JP2001518186A - 細胞標本等級付けのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 顕微鏡スライドガラス上の細胞標本内に存在する沈殿物識別マーカの量を評価するためのシステムおよび方法を開示している。自動顕微鏡システムは、沈殿物識別マーカを含む細胞に関連する目的の候補物質を識別および確認するために、細胞標本の低倍率および高倍率の走査を実行する。目的の候補物質について計算された中心周囲を占める整った形状の領域が、処理する画素を決定するために使用される。各画素について色比率が計算され(204)、沈殿物識別マーカに関連する色によって支配されていることを示すこれらの色比率が合計され（210）、標準化される（214）。目的の候補物質に等級を指定するために、標準化された色比率が最低1つの所定のしきい値と比較される（220）。総計スコアを形成するために、所定数の目的の候補物質の等級が合計され（224）、この総計スコアがしきい値と比較される。総計スコアがしきい値を上回る場合、一般にマーカに関連する病状を示すために、目的の候補物質が決定される。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞標本等級付けのシステムおよび方法発明の分野 本発明は、顕微鏡スライドガラス上での細胞標本の自動分析に関するものであ り、特に染色したマーカを含む細胞標本の自動分析に関するものである。発明の背景 癌研究を含む医療診断の分野において、例えば癌細胞のような目的の細胞を、 生物標本の検査を介して検出、識別、評価、特徴付けを行うことは重要な診断の 局面である。一般に、骨髄、リンパ節、抹消血液、脳脊髄液、尿、溢出、細い針 の穿刺、抹消血液のスクラッピングまたはその他の材料のような生物標本が、目 的の細胞を識別するために標本を染色することで準備される。細胞標本準備の方 法の1つは、例えば腫瘍細胞といった目的の細胞の構成に反応する単クローン抗 体、多クローン抗血清、または核酸のような特定のプローブで標本を刺激するこ とである。可溶性の無色基質を有色の不溶性沈殿物に変換するための、アルカリ フォスファターゼ、グルコース酸化酵素、ペルオキシダーゼのような酵素反応を 利用して、またはプローブに染料を直接接合することにより、この反応を検出す ることができる。 例えば、ある医療的に異常な状態になると、時にマーカとして知られている物 質が人間の血液中に存在することがある。これらマーカは、予白血病性癌、ダウ ン胎児、またはその他の、人間の血液中にマーカを生じさせる従来の症状におい て存在する。通常、これらのマーカは可視検出することができない。しかし、有 色の不溶性沈殿物を生成するために血液細胞サンプルを準備し、酵素の基質と結 合することができる。次に、その細胞標本が、サンプルを採取した人物にその症 状が存在するかどうかを決定するべく、細胞標本内に含有された沈殿物の量を評 価するために、準備した細胞標本を載せたスライドガラスが検査される。 例えば、血液細胞は、赤血球と白血球の2つのタイプに分類される。赤血球は 、 ヒトの細胞に酸素をヘモグロビンの形で伝搬する。白血球は一般にヒトの免疫シ ステムに関連する。白血球は5つのタイプを備えており、その内の1つである好中 性白血球は、一般にこのタイプの白血球細胞を識別するために使用される分葉核 を備えている。胎児の出現に反応して、妊婦の血液中の好中球細胞は評価された レベルのアルカリフォスファターゼを有する。胎児がダウン胎児である場合、好 中球内のアルカリフォスファターゼのレベルはさらに高くなる。従って、妊婦の 血液中の好中球内のアルカリフォスファターゼの量を、ダウン胎児のマーカとし て使用することができる。病理学者は、好中球中のアルカリフォスファターゼを 識別する染色剤を使って、胎児がダウン胎児である可能性を可視的に検出するこ とができる。 過去の生物標本の検査は、研究室技術者または病理学者のいずれかによって手 作業で行われてきた。手作業方法では、目的の候補細胞を視覚的に見つけるため に、生物標本を載せたスライドガラスを顕微鏡で低倍率で観察していた。次に、 これらの物質が目的の細胞であることを確認するために、スライドガラス上の目 的の候補物質が配置された領域をより高い倍率で観察する。手作業方法には時間 がかかり、スライドガラスの欠損領域を含むエラーの影響を受けやすい。上述し た例において、対比染色カラーを有する分葉形の核によって好中球を識別するた めに、低倍率での走査を行う。 スライドガラス評価処理の速度と正確性を高めるために、自動細胞分析システ ムが開発されてきた。ある従来のインタラクティブシステムは、検査のために作 業者が予め確認したスライドガラスの台を走査することを目的とした単一ハイパ ワー顕微鏡を含む。このシステムにおいて、作業者はまず各スライドガラスを、 手作業方法と同様に低倍率で走査し、後の分析のために目的の地点を記述してお く。次に、作業者は記述した位置アドレスと、関連機能をデータファイルに記憶 する。目的の地点が見つかり、作業者によって記憶されると、そのスライドガラ スは、マークされた地点でのスライドガラスの画像を得て、画像分析を実行する 自動分析装置内に配置される。 また、ホッパに搭載されたキャリアに配置されたスライドガラスを自動的に観 察する自動標本分析システムも知られている。キャリアは、ホッパから顕微鏡の モータ付きXYステージへと1つずつ移動される。モータ付きステージは、顕微鏡 の対物タレットの下に設けられたキャリア内に1枚のスライドガラスを配置する ために操作され、このスライドガラスが低倍率パワーで走査される。顕微鏡の接 眼レンズを介したスライドのビューが、アナログ/デジタル（A/D）変換器を備え たデジタルカメラまたはアナログカメラのいずれかのカメラによって取り込まれ る。スライドガラス上で目的の候補物質を検出するために、デジタル化された画 像が自動顕微鏡と接続したコピュータサブシステムに供給される。次に、目的の 候補物質に関する情報が記憶され、対物タレットのビューパワーが高倍率レベル に増加される。スライドガラスが高倍率で走査され、高倍率レベルでのスライド ガラスの画像がカメラによって取り込まれ、デジタル化され、さらに、分析する 必要のない細胞標本の部分である破片やその他の物質の除去のためにコンピュー タサブシステムによって処理される。高倍率レベルの処理によって除去されない 、目的の候補物質に関連した高倍率画像の部分が、病理学者が観察するためにモ ンタージュに記憶される。画像を得たスライドガラスを識別する情報と、スライ ドガラス上の目的の候補物質の位置もモンタージュと共に記憶される。病理学者 がスライドガラス上の目的の候補物質を観察したい場合は、病理学者はスライド ガラスをキャリア内に配置し、これを自動分析システムに搭載する。次に、シス テムがスライドガラスを対物タレットの下に配置するので、病理学者はモンター ジュについて目的の候補物質の選択を確認するために、目的の候補物質を観察す ることができる。 従来の自動システムの1つの問題は、細胞標本内に存在するマーカの量を評価 することが困難な点である。例えば、好中球アルカリフォスタファーゼ（NAP） は、色が赤になるマーカを識別する不溶性生成物を生じるために染色される。通 常、細胞標本は対比染色され、細胞の核を青にする。このようなスライドガラス を観察する病理学者が、好中球の予測される色、形状、サイズの核を有するこれ らの細胞を探索することにより、好中球を検出する。次に病理学者は、見つかっ た好中球の各々について赤色の密度を主観的に評価する。また病理学者は、濃い 赤好中球の数が特定の病状を示すものであるかどうかを主観的に決定する。NAP について、病理学者は通常、等級スケールに従って0、1、2、3、4の等級で好中 球の等級付けを行う。この等級スケールは、Sigma Diagnosticsが販売する、白 血球内のアルカリフォスファターゼの活動をデモンストレートする試薬キットを 使った方法を使用するのと同じ事である。病理学者はこの方法に従って、細胞サ ンプル内の好中球の相対赤密度を決定するために使用できるスコアに到達するた めに、最初の100の好中球内の沈殿物識別マーカに主観的に指定された等級付け を合計する。次に、このスコアは、マーカの存在に関連する病状が示されている かどうかを決定するために使用される。 従来の自動標本分析システムは、経験を積んだ病理学者によるものと同じくら い信頼できる等級付けを行うことができなかった。例えば、Tafas等による米国 特許明細書第3,352,613号は、こうしたNAPのようなマーカの存在と量の評価を意 図する、細胞学スクリーニング方法を開示している。しかし、この特許のシステ ムは多くの限定を有している。その1つは、この特許の方法は、目的の候補物質 内の各画素について平均の光密度を計算するため、好中球、またはその他の目的 の候補物質の周囲を画像内に正確に定めなければならないことである。しかし、 好中球のような目的の候補物質が赤血球によってオーバーラップされる場所では 、目的の候補物質の周囲を画定するために赤の色成分を使用している場合、この 特許の方法は目的の候補物質の周囲を不正確に画定してしまう。目的の候補物質 の周囲が正確に画定されないと、目的の候補物質内に実際に存在する画素が見過 ごされ、目的の候補物質内に実際には存在しない画素が密度値の計算に含められ てしまう。実際、この特許は、評価されている細胞の核の画素が、光密度測定か ら除外されていることについて示していない。核画素の含有、または実際に細胞 内に存在する画素の除外が測定を歪曲してしまう場合もある。従って、この特許 の方法は細胞標本の画像の単一色成分で動作し、その結果、細胞がオーバーラッ プする場所において、分析される単一色成分の画素値が、オーバーラップした細 胞によって送られる光の中で減少する可能性がある。 そこで、経験を積んだ病理学者と同じくらい信頼できる、NAPを含有する好中 球を等級付けするシステムが必要となる。目的の候補物質内の沈殿物識別マーカ の量を測定するために、目的の候補物質の正確な周囲の画定に依存しない自動標 本分析システムが必要である。また、画定された目的の物質内にオーバーラップ した細胞が存在する場合にも、細胞標本内の沈殿物識別マーカの量を正確に評価 することが可能なシステムが必要である。発明の概要 従来の自動分析システムおよび方法の限定は、本発明の方法を実現するシステ ムによって克服することができる。本発明の方法は、顕微鏡スライドガラスに固 定した細胞標本の拡大ビューのデジタル画像を得る段階と、細胞標本内の複数の 目的の候補物質を識別するためにカラーデジタル画像を処理する段階と、複数の 目的の候補物質内で識別した目的の候補物質の中心を識別する段階と、識別され た各中心周囲の領域の各画素について、少なくとも2つの色成分の色比率を計算 する段階と、所定の色比率しきい値を超える計算された色比率を有する各中心周 囲の領域内に存在する全ての画素について、平均色比率を計算する段階と、各中 心周囲の領域内に存在する沈殿物識別マーカの量を測定するために、算出された 平均色比率を少なくとも1つの密度しきい値と比較する段階とを備えている。 この方法は、デジタル画像を得て、顕微鏡スライドガラス上の細胞標本内で目 的の候補物質を探索するために、このデジタル画像を処理する自動分析装置によ って実現される。好ましい実施例においてシステムは、画定された中心周囲を占 める整った形状の領域内に存在する画素について、2つの色成分の比率を計算す る。最も好ましい実施例においてこの領域は、中心周囲の70画素×70画素領域で ある。中心の周囲に整った形状の領域を画定することにより、物質の分析に必要 な画素を識別するために、等級付けシステムが目的の候補物質に関連した不均整 な周囲を越える必要がなくなる。その代わりに、少なくとも2つの色成分を使っ た色比率の計算が、評価に、沈殿物識別マーカの証拠とその相対密度を含む画素 のみを効果的に含有する。中心の周囲の領域が整った形状であるので、画素の処 理は従来の方法に比べて格段に速い。さらに、2つの色成分の比率を使用するこ とによってより多くの情報が提供されるため、この方法は、沈殿物識別マーカの 量を評価するために1つの色成分しか使用しない方法よりもさらに正確である。 本発明の好ましい実施例において、まず、中心周囲の70画素×70画素領域が画 定される。領域内の各画素について赤画素密度の緑画素密度に対する比率が、 領域内のNAPを評価するために使用される。好ましい比率は、赤と緑の画素成分 の差の、赤と緑の画素成分の和に対する比率である。好ましい実現では差の絶対 値を使用しないため、この比率は-1〜+1の範囲内の指示された大きさである。細 胞サンプルが、ナフトールAS-2リン酸塩の溶液とファストレッドバイオレットLB で化学的に分析されると、アルカリフォスファターゼの存在が、加水分解によっ て形成された沈殿物の赤色によって示される。その結果、NAPの存在を示す好ま しい色比率は、0よりもわずかに大きな値から+1の範囲内にある。従って、整っ た形状の領域内のNAPの存在を示す全ての画素が、正であり、0でない値を有する 比率によって識別される。 0でなく、正である色比率を有するこれらの画素の色比率が合計され、この合 計が、ゼロでなく、正の値を有する画素の数で割られる。算出したこの値は、0 〜+1の範囲内にある標準化値である。0〜+1の範囲が、細胞標本内のNAPの量を等 級付けするために共通に使用されるスコア値0、1、2、3、4に関連する5つのサブ 範囲に分割される。これらの範囲の100のスコアが計算され、次に、細胞標本の 総計スコアを得るために合計される。次に、細胞標本内のNAPの量が、標本を採 取した人物がマーカが一般に示す病状を有するかどうかを示すか否かを評価する ために、総計スコアがしきい値と比較される。 本発明の方法およびシステムは、多くの利益と利点を提供する。例えば、目的 の候補物質の中心周囲の領域を評価するために整った形状の領域を使用するため 、この領域内の画素の処理が、不均等な形状の周囲領域を探索し、候補物質の画 像データを処理しなければならない場合よりも格段速い。色比率のために2つの 色成分を使用することにより、システムおよび方法が整った形状領域を、物質周 囲を探索および越えることなく、アルカリフォスフォターゼを含有する好中球の 細胞質内の画素のみを効果的に識別する比率として使用できる。読者は、本発明 によるこのシステムおよび方法が、細胞標本内に存在するマーカを識別するため に染色したあらゆる細胞標本内のマーカの量を評価するために使用できることが 理解できるはずである。これらの方法は、単クローン抗体、多クローン抗体、現 場交配、または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RTPCR）を含むが、これに限定さ れるものではない。 本発明の別の特徴は、色比率計算にノイズ低減フィルタを使用することである 。このフィルタは、2つの色成分の差が比較されるしきい値である。2つの色成分 の差がしきい値よりも小さい場合、画素の比率は計算されない。このしきい値は 小さい正の数であることが好ましい。このノイズしきい値は、電子ノイズによっ て小さい正の数に増加されたその2つの色成分差を有する画素が、沈殿物識別マ ーカについて評価される可能性を減少させる。このフィルタはさらに、目的の候 補物質とオーバーラップする領域を超えて延びる赤血球から画素を除去する助け をする。従って、このフィルタは、目的の候補物質の周囲領域を正確に画定する 必要性を低減し、画像データの生成における電子ノイズを補正する。 本発明のシステムおよび方法の、これらの、またその他の利点と利益は、本発 明の詳細な説明によって確実になる。図面の簡単な説明 本明細書に採用され、本明細書の1部を構成している添付の図面は、上述の一 般的な記述と、本発明の原理を説明するための後述する実施例の記述と共に、本 発明の好ましい実施例とその他の実施例を説明するものである。 第1図は、本発明を具現化する自動細胞分析用の装置の斜視図である。 第2図は、第1図に示した装置のブロック図である。 第3図は、顕微鏡コントローラを示すブロック図である。 第4図は、第1図の装置で得た細胞標本の画像において物質を等級付けするため の好ましい方法を示すフローチャートである。 第5図は、第3図で図示した例証的方法で処理した細胞標本の画像内の通常の形 状をした領域を示す斜視図である。 第6図は、第4図の方法を実行する細胞標本等級付けシステムのブロック図であ る。発明の詳細な説明 次に図面を参照すると、第1図の斜視図と、第2図のブロック図にあるように、 生物標本の自動細胞分析装置を概して参照番号10で示している。装置10は、ハウ ジ ング12内に収納された顕微鏡システム32を備えている。ハウジング12のドア14が 顕微鏡サブシステムを外部環境から保護する。コンピュータサブシステムは、シ ステムプロセッサ23、画像プロセッサ25、通信モデム29を設けたコンピュータ22 を備えている。コンピュータサブシステムはさらにコンピュータモニタ26と画像 モニタ27を備え、また、記憶装置21、トラックボール装置30、キーボード28、カ ラープリンタ35といったその他の外部周辺機器も備えている。システムに電力供 給するための外部電源24も図示されている。作業者が覗き込むための、顕微鏡サ ブシステムの接眼レンズ20がハウジング12から突出している。装置10はさらに、 顕微鏡サブシステム32を介して画像を得るためのCCDカメラ42を備えている。シ ステムには、対物タレットから接眼レンズ20またはカメラ42への画像を拡大する ためのスイッチが設けられていることが好ましい。システムプロセッサ23によっ て制御されている顕微鏡コントローラ31が、多数の顕微鏡システム機能を制御す る。この顕微鏡システム機能については、後により詳細に説明する。自動スライ ドガラス供給機構37は、X-Yステージ38と共に、装置10において自動スライドガ ラス処理を提供する。照明光源48がX-Yステージ38に光を照射し、次にX-Yステー ジ38が顕微鏡サブシステム32を介してイメージされ、これが画像プロセッサ25で の処理 1 Zステージまたはフォーカスステージ46が、フォーカスのためにZ平面における 顕微鏡システムの置換を提供する。顕微鏡システム32はさらに、目標を選択する ためのモータ付対物タレットを備えている。 装置10の目的は、例えば、沈殿物識別マーカを含んだ特定の細胞といった目的 の候補物質を探索するために、また、探索した目的の候補物質内の沈殿物識別マ ーカの量を評価するために準備した顕微鏡スライドガラスの無人の自動走査であ る。装置10は、色、サイズ、形状特徴に基づいて、生物標本内から自動的に目的 の候補物質を探索する。生物標本のスコアを生成するために、目的の候補物質の 沈殿物識別マーカの量を示す等級が決定および合計される。このスコアは、生物 標本が、沈殿物識別マーカを生じたマーカと一般に関連する病状を示すものかど うか評価するために使用される。ステインと対比染色の数は、生物標本の様々な 細胞と細胞構造内の染色した沈殿物識別マーカを生成するために使用される。本 発明の装置は、目的の候補物質を識別するべくこの沈殿を検出するために使用さ れる。 装置10の動作中に、病理学者または研究室技術者はスライドガラスキャリア上 に準備したスライドガラスを載せる。スライドガラスキャリアには4枚までのス ライドガラスを載せることができ、入力ホッパ16内にスライドガラスキャリアを 25個まで搭載することができる。操作者は、走行を行う領域のサイズ、形状、位 置を特定することができる。あるいはシステムが走行を行う領域を自動的に探す こともできる。次に操作者は、グラフィカルユーザインターフェースを介したス ライドガラスの自動走行をシステムに命令する。無人走行は、第1キャリアの精 密なモータ付きX-Yステージ38上に自動的に搭載することから開始する。この搭 載操作中に、バーコード読取り機33がスライドガラスに固定されたバーコードラ ベルを読取る。次に、色、サイズ、形状特徴に基づいて候補物質を識別するため に、各スライドガラスが、ユーザが選択した例えば20倍といった顕微鏡の低倍率 で走査される。走査が完了するまで、候補物質のX-Y位置が記憶される。 低倍率での走行が完了すると、装置は自動的に各候補物質へと戻り、NAP評価 のために、例えば60倍といった高倍率で焦点し、目的候補の確認のためのさらな る分析のために、デジタル形式にした画像を採り込む。確認した細胞候補の各々 の中心が、沈殿物識別マーカの評価のために計算および記憶される。次に装置10 は、最初に各印した目的の候補物質の中心に戻り、中心周囲の領域のカラー画像 を取り込む。この領域内の沈殿物識別マーカの量を決定するために、この領域の 画素データが処理され、その物質に等級が付けられる。装置10は、所定数の物質 の処理が終わるまで、その他の確認された目的の候補物質についても中心周囲の 処理と等級付けを続けて行う。次に、所定数の物質の等級から集計スコアが算出 される。続いて、物質等級、集計スコア、画像が、脱着可能なハードドライブま たはDATテープのような記憶装置21に記憶されるか、またはレビュー検査、また は記憶を行うために遠隔地へ伝送される。各スライドガラスについて記憶された 画像は、さらなる検討のためにモザイク画像で映し出される。さらに、病理学者 または技術者は、接眼レンズ20を使った顕微鏡または画像モニタ27を介して、検 出した細胞を直接見ることができる。 次に第3図を参照すると、顕微鏡コントローラ31をさらに詳細に示している。 顕微鏡コントローラ31は、システムバスで接続した多数のサブシステムを備えて いる。システムプロセッサ102がこれらのサブシステムを制御し、また、システ ムプロセッサ自体が、RS232コントローラ110を介して装置システムプロセッサ23 によって制御されている。システムプロセッサ102は、入出力フィーダ、モータ 付きタレット44、X-Yステージ38、Zステージ46を制御するモータ制御サブシステ ム114〜124のセットを制御する（第2図参照）。後に詳細に説明する焦点操作の 最中に可変データを計算するために、ヒストグラムプロセッサ108がCCDカメラ42 からの入力を検査する。 システムプロセッサ102はさらに、サブステージ照明48を制御するための照明 コントローラ106を制御する。バルブの老朽化、光学整列における変化、その他 の要素のために、システムを照明するためのハロゲンライトバルブから出力され る光を時間が経つにつれて変えてしまう。さらに、「過度に染色した」スライド ガラスは、カメラの露出を許容できないレベルにまで減少させてしまう。これら の影響を補正するために、照明コントローラ106が採用される。様々な照明レベ ルに対応するために、このコントローラは照明制御ソフトウェアと共に使用する 。照明制御ソフトウェアはカメラからの出力を間をおいて（スライドガラスキャ リア搭載の間など）採取し、コントローラに、照明を所望のレベルに調節するよ うに命令する。この方法で、照明制御は自動であり、ユーザにとって明白であり 、システム操作に時間を追加する必要がない。 システムプロセッサ23は、IBMと互換性があり、Pentium 90MHzを使用し、RAM が32MBであり、1つが脱着可能な2つのIGBのハードドライブを備えたPCであるこ とが好ましい。システムプロセッサ23のOSは、ワシントン州レッドモンドにある Microsoft Corporation製のWindows for Workgroups 3．1を使用する。画像プロ セッサ25は、カナダ、ケベック州ドーバル（Dorva l）にあるMatrox Electronic s Systems，Ltd.製のMatrox Imaging Series 640ボードセットを使用することが 好ましい。好ましい画像プロセッサは、サポートソフトウェアとMatrox Imaging Library(MIL)を備えている。顕微鏡コントローラシステムプロセッサ102は、Ad vanced Micro Devices AMD29K装置である。 低倍率画像処理が核を有する細胞を識別する。この場合、核は、細胞標本の準 備に使用した染色または対比染色に関連する特定の色で染色されている。例えば 、好中球内のアルカリフォスファターゼの有無を評価するために使用する血液塗 布は、一般にナフトールAS-biphosphate saltとファストレッドバイオレットLB で染色される。各標本の好中球内のアルカリフォスファターゼ(NAP)の有無は、 加水分解によって形成された沈殿物の赤色で示される。通常、標本は、白血球核 において不溶性の青色の沈殿物を生成するためのヘマトキシリンのような対比染 色剤で着色される。この白血球内の染色/対比染色方法で得られた標本は、青色 核を有する細胞によって識別される。これらの細胞は、核の形状とサイズに基づ いて好中球細胞を識別するために処理される。従って、低倍率処理は細胞標本の 画像内において、物質の色、形状、サイズから好中球のような目的の候補物質を 識別する。 高倍率画像処理の間にシステムが実行した処理はさらに、沈殿物識別マーカを 含有していなさそうな物質を除去するために、目的の候補物質の各々について細 胞核の色、形状、サイズを評価する。NAPのための本発明の好ましい実現におい て、目的の候補物質を識別するための最小領域は14μm²である。好ましい緻密(C ompactness)値は、1.25の値よりも大きな核を有する物質についてのものである 。緻密性とは、この分野でよく知られた、核の周囲の形状を示す用語である。次 に、識別された目的の候補物質の中心が計算され、スコア処理のために中心が記 憶される。所定数の目的の候補物質が確認され、その関連する中心が記憶される と、スコア処理が実行される。 好ましい実行において、低倍率および高倍率レベルで実行される画像処理は、 我々の同時継続特許明細書、シリアル番号08/758436、1996年11月27日提出の"ME THOD AND APPARATUS FOR AUTOMATED IMAGE ANALYSIS OF BIOLOGICAL SPECIMENTS "で開示されているものである。本明細書では、この明細書の開示を、参照する ことで明白に採用している。上述の明細書で開示されている色変換、低域フィル タリング、しきい値、形態処理を、目的の候補物質を識別するために使用するこ とが好ましい。サイズ、緻密性といった、目的の候補物質の中心および形態特徴 は、好ましい画像プロセッサのMIL内の機能から得られる。これは、細胞 標本の画像内における目的の候補物質を識別するための好ましい方法であるが、 沈殿物識別マーカを含むこれらの細胞の場所と整った形状を識別する方法であれ ば、その他の従来の方法も使用することができる。 第4図にスコア処理の方法を示す。この処理は、最初に確認された目的の候補 物質の中心を探索し、中心周囲の整った形状のカラー画素値を取り込む（ブロッ ク200）。この領域は、2次元平行四辺形のような従来のプログラミングループ制 御で容易にトラバースできるあらゆる整った形状であってよい。最も好ましい整 った形状は四角形であり、この四角形の最も好ましいサイズは70画素X 70画素で ある。整った形状領域は、目的の候補物質と関連した沈殿物識別マーカのための 画像データを含有する全ての画素を十分収容できるだけの大きさがなければなら ない。例えば、最も好ましい70画素X 70画素の形状は、確認された目的の候補物 質に関連する細胞の細胞質および核を十分に網羅する大きさの領域と関連する。 最も好ましい領域を第５図に示す。この図からわかるように、整った形状の領域 は目的の候補物質の周囲を越えて延びているため、目的の候補物質の中心周囲の 領域が、その目的の候補物質の全ての画素を包括できる。読者は、評価に含まれ る目的の画素の候補物質を識別するために、目的の候補物質の外周を画定するこ となく目的の候補物質内の沈殿物識別マーカの量の評価を簡素化するために使用 されるあらゆる領域は、本発明の原理の範躊内にあることが理解できるはずであ る。 次に、各画素の色比率が計算される（ブロック204）。好ましい実現において 、色比率は、2つの画素色成分の同2つの画素色成分の和に対する差である。最も 好ましい実現において、ナフトールAS-2リン酸塩とファストレッドバイオレット LBで染色され、続いてヘマトキシリンで対比染色された細胞標本内でNAPをスコ アするために、赤および緑画素色成分を使用する。従って、この比率は(R-G)/(R +G)と表されるが、その他の色成分の組合せも可能である。色成分の選択は、沈 殿物の色（通常は染色剤の色）を識別するマーカと、色を識別する細胞（通常は 対比色）に最も関連する2つの色成分を含んでいるとが好ましい。この比率が、 第1色成分（最も好ましい実施例では赤）が支配する画素を識別する。第1色成分 からは、第2色成分（最も好ましい実施例では緑）が除去される。比率が第1 色成分が支配する画素について正であり、第2色成分が支配する画素について負 である場合、比率は-1〜+1の範囲にあり、2つの成分が等しい場合には、比率は0 である。 色比率を使用することで、本発明のシステムと方法が、目的の候補物質内にあ る全ての画素を識別するために周囲領域を越えることなく沈殿物識別マーカの量 を評価するために、整った形状領域の画素を処理することができる。あるいは、 少なくとも1つが沈殿物識別マーカの色に関連している2つの色成分の比率によっ て、システムが、目的の候補物質の形状を参照することなく、沈殿物識別マーカ に関連する画素値を識別することができる。これにより、本発明の方法は、沈殿 物識別マーカに関連する画素を識別するために形状に依存する方法よりも、高速 に且つ正確に目的の候補物質の各々を評価することができる。 色比率は、所定のノイズしきい値よりも大きな2つの色成分差を有する画素か らのみ計算されることが最も好ましい。ノイズしきい値は小さな正の数であるこ とが好ましく、またしきい値は5であることが最も好ましい。ノイズしきい値の 影響は、沈殿物識別マーカを示す色として現れる白または濃い色の領域にある画 素の数を減少することである。白または黒の画素は、全ての色成分がゼロ（0） または255である値を各々有する。結果として、白または黒の画素についての2つ の色成分の差は0であるべきであり、画素は以下に説明する色比率の標準化に含 まれない。しかし、電子ノイズが、白であるべき画素に、小さな正の値の色成分 を持たせ、黒であるべき画素に、255よりもわずかに小さい色成分を持たせてし まうことがある。ノイズ誘導値を持つ色成分が、NAP等級付けのための好ましい2 つの色成分差における白画素の赤成分、または黒画素の緑成分である場合、白お よび黒の両方の画素について小さな正の比率が計算される。次に、これらの色比 率が色比率の標準化に誘導され、結果を歪曲する。この歪曲した比率が目的の候 補物質の等級に影響を及ぼす。細胞標本のスコアに影響を及ぼす可能性もある。 しかし、2つの色成分の差がノイズしきい値よりも小さい限り、ノイズしきい値 が画素の色比率の計算を妨げる。さらに、ノイズしきい値が、重なった細胞から の画素が細胞標本の等級付けとスコアリングに含まれる可能性を減少させる。例 えば、目的の候補物質の周囲領域を超えて延びる、目的の候補物質と重なる赤血 球 の画素は、一般に濃い赤ではない。その結果、ノイズしきい値が、表面上は候補 物質の等級付けから赤に着色されている目的の候補物質の外でこれら赤血球の画 素を除去する。このフィルトレーションは、目的の候補物質の周囲領域を参照す ることなく行われる。 また、ほぼ白、またはほぼ黒の画素は白または黒と考慮されるため、これらの 画素は目的の候補物質の等級付けには使用されない。この方法は、最大値の色成 分が白しきい値よりも小さいかどうか、または、最小値の色成分が黒しきい値よ りも大きいかどうかを決定する。例えば、10の白しきい値を使うと、9、3、8の 値の赤、緑、青を各々持つほぼ白の画素は、実際の赤−緑の差が6であっても、2 つの色成分の差、ゼロ（0）を持つほぼ白の画素として考慮される。従って、5の ノイズしきい値は、物体の等級付けにおいて画素に色比率を有するが、10の白し きい値が等級付けからこれを除去する。同様に、250の黒しきい値は、250または それ以上の最小の色成分を有する画素を分類し、画素の比率を計算しない。 次に、第4図の処理は以下のように続けられる。正でありゼロでない色比率を 有する画素の全ての色比率を合計し、この合計数を合計を求めるために使用した 画素の数で割る（ブロック208、210、212、214）。次に、沈殿物識別マーカの量 を求めるために、この領域内の標準化された色比率が少なくとも1つのしきい値 と比較される（ブロック220）。上述した染色および対比染色のNAPのための好ま しい実施例では、0〜＋1の範囲の4つのしきい値が存在する。これら4つのしきい 値が、範囲を、一般にNAP沈殿物の密度を分類するために使用される5つの等級に 関連した5つのサブ範囲に分割する。次に、この範囲の等級が物質スコアに追加 され（ブロック224）、処理は、所定数の目的の候補物質が処理されるまで（ブ ロック228）継続する。最も好ましい実施例において、細胞標本内に含まれるNAP 量を評価するための所定数の目的候補物質は100物質である。続いて、病理学者 が後に評価を行えるように、物質スコアがスライドガラスと共に記憶される。あ るいは物質スコアは、細胞標本がマーカに関連した状態を示しているかどうかを 示す所定のしきい値と比較されてもよい。 本発明の好ましい実施例において、第4図の処理は、実行のために画像プロセ ッサ25にダウンロードしたCプログラムで実現されるが、その他のプログラム言 語を私用してもよい。さらに、画像プロセッサ25に記憶された画像データが第4 図の処理を実現するプログラムおよび/またはハードウェアで使用可能である限 り、プログラムをシステムの別のプロセッサ上で実行することもできる。 本発明の好ましい方法を実行するために使用できるシステムを第6図に示す。 スライドガラス固定した細胞標本のスコアを生成するために、システム150が画 像プロセッサ25に記憶された画像データを処理する。色比率生成器154が、画像 データ内の目的の候補物質の中心周囲の正確に画定された領域内の画素の色比率 を計算する。色比率生成器154は、どの画素に色比率を計算するかを決定するた めのノイズしきい値を含んでいることが好ましい。計算した色比率は色比率比較 測定器158に供給される。色比率比較測定器は、色比率が標本の標準化した色比 率に含まれているかどうかを決定するために、色比率を正であり0でないしきい 値と比較する。比較測定機158によって伝送されたこれらの色比率が色比較ノー マライザに供給される。色比較ノーマライザは、伝送された色比率を合計し、こ れを伝送された色比率の数で割る。目的の候補物質の標準化された色比率が等級 生成器164に供給される。等級生成器164は、標準化された色比率を1つ以上のし きい値と比較し、目的の候補物質に等級を指定する。指定された等級がスコア生 成器168に供給される。スコア生成器168は、スライドガラスについてデータと共 に記憶される総計スコアを生成するために、所定数の目的の候補物質の等級を合 計する。このスコアは、細胞標本が特定の病状を示しているかどうかを決定する ために使用される。システム150のコンポーネントは、ハードウェアかソフトウ ェア、またはこれらの組合せにおいて実行することができる。 研究室の技術者は、マーカを可視的に検出することができるように処理した細 胞標本を載せた複数のスライドガラスを準備する。次に、スライドガラスをスラ イドガラスキャリアに搭載され、自動顕微鏡システムのスライドガラスホッパ上 に配置される。システムが初期化され、スライドガラスキャリアが、対物タレッ トの下に設けられたモータ付きステージに供給される。目的の候補物質を識別お よび確認するために、低倍率と高倍率での処理が実行される。次に、所定数の確 認された候補物質の周囲にある整った形状の領域の画像が、本発明の方法で等級 付けされる。スライドガラス上の細胞標本の総計スコアが、そのスライドガラス の識別子と共に記憶され、続いてキャリア上の次のスライドが処理される。全て のキャリア上の全てのスライドガラスの処理が完了するまで、各キャリア上の各 スライドガラスの処理が行われる。処理の最後に、各スライドガラスについて確 認された目的の候補物質のモンタージュ、各物質の等級、各物質の位置、核スラ イドガラスの総計スコアがコンピュータサブシステム内に記憶される。この情報 は、細胞標本が特定の病状を示しているかを決定するため、または等級付けされ たスライド上の物質のレビュー検査を行うために、病理学者によって使用される 。 本発明を好ましい実施例およびその他の実施例の説明によって説明し、実施例 をかなり詳細に説明してきたが、発明者は、これらの説明によって添付の請求の 範囲を規制もしくはいかなる形でも限定することを意図していない。当業者には 、さらなる利点および変更が可能であることが明白であろう。従って、本発明の より広範囲な局面は特定の細部、説明した装置および方法、または図示および解 説した例証に限定されるものではない。従って、発明者の全般的な発明の概念の 精神または範囲から逸脱しない限りは、こうした細部からの逸脱が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，Ｙ Ｕ，ＺＷ (72)発明者 リディング，トーマス，ジェイ. アメリカ合衆国 32904 フロリダ州，ウ ェスト メルボルン，リンヴィル フォー ルズ ドライブ 663 (72)発明者 デッカー，ウィリアム，ジェイ. アメリカ合衆国 92675 カリフォルニア 州，サン ユアン キャピストラノ，デル オビスポ ナンバー 118―314 31878

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 顕微鏡スライドガラスに固定された細胞標本内の、可視的に検出可能な沈殿 物識別マーカの量を評価する方法であって、 顕微鏡スライドガラスに固定した細胞標本の拡大ビューのデジタル画像を得る 段階と、 細胞標本内の複数の目的の候補物質を識別するためにカラーデジタル画像を処 理する段階と、 複数の目的の候補物質内で識別した目的の候補物質の中心を識別する段階と、 識別された各中心周囲の領域の各画素について、少なくとも2つの色成分の色 比率を計算する段階と、 所定の色比率しきい値を超える計算された色比率を有する各中心周囲の領域内 に存在する全ての画素について、平均色比率を計算する段階と、 各中心周囲の領域内に存在する沈殿物識別マーカの量を測定するために、計算 された平均色比率を少なくとも1つの密度しきい値と比較する段階と、 を有することを特徴とする方法。 2. 前記色比率計算段階がさらに、 各画素について、赤画素成分の緑画素成分に対する色比率を計算する段階を有 すること特徴とする請求の範囲1に記載の方法。 3. 前記色比率計算段階がさらに、 領域内の各画素について、第1画素色成分と第2画素色成分との差の、前記第1 画素色成分と前記第2画素色成分との和に対する色比率を計算する段階を有する ことを特徴とする請求の範囲1に記載の方法。 4. 前記第1画素色成分が赤であり、前記第2画素色成分が緑であることを特徴と する請求の範囲3に記載の方法。 5. 各中心周囲の各領域内に存在する沈殿物識別マーカの量の等級を決定するた めに、前記計算された平均色比率を比較する前記比較段階が、複数の順序付けら れたしきい値と比較することを特徴とする請求の範囲3に記載の方法。 6. 細胞標本のスコアを決定するために、複数の領域の等級を合計する段階を さらに有することを特徴とする請求の範囲5に記載の方法。 7. 前記細胞標本スコアが、細胞標本内で識別された100の中心周囲の100の領域 の等級の合計であることを特徴とする請求の範囲6に記載の方法。 8. 前記2つの色成分の差をノイズしきい値と比較する段階と、 前記ノイズしきい値よりも大きな前記2つの色成分の差に応答して、前記色比 率を計算する段階と、 をさらに有すること特徴とする請求の範囲3に記載の方法。 9. 前記画素の色比率を計算するかどうかを決定するために、最大値を有する画 素の色成分を白しきい値と比較し、最小値を有する画素の色成分を黒しきい値と 比較する段階をさらに有することを特徴とする請求の範囲3に記載の方法。 10． 顕微鏡スライドガラスに固定された細胞標本内の、可視的に検出可能な沈 殿物識別マーカの量を評価する方法であって、 顕微鏡スライドガラスに固定された細胞標本の拡大ビューのカラーデジタル画 像を得るための画像プロセッサと、 前記細胞標本内で目的の候補物質を識別する手段と、 目的の候補物質の各々の中心を識別する手段と、 識別された各中心の周囲にある領域の各画素について、少なくとも2つの色成 分の色比率を計算する手段と、 所定の比率しきい値を越える計算された色比率を有する、各中心の周囲にある 領域内に存在する全ての画素について平均色比率を計算する手段と、 各中心の周囲にある各領域内に存在する沈殿物識別マーカの量を評価するため に、計算した平均比率を、少なくとも1つの密度しきい値と比較する手段と、 を有することを特徴とするシステム。 11． 色比率を計算する前記手段が、赤画素成分の緑画素成分に対する比率を計 算することを特徴とする請求の範囲8に記載のシステム。 12． 色比率を計算する前記手段が、第1画素色成分と第2画素色成分との差の、 前記第1画素色成分と前記第2画素色成分との和に対する比率を計算することを特 徴とする請求の範囲8に記載のシステム。 13． 前記第1画素色成分が赤であり、前記第2画素色成分が緑であることを特徴 とする請求の範囲10に記載のシステム。 14． 計算した平均色比率を比較するための前記手段が、各中心の周囲にある各 領域内のマーカの量の等級を決定するために、前記計算した平均色比率を複数の 順序付けられたしきい値と比較することを特徴とする請求の範囲10に記載のシス テム。 15． 前記細胞標本のスコアを決定するために、複数の領域の等級を合計する手 段をさらに有することを特徴とする請求の範囲12に記載のシステム。 16． 前記合計手段が、前記細胞標本内で識別された100の中心周囲の100の領域 の等級を合計することを特徴とする請求の範囲13に記載のシステム。 17． 顕微鏡スライドガラスに固定された細胞標本内の、可視的に検出可能な沈 殿物識別マーカの量を評価する方法であって、 複数の目的の候補物質内の各目的の候補物質について中心を識別する段階と、 各識別された中心の周囲にある領域の各画素について、少なくとも2つの色成 分の色比率を計算する段階と、 所定の色比率しきい値を超える計算された色比率を有する、各中心の周囲にあ る前記領域内の全ての画素について平均色比率を計算する段階と、 各中心の周囲にある各領域内に存在する沈殿物識別マーカの量を評価するため に、前記計算された平均色比率を少なくとも2つの密度しきい値と比較する段階 と、 を有することを特徴とする方法。 18． 中心の周囲にある前記領域が整った形状の領域であることを特徴とする請 求の範囲1に記載の方法。 19． 前記整った形状の領域が平行四辺形であることを特徴とする請求の範囲1 に記載の方法。 20． 前記色比率計算段階が、 前記領域内の各画素について、第1画素色成分と第2画素色成分との差の、前記 第1画素色成分と前記第2画素色成分との和に対する色比率を計算する段階をさら に有することを特徴とする請求の範囲1に記載の方法。 21． 前記第1画素色成分が赤であり、前記第2画素色成分が緑であることを特徴 とする請求の範囲3に記載の方法。 22． 各中心の周囲にある各領域内に存在する沈殿物識別マーカの量の等級を決 定するために、前記計算された平均色比率を比較する前記比較手段を、複数の順 序付けられたしきい値と比較することを特徴とする請求の範囲3に記載の方法。 23． 前記細胞標本のスコアを決定するために、複数の領域の等級を合計する段 階をさらに有することを特徴とする請求の範囲5に記載の方法。 24． 前記2つの色成分の差を、ノイズしきい値と比較する段階と、 前記ノイズしきい値よりも大きな前記2つの色成分差に応答して、前記色比率 を計算する段階と、 を有することを特徴とする請求の範囲20に記載の方法。 25． 前記画素の色比率が計算されたかどうかを決定するために、最大値を有す る画素の色成分を白しきい値と比較し、最小値を有する画素の色成分を黒しきい 値と比較する段階をさらに有することを特徴とする請求の範囲20に記載の方法。 26． 顕微鏡スライドガラスに固定された細胞標本内に存在する沈殿物識別マー カの量をスコアするシステムであって、 前記細胞標本の拡大ビューの画像データにおける目的の候補物質の中心周囲の 領域内に存在する画素について、色比率を計算する色比率生成器と、 標準化された色比率内にどの色比率が含まれているかを決定するために、前記 計算した色比率を所定のしきい値と比較する色比率比較測定機と、 標準化された色比率を生成するための色比率ノーマライザと、 前記標準化された色比率から、目的の候補物質に等級を生成するための等級生 成器と、 所定数の目的の候補物質の等級を合計することによって、前記細胞標本内に存 在する沈殿物識別マーカの量を示すスコアを生成するためのスコア生成器と、 を有することを特徴とするシステム。 27．前記色比率生成器が、 画素の色比率が計算されたかどうかを決定するために、前記色比率生成器によ って使用されるノイズしきい値をさらに有することを特徴とする請求の範囲26に 記載のシステム。 28． 前記色比率生成器が、 画素の色比率が計算されたかどうかを決定するために、前記色比率生成器によ って使用される白しきい値と黒しきい値を有することを特徴とする請求の範囲26 に記載のシステム。