芯片保护结构，还有另外一种结构：在所述载玻片的四周侧边的外缘设有吸水材料物。所述吸水材料物粘在胶带上，胶带粘在所述载玻片的四周侧边的侧壁上。
本发明的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的方法，其包括：将血细胞样本置于载玻片与盖玻片之间，压好，调整光源在盖玻片的上方，并且调整CCD芯片或CMOS芯片在载玻片的下方位置；开启光源，使光源发出的光穿过小孔，并垂直入射到盖玻片上，位于载玻片下方的CCD芯片或CMOS芯片记录光通过血细胞样本后的细胞阴影成像，并输出记录信息。
在一个实施方式中:在所述载玻片与所述CCD芯片或CMOS芯片之间设置一层面积不小于所述感光面的透明体。透明体如果贴附在载玻片的背面，在压好前或后，均完成贴附透明体操作。透明体如果贴附在CCD或CMOS的感光面上，则应该在载玻片与感光面距离定位之前完成。另外，如果在所述载玻片的四周侧边的外缘设吸水材料物。则这个操作可以在压片之前完成，即将粘胶带粘在载玻片的侧面；或者在压片之后完成，即在载玻片与感光面距离定位完成后，在它们侧壁环绕粘一圈。用完后扯下粘带即可。
以下通过实施例对本发明进行详细说明，但是本发明并不限制于以下实施例，任何逻辑变体技术方案均在本发明的保护范围内。
该无透镜的基于全息成像的细胞分析计数装置，其记录每个细胞在光电传感器阵列上的散射光与直接从光源发出的非散射光干涉信息。该装置包括光源1、小孔装置7及其上的小孔2、上层玻片（即盖玻片）3、血细胞样本4、下层玻片（载玻片）5以及CCD/CMOS芯片6等部件组成。用真空笔将夹有血细胞样本4夹在上层玻片3和下层玻片5之间，下层玻片5置于CCD/CMOS芯片6的成像平面的上方，与成像平面平行，光源1置于上层玻片3的正上方，方向与上层玻片3垂直。小孔2置于光源1与上层玻片3之间。
光源1通过小孔2从上层玻片3的上方垂直入射。下层玻片5与CCD芯片6的成像平面的距离保持5厘米左右。上层玻片3与下层玻片5的厚度为100-150微米。微细胞样本的直径在1微米以上，细胞(在磷酸盐缓冲液中)被放置在两个玻片（显微镜片）之间，液体体积为10-100微升。光源1采用单色相干光源，波长范围为350-1000纳米。每个细胞的散射光与光源发出的光干涉模式落在成像阵列上。小孔2的直径为100微米。成像阵列获取的图像在计算机上通过模式识别与图像处理算法实现分析。提取的目标图像与已知库比较，计数其相关性，得到当前样本的统计信息。
本发明是不需要透镜即可对血细胞分析计数，其采用光电传感器阵列记录成像平面上的细胞全息衍射成像，其不需要任何机械扫描和光学元件、如显微镜目镜或镜头。本发明提出的方法采用一个小孔，控制照明源的空间相干性，在高分辨率的成像阵列上记录芯片上每个细胞的全息衍射模式，即细胞的散射光与直接从光源发出的非散射光干涉信息，不需要透镜和其他光学设备对细胞并行成像。
与小型化的流式细胞术比较，本方法不涉及流体，在0.3秒内并行捕捉芯片上细胞的全息衍射信息，通过数字处理全息衍射信号。
与在线全息显微镜系统比较，本方法基于简单的光学设计，简单的数字处理，不采用透镜。
与其他不同的非全息的无透镜成像方法，本方法用于计数而不是成像，本方法是通过成像计数，不涉及流运动，所以可以检测大的视场。
与基于非相干光照明的阴影成像检测计数技术比较，本方法用空间相干的单色光记录全息衍射模式，而不是采用白光记录传统的衍射模式，本方法可以采用更大的样本体积10-100微升，而传统衍射方法限制为每秒小于0.1微升。本方法记录的全息衍射模式在细胞类有更均匀的强度，不同细胞间有更显著地差别。
本发明可以在线分析计数血细胞，为相关诊断提供依据，由光源、小孔、玻片、CCD/CMOS芯片和其外围驱动电路组成。与常用的基于流的血细胞计数装置比较，本发明中的全息成像装置通过记录空间相干的单色照明下样本在成像整列上的全息衍射模式，不通过透镜直接成像，大大减少了检查装置的体积和复杂程度。具有小型化、便携式、低成本的特点。

Claims (10)

1.一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，包括用于放置样本的载玻片和置于载玻片之上的盖玻片，其特征在于：
在所述载玻片的下方设有CCD芯片或CMOS芯片，在所述盖玻片上方设有光源；
在光源与盖玻片之间设有小孔装置，小孔装置上有小孔，小孔设在光源的出光路线上。
2.根据权利要求1所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其特征在于：所述小孔的直径为80～120微米；
所述光源位于所述盖玻片的正上方，光源发出的光穿过小孔能够垂直入射在盖玻片上。
3.根据权利要求1所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其特征在于：所述CCD芯片或CMOS芯片包括感光面，所述载玻片与所述感光面的距离为4～6厘米。
4.根据权利要求1所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其特征在于：所述载玻片和盖玻片的厚度为100～150微米。
5.根据权利要求1所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其特征在于：所述光源为单色相干光源。
6.根据权利要求1所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其特征在于：所述相干光源的波长范围为350～1000纳米。
7.根据权利要求1所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的装置，其特征在于：所述样本为直径为1微米及以上的细胞。
8.一种无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的方法，其包括：
将血细胞样本置于载玻片与盖玻片之间，压好，调整光源在盖玻片的上方，并且调整CCD芯片或CMOS芯片在载玻片的下方位置；
开启光源，使光源发出的光穿过小孔，并垂直入射到盖玻片上，位于载玻片下方的CCD芯片或CMOS芯片记录光通过血细胞样本后的干涉成像，并输出记录信息。
9.根据权利要求8所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的方法，其特征在于：所述载玻片与CCD芯片或CMOS芯片的感光面保持平行且间距为4～6厘米。
10.根据权利要求8所述的无透镜全息衍射成像血细胞分析计数的方法，其特征在于：所述光源为单色相干光源，所述相干光源的波长范围为350～1000纳米。
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